Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku A-21978. Terminem tym okres¬ la sie mieszanine antybiotyków, obejmujaca frakcje A, B, C, D i E. Wynalazek dotyczy szczególnie wytwarzania nowego antybiotyku A-21978C, który jest mieszanina indywidualnych sTkladników Co, Ci, C2, C3, C4, i C5, jak równiez soli tych zwiazków.Choc znanych jest wiele czynników przeciwbak- teryjnych istnieje stale zapotrzebowanie na nowe antybiotyki, o "lepszym dzialaniu. Antybiotyki róz¬ nia sie skutecznoscia oddzialywania na chorobo¬ twórcze organizmy, a przy tym obserwuje sie wzrost liczby szczepów opornych na antybiotyki obecnie stosowane. Ponadto indywidualni pacjenci silnie reaguja na pewne antybiotyki, wskutek nad¬ wrazliwosci i/lub efektów toksycznych.Antybiotyki A-21978 sa scisle zblizonymi budowa peptydowymi antybiotykami o charakterze kwas¬ nym. Znane dotychczas antybiotyki tej klasy obej¬ muja krystalomycyne, amfomycyne, zaomycyne, , aspartocyne i glumamycyne (patrz T. Korzybski, Z. Kowszyk-Gindifer i W. Kurylowicz, „Antibio- tics-Origin, Nature and Properties", Vol. I, Per- gamon Press, New York, N. Y., 1967 str. 397^101 i 404—408); tsushimycyne (J. Shoji i inni, J. Anti- biotics 21, 439—443 (1968); laspartomycyne (H. Na- ganawa i inni, J. Antibiotics 21, 55 (1968)); bre- wistyne (J. Shoji i T. Kato, J. Antibiotics 29, 380— —389 (1976)); cereksyne A (J. Shoji i inni, J. Anti¬ biotics 29, 1268—1274 (1976) oraz cereksyne B !• 11 30 (J. Shoji i T. Kato, J. Antibiotics 29, 1275—1280 (1976)). Sposród powyzszych, najbardziej zblizony¬ mi do nowych antybiotyków A-21978C sa brewisty- na, cerestyna A i cerestyna B.Termin „mieszanina" jest stosowany w dziedzinie fermentacji, a niniejszym opisie dotyczy miesza¬ niny produkowanych lacznie indywidualnych czyn¬ ników antybiotycznych. Jak wiadomo fachowcom w dziedzinie fermentacyjnego wytwarzania anty¬ biotyków, liczba i udzial indywidualnych czynni¬ ków w mieszaninie antybiotycznej sa zmienne, w zaleznosci od zastosowanych warunków fermen¬ tacji. W mieszaninie A-21978C skladnikami glów¬ nymi -sa Ci, C2 i C3, a skladnikami ubocznymi Co, C4 i C5.Substancje antybiotyczne wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa w niniejszym opisie arbitral¬ nie okreslone terminem „A-21978". Termin ten obejmuje mieszaniny A-21978 i A-21978C, indywi¬ dualne skladniki mieszaniny A-21978C, tj. Co, Ci,' C,2 C3, C4 i C5 oraz dopuszczalne w farmacji sole powyzszych substancji.Spoisobem wedlug wynalazku mieszanine anty¬ biotyków A-21978 otrzymuje sie przez podpo- wierzchniowa, aerobowa hodowle Streptorr^ces roseosporus NRRL 11379 lub mutanta tego szczepu, w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla weg¬ lowodanów, azotu i nieorganicznych soli.Po uzyskaniu znaczacego poziomu czynnosci antybiotycznej, mieszam ne A-21978 wydziela sie 122 756122 756 przez przesaczenie brzeczki fermentacyjnej, obni¬ zenie pH przesaczu do okolo 3, co powoduje wy¬ tracenie mieszaniny i odsaczenie. Wytracona mie¬ szanina moze byc dalej oczyszcza sposobami ek- straktycyjnymi. Do wyodrebnienia mieszaniny A-21978C i indywidualnych jej skladników ko¬ nieczne jest zastosowanie chromatografii.Antybiotyki A-21978 otrzymywane sposobem wedlug wynalazku hamuja wzrost bakterii choro¬ botwórczych, zwlaszcza bakterii gramdodatnich.Widma absorpcji w podczerwieni (w KBr) anty¬ biotyków A-21978C (w postaci soli sodowych) sa przedstawione na zalaczonych rysunkach, na któ¬ rych fig. 1 dotyczy mieszaniny A-21978C, a fig. 2—7 odpowiednio skladników Ci, C2, C3, Co, C4 i C5 tej mieszaniny.- Skladniki mieszaniny A-21978C, tj. C0, Ci, C2,t C3, C4 i C5 sa scisle zblizonymi budowa antybiotykami fcolipeptydowymi o .'charakterze kwasnym, podsta¬ wionymi rodnikiem acylowym kwasu tluszczