DK148918B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotika benaevnt a-21978 - Google Patents

Description

i 148918

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt antibiotisk A-21978-blanding, hvilken blanding omfatter faktorerne Cq, C^, C3, C4 og Cg, som er nært beslægtede, sure peptid-5 antibiotika, eller komponenter eller salte heraf. Forbindelser tilhørende denne klasse af antibiotika, som i forvejen kendes, omfatter crystallomycin, amphomycin, zaomycin, aspartocin og glumamycin Cse T. Korzybski, Z. Kowszyk-Gindifer and W. Kurylowicz: "Antibiotics-Ori-10 gin, Nature and Properties," Vol. I, Pergamon Press,

New York, N.Y., 1967, pp. 397-401 og 404-408]; tsushimycin tJ. Shoji et al., J. Antibiotics 21, 439-443 (1968)]; 1aspartomycinCH. Naganawa et al., J. Antibiotics 21, 55-(1968)] ; brevistin £j. Shoji and T. Kato, J. Antibio-15 tics 29, 380-389 (1976)]; cerexin A C>J· Shoji et al., J. Antibiotics 29, 1268-1274 (1976)] og cerexin B fJ.

Shoji and T. Kato, J. Antibiotics 29, 1275-1280 (1976)3.

Af disse antibiotika formodes brevistin, cerexin A og cerexin B at være de forbindelser, som er nærmest beslæg-20 tet med de hidtil ukendte A-21978C-antibiotika. De omhandlede A-21978-antibiotika inhiberer væksten af patogene organismer, i særdeleshed Gram-positive bakterier.

Betegnelsen "blanding" benyttes inden for fermenterings-tekniken og i nærværende beskrivelse om en blanding af 25 samtidigt fremstillede individuelle antibiotiske faktorer. Som det vil forstås af fagfolk, som arbejder med antibiotisk produktion ved- fermentering, kan antallet og blandingsforholdet af individuelle faktorer, som produceres i en antibiotisk blanding, variere i afhængighed af de 30 benyttede fermenteringsbetingelser. I A-21978C-blandingen er faktorerne C-^, C2 og hovedfaktorer, mens faktorerne Cq, C4 og Cg er mindre betydende faktorer. Herudover indeholder A-21978-blandingen mindre mængder af faktorerne A, B, D og E.

2 148918

De antibiotiske forbindelser, som opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, betegnes under et som A-21978-antibio-tika. X diskussionen af forbindelsernes anvendelighed benyttes for simpelheds skyld betegnelsen "A-21978-antibio-5 tika" som fælles betegnelse for A-21978-blandingen, A-21978C-blandingen og A-21978-C-faktorerne CQ, C^, C2, C^, og Ccj samt de farmaceutisk acceptable salte deraf.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker Streptomyces roseosporus NRRL 11379 eller 10 en mutant deraf med væsentlig samme egenskaber i et dyrkningsmedium, indeholdende assimilerbare carbonhydrat-og nitrogenkilder samt uorganiske salte under neddykkede aerobe fermenteringsbetingelser og skiller A-21978-blandingen eller et salt deraf fra dyrkningsmediet og, 15 om ønsket, isolerer en blanding af A-21978 faktor Cq, C^, C2, Cg, og C,, fra A-21978-blandingen, eventuelt i form af et salt, og ligeledes om ønsket, fra denne blanding isolerer en eller flere af de enkelte faktorer Cq, Cx, C2, Cg, og Cg, eventuelt i form af salte 20 heraf.

De medfølgende figurer viser absorptionsspektrene (optaget i KBr-tabletter) af de nævnte A-21978C-antibioti-ka (i form af natriumsalte) på følgende måde:

Figur 1 - A-21978C-blanding 25 Figur 2 - A-21978C faktor Cx

Figur 3 - A-21978C faktor C2

Figur 4 - A-21978C faktor

Figur 5 - A-21978C faktor Cq

Figur 6 *· A-21978C faktor 30 Figur 7 - A-21978C faktor C5 A-21978C-faktorerne er som nævnt nært beslægtede, sure cycliske polypeptid-antibiotika, som bærer en fedtsyre- 3 acylgruppe ved den terminale aminogruppe. Ved hydrolyse gav hver af faktorerne følgende aminosyrer: 146916

Aminosyre Antal mol * asparaginsyre 4 5 glycin 2 alanin 1 serin 1 threonin 1 tryptophan 1 10 o mi thin 1 kynurenin 1 3-methylglutaminsyre 1 6 en af disse kan være asparagin idt kan stamme fra 3-methylglutamin 15 Hver A-21978C-faktor indeholder en fedtsyre. I den følgende tabel I er anført antallet af carbonatomer i fedtsyren samt identiteten af denne i de tilfælde, hvor identiteten er kendt, for hver A-21978C-faktor.

TABEL I

20 Fedtsyre A-21978C- . . Indhold af faktor_carbonatomer_Identitet

Cl Cn 8 -methyldecansyre

Cg C12 10-methylundecansyre 25 C^ Cj^ 10-methyldodecansyre C0 C10 C4 C12 ----- C5 C13 4 148918

Subtraktive Edman-nedbrydningsreaktioner tyder på, at tryptophan er den N-terminale aminosyre og at den næst-nærmeste aminosyre er en asparaginsyredel.

Gaschromatografiske massespektrale studier af A-21978C faktor 5 C2 angiver, at en af de to følgende sekvenser kan være identisk .med strukturen af denne faktor (Asx angiver asparagin-syre eller asparagin, og MeGlx angiver 3-methylglutaminsyre eller 3-methylglutamin): 0 jj 1) O-Qi^C-N-Trp - Asx - Asx - Thr - Gly - 10 Orn - Asx - Ala - Asx - Gly - Ser - MeGlx - Kyn

, S H

2) C-^-jI^C-N-Trp - Asx - Thr - Gly - Om - Asx -Ala - Asx - Asx - Gly - Ser - MeGlx - Kyn

En enzymatisk hydrolyse af A-21978C faktor C2 ved anvendelse af carboxypeptidase Y har bekræftet, at den C-terminale ami-15 nosyre er kynurenin og at den C-terminale C00H-gruppe kan forestre hydroxylgruppen i threonin-delen.

På basis af de ovennævnte studier må det formodes, at de omhandlede A-21978C-antibiotika har følgende struktur: , L-Asp

V

D-Ala Gly t 4f L-Aso D-Ser ^ 4,

L-Orn 3MG

4.

Giv L-Kyn \ / L-Thr t L-Asp L-Asp 4» L-Tro

NH

!

R

5 148918 hvori 3MG betegner L-threo-3-methylglutaminsyre og R betegner en specifik fedtsyredel, idet faktorernes R-grupper er følgende: A 21978 faktor R-gruppe 5 C-j^ 8-methyldecanoyl C2 10-methylundecanoyl 10-methyldodecanoyl C0 C10 -alkanoyl *

A

2“alkanoyl 10 C-^-alkanoyl * A Identiteten er endnu ikke fastslået.

A-21978C-blandingen og dennes faktorer (i form af natriumsalte) er opløselige i vand og i svire og basiske opløsninger undtagen ved pH-niveauer på under ca. 3,5. Endvidere 15 er forbindelserne opløselige i lavere alkoholer såsom methanol, ethanol, propanol og butanol, samt i dimethylformamid, dimethylsulfoxid, dioxan og tetrahydrofuran. Forbindelserne er kun svagt opløselige eller uopløselige i acetone, chloroform, diethylether, benzen, ethylacetat og carbonhy-20 drider. Saltformerne af A-21978C-blandingen og faktorerne er opløselige i vand, methanol, dimethylformamid og dimethylsulfoxid, men uopløselige i opløsningsmidler såsom ethanol, butanol og dioxan.

I den efterfølgende tabel II er anført den omtrentlige pro-25 centvise grundstofsammensætning af natriumsaltet af hver af A-21978C-faktorerne.

148918 -p

Φ VD H t" O VO

d [s is σι φ o> rF' § oj J in in o' ® ° Pn m h cvi -p ø os m <r vd n -d h m m ο o

Vk tk A n 4 vd m m h &i in h oj

KV

o v ø

w 4 co σι m \D

ω 4 cm w vo m S{ *) ·. « η n ω in vo m in h pq in H cm -p ø m σ n Η o d is σ o oo 4 . <\ »1 Λ Λ ·> rrT p cvi m 4. in h ϋ 1¾ in h cm *p

0 N in vfl VD VD

d co o vo co in S3 - ---- d h vo m in cm h in h cm g 1 +3 b£ C"- rt H -4 00 .,±4 0 rl CVI 4 to m 10 S-i ·*·»·»·*·« ch id m vd m in h i Pd m H cm h Q.

h co

•IN

kJ σν -P „ )iq η· ® s m co o m

pq cm t) -4 σ\ m Η O

<i rC"1 d cvi in m 0 cvi ° fe in h cm -p ω d £a£ CTv -4 CM VO CF\ 0 co h in o m

Pi - - ~

0 cm 0 m vo H

pq in H cm

-P

0 is- m m -4 h d o cn is- co -4 c~| »k «k ft ft ft 3 cm in cm in m fe in h cm m ti

0° -P U

u © 0 d ty-j IK H S in (0 O <Η

0 VD O VO CM -4 -H

S_j *1 Λ Λ H Λ rD

0 CM vo in vo H

pq in h cm S

o ω 'η "M s ο S3 S3 0 -p ØØS +3 ra s3 «) so S3 3 id Ό O O O 0 -H 0 S3 p sq sq UO sq p d fq -d -p ί>> -p sq 0 >> -π x co

C5 Ο Λ S3 O S3 *W

7 148918 IR-absorptionsspektrene af A-21978C-blandingen og faktorerne (som natriumsalte) optaget i KBr-tabletter er vist i figurerne 1 til 7. I tabel III er vist de mest karakteristiske absorptionsmaksima for blandingen og for hver 5 af faktorerne.

8 148918

U

ω u ο

-P

X

cd «Η Μ ω ω d &ο oiAooomido in in ιλ in 0 o4ri<finw-iai η in in m mmoffiffliom-im cm η o c-

d O N'\ff'\CMCMHHHH HHH

Φ &0 d •h oooomininin o o m o d Ninwininnimoi n vo id <f d -imocncocoin-iin cmhoin

M Cd O fOt^CMCMHHHH HHH

M H

Η & H u οοοίΛΟίηοίΓι in ο o in Η ω ri<friininininai w id 10 <f pq in tnmocncocDin-itn cm η o in < cn o mmNWHHHH hhh

EH H

CM I

< oooominoo m o m m

HinH-fiommo cm vo co sh nimouioDcom<f<r cmhoin

CO D .mtnNWrlHrlrl HHH

H

i oooooltvoiti oomm S o<fH<rinminoi cm vo vd <i- ο Ηΐηοσιφίΰΐη-ίΐη cmhoin

W O KnfOiCMCMHHHH HHH

cd s •h oooooocnm m m o in ra οιηπ-ίιη-ί-ίσι h m vo <! Λ! omomcoiom-im cmhoin

Cd O mmCMCMHHHH HHH

S

od

H

bO

d

•H

d ΟΟΟΟίηΟΟΙΤλΟΟΟΙΑΙΑΙΡιΙΑΟΟ co HinH^in^inoiH-icO' ιο-ί-ίΐηπ H tnocricou)in<hintnniHONU)inin PQ mtncMCMHHHHHH HH

9 148918

De omtrentlige molekylvægte og molekylformler for A-21978C-faktorerne er anført i tabel IV.

TABEL IV

A-21978C-faktor molekylvægt formel 5 C0 1622 C72H100N16°27 C1 1636 C73H102N16°27 C2 1650 C74H104N16°27 C3 l66Zf C75H106Nl6°27 C4 1650 C74H104Nl6027 10 1664 C75H106Nl6°27 I tabel V er anført absorptionsmaksima for det ultraviolet-te absorptionsspektrum af hver af de tre mest betydende A-21978C-faktorer (i form af natriumsalte) i neutral ethanol.

TABEL V

15 UV-maksima (neutral ethanol) «i# _Elcm__ nin · 223 307 303 300 260 62 62 63 280 39 41 42 20 290 35 36 38 360 33 33 32 I tabel VI er anført elektrometriske titreringsdata bestemt i 66# vandig dimethylformamid (DMF) for de tre mest betydende A-21978C-faktorer samt A-21978C-blandingen (i form af natrium-25 salte).

10

TABEL VI

148918

Titrering (66% DMF) A-21978C oK -værdier * - f a

Faktor Οχ 44 5,7, 5,9; 7,2, 7,6 5 Faktor C£ 44 5,8, 5,93; 7,6, 7,63

Faktor C3 44 5,73, 5,75; 7,54, 7,58

Blanding 5,62j 7,16 A Alle har mindre grupper ved 11,5-12 AA To bestemmelser 10 De optiske rotationer af A-21978C-faktorerne (i form af natriumsalte), r bestemt i vand er anført i tabel VII.

L“Jd

TABEL VII

Optiske rotationer A-21978C-faktor Rotation 15 C0 +11,9° (c 0,7, H20) 0χ +16,9° (c 0,7, H20) C2 +18,6° (c 0,9, H20) C3 +20,9° (c 0,4, H20) C4 +14,8° (c 0,7, H20) 20 C5 +17,9° (c 0,7, H20) A-21978C-faktorerne kan adskilles ved højtryksvæske-chromatografi (HPLC) under anvendelse af følgende betingelser: 11 148918

Kolonne : glas, 1 x 21 cm

Pakning : silicagel/C^g (Quantum LP-1)

Opløsningsmiddel : vand:methanol:acetonitril (95:30:75) indeholdende 0,2% eddikesyre og 0,2% 5 pyridin

Detektor : UV ved 285 nm

Tryk : 100 psi (7 kg/cm2)

Retentionstiderne for A-21978C-faktorerne (i form af natriumsalte) er anført i tabel VIII.

10 TABEL VIII

Retentionstider (HPLC) A-21978C- Tid Bioprøve (Micrococcus luteus) faktor minutter _(enheder/mg) C0 6 966 C1 8 1663 15 C4 9 1410 C2 13 1390 C5 14 1246 C3 19 803 A-21978C-blandingen kan adskilles og skelnes fra A-21978 20 faktor A, B, D og E ved anvendelse af tyndtl ag s chromat o gr af i (TLC) på silicagel. Et foretrukkent opløsningsmiddel-system til dette formål er acetonitril og vand (3:1)> og en fore-trukken .détekiionsmetode er bioautografi med Micrococcus luteus. De omtrentlige Rf-værdier af disse A-21978-fakto-25 rer (i form af natriumsalte) er anført i tabel IX.

TABEL IX

12 148918 A-21978-faktor R^-værdi A 0,66 B 0,57 5 C-blånding 0,31 D 0,51 E 0,48

Faktorerne i A-21978C-blandingen kan mest bekvemt adskilles og skelnes fra hinanden ved anvendelse af tyndtlags-10 chromatografi på silicagel (Quantum, C18). Et foretruk-kent opløsningsmiddel-system består af vand, methanol og acetonitril i forholdet 45:15:40 indeholdende 0,2 procent pyridin og 0,2 procent eddikesyre. Til detekteringen kan benyttes ultraviolet langbølgelys (365 nm). De omtrent-15 lige Rf-værdier for A-21978C-faktorerne (i form af natriumsalte) i dette system er anført i tabel X.

TABEL X

A-21978C-faktor R^-værdi C0 0,71 20 0χ 0,64 C2 0,56 C3 0,47 C4 0,63 C5 0,53 25 A-21978C-faktorerne og A-21978C-blandingen udviser stabi litet i opløsninger med pH-værdi på 2-9 ved 5°C og 25°C i mindst syv dage. Forbindelserne er ustabile ved pH 11 efter fire timer (total inaktivering) ved både 5°C og 25°C.

13 148918 A-21978- og A-21978C-blandingerne og de individuelle A-21978C-faktorer CQ, C^, C2, Cy og er i stand til at danne salte. Sådanne salte er nyttige, f.eks. til adskillelse og rensning af blandingerne og de indi-5 viduelle faktorer. Desuden er de farmaceutisk acceptable salte specielt anvendelige. Farmaceutisk acceptable salte er salte, hvori toxiciteten af forbindelsen som helhed ikke forøges over for varmblodede dyr i forhold til forbindelsen på ikke-saltform.

10 Det bemærkes, at de omhandlede A-21978-antibiotika indeholder helt op til fem frie carboxylgrupper, som kan danne salte. Der kan derfor dannes partielle, blandede og fuldstændige salte. Ved fremstilling af disse salte bør man undgå pH-niveauer større end 10 på grund af 15 forbindelsernes instabilitet på disse pH-niveauer. De omhandlede A-21978-antibiotika indeholder også to frie aminogrupper, og de kan derfor danne mono- eller di-syre-additionssalte.

Farmaceutisk acceptable alkalimetal-, jordalkalimetal- og 20 aminsalte samt syreadditionssalte er særligt anvendelige. Repræsentative og egnede alkalimetal- og jordalkalimetalsalte af A-21978-antibiotika omfatter natrium-, kalium-, lithium-, cesium-, rubidium-, barium-, calcium- og magnesiumsalte. Egnede aminsalte af A-21978-antibiotika omfat-25 ter ammoniumsalte samt primære, sekundære og tertiære alkyl- ammoniumsalte med 1-4 carbonatomer i alkylgruppen og hydroxy-alkylammoniumsalte med 2-4 carbonatomer i alkylgruppen.

Som eksempler på illustrative aminsalte kan anføres de salte, som dannes ved at omsætte et A-21978-antibiotikum med 30 ammoniumhydroxid, methylamin, sec-butylamin, isopropylamin, diethylamin, diisopropylamin, ethanolamin, triethylamin, 3-amino-l-propanol eller lignende.

De kationiske alkalimetal- og jordalkalimetalsalte af 14 148918 A-21938-antibiotika fremstilles ved de metoder, som almindelig anvendes ved fremstilling af kationiske salte. F.eks. kan man opløse A-21978C faktor på' fri syreform i et egnet opløsningsmiddel såsom varm methanol eller ethanol, 5 hvorefter man til denne opløsning kan sætte en opløsning indeholdende den støkiometriske mængde af den ønskede uorganiske base i vandig methanol. Det herved dannede salt kan isoleres ved velkendte metoder, f.eks. filtrering eller bortdampning af opløsningsmidlet.

10 Saltene, som dannes med organiske aminer, kan fremstilles på lignende måde. F.eks. kan mian sætte den gasformige eller flydende amin til en opløsning af A-21978C faktor i et egnet opløsningsmiddel såsom acetone. Opløsningsmidlet og den overskydende amin kan fjernes ved inddampning.

15 Repræsentative og egnede syreadditionssalte af A-21978-anti-biotika omfatter salte dannet ved standardreaktioner med såvel organiske som uorganiske syrer såsom saltsyre, svovlsyre, fosforsyre, eddikesyre, ravsyre, citronsyre, mælkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, cholsyre, slimsy-20 re, D-glutaminsyre, d-camphersyre, glutarsyre, glycolsyre, phthalsyre, vinsyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, methansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, picrinsyre, benzoesyre, kanelsyre og lignende syrer.

Det er velkendt inden for den veterinære farmaci at formen 25 af et antibiotikum almindeligvis ikke er af stor betydning, når et dyr skal behandles med antibiotiket. I de fleste tilfælde vil de nærmere betingelser inden i dyret ændre medikamentet til en anden form end den form, hvori det blev indgivet. Saltformen, på hvilken medikamentet kan indgives, 30 er derfor ikke af større betydning. Imidlertid kan man vælge saltformen af forskellige grunde såsom økonomiske grunde, bekvemmelighedsgrunde og toxicitet.

U8918 15

MIKROORGANISMEN

Mikroorganismen, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er undersøgt og karakteriseret af Frederick P. Mertz og Ralph E. Kastner fra the Lilly Research 5 Laboratories.

Mikroorganismen, som er anvendelig til fremstilling af A-21978C-antibiotika, blev isoleret fra en jordprøve opsamlet på Mount Ararat, Tyrkiet. Denne organisme kan klassificeres som en hidtil ukendt stamme af Streptomyces 10 roseosporus, Falcao de Morias and Dalia Maia 1961. Denne klassifikation er baseret på en sammenligning med udgivne beskrivelser £r.E. Buchanan and N.E.Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology," The Williams and Wilkins Company, 8th. Ed., 1974; og E.B.Shirling 15 and D.Gottlieb, "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces," Intern. Journal of Systematic Bacteriol, 808-809 (1972)].

Denne klassicifikation er baseret på de metoder, som er anbefalet for Streptomyces Project (ISP) [E.B.Shirling og 20 D.Gottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces

Species," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)] sammen med visse supplerende forsøg. Udnyttelsen af carbon blev bestemt på et ISP nr. 9 basismedium, hvortil der var sat carbonkilder til opnåel-25 se af en slutkoncentration på 1,0%. Disse carbonkilder blev steriliseret ved filtrering, og basismediet blev steriliseret ved autoklavering. Pladerne blev aflæst efter 14 dages inkubation ved 30°C. Cellevæggenes sukkerarter blev bestemt ved anvendelse af en modifikation af den af 30 Lechevalier beskrevne metode (M.P.Lechevalier: "Chemical

Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera"., seminar støttet af the Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology og ledet af Thomas G.Pridham afholdt på the Institue of Microbiology, Rutgers 35 University, The State University of New Jersey, New Brunswick, 16 148918

New Jersey, 1971.)· Isomeren af diaminopimelinsyre blev bestemt ved anvendelse af metoden beskrevet af Becker et al. [B.Becker et al., "Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of 5 Whole Cell Hydrolysates," Appl. Microbiol. 11, 421-423 (1964)]. Aminosyreanalysen blev bestemt med vaskede cellevægge fragmenter. Melanoidpigmenter blev bestemt ved anvendelse af XSP No.l (trypton-gærekstrakt-væske), ISP No.6 (pepton-gærekstrakt-jern-agar), ISP No.7 (tyrosin-10 agar), ISP No.7 (tyrosin-agar), ISP No.7 modificeret (ISP No.7 uden tyrosin) og en tyrosinprøve [Yuzuru Mikami et al.: "Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces," Intern. Journal of Systematicacteriol.

27(3), 290 (1977)]. Stivelseshydrolysen blev bestemt ved 15 at undersøge tilstedeværelsen af stivelse ved hjælp af iod.

Temperaturrække, NaCl-tolerance, pH-område og antibiotisk følsomhed blev fastlagt ved hjælp af ISP No.2 agar-medium. Temperaturrækken var følgende: 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 og 55°C. NaCl-tolerancen blev målt ved at sætte NaCl 20 til agar-mediet i følgende mængder: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 og 12%. Derefter inkuberedes ved 30°C. Bestemmelsen af pH-området blev foretaget ved at justere agaren fra pH 3,0 til 11,0 med stigninger på 1,0 pH-enhed umiddelbart før udhældning. Den antibiotiske følsomhed blev bestemt 25 ved afvendelse af følsomhedsskiver anbragt på de podede agarplader.

Farverne blev navngivet i overensstemmelse med ISCC-NBS-me-toden (K.L.Kelly and D.B.Judd: "The ISSCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S.

30 Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C. 1955).

Det i parentes anførte refererer til den af Tresner og Backus udviklede farveskala (H.D.Tresner and E.J.Backus: "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy, "Appl. Microbiol. 11, 335-338 (1956)). Farveregister-betegnelserne er 35 understreget. De af Maerz og Paul indførte farveblokke er 17 148918 anført i kantede paranteser (A.Maerz and M.R.Paul: "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, Inc.,

New York, N.Y., 1950).

Karakteristik af den A-21978-producerende stamme. ij Mdrphologi.

Morphologien af kulturen A-21978.6, som er den kultur, der producerer A-21978-antibiotika, består af sporophorer af Rectus-Flexibilis-klassifikationen (RF). Sporekæderne indeholder mere end 10 sporer pr. kæde. Sporeoverfla-10 den er glat.

Kulturen A-21978.6 er karakteriseret ved, at den producerer et luftmycelium af overvejende rød farve med en rødbrun bagsidefarve. Et lysebrunt vandopløseligt pigment er ligeledes tilstede. Disse karakteristika viser sig på 15 tre ud af 14 agarplade-medier (ISP No. 2, ISP No. 7 og TPO);. Disse tre medier er de eneste, som giver rigelig luftig og vegetativ vækst.

To agarplade-medier, ISP No. 4 og glucoseasparagin-agar, producerede et luftmycelium med en hvid til grålig farve 20 og gul bagsidefarve. Her observeredes ikke noget vandopløseligt pigment. Disse to medier gav god, omend ikke rigelig, luftig og vegetativ vækst.

Der benyttedes ni andre agarplade-medier, men disse gav ringe eller slet ingen vækst og sporedannelse. Når et 25 luftmycelium, omend sparsomt, var tilstede, havde dette en farve i området fra hvid til grå.

Melanoid-pigmenter er ikke tilstede. De væsentligste bestanddele i cellevæggen er LL-DAP, glycin, glucose og ri-bose. Dette indikerer en cellevæg af type I og et sukker-30 mønster af type C (R.E.Buchanan and N.E.Gibbons, Eds., r, 18 148918 "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The William & Wilkins Company, 8th Edition, 1974, p. 658).

De følgende fem kulturer blev ved laboratorieforsøg sammenlignet med A-21978.6: 5 Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891 Streptomyces moderatus ISP 5529: ATCC 23443 Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497 10 Disse kulturer tilhører den hvide og røde farveserie, de har en sporophora-morphologi af RF-typen,- en blød spore-overflade, og ifølge TSP-beskrivelseme er de melanin-negative, og de har ikke en tydelig bagsidefarve, ligesom de ikke indeholder vandopløselige pigmenter. Disse karakteri-15 stika, sammenholdt med carbonudnyttelsen og andre sekundære egenskaber, svarer til de karakteristika, som udvises af kulturen A-21978.

Da disse kulturer blev sammenlignet med A-21978.6 under laboratoriebetingelser, blev fire af dem afvist. Streptomy-20 ces candidus og Streptomyces setonii udviste et gult luftmycelium på mange medier, hvorved disse kulturer afviger fra kulturen A-21978.6. Streptomyces albovinaceous og S-trdptomyces moderatus udviste en mørk, tydelig bagsidefarve og vandopløselige pigmenter, og disse kulturer produce-25 rede melanoid-pigmenter. Alle disse egenskaber er forskellige fra kulturen A-21978.6. ISP-beskrivelsen af Streptomyces moderatus nævner en rødbrun eller kraftigt brun bagsidefarve, men en sådan egenskab nævnes ikke for Streptomyces albovinaceous. Ingen af kulturerne er anført som 30 melanin-positive.

Kulturen A-21978.6 blev derfor klassificeret som en stamme af Streptomyces roseosporus, Falc'åo de Morias and Daliå 19 148918

Maia 1961. Denne klassifikation blev baseret på sammenligning med udgivne beskrivelser samt på direkte sammenligningsforsøg i laboratoriet. De følgende karakteristika opsummerer resultaterne af den direkte sammenligning af 5 kulturerne.

20 148918 \ Φ ΙΑ X cvi Μ ·< Η -Η 2 ΙΑ φ ρ 3

• Ό \ I

ω ρ ·η Ρ t-

3 φ ρ, ·Η <f fA

Ρ Ti O H •'CO

O æ r!sj 1>^ CVl ^

p S ra o H

ra o !*!

o Ρ Η X

φ · ,y ·η h

m Ρ ·Η -P O fA

O φ S Λ Λ Ρ Η 3 Φ Η Η to ο ω • ρ Ρ 3 ι m η -ρ 3 ο- ρ χ η σ\ ra φ Η ·> Η < Ο ρ φ φ Η Φ η η φ £ φ Ρ Ρ φ φ 'Η Τ3 •Ο ρ αί φ ns

Β Η X

Η mm ο ~ Ό

Ed φ φ bo !> fe ο <! ·Η Ρ -Ρ

b£ ^ S

hd ο Φ Η Η S -Ρ

ΕΗ Ο Φ Φ S

CQ ,Ρ ti φ Φ HP 3 Ρ \

Pi ρ „ VO

Η Ο ^ -Ρ

Η S fe Φ CM

Μ S Η Φ I

<| ^ bo Η O'er! Φ <3\

<£ Φ Φ > S

fcd d d 0 3 0 Φ Φ \

-PH Η 00 X

bO <Η ·Η C"- 3 Ρ -Ρ - ΪΝ ρ φ η σ> ί> φ ·> Η Ο bo X Ο

•Η Φ Ρ I

-Ρ Ρ Φ ΙΑ ΙΑ

Ο Η 00 VO

Φ Ρι Η - - bO CQ <ί Ο -Ο •Η Η • ·· Φ Ο -Ρ Ρ Η ·Η VO Ο * Ρ . Λ * ·· m ·· οο ρ ρ ρ a φ |>- Ο Φ Φ Φ d ο> Ρ Ρ Ρ ρ «Φ Η Ο Ο Ο Ρ Ρ cm ρ ρ ρ φ a < mm οο ο ο 148918 _ JJ Η 3 21 1 p 3 t£\ i P -p

3 hObiK ω φ P

ίπ ω o 5 bo !> φ ,α d ω ω £ 3 -π s ρ i -Ρ ·η _i φ Η δ 3 Φ Ρ > Η Hq, Ρ Ο Ή ω Ρ Ρ S «I® α oV> o p.

> ø i φ ρ g i—i uTh cq ω

P &0 H bO 3 bO II N uj >> >> -P

cd P 3 Ρ Ρ ·Ρ Γ· ffl φβ H HbO

&. Ή SO -HOP, |3 O jjB) _ 'Η

w Η d.T ΦΙ H

-P +> t-ji .53, ϋ Φ bo bo p* ΚΛ| I—1 ra φ ·Η ·Ρ N 8 3 Η Η ι-ί Η ρ ω φ ο cm ft ο ra to ffj Η Ο ο SS — 1—1 ω Η Η ^ -Ρ ο Ρι Ρι ρ . „ .. 3

Φ Ο-Ρ Ο Φ bObOP

Μ Ρ bt ^-ν ·Η ·Η Ρ

ο 43 p +> φ p -ΡΦΦΦ Ρ Η HP

ρ 01 Φ ΦΟ Φ Ρ Φ i bObO Φ Φ ΦΦ X bo -d-Ρ b0 bO >+> -Ρ ρ Ρ bC bo b0 Φ . æ Ρ Ο Ρ ·Η ρ 8 Ρ Μ ·Η ·Η Cd ·Η -Η >> CQ > ·Η bO-rl p] ·Ρ ·Γ3·Η Cd Ρ Ρ I Ρ Ρ Η Ρ -Ρ +3 Μ οι cd Λ! Ρ ν! Φ -Ρ +> ρω φ 8 -y ω b£ Φ +3 I -....... +3 - Ρ g η Ο Ο Φ

«Η Ρ -Ρ S

ρ φ ρ I

φ ,« F Ρ -ρ ώ & ^ ρ æ s 5 3 t> EH .o g

E-i >- -P w ,, ^ R

J -p Cd -P bO

£> oi m- H --Η Ρ P CM ·Η 0 ω Φ s Φ Pi d 9-i »PS*

Eu o Ve obDbOO -P

<J P o S φ ·Η !3 bo φ +3 ω p, -p

y H P"PØh!>»Pi rH

H 3 Φ p CO Η -P CQ Φ

EH eb W Φ H i bO H CQ

CQ S Η H S

H bO 3 Η H

c£ d +3 d ·Ρ bO Φ Pi m s P s Pi ωω d o

Ep ρ Φ P rad «ρ®.

[ad Φ S Φ +3 d >5 Η Ρ P +3 +3

<j ω bo ω bO -HHPi bO Φ Η P

2 >a-H >> -ri > O ,® P 3 2 Η Pi Η Η Λ ' ' rQ [>, i '3 Ρ Μ φ Η -Ρ ϋ Η Ο Ρ,Ο φ ιο -Ρ ιο ω φ| <! Φ ιλ| ι Η,Ω Φ

> pbO p S ^ 0+3 Η PtiB

ρ «φ 3 ·ρ °φ 3 η IS Η Ρ ttl ί IASl>i Φ Ρ Ρ Η Ρ Ρ ft ' ι—> ·Η ν-/ bO ι—ι Ρ Η tH bO fit φ 60 Ρ Ο ω S +3

Η S

ρ, 3

bO Ο bOP bO bO

•Ρ ·Ρ ,Ω ·Η ·Η +3 Η +3 Η Φ Η Η ω φφ Φ^ΐ Ρ ΦΦ

X d bD+3 d bO Ρ > d bO bO

8 O -Η p O -P S 8 0 -Η -H

> bOP’H bOPS -obO Ρ P

·· ·· ·· ·· gg g g 3 g g g •H ·Ρ ·· ·Ρ ·· *P ·· H 13 H !> rH ^ H l>

\Q Φ -Ρ φ -Ρ φ -Ρ Φ -P

. 0+3 043 0+3 0+3 00 >a Φ r-ίΦ !>>Φ >»Φ in a +> a+3 a+> a+> cn +3 φ +3 φ +3 φ +3 φ

H «HbO «HbO «HbO «HfaO

CM 3 CD 3 Φ 3 Φ 3 Φ •ai i-5> i-5> i-5> i-5!> ϊ 148918 22 a +3 +3 So d d ·η ø ø ft

S Η S

a 3 so -p

•Η SO ·Η SO

ft 'ft ^ CD p-ϊ r4 -P SO d -P HO) SO d SO SO 3 £ H CO I ·Η SO® Η P SO H SO r-l «3 0 Ο ·Η CD Ή ft

d CQ COHM 'dHO

m 60S >> «3 S Τ'0?*.

*3 I Η H S H r" d -r4 d ft .SOft ilSOg CO > S O CM O 3

ft H d Ol i—i . '—1 S

S04-3 fC-J in+3 ,Q[ CVl fil

(D CD 0 M CD U CD

κι-p ra ^ H +3 Ο Ο cq ra hfl H ft HP ^ H >> d w/ Η ·Η 0 ^ I—I-H — I—Ή s C >

Ο "H

p fn 01 01 o 0 sc so

01 0‘H

O 4-3 CD Η S _ d ra sop <D cd 3 d .

>£j d £ -P Tj SO 6£ρ>·ϋ . æ ·ΓΪ 8 Η Ο ·Η C0 8 0

CQ > SO COSOS I-oSO

rad 43 ·Η 3 g Si 01 .¾ 3

43 ra S

d p->f ·Η cO

o s d P

CH CO 3 ---

v_^ S£ SC CO

CO s os i 2 1 d> M- $ ,

Eh Η H

j 0 43 CH 4-3 O

£ S SCO d S U -P

M 0 0 0 0 ·Η SO

as a 0 >

ft > SOCO a d H

<£ 0 TJ ·γΗ SI ·Η H I CD

P3 Qft<! ft ϋ Ό 01

M wd'-' ^ S ^ S

HI CD +3 +3 ^ ΌΗ fh foi ra so -d- d so in so s ft

CQ rvH s τ4 ·γ4 S O

Η · HH · S Η · H CD

CC O 10O SO CD O »Cd CQ+3 3 a H to *3 imSi-4 ί^-d

ϋ dS HS 42HS

M ft SOH ft dH ft IS

<; DJ O CD ft CQ ttJft CQ 4-3 H CD

Qj Η ·Η WO H 0O H CD d CQ

3 > >j ra H so f>>

W 0 £ HP Ό S+3 »CO H

£> d Ή ΗI d 3 S 1

d C0| 3 > 3 ,Q S043 -P

0 ^ 1—iS d 1—'S ΙΛ H d

ft a CM.Q H fQ Η 1—'3 CD

C <0 pi ρφ issoa

0 CQ /—s O CO ^ffloø&O

H !>i |S H {>5 a^S-P

1 _i|-4 ^ i—ir-4 1—1 SO ft

-P

j!j ^ > Ό ti £ ·3 8 8 8 ο ο 8 0

}> ·Γ3 ·ο SO SO *θ SO

·· ·· ··

gj ! S

•r4 ·· ·Η ·· ·Η ·· rH ί> Η !> γ4 ^ \Γ) 0 ·Η 0 ·γ4 0 Ή . Ο 4-3 Ο 4-3 Ο 43 00 !>> 3 !>> 3 >> 3 ο s 43 a -ρ a -ρ σ\ 4-5 0 43 0 43 0 Η «Η 60 Ή Μ «Η 60 CM 3 3 3 3 3 3 C (3 > η4 > Η > Ρ ti a 148918 S Μ ti Ρ β ·Η S 23 bo

0 ft β -H

cd ω H

>, p m p ø H bo ft bo ω

1 Ή Η ·Η S

HH IH H

0 0) Η H 0 ft bo w β β ω β o bO d & bo b0<9 Si

H 3 H bO bOH β P

0) Η β ft -Η -H ft bOrt «ώ P O HHO ® 8 β β H °0 °0 Ό) « β

Cd bO 3 Ρ β β Ρ <H ft bO

(x, bOfl bO bOfl > Η I

pi 3 3 -Ρ ft i P

Oli—>β rQ|i—ιβ β HHP

ιη| mp o| ft-p ø , 33 β ft ø in| ft ø a ø| bO & 0

03 ^-nH03 HWbO 0 0 S

3 ft H >i οΗ>>·Η Ο i? i? &P

β i—jH ft 1—·Η ft |S ft ft-H

O —' '— Η H ft P w o

ø bO bO bO bO

ra ·Η ·Η ·Η ·Η O-P HH HH 00

β ra øø 00 bObO

a bO bO bO bO β β • {β ’Η ·Η ·Η ·Η Ή ·Η CQ |> β β ββ ββ -Ρ 0

W

Ρ β β ο 0 <Η b£ ν— 0 β------ 03 0 -Ρ 0 JD bi β ti -Ρ Εη 0 0 0 β ρ ι a β 2 ρ β ti bo ø--a

a ·Η S ·Η O Ρ β bO

ra β β ft ·η β 0 ή ft Ο 0 3 Ή Øbt β β) <2 β ra β "Ρ η aø 3 t> ft ρ bo ti bo I β-Ρ

a Εη H ti Ή Ο ·Η Ρ Ρ bO

Η w ι ®Η a ft 0 Tj-H

EH Η β 0 Η ®Η CQ IN β Μ W -Ρ0 βω η ω ρ si - boa ra

ft · bD 0 Η -Ρ H S -Ρ S

ft Ο ·Η β ft Ρ Η 3 ØH

Εη ΡΗ0Ο0β0·Η ββ) a oø ti β 3 ra o øo <t ft β op β βει η ti

od CQ bo s ϋ 0 ,ΟΗ 0 O-P

<; h 3m ifto ag a ρ β ho 3 O i—·Ρ 3 1—'β ø in| cm ø i bo-Ρ i ojp > na løø i h ø β ^ ft β i a-P l ft ra ø ft N si i !>>β 1 N- ft ft ^ i—i a I Η ·Η I 1—Ή ω ω Η ·Η Ρ Η Η βω β ra øø ø bo 0 β a bO bO bO β bo > æ -HH β ·η β æ ί> β β ·Η β ·Η Ό • ft *· ·· •Η ·· ·Η ·· Ή ·· Η > Η > Η ί> \0 0 ·Η 0 Η 0 ·Η . Ο Ρ Ο Ρ Ο Ρ 00 ft 0 ft 0 ί^0 in a ρ a ρ a ρ CTi PØ PØ PØ H <H bo «Η Μ P bo <M 3 0 β 0 β 0 C ft > ft > ft ft 148918 24 ti Ό ø § a

in bO

<D P

® ft ^

>5 S

HP ® I bO 0

Η Η P bO

! I 3 3 Η I, ,,

I I bO bO Φ HP

Φ ll bO bora 0 d > ll ρ P S bO 0 ?h I t Η Η H TS Φ a

to I I 0(0 »CO (¾ P w bO

fe II i fi O > >>P

bO bO ri HP) I - .

ril 3 bO

ra o i—i μ Ή ti iA iftri Η 0 Η ω 0 ο ^ Η φ ra ft Ρ3 Η >> ri 1-1(3 Μ ι—ιΗ ' · CM Η ο !s PQ ft 0) bO bO —' CM Ο IQ Ή Ή Η Ο -Ρ ti S3 Η Η ·—'Ρ

Cj CQ 00 00 0 0 ij bObO bObO > T3 Ρ * 8 Cl S3 ·Η ·Η 8 O 0

/—J Μ ί> ·Η ·Η ίι ίπ ·<"3 bOP

Ρ cd ra Ρ 0 ο ΰ t, bil cd Λ S3 Μ s ρ cd Η 0 ι

ri S S

CD S Ή

g H bC

p. cd fe o-- ø - <; C) Ri ra ø p ts* - bt ra H ri cd 0

Eh ω w prai H 0 - en n -pø pø p fe O so 0 ra S3 ^ ø ra ø o ø g *h a Ci s o h a

ø bO 0 bO 3 3 bO

K bOP a PH bOP

<S ' Ρ P ft fe I ft C5 bOft

W ’ 0 0 Η I P

> bl ti tip I Ρ HP

Sh <| PPbO I >—'bO oø bO

ø > > P i VO P ti Ch P

fe ri ri Η I ri Η P bDH

0 ΙΆ 0 >0 ra H ra ri 1—1 ® 01 S ljS cm s

•'—c H H ri M H

IS ft ft O AI ft

w o bo O IS H O

Ρ i—i

P ØøP øHP P

ra bO bOØ bO 0 0 0

ri S3 S3 P S3 bOP ri -d P

æ ρ p ø ρ p s3 o o S3

t> Ρ PP P S3P bo bOP

·· ·· ·· p ·· p ·· P ·· H !> H !> H >

vn 0 P 0 P 0 P

. O P OP OP

CO >j 0 >5 0 >» 0 a p a p a p m pø pø pø

H <H bO sh bO P bO

cm 3 0 3 0 3 0 < ri > ri > ri > 25 * 148918 <s> u ω m >»

«β H

U I

P UO H

β I 3 η o H no β ω So Ιο Sop η β ίϋ > ϋω-Η 'd φ β η ρ φ P -wrap, ·Η Μ 0) ·ίβ Hfi β > >, > >>Β β 3 no

Cn p Η Ρ Λ hS no WM

ra no h ft 3 H Pi β H ,+3 ο ω p p| no β 03 no Οι I—frl

03 i—i® Η ΙΓ\| NH

O P| N"\H H 1-5 Φ Φ λ β3 ci Φ ^ Nil ω !soo ω Pd H <a

O ·— H S — i—iH

P I—+> P| H Pi β pi, no no o • no no 3 ^ ο «η ·η

CQ ·Η Η p v-^ Η HP

-P H HP +3 0) Φ£! m φφφ β φ no no β .id no no to !> ·ϋ p hhs æ ·η·η!>, æ ο β β β a > ρ ΡΗ ·ο non ο Ρι ΕΗ /—si s—" +1 β

φ cO

ω ρ η: •Ρ to td ρ nc i ο to Η l·! i Ρ Φ ^ β cd a •η nc φ cd ο cd Ρ Ρ > i _>--:-- εη Η-η β τ) Η nc φ ρ s ρ ·ϋ i Ρ S ι το to φ β η -ρ w (χι Η 3 a ra >, β C ο Ρ μ cd Η 3 ρ ρ ηι ρ ι Ρ ,, Μ φ -co-ρ β -μ -μ η ρ ρ η ο ρ β ·Η β β β «0 3 η > ηοΦΡ °β φ a no Ρ 2 cq η a æ β a ο no no s η Ο ^i« g ηοηοΕπ-Η no

Pd Ρ ·Η ι ·η η .¾ η pq sp HP »cd Ρ ft

Eh I a I 3 PS

φ ι -Ρ ι nop no a -p 2 > ι no i φ no no

Pd Ρ I ΤΉ I 03 -H Pl ι—Krl

<| cd I CM Η I >>H O CM H

W Ρ ΙΗΦ I Η Φ in! ΗΦ p 03 03 Ρ ω

CO S $ β (DS

ι—ip H '—' ι—>H

Pl p| no o o no no o Η ·Η ·Η Ρ Φ HP β Φ-Ρ Η Η-Ρ to ηοΦβ φ ηοΦ φφβ χ βηο3 no β ρ ηοηο3 ffi Η Ή Ρ β Η β ·Η ·Η Ρ ί> ΡΡΡ Η Ρ ·Η ΡΡΡ ·· ·· Μ •Η ·· ·Η ·· ·Η ·· Η > Η > Hr· φ φ ·Η Φ Η Φ Η • Ο Ρ Ο Ρ Ο ρ GO cd β β a ρ a ρ a ρ σ\ ρ φ ρ φ ρ φ Η <ν ηο ρ no ρ no CM β Φ β Φ β Φ «β Ρ !> Ρ f> Ρ !> 26 148918

Carbonudnyttelse

Substrat A21978.6 S. roseosporus L-Arabinose + + D-Fructose + D-Galactose + + D-Glucose + + i-Inositol D-Mannitol + D-Raffinose L-Rhamnose + +

Salicin + +

Saccharose D-Xylose + + + = Positivudnyttelse - = Negativudnyttelse U8918 27

IQ

p α> P w o >> o P Ho to ο H in O fj H <f <D I I I I I + Ό

IQ >» + I 1 + VO

O ,P

p in in p m

• CD

CQ H

ω

CQ

!>>

H

O O

i£> P o

• Ί0 HO

00 i>j H <f

IS Æ iR

cn IIIII+ +1110

H PH

cm ω in in C H cm

P

•H

IQ

'-n O

fi ϋ.

ω p ^ T3

P I IQ

>« p P

ci Λ P

P CO Η H

P P S -H

CQ P P

Jsi IQ —' IS

0) .Μ P ft P a) to ο o æ p bo s ω æ co p

I 60 I ft CQ

P I P W 60 .¾ Ο P ·Η H fi 8 PPOIQ^ 60 H CD t>

CD ft P Ο P P CQ

PSftP · Ή Λ h ω s PPCDj^-dCDpPH op«

P CDP ftp Ο J> p ·Η O °C0 O CD

X gwwwg S 8 > P PHO

•rt 60 PPCQ-d SPP

P HHCDlSISftP^ii»» Ojsjco

CQ ft· · · · p O H Æ P P P

•Η I OOOO-H'HSCQCDp'dCD

p tj g g g g ΜΦβΦΟΡΦΗ ω·Η oppw°c0c0po

ρ Ο m ft ft ft P-HCDHPPPP

P CQ CQ CQ CQ >> P S CD S CD CO I

CO CO Η H H H E-lCOSr’OftPH

PH HP ·Η I S P O

CO Φ Φ ^ p K Φ Ή li W S O CQ CQ ft EH g g 143918 CO 28 δ ο α co Ο + + I I I + + + <0 C0 ο d 03

VO

C0 E'en + + ι ι + + + + Η

CM

<

Tj τ3 ' φ τ4 - cj ίο β ϋ g=j ο ή ή Ο Ο Η ·Ρ CO ti S ΐ) [>, Ο Ρι Η ·Η 3 ·Η Η 1>> i) s φ Η-ρωβ'ΰΜορι

CH CO OOOtø’HOtøO

Μ dtøof>>-Pddp 34 cd θπ!3>ιΗΡ)·Η·Ρ!>ί CQ Η cd I Η Ο tø S tø Η •Η isi ' -Ρ Ο •Η '5 Τ jp ω 5 § φ Ν tj tø cd co co bo r-4 -P +> si o ·Η ·Η ·Η bObObOdd^ObObO d

H dddddddd C'S

W S. N. W d 32 • tnocMooooo ω ·η o h ro o o H ro ro d £3 d H r\ o ^

o N -H

M CO

bo d d ω •H bo d d tø ·Η -P ^

CO

0 +2 s d d _ -n d 3-Hd pQ-Pd_ ^ tø 34 O-Hd O-Hd S-p •H >, ,d -H d !>> H -H o co -P g-POd’HSOO Μ Ή 0·00>ϊ·ΗΧ0>ι>> η tø •η dHS-P^-Pog „rå ω ja jdcdocdSftcdo 'h d

•H -PiiO-P>itødO

-Pi>.ftdtøHd-Pd II II

d dtø’H^O'Ptød <2 H03ISPiWti!> +i 148918 29

Visse karakteristika for den A-21978-producerende stamme Streptomyces roseosporus NRRL 11379 afviger fra de karakteristika, der er publiceret for Streptomyces roseosporus.

Kulturen A-21978.6 afviger fra den publicerede stamme hvad 5 angår sporestørrelse, vækst på gulerødder og kartofler, NaCl-tolerance og nitratreduktion.

Den kultur af Streptomyces roseosporus, som har vist sig anvendelig til fremstilling af A-21978-antibiotika, indgår i samlingen af stamkulturer hos Northern Regional Research 10 Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, hvorfra den er tilgængelig for offentligheden under nummeret NRRL 11379·

Ligesom det er tilfældet med andre organismer kan også egenskaberne af den A-21978-producerende kultur Streptomyces !5 roseosporus NRRL 11379 variere. F.eks. kan man opnå kunstige varianter og mutanter af NRRL 11379 ved behandling med forskellige kendte mutagener såsom ultraviolette stråler, røntgenstråler, højfrekvente bølger, radioaktive stråler og kemikalier. Alle naturlige og kunstige varianter og mutanter 20 af Streptomyces roseosporus NRRL 11379, som har væsentlig samme egenskaber som denne, og som producerer A-21978-anti-biotika, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Mediet, som anvendes til dyrkning af Streptomyces roseosporus NRRL 11379, kan udvælges blandt en række forskellige me-25 dier. Af hensyn til økonomisk produktion, optimalt udbytte og bekvem produktisolation er visse dyrkningsmedier imidlertid særligt foretrukne. Således er f.eks. tapiocadextrin en foretrukken carbonkilde ved fermentering i stor målestok, selv om glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, bom-30 uldsfrøolie, methyloleat, glycerol, raffineret soybønneolie og lignende også kan anvendes. En foretrukken nitrogenkilde er enzymhydrolyseret casein, men man kan også anvende peptoner fra kødekstrakter, soyabønnemel, soyabønnehydrolysat, groft soyabønnemel, gær og aminosyrer såsom L-asparagin og 30 148918 DL-leucin. Nærende uorganiske salte, som kan incorporeres i dyrkningsmediet, omfatter opløselige salte, som kan frigive kalium-, ammonium-, chlorid-, sulfat- og nitrationer samt lignende ioner. Blandt disse salte er K^SO^ specielt 5 anvendeligt til antibiotisk produktion. Melasseaske, aske-dialysat og syntetiske mineralblandinger er ligeledes anvendelige.

Ved fremstillingen af A-21978-antibiotika foretrækkes det at anvende destilleret eller demineraliseret vand i fermenterings-10 mediet. Nogl.e af de mineraler, som findes i postevand, f. eks. calcium og carbonat, synes at modvirke den antibiotiske produktion.

Dyrkningsmediet bør også indeholde væsentlige sporstoffer, som organismen behøver til vækst og udvikling. Sådanne sporstof-15 fer optræder hyppigt som urenheder i andre af mediets bestanddele i mængder, som er tilstrækkelige til at imødekomme organismens vækstkrav. Det kan være nødvendigt at tilsætte små mængder (f.eks. 0,2 ml/L.) af et antiskummiddel såsom poly-propylenglycol til fermenteringsmediet, hvis skumning bliver 20 et problem ved fermentering i stor målestok.

Til fremstilling af større mængder A-21978-antibiotika foretrækkes tankfermentering vinder neddykkede aerobe betingelser. Små mængder A-21978-antibiotika kan opnås ved dyrkning i rysteflasker. På grund af den tidsforsinkelse i den anti-25 biotiske produktion, som almindeligvis er forbundet med podning af store tanke med sporeformen af organismen, foretrækkes det at anvende et vegetativt podestof. Dette vegetative podestof fremstilles ved at pode et lille volumen dyrkningsmedium med sporeformen eller med myceliske fragmenter af 30 organismen til opnåelse af en frisk, aktivt.voksende kultur af organismen. Derefter overføres det vegetative podestof til en større tank.

148918 31

Den A-21978-producerende organisme kan dyrkes ved temperaturer på mellem ca. 20 og ca. 37°C. Den optimale produktion af A-21978C synes at optræde ved temperaturer på omkring 30 til 32°C.

5 Som det er almindeligt ved dyrkninger under neddykkede aerobe betingelser ledes steril luft igennem dyrkningsmediet. For at opnå en effektiv dannelse af A-21978-antibiotika bør den procentvise luftmætning ved tankfermentering være over 20%, fortrinsvis over 30% (ved 30°C og 1 atmosfæres tryk).

10 Ved tankfermentering foretrækkes det at holde pH-niveauet i fermenteringsmediet i området fra omkring 6,5 til omkring 7,0. Dette kan gøres ved tilsætning af passende mængder af f.eks. natriumhydroxid (på de tidlige trin) og saltsyre (på de senere trin).

15 Produktionen af A-21978-antibiotika kan følges under fermenteringen ved at teste prøver af dyrkningsvæsken eller ekstrakter af de myceliske faste stoffer for antibiotisk aktivitet over for organismer, som vides at være følsomme for antibiotika. En prøveorganisme, som er nyttig ved test af disse 20 antibiotika, er Micrococcus luteus. Bioprøven foretages fortrinsvis ved en papirskive-test på agarplader.

De opnåede A-21978-antibiotika kan, efter fremstilling under neddykkede aerobe fermenteringsbetingelser, udvindes fra fermenteringsmediet ved metoder, der er velkendte inden for 25 fermenteringsteknikken. Den antibiotiske aktivitet, som er produceret under fermenteringen af en A-21978-producerende organisme, optræder almindeligvis i fermenteringsvæsken.

Den maksimale udvinding af A-21978-antibiotika udføres derfor ved en indledende filtrering til fjernelse af den my-30 celiske masse. Den filtrerede væske kan renses ved en række forskellige metoder til opnåelse af A-21978-blandingen. En foretrukken metode omfatter ekstraktion og udfældning til opnåelse af A-21978-blandingen.

32 148918

Yderligere rensning og adskillelse af A-21978C-blandingen og de individuelle A-21978C-faktorer kan udføres ved yderligere adsorptions- og ekstraktionsprocesser. Anvendelige adsorberende materialer til rensning af A-21978C-blan-5 dingen og dennes faktorer omfatter: 1) anionbytterharpik-ser - a) stærkt basiske; polystyren, BioRad AG 1 & 2, Bio-Rex, Dowex 1 og 2, Amberlite IRA 400, 401, 410; b) moderat basiske; epoxypolyamin Bio-Rex 5 og Duolite A30B; c) svagt basiske; polystyren eller phenolisk Bio-Rad AG3, Duolite 10 A-6, A-7, Amberlite IRA 68, IR-45, IR-4B; 2) silicagel; 3) florisil; 4) polymere adsorbener (XAD-2 og 4); 5) en højporøs polymer (Diaion HP-20); 6) Sephadex G-10, G-25 og G-50;.Bio-Gel P-2 og P-10; 7) modfaseharpikser,/silica-gel/C-]_g og silicagel/Cg; 8) carbon; 9) DEAE cellulose, 15 DEAE Sephadex; 10) polyamid; 11) aluminiumoxid; og 12) mi-krocellulose. Leverandører: Bio-Rad og Bio-Gel harpikser - Bio Rad Laboratories, Richmond, Cal.; Amberlite og XAD harpikser - Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa.; Duolite harpikser - Diamond Shamrock Chemical Co., Redwood City, 20 Cal.; Sephadex harpikser - Pharmacia Fine Chemicals AB,

Uppsala, Sverige; Dowex harpikser - Dow Chemical Co., Midland, Mich.; Diaion-Mitsubishi Chemical Industries Ltd.,

Tokyo, Japan; XAD harpikser; silicagel/C-^g og silicagel/Cg - E. Merck, Darmstadt, Tyskland.

25 Alternativt kan man anvende kulturens faste stoffer, herunder mediets bestanddele og mycelium, uden ekstraktion eller adskillelse, men fortrinsvis efter fjernelse af vand, som en kilde til fremstilling af A-21978-antibiotika. F.eks. kan man, efter produktionen af den A-21978-antibiotiske aktivi-30 tet, tørre dyrkningsmediet ved lyofilisering og anvende det direkte til fremstilling af en foderblanding.

A-21978C-blandingen og de individuelle A-21978C-faktorer anvendt i de beskrevne forsøg var alle på natriumsaltform.

A-21978- og A-21978C-blandingerne og de individuelle anti- 33 148918 biotiske A-21978C-faktorer CQ, C-^, C2, Cy og inhi-berer væksten af visse patogene organismer, i særdeleshed gram-positive bakterier. De minimale inhiberingskoncen-trationer (MIC), ved hvilke A-21978C-faktorerne og A-21978C-5 blandingen inhiberer udvalgte bakterier, bestemt ved standard agar-fortyndingsforsøg, er anført i tabel XI.

34 148918 tn tn νΟ νΟ N't ^ Η Η Ο Ο Η ΙΠ| ·> *· » ·» ·» Εη ο I ο ο ο ο ο s in tn _ ni ο η m ο Ή <Η ». ·> ♦> ·>> ·> ΕΗ

Ο I Ο Η Ο Ο Η S

νο tn m tn ο Η <μ η in ο |f\| Μ * fs * ·» ·* ΟΙ Ο Ο Ο Ο Ο <Τ m η tn m ^ h ni h ni o o h mi - - - *· - _r sol OOOOrt-d- - bi ti tn tn

'w' Lf\ O i—i iH tT\ O

’ I-11 ft ft fv ft Λ ·.

’ O O I OHOOOVO

H H

:s in o O ni in o # • ol ·* ·> »··>·> eh

; o I H m o o H S

Ή ' ' tø

' >4 'S

• 1 ' -ri tn m tn m •μι ' >cf H nj r-f Η η ο 1 μ r| λ λ ^ ^ ^ ^ jrj 3 ο ο ο ο ο co

'S 'CP

Η -d- 44 i

in VO

mamc'-in m o Pn -d· O

in to w οι H

o cm ο ø σν Η tn an

01 U) -ri IQ

Μ ri ø a ti ø 3 ο £ ο ο a ø ο ω S ο ø

Sm ο ω ti ο ο £ Ο Ο 0 Ο ,3 ·ρ χι ti ο >> ti ο U ω ο -Ρ ρ, ρ, -μ u -Ρ u to ft ft ο ω øåøtamøgct) ti υ U ti ti b ο -Ρ w ο -Ρ ο ο -ρ Μ) ο ω ο ο CQ ω 0 ο ο ο a 44 s ο Q ο ο m -ri 44 ω Η ο ο 3 fti ·η •η >, ø -μ -ρ a ø

ti ί ft ft ft li » II

a a o. ø ø ·η ra

h£ EH

U -P 3 -P -P -ri Φ S

o M o to 01 > g ·Μ 148918 35

De minimale inhiberingskoncentrationer, ved hvilke A-21978C-blandingen og de mest betydende A-21978C-faktorer inhibe-rer udvalgte bakterier, bestemt ved standard fortyndingsforsøg på dyrkningsvæsken, er anført i tabel XII.

36 148918 ΙΛ ΙΑ !0 Η Η Η ΙΑ Ο ΚΜ Λ Λ Λ Λ Λ

Ο Ο Ό Ο Ο CM

ΙΑ Η S ΙΑ \ ΙΑ Ο CM Ο Ο

'Μ CM I

3 Ο I Ο Η Ο Η VO

. Η ' U Ο Ο ΙΑ Ο Ο ’ H ' Η| ·> ·· ·> *· ·>

Ξ Ο Η CM Ο CM CM

; ΙΑ ΜΙ ; : ri •Η Ό ΙΑ ΙΑ ΙΑ Η ' £ CM CM Η ΙΑ Ο I—I CO Λ ·* ·ν ·* ·» • jxj Η Ο Ο Ο Ο 00 I m j Η m <! ΕΗ Η ri ΙΑ Cd ΙΑ CM Ο &ι -ί ΙΑ 00 CM σ\ A CM Ο Φ σι Ο cd

ΙΑ ω CQ ·Η CQ

ri ω ri d ri ο ri ο ο ω ο φ a ο ri Ο Μ) 3 ο ri ο Ο 0) ο ,ο cd ο !>> ri ο ο -μ a a ρ ri CQ ft ft ω ri <D CQ CQ 0) cd o ri ri ri ri v_x o -p o o -p

• O CQ O O CQ

(DO O O

S O Ω O O CQ

CQ I—l O O ri •H i>> CD -P -P cd ri rj ft ft ft T)

Cd ft ft (D CD -H

M Cd ri ri ri ri ri -P ri -P -P -ri O CQ C5 CQ CQ > 148918 37 A-21978C-antibiotika inhiberer væksten af organismer, som er resistente over for andre antibiotika. I tabel XIII er anført MIC-værdierne af A-21978C-faktorerne Cq, C^, C£, Cy og over for repræsentative organismer be-5 stemt ved agar-fortyndingsforsøg under anvendelse af ICS-teknikken..

38 148918 ΙΑ CO i—* ·* ^ C\l ο <r l-1

i—I * ·> CO <T

0 1—i i—i ·» ··»

rH (Tv A in 1—1 H

1 _i i i c—i 00 ·* H ©

ift lf\ Μ I—I O Η H

CM (MCMH1A »-<(·—' H

O ^ ~ ·. .» i—i ·· 00 © co o o o o in in cm ^ l>- i I I I I—' ·> i~4 cr\ cm tn co m cm o λ 2 hhhocmh /' £ cm ·» ·>·»·* ·* i g

COOOOO -i P

o Μ ·Η

S xJ

H

Φ S3 X) j>

g tS

g ' H S

P4 (D

r i CD

S fco φ 3 «id ^ o A S3 m « i—i vo 1—1 ^ H 9 H CTv Η 'O CO Η ΦΗ H/-> oo o m 00 Λ r-1 ’cr1 " Si

Sh is- H CM ·> / > C"- 00 . j© CQ a (Tv 1—I - i—V »I—' 00 CM *3 ®3j

H ^ H in O in 1—i H ·** H

js; fcC CM ·> l '—I 00 I in λ H 3 <tj omcMi—i cm ·* *' . 55 d ’>> ri. H. ^ H. ° vi I -s OOHOH ^ _L> u fj +i

«Η § Sh* ^ H

V. § (D © O

•s S 5 5

° g i o -P

ed · -p CM « m Ό) H S f°> -Η ·Η

Bl g I ί »4 f « s * 5? å o S Λ P μ +> ® jpnoj o 1—'i— ^ c— © - © Φ Η I &£ 00 O CM I—1 1—I I—1 I—I -H ©Hø m o si ts η h m co o cm 5 +3 d © < 00 ·Ή (Tv I—'1—‘1—1'—' * '—'» , EHiSf-v H O CM in <f H <f- (Tv © CM i ~ I I I I I §H © 5 ,Γ H rCJ <J HHincMK)HS ,, © £

“ ί ™ t u S

-¾ i „ ° ° a"« μ N a -η 3 “η ΰ ~ 5 s %

Eh cd oo © cd © M g ^-N CQ S~\ ^-N +· IH -Η O ·Η Ν σι CM H ^ H d H ‘b w ^ Φ ^ Η Φ ffj ^ {> ·Η '—' ·Η Cd 1—/ k* - HS S CQ CQ Ή CQ -HH« E-i © ^ © a si a © ω © © (si a©sooocd si y H © Φ © O S O © ro © _ |i, Sa ·Η W) O P O O P< ,3 fø y p, o o © o ,3 to m · Η cd © >> o si o P (» ® +? « P. -P P, -P Sh -P © © ” CQ CQ Qi QiO ej © · · 43 © p p © © © © s ® ΐ ^ ® a o o p p p sh o p £ h © m o o o -P o -P δθ cdcdcd+s •H OOOtQOCQ p,^sj> ti o o o o cd .¾¾ cd ΟΟΟΡΟΜ’Η ·Η'Η^·3 &C rH rSO OS?h jjj *3 >, !>, -p 0) -P © © '3 ^ O ij.cjftPPv'Clra © © "^ „ -P P, ft (D P, ω ·Η CQ H H I 11 cq ededS-vSkin·^ ddujcj

0) -Ρ-Ρ-ΡΡ-ΡΉΟ) © 5 b U

eh ra w οι ΰ w > S EH EH S S

« a - §

CM

Λ on 148918 i—i λ jy O i—i Ώ «—i t—«

Η CM H 00 CM

i—i H . r '—i i—i P

mi—i m cm m o

ip) CM IT* » CM ·> CM H

o - fs I—I «. i—I Λ H

co oomoc^-o« o O- I I I—I I I I I -48 cr\ M3K^vom^Dm-N 1 HOHOHOH Ή CM n »i *v ·. ·> * f-| 1 cj c oooooos P · S 3 I p o æ h > s i o ω h

d S

Pi O O d d CM CM H Pi

Ct! i—i i—i ΙΛ ΙΛ ffi CD

Η O CM fcO d

EH Η H CO 1 ' °cd H

<i i—' i—i H 00 Pi fB

►J <(: ΙΓ\ O - '—‘CM -,51° Ο O S- ·> i—'O'* Pi °cd

CQ 00 Ο H LO - i—11—|*W O P

Η -g IN I I i—i H h CM fl d

HcTiT\m roii—> >—' <« pi Η H CM CM H T\ m CM P © $4 ✓—-. CM ·>·»·>·*·* I Eh Cd d m H < Ο Ο Ο Ο Ο H S Λ h a -p a < p cd

H b£ OH

J d do S . ra

' P ·> H

P © P

OP -P © -P

«Η © CO -P ME)

' S-i £ H O

-PO O Ο Η d

cd >> Η H WOO

CQO -P » CO ' «ί H CQ ,¾ -p Cd i—i i—i »- <f * ·Η

p 02 P OH'—> ·» '—1 O O

OH-P Η H CO i i IN ti H ti

Cp (35 Pj i—i i i i i 00 i—i i—ι Ο CO p· —* o'© cm m m i—ι m σι -P cd

Eh o ml h cm cm m cm >— cq -p ,d

HfcsiSO *·>·-.>.. CO OO

H<iOCOOOOOO<—'CM -PH«

H En ' ,W IN I I 1 1 t CM Η H-P

M I M Q\ CO CO CD CM CO i—ι.-. <Ρ Cd p O&CH Ο Ο Ο Η Ο ΙΛ Λ Cti-P® H 00 pi CM ·>**«> ·>» I Pil·) 1¾ IN H <d OOOOOOnt -P cd pi pq CT\ ' P Φ C0

<! Η O . HP

EH CM ,Ω Η Ο H

ι h cd !> cd

« s 5 T

Η η 3 fl -ρ cd co o

O <—v P -P

EH H CM O CQ β

H Cd Η > o H

EH gj w ^ H ·P

HH 00 taO Pi p 5> <3 ^cqO-^w^n^-n do o HH OH'w'Cn cm h Sptj eh g; h d s—' o 1—' h cd a ·γΗ CO ^ CQ P) p · m s cq cq η ω o H-p P cQPødPd® -p-p o P dOHOoocd pio.-p

p£) O ' Ό 'O O a O O O-P^vCQ

pH bo O 3 O O PPiHO

dfto'oooÆ rororo-p roop-iOdoP ΡίΗ>· •g ft-Pft-PP P 0) cq cq p. Pi o Η H O jci O p d CQ O CQ O Pi -P^si

S O O d P 3 P O -P-Ppi-H

CQ OOO-PO-PhO O O H

•H O O O CO O CQ HHlil dooo o ro hhu ro o o od o cq h ro cd h eh

<a£ HHO OPiP EhEhSS

p iNiN-po-proo ^ o a a p, p, o, d cq -g -g -g -P PiPiOPhOHcq « -g cQcdcdPdPPH «

O -P-P-PP-PHO

EH cocococ5co>a f48918 40 A-21978C-antibiotika hæmmer også væksten af visse anaerobe bakterier. I tabel XIV er anført aktiviteten af A-21978C-blandingen og A-21978C-faktorerne Cq, C-^, C2, C^, og over for visse anaerobe bakterier bestemt ved et stan-5 dard agar-fortyndingsforsøg.

148918 41 t bi , .

a id Ο ο o m o o

_j —. ,— -— *—. is CO CO CO

H r-iOOHOTHCHH CM CM CM CM ' V «-4 r-i rH

|.W Λ Λ Λ in mm in in m in m in cm.cm cm 'in l/·) I *— ·— — — ·— *—- r“ * CO ·” -

Oiooooooooocmcmo <-l A.

in σ ο ο o mom 'S' I ·— *·*- 00 U <-lH<-HCMi-ICMOHOCM-<3,'<S· _ r-i H A .

e \ ο o omom o br ml — — ~ ^ · — — (Of-iO'-ico'-onj v V V CN f-i m v_- ' 1-1 Λ

O

H

2 ο ο ο ο o ml *-v. — *- O Hoohoocmhhh<mcooo*!|'

CM CM VO

Ή H

Λ Λ H|'3'VO'ClC'3lCMm,=3,C3C0O3'«'

U H r-i m m VD

<—l H

Λ Λ m

CM

b> Ol CM CM *q‘ ·5!< M· Μ* Ο CM H CO M1 CM

H υ I ^ * Λ ' m a < ζ~ι

Ui (0 3 to 3 -.-1 3 -Η T3

Ο η O

•H O S £ •P 5-1 M 3 trt to >, Q) (D Cfl S3 S C<H 3 3 U) 30 o ojo ccc a x;

•Η EP S -H 3 3 -r) U to 0 CO

•H C 3 O 3 H 3 Η -H 0 -! -H 0 3 X! -3 W !0 Η Λ 3 <UMM-)*w0033£M-*St>·

<3iM-U00>0U3tr· >,<U

. 33a33Q)00-3 3tnC

' 3 000013 0033 <D-3alwo3aoooi-3s S a 0 0-333

to toSSStOUJ-P-UOtO-i-llH

η o33333aaoo33 £ υ η ·η η υ υ ω φ Λ ό ο o to ^^3^30033-3 -3 -U.0 be g' -3 -h 000-3-33000 3, ο 3 3 -3 Ο Ο H CO 0 3 3 3 O 3-3-300000 H(L'X!J3 +J -H u) Ώ 3 -U -3 Jj JJ a -U O 0 w -ooo-oaaaaootntn O 0.3/3300003033 én rfjuui«A<3iP<P4ejaaa 42 148918 A-21978C-faktorerne udviser antimikrobiel aktivitet in vivo over for eksperimentelle bakterieinfektioner. To doser af testforbindelsen indgives i mus med illustrative infektioner, og den observerede aktivitet måles som 5 en ED^q-værdi (den effektive dosis i mg/kg, som beskytter 50% af forsøgsdyrene; Se Warren Wick et al.; J.Bacterial. 81, 253-235 (1961). De observerede ED^q-værdier for A-21978C-blandingen og A-21978C-faktoreme C^, C2 Cy Cq, og C(j er anført i tabel XV.

148918 tf 43 •Η ti ο i cm P o (Dioro-icnoococ-

tiQ -HOCOtOHHtO

P [τ'] Ο *v Λ »s ·* ·» ·* Λ

Ο Ο Ο Ο Ο Ο 1N W

ti Ο Ο ο ο ο ρ ro ιό m κο ro pol HHommoHio Φ J—]| ti S| oooooooo

-P

CO

O tf > 0 Ό

•H ti O

t> Φ IO

w q ίο σ> vo w β O pq σ\ IO M3 ti •H > p "ti 0 w cm <t cm cm ro ro

pocororovooio-j-ti· -P

OOIOOOOHHOOM3 ti

^ Q Q Q

-P O H OOOOOOOO Vi

•ri O I

> o ti -P rOrOCQlOfOprOrO ti

ti PO| HHOCMHOOH bO

♦H <D Hl ·» r. #v *v ·» ·* »v Co

tig OOOOOOOO

-P -P v; ω co V ^

-P H

•H S

J> i> 'v.

U ·γλ bo -P ti o y \ H to m ^ PQ ti <: «η ω ti

H tf ti CM O

ti O CM M3 CO CO ·Η

b£ tf ΙΟ CM H O Hio -P

*\ ψ\ ψ. *» *v CO

' ·Η W Η O O O O O ti ti ti £ bC O ti •H O ti H O C3 ti o ti a H 3 1 >-H ro cd ro ro w S iJ U ΙΟ H O HH bp CQ p H "· ·* ·« »«. ti

tf S O O O O O -H

-P ti CQ ti p ·Η ti

•S S

bo η ω ti > ti •Η Η H w

•ti ti bo H

S ti ti S ^ ti 3 3 ·Η ·Η ti >

y H O ti H -H

H p t>, -H ti bp p HCMroo<i-ioi s 8 3¾ OOOOOOOOO Pti •H COCOCOCOCOCOCOti II ti Ή

P NNISISNSNil yH

•h cncr\cr\cricri03D3P o p tf •P HHHHHHH !>> Η tf ti

ti CMCMCMCMCMCMCM ti g M O

•5 h cm to 44 148918 A-21978C-blandingen og A-21978C-faktorerne er effektive til behandling af pyelonephritis. F.eks. udviste A-21978C-faktorerne ved en eksperimentel fremkaldt pye-lonephritis-infektion i rotter en beskyttelse, som var 5 bedre end den beskyttelse, som opnås med vancomycin. Den benyttede bakteriekultur i denne test var Streptococcus faecalis (Guze). Kulturen blev dyrket på Trypticase-soya-agar (BBL), suspenderet i hjerne-hjerte-infusionsvæske (BBL), opdelt i portioner af 0,2 ml og frosset i flydende 10 nitrogen. Bakteriesuspensionerne til indpodning i rotterne fremstilledes dagligt ved at pode en 50 ml kolbe med trypticase-soyavæske (BBL) med indholdet af en frossen ampul og dyrke -.kulturen natten over ved 37° C på et rysteapparat. Kulturen af Streptomyces faecallis blev fortyndet

Q

15 til 5 x 10 kolonidannende enheder pr. ml. Testforbindel-seme blev injiceret subcutant en gang daglig i syv dage.

Alle forbindelser blev suspenderet i 0,125% carboxymethyl-cellulose.

De eksperimentelle infektioner af rotterne blev udført på 20 følgende måde: tilfældigt udvalgte albino-hunrotter (Cox-Wistar), som vejede fra 190 til 210 g, blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af 12 mg natriummethohexital, der om nødvendigt blev suppleret op. Den eksperimentelle pyelonephritis-model blev baseret på de af Guze og Beeson 25 udførte studier, ved hvilke den venstre urinleder blev tillukket i 20 minutter, hvorefter der indsprøjtedes 0,5 ml af testorganismen i lårets vene. Den antimikrobielle terapi blev påbegyndt fire til fem timer efter infektionen.

Fire timer efter den sidste behandling blev rotterne dræbt, 30 og den venstre nyre blev udtaget og homogeniseret i en Duall-mølle indeholdende 9 ml fysiologisk saltopløsning.

Dette repræsenterede en fortynding af nyrevævet på 10 gange. Yderligere fortyndinger på 10 gange i saltopløsning blev baseret på de forventede tilstedeværende bakteriecel-35 ler i vævshomogenatet. Til sidst fremstilledes et antal 148918 45 agarplader til udhældning ud fra et antal af disse opløsninger, og pladerne blev inkuberet natten over ved 37°C.

De terapeutiske resultater blev udtrykt på to måder: (i) den procentdel af rotterne, hvis nyretal var mindre end o 5 10 pr. gram nyrevæv, hvilke rotter betegnes "helbredte", og (II) den procentdel af rotterne, der mindst udviser en 4-log^Q reduktion i bakteriel titer sammenlignet med in*..

ficerede kontrolnyrer. Kontrolrotteme blev kun behandlet med 0,125% carboxymethylcellulose. Optællingen af levedyg- 10 tige celler i nyrevævet fra kontrolrotter med Streptomyces 3 8 faecalis viste værdier på mellem 1,2 x 10 og 4,6 x 10 pr. gram homogeniseret væv.

Resultaterne af de ovenfor beskrevne undersøgelse er anført i tabel XVI.

O 148918 -p d

CD

u ,ο 46

H

CD

Λ

-P

C! 3 ω cd

o-P

o-P _ _ 3 o ro o σ\ co σ> ρ,ί-, ro in oo t" co w

•H

H

CO

O O

CD CD bl CO -P &Q3 «Η +>0·Η

OH 3 CQ 3 I M

3 fl o -p _ æ

o S 3 CQ

O 0) CD 3

O O CD

o o-d-P ^ Λ -P3<DHlO-OOCO<7v p p,g-p Lf\ ΙΟ O D1- 00

CD H

O P

m

CO CM

S3 ^

-p ω CD

-d -P N

Η -P P

CO O u .¾ 3 w S ri

Φ H S

3 H g

‘H +3 I

CQ tiO1^ CO

•H ri M -p PH ® H $H W 1

O øX O O O O O CQ

Hi X) W'v, ·>···»>· η

> p O tit CMHHHH H

- κ ® π al h g

Jo g Η H ^ pq cd <Cj fc>1 EH P ra

Cl Μ- ω

d P

cd p? s s

r->| O

3 ' Η "P

CD H S Pc •p o\ ? •P ' HH LO tO LTl 3

O S3 O O CM H CM -P

^ ^ n 1s ·» ·» ·» UJ

W Η H O O O

d ‘P

CD CO CD

a HH

Ό H

h CD CD

e £ >

φ CQ s H

eh ^ o &p CD CQ >d Η H 3

S P S H

3 .3 I o a

tiD-P O H CM tO I P CO

aoi>»oooo-P -p CQ H g 00 00 CO oo H 3 3,0 O C1— C— t1— i>~ i> -¾ cd η οοη<τ\<Τνσ\ . β *d -p 3 Η Η Η Η 33

33 C0CMCMCMCM Η CQ

|dcO ;> <; <; <ί «; hcm 148918 47

Toxicitetsdata for de mest betydende A-21978C-faktorer og for A-21978C-blandingen er opsummeret i tabel XVII.

TABEL XVII

Toxicitet af A-21978C

5 LD50 (mg/kg) mus_ J_ rotte

A-21978C IV SC IV

Faktor ^ >250 >365 479*32

Faktor C£ 150-250 175 204-17 10 Faktor < 50 70-75 <160

Blanding 150 175-190 169-10 IV: intravenøs SC: subkutan Når en A-21978C-blanding eller en A-21978C-faktor anvendes 15 som antibakterielt middel, kan dette middel enten indgives oralt eller parenteralt. Det vil være klart for fagmanden, at en A-21978C-blanding eller faktor almindeligvis indgives sammen med et farmaceutisk akceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel. Doseringen af A-21978C-blandingen eller fak-20 toren vil afhænge af en række overvejelser, som f.eks. arten og omfanget af den bestemte infektion, som skal behandles. Fagmanden vil vide, at passende doseringsområder og/el-ler doseringsenheder til indgivelse kan fastlægges ved at tage de anførte MIC- og ED^Q-værdier og toxicitetsdata i be-25 tragtning sammen med faktorer såsom patienten eller værtsdyret samt den inficerende mikroorganisme.

De omhandlede A-21978-antibiotika er også nyttige som vækst- 48 148918 fremmende midler til dyr. F. eks. har A-21978C-blandingen ført til forbedrede vægtstigninger qg forbedret foderudnyttelse hos kyllinger. I tabel XVIII er anført resultaterne af to forsøg, som efterviser denne virkning. I disse 5 forsøg blev A-21978C-blandingen givet til dyr i en koncentration på 25 g pr. ton foderstof. Den antibiotiske forbindelse blev givet til fire gange otte fugle, hver i en tidsgentaget undersøgelse udført i grupper (ialt otte gange otte fugle, dvs. 64 fugle). Testperioden strakte sig 10 over 21 dage, nærmere bestemt fra fuglene var 7 dage gamle og til de var 28 dage gamle. De fundne vækstdata (vægtforøgelse, foderoptagelse og foderudnyttelse) blev sammenlignet med tilsvarende data for en samtidig kontrolbehandling omfattende 40 fugle.

$ 148918 Η ω a 49 d Ο Ο CTi «η co σι I » I « ^R. IH Ι-ί d ø

O I

d\ feo

O β·Η X o-P

d-H ra fOH in cm di+i-PM C—4 CO 00 •ti co feOd ISIS CO m 0 d ffi H ·> ·· - -

fe +1 ? β HH HH

d~ ø feO Ow ti . o d w o

d H

0 -P ^ dø <fo C- m o u mm o co W-P isis c-vo tt ø ra

H

ø

feO

S

d O O c\i

Vi Η H

I ·» I * -£R I <1- I CM 0 ra

H

H 0

H feO feO

H ti ® [> Ή Fh «s £

feO *H

π-i •H''--

pq -P &o "JR

5

Eh feO <f H meM

æ H m cm m o

f> -cfC -T-C O

H

H

d o

H

-P

0 d -P^ d ti

0 O -P

o-P H

d^ d o feo i m i in ω -p

W'-' I CM I cm S H

ø d d ω d S

feO 0 0 d Μ Fjj Η Η O H O »0 t) O 00 O CO fet &0 d d IN d f- d ø -p en -p σ\ h -

in d H d H HH

0 O CM O CM 0 O

fn wc wc d d 0 -P xi d 0 o

feo m M

s

CO

d o

fe H CM C

50 148918

De omhandlede A-21978-antibiotika er typisk effektive som vækstffremkaldende midler til fjerkræ, når de indgives sammen med dyrenres foder i mængder på mellem ca. 1 og ca. 100 g antibiotika A-21978 pr. ton dyrefoder.

5 Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 A. Rysteflaskeferraenterinq til fremstilling af A-21978

En lyofiliseret tablet af Streptomyces roseosporus NRRL 11379 blev opløst i 1 til 2 ml steriliseret vand. Denne opløsning 10 benyttedes til podning af en agar-skråkultur med følgende sammensætning:

Bestanddel mængde (%)

Glucose 0,5 Gærekstrakt 0,2 15 CaCO^ 0,3

Vegetabilsk juice ± 20,0

Demineraliseret vand ujusteret pH 6,lj efter autoklavering: pH 5,9 *y/8 Juice, Campbell Soup Co.

20 Den podede skråkultur blev inkuberet ved 30°C i omkring syv til ti dage. Den modne skråkultur blev dækket med sterilt destilleret vand (10 ml) og skrabet med en steril pipette for at løsne sporene. En portion (1 ml) af den resulterende sporesuspension blev anvendt til at pode 50 ml af et 25 vegetativt medium med følgende sammensætning: 148918 51

Bestanddel mængde (%) jAl

Trypticase-soyavæske 3,0

Dextrin 2,5 demineraliseret vand 5 ^Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville

Md.

Det podede vegetative medium blev inkuberet i en 250 ml Erlenmeyer kolbe ved-30°C i omkring 48 timer på et rysteapparat, der roterer i en cirkel med diameter to tommer 10 (ca. 5 cm) med en hastighed på 250 omdrejninger pr. minut.

Dette inkuberede vegetative medium (0,5 ml) benyttedes til podning af 50 ml af et produktionsmedium med følgende sammensætning :

Bestanddel mængde (g/l) 15 Glucose 7,5 4

Tapioca-dextrin 30,0

Enzymatisk hydrolysat 5,0

af casein AA

Enzym-hydrolyseret 5,0

20 casein AAA

K2S04 17,4 L-Asparagin, vandfri 1,32

Demineraliseret vand op til 1 liter A Stadex 11, A.E.Staley, Co., Decatur, 111.

25 AA NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

AAA Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

Det podede produktionsmedium blev inkuberet i en 250 ml Erlenmeyer kolbe ved 30°C i 6 til 7 dage på et rysteapparat, der 52 148918 roterende i en cirkel med diameter ea. 5 cm med en hastighed på 250 omdrejninger pr. minut.

B. Tankfermentering til fremstilling.af A-21978C

Med henblik på at opnå et større volumen podestof anvendtes 5 10 ml af det oven for beskrevne inkuberede vegetative medi um til podning af 400 ml af et andet vegetativt vækstmedium med samme sammensætning som det vegetative medium. Dette andet medium inkuberedes i en kolbe med volumen 2 liter ved 30°C i 48 timer på et rysteapparat som ovenfor beskrevet.

10 800 ml af dette andet vegetative medium, fremstillet som be skrevet ovenfor, anvendtes til at pode 100 liter sterilt produktionsmedium med samme sammensætning som beskrevet under (A). Man lader det podede produktionsmedium fermentere i en 165 liter fermenteringstank i omkring 6 til 8 dage ved 15 en temperatur på 30°C. Fermenteringsmediet beluftes med steril luft ved et tryk på 1 atm. til opretholdelse af en luftmætning på over 30%, idet der omrøres på konventionel vis med en omdrejningshastighed på 200 - 300 omdrejninger pr. minut.

EKSEMPEL 2 2o -

Adskillelse af A-21978C-blandingen af antibiotika

Ca. S080 liter fermenteringsmedium, opnået som beskrevet i eksempel 1, blev filtreret på en filterpresse ved anvendelse af 3% filterhjælp (Celite 545, Johns-Man-25 ville Products Corp.). Filterkagen blev vasket med vand til opnåelse af en total mængde filtrat på 4100 liter indeholdende 230 enheder pr. ml. Filtratets pH blev indstillet til 3,5 ved hjælp af HC1, og det sure filtrat blev holdt ved stuetemperatur i 16 timer for at lade de aktive faktorer ud-30 fælde. Der sattes filterhjælp (0,75% C :iite 545) til suspensionen, og bundfaldet blev skilt fra ved filtrering. Filterkagen blev ekstraheret to gange med 410 liter methanol, og 148918 53 hver gang omrørtes i 1 time inden filtreringen. Til de kombinerede methanolekstrakter (720 liter) blev sat 0,1 volumen vand (72 liter). pH i denne opløsning blev indstillet til 6,5-7,0 ved hjælp af NaOH. Opløsningen blev koncentre-5 ret under vakuum til omkring 1/20 af volumenet (30 liter) til fjernelse af methanolen, og under koncentrationen tilsattes destilleret vand efter behov. Derefter tilsattes under omrøring 3/4 volumen (22 liter) n-butanol. pH i den resulterende opløsning blev indstillet til 3,0 ved hjælp 10 af HC1. Faserne blev adskilt, og n-butanol-fasen, som indeholdt den ønskede aktivitet, blev koncentreret under vakuum til opnåelse af en inddampningsrest. Denne rest blev opløst i en minimal mængde methanol, og methanolopløsningen blev sat til 30 volumener acetone til udfældning af hoved-15 mængden, af A-21978C-blandingen. Bundfaldet blev skilt fra ved filtrering og tørret, hvorved der opnåedes 247 g rå A21978C-blanding (780 enheder/mg).

Methanol-acetone-filtratet, som indeholdt den resterende del af A-21978-blandingen (faktorerne A og B), blev koncentre-20 ret til en rest. Denne rest blev opløst i t-butanol:H20 (5:1), og denne opløsning blev frysetørret til opnåelse af 169 g A-21978-blanding.

EKSEMPEL 3 A. Rensning af A-21978C-blandingen 25 734 g rå A-21978C-blanding, fremstillet som beskrevet i ek sempel 2, blev suspenderet i 25 liter vand, og pH i denne suspension blev indstillet til 6,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid til fuldstændig opløsning af materialet. Opløsningen blev overført til en kolonne indeholdende 27 liter ion-30 bytterharpiks (acetatcyclus) (IRA68, Rohm & Haas Co.). Kolonnen blev vasket med fire kolonnevolumener vand (108 liter) og derefter med fem kolonnevolumener 0,1 N eddikesyre (135 liter). Det aktive stof blev elueret med 0,5 N eddikesyre, idet der opsamledes fraktioner af ca. 120 liter, og 54 148918 hver fraktion blev prøvet for biologisk aktivitet.

De stærkt aktive fraktioner blev kombineret og frysetørret til opnåelse af 278 g brun A-21978C-blanding (1100 enhe-der/mg). Fraktionerne med lav aktivitet blev kombineret 5 til opnåelse af 238 g brun A-21978C-blanding (880 enheder /mg).

B. Yderligere rensning af A-21978-blandingen

En del af den mest aktive A-21978C-blanding (150 g) fra IRA-68-kolonnen blev suspenderet i 600 ml vand, og pH 10 blev indstillet til 6,5 til fuldstændig opløsning af det suspenderede præparat. Der tilsattes en mængde tør silica-gel (Grace, Grade 62), som var tilstrækkelig til at absorbere den vandige opløsning. Dette fugtige silicagel-præ-parat blev overført til en 30 liter silicagelkolonne 15 (Grace 62), 10 x 375 cm, pakket i acetonitril. Forinden var silicagelen blevet vasket med vand til fjernelse af fine partikler, og kolonnen blev pakket med den i vand suspenderede silicagel, hvorpå silicagel-kolonnen blev vasket med 30 liter acetonitril. Efter overføringen til 20 kolonnen blev denne vasket med 15 liter acetonitril og derefter udviklet med acetonitril:vand (4:1), idet der opsamledes fraktioner af omkring 4 liter. Elueringen blev fulgt ved bioprøver og silicagel-TLC-bioautogrammer [CH^CN:H20 (3:1)]. De fraktioner, som kun indeholdt A-21978C-blan-25 dingen (fraktionerne 43-60), blev kombineret, koncentreret under vakuum, og frysetørret til opnåelse af 86,2 g rent gulligt A-21978C-kompleks (ll60 enheder/mg). Fraktionerne 21-29, som indeholdt faktorerne D og C, blev kombineret og frysetørret til opnåelse af 13 g gult pulver med lav bio-30 logisk aktivitet.

Den således opnåede rene A-21978C-blanding (30 g) blev yderligere affarvet ved at suspendere de 30 g blanding i en minimal mængde vand og iblande en lille mængde silicagel (Type LP-1, 10-20 ^u. Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, 148918 55

Fairfield., N.J. 07006) til absorption af opløsningen. Den fugtige silicagel-blanding blev suspenderet i acetonitril og methanol (4:1) og pakket i en blyglaskolonne med dimensionerne 30 x 4 cm (ydre diameter) forbundet med en glas-5 kolonne med dimensionerne 82 x 6,5 cm (ydre diameter) indeholdende 2,8 liter silicagel (Quantum LP-l) pakket i acetonitril og methanol (4:1). Forinden var silicagelen blevet vasket med vand og acetonitril:methanol (4:1), og kolonnen var blevet pakket med silicagel i acetonitril: 2 10 methanol (4:1) under et tryk på 50-60 psi (3»5-4,2 kg/cm ). Kolonnerne blev vasket med 3 liter acetonitril:methanol (4:1) ved 50 psi (3,5 kg/cm ). Det aktive materiale blev elueret med acetonitril:methanol:vand (55:20:25), idet der opsamledes fraktioner af 300 ml. Elueringen blev fulgt 15 ved binforsøg med Micrococcus luteus. Fraktionerne 14-25 viste sig at have den højeste aktivitet, og disse fraktioner blev kombineret, koncentreret og frysetørret til opnåelse af 24 g lysegul, ren A-21978C-blanding i form af natriumsaltet (1250 enheder/mg). Fraktionerne 26-32 var min-20 dre aktive, og disse fraktioner blev kombineret, koncentreret, og frysetørret til opnåelse af 1,6 g mindre ren A-21978C-blanding (780 enheder/mg).

EKSEMPEL 4

Adskillelse af A-21978C-faktorerne 25 2 g ren A-21978C-blanding, opnået som beskrevet i eksempel 3, blev opløst i 40 ml vand og ført igennem en pumpe (FMI LAB Pump, Fluid Metering, Inc. 48 Summit St., Oyster Bay, NY II77I).ved 50 psi (3,5 kg/cm2) over i en 4,1 x 60 cm ko- ..... lonne indeholdende silicagel i omvendt fase (Quantum LP-l 30 silicagel/C^g) i vand:methanol :.acetonitril (100:15:85) indeholdende 0,15$ eddikesyre og 0,15 pyridin. Kolonnen blev p udviklet ved 65 psi (4,55 kg/cm ) med dette opløsningsmiddel, idet der opsamledes fraktioner af 25 ml. Elueringen af faktorerne blev overvåget ved UV-spektroskop! ved 280 nm 35 og ved bioforsøg. De individuelle fraktioner blev undersøgt 56 148918 på en analytisk kolonne til bestemmelse af renheden af faktorerne. De typiske adskillelser var følgende: fraktioT neme 33-37 indeholdt faktor CQ, fraktionerne 45-53 indeholdt faktor Clf fraktionerne 75-92 indeholdt faktor Cg, 5 fraktionerne 112-134 indeholdt faktor Cy fraktionerne 54-74 indeholdt faktorerne C-^, Cg og C^, og fraktionerne 93-111 indeholdt faktorerne Cg, C^ og C^. De fraktioner, som indeholdt blandede faktorer, blev ført tilbage til kolonnen til opnåelse af yderligere udbytter af f ktorerne C^, 10 Cg og Cysåvel som yderligere udbytter af faktorerae C^ og Cy De fraktioner, som indeholdt en enkelt faktor, blev kombineret, koncentreret under vakuum og frysetørret til opnåelse af lysegule pulvere af hver af faktorerne i form af natriumsalte. Ud fra 60 g blanding opnåedes følgende 15 udbytter: faktor C^ = 5,55 g, faktor Cg = 10 g og faktor C^ = 6,61 g. Fraktionerne indeholdende blandede faktorer blev ført tilbage igennem kolonnen indeholdende harpiks i omvendt fase, hvorved der opnåedes yderligere udbytter:

Faktor Cq = 550 mg; faktor C·^ = 1,29 g; faktor Cg = 1,99 g; 20 faktor C^ = 443 mg; faktor C^ = 512 mg og faktor C^ = 384 mg.

EKSEMPEL 5

Adskillelse og rensning af A-21978C-faktorer i stor målestok I større målestok blev faktorerne adskilt ved kolonnechro-matografi i omvendt fase. 6 g ren A-21978C-blanding, opnået 25 som beskrevet i eksempel 3, blev opløst i 80 ml vand, og pH i opløsningen blev indstillet til 4,4 ved hjælp af eddikesyre. Der tilsattes 20 ml tetrahydrofuran, og opløsningen blev under lavt tryk pumpet (Lapp Pump) over i en stålkolonne (4,8 x 100 cm) indeholdende 1,77 liter silicagel/C-^g 30 [Quantum LP-1, 10-20^u, silyleret med octadecyltrichlorsilan] pakket i vand:tetrahydrofuran (4:1). Kolonnen blev vasket Λ under'tryk (omkring 100 psi svarende til ca. 7 kg/cm ) med 150 ml vand:tetrahydrofuran (4:1). Kolonnen blev udviklet ved hjælp af vand:methanol:acetonitril (47,5:15:37,5) inde-35 holdende 0,2% pyridin og 0,2% eddikesyre ved omkring 100 psi 57 U8918 p (7 kg/cm ) ved en strømningshastighed på 35 ml/min., og der opsamledes fraktioner af 175 ml. Elueringen blev kontinuerligt overvåget på et registrerende apparatur ved hjælp af en UV-detektor ved 280 nm. De fraktioner, som in-5 deholdt individuelle faktorer (indikeret ved grafens toppe), blev yderligere overvåget på en analytisk kolonne i omvendt fase. Fraktionerne indeholdende en enkelt faktor blev kombineret og frysetørret. Et typisk forløb illustreres her: Fraktionerne 12-16 indeholdt faktor Cq'; frak- 10 tionerne 20-26 indeholdt faktor C^; fraktionerne 38-50 indeholdt faktor C2 og fraktionerne 63-78 indeholdt faktor Cy Fraktionerne 27-37 (indeholdende faktorerne og C^) og fraktionerne 51-62 (indeholdende faktorerne C2 og C^) blev atter ledt gennem kolonnen til opnåelse af 15 de rene faktorer og C^. Kolonnefyldningerne var mellem 6 og 12 g. På basis af ialt 84 g A-21978C-blanding opnåedes følgende udbytter: 1,9 g faktor Cq, 3,27 g faktor C-^, 4,97 g faktor C2 og 1,94 g faktor Cy Højere udbytter af de individuelle faktorer opnåedes ved at recirku-20 lere fraktioner af flere faktorer under anvendelse af egnede opløsningssystemer til højtryksvæskechromatografi.

Valget af opløsningsmiddelsystem varierer i afhængighed af de individuelle fraktioner og af de valgte harpikser og kolonner.

25 Følgende opløsningsmiddelsystemer er nyttige til adskillelse af A-21978C-faktorerne: A. Analytiske systemer

Vand: methanol:acetonitril (50:15:35) indeholdende 0,2% eddikesyre (HOAc) indstillet til pH 5,5 med pyridin 30 Vand:methanol:acetonitril (50:15:35) indeholdende 0,2% HOAc og 0,2% pyridin

Vand:methanol:acetonitril (50:15:35 indeholdende 0,75% ammoniumfo rmi at

Vand:methanol-acetonitril (95:30:75) indeholdende 0,2% 35 HOAc. og 0,2% pyridin 58 148918 A. Analytiske systemer (fortsat)

Vand.:methanol:acetonitril (105:15:80) indeholdende 0,2% HOAc og 0,2% pyridin

Vand:methanol:THF (59:15:25) indeholdende 0,5% HOAc og 5 0,5% pyridin

Vand:methanol:THF (60:15:25) indeholdende 0,5% ammonium-formiat B. Preparative systemer

Vand:methanol-acetonitril (95:20:85) indeholdende 0,15% 10 HOAc og 0,15% pyridin

Vand:methanol:acetonitril (100:15:85) indeholdende 0,15% HOAc og 0,15% pyridin

Vand:methanol:acetonitril (50:10:40) indeholdende 0,1% HOAc og 0,1% pyridin 15 Vand:methanol:acetonitril (50:15:35) indeholdende 0,75% ammoniumformiat

Vand:methanol:acetonitril (55:10:35) indeholdende 0,2% HOAc og 0,8% pyridin

Vand:methanol:THF (52,5:15:32,5) indeholdende 0,6% 20 ammoniumformiat

Vand-methanol:THF (50:15:35) indeholdende 0,6% ammoniumformiat

Kombinationen af eddikesyre og pyridin har den fordel frem for ammoniumformiat, at den kan fjernes under frysetørrin-25 gen, hvorimod ammoniumformiat må fjernes ved hjælp af ko-lonnechromatografi (Sephadex G-25).

EKSEMPEL 6

Alternativ isolering af A-21978C-blandingen 97 liter fermenteringsmedium, opnået som beskrevet i eksem-30 pel 1, blev filtreret ved hjælp af en filterhjælp (4% Hyflo Super-Cel), og det resulterende filtrat (80 liter) blev omrørt med 2 liter af en ikke-ionisk, macroporøs styren-copo- 148918 59 pyler tværbundet med divinylbenzen (Diaion HP-20 resin,

Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) i 2 timer. Det øvre væskelag blev dekanteret fra, og harpiksen blev vasket med 8 liter vand, hvorefter vandet blev 5 dekanteret fra. Derefter blev harpiksen omrørt med 8 liter acetonitril:vand (15:85) i 15 minutter, og opløsningsmidlet blev fjernet ved filtrering. Derefter blev A-21978C-blandingen elueret fra harpiksen ved at omrøre denne med 8 liter acetonitril:vand (2:3) i 1 time og derefter filtre-10 re. Denne procedure blev gentaget til fjernelse af hele mængden af A-21978C-blanding. De to filtrater blev kombineret og koncentreret i vakuum til en olie. Denne olie blev opløst i et minimalt volumen vand, og der tilsattes to volumener methanol under opvarmning. Derefter tilsat-15 tes 30 volumener acetone til udfældning af A-21978C-blandin-gen. Bundfaldet blev skilt, fra ved filtrering og tørret i vakuum, hvorved der opnåedes 13,6 g rå A-21978C-blanding (570 enheder/mg).

Den rå A-21978C-blanding blev renset ved kolonnechromatogra-20 fi på silicagel. Blandingen (lg) blev opløst i et minimalt volumen vand, og der tilsattes silicagel (Grace 62) til absorption af vandet. Absorbenden udrørtes i acetonitril, og den resulterende opslæmning overførtes til en 1,5 x 40 cm silicagelkolonne (Grace, Grade 62) pakket i acetonitril.

25 Derefter vaskedes kolonnen med acetonitril. Der elueredes med acetonitril:vand (4:1), idet der opsamledes fraktioner af 25 ml. Disse fraktioner blev overvåget som beskrevet i eksempel 3· Fraktionerne 21 til 46, som indeholdt størsteparten af A-21978C-blandingen, blev kombineret, koncen-30 treret til et lille volumen under vakuum og frysetørret til opnåelse af 605 mg ren A-21978C-blanding i form af natriumsaltet (900 enheder/mg).

EKSEMPEL ~7

Fremstilling af A-21978C-blandingen på syreform, 35 7 g A-21978C-blanding på natriumsaltform, fremstilles som 60 148918 beskrevet i eksempel 6, opløstes i 150 ml vand, og der tilsattes 150 ml n-butanol. Opløsningens pH blev indstillet til 3,4 ved hjælp af 2 N saltsyre under omrøring i 1 time. Derefter blev n-butanolfasen skilt fra og koncen-5 treret til en rest i vakuum. Inddampningsresten blev opløst i vand og frysetørret til opnåelse af 6 g A-21978C-blanding på syreform. Saltene af de individuelle A-21978C-faktorer kan omdannes til de tilsvarende syreformer på samme måde.

EKSEMPEL 8 10 Fremstilling af natriumsaltet af A-21978C-blandingen ud fra A-21978C-blandingen på syreform 50 mg A-21978C-blanding på syreform, fremstillet som beskrevet i eksempel 7, opløstes i 5 ml varm absolut ethanol, og der tilsattes dråbevis 1 N natriumhydroxid, indtil op-15 løsningens pH var 9,4. Den resulterende opløsning blev opbevaret ved stuetemperatur natten over. Det herved dannede bundfald blev filtreret fra og tørret i vakuum til opnåelse af 32 mg af natriumsaltet af A-21978C-blandingen.

Ved atomabsorptions spektroskopi viste saltet sig at in-20 denholde 8% natrium.

EKSEMPEL 9

Ved at benytte den i eksempel 8 beskrevne procedure fremstilledes calciumsaltet af A-21978C-blandingen ved at sætte calciumchlorid i ethanol til en ethanolisk opløsning af 25 Ar-21978C-blandingen på syreform.

Mikrobiologisk test af A-21978-fermenteringen og isolerede prøver

Metoden, som benyttedes til at bestemme aktiviteten af A-21978 i fermenteringsmedier og i isolerede prøver, be-30 stod af et papirskive-agardiffusionssystem, hvortil der benyttedes organismen Micrococcus luteus.

148918 61

Podede agar-diffusionsplader fremstilledes ved at pode et nærende agar-medium med en passende koncentration af testkulturen, idet der hældtes 8 ml agar i hver petriskål af plastic (2o x 100 mm).

5 Som reference ved prøven anvendtes et præparat af A-21978C-blandingen. Dette præparat anvendtes på enhedsbasis. En særligt ren A-21978C-blanding indeholder omkring 1250 enheder pr. milligram. Der konstrueredes en dosis-response-standardkurve svarende til et indhold på 150, 75» 40, 20 10 og 10 enheder pr. ml. Som fortyndingsmiddel for standardpræparatet og prøverne anvendtes 0,1 M fosfatpuffer med pH 6,0.

Opløsningerne af prøver og standardpræparat blev overført til papirskiver (12,7 mm) ved hjælp af en automatisk pipet-15 te. Inkubationen foregik ved 30°C i 16-18 timer. De dannede zoner blev aflæst på en modificeret Fischer-Lilly-zone-aflæser.

Claims (1)

148918 Fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk A-21978-blanding, der omfatter faktorerne Cq, C-^, Cg, Cg, og Cg, som har formlen s L-Asp S* V D-Ala Gly * L-Asp D-Ser 1· ^ L-Orn 3MG ίξ ^ Giv L-Kyn v / L-Thr t L-Asp ? L-Asp 4» L-Tro NH R 5 hvori 3MG betegner L-threo-3-methylglutaminsyre, og hvor gruppen R for C^· er 8-methyldecanoyl for C2 er 10-methylundecanoyl 10 for Cg er 10-methyldodecanoyl for Cq er C^Q-alkanoyl for C4 er C-^2_alkanoyl for Cg er C^g-alkanoyl, eller komponenter eller salte heraf, kendetegnet ved, at Streptomyces roseosporus 15 NRRL 11379 eller en mutant heraf med væsentlig samme egenskaber dyrkes i et dyrkningsmedium indeholdende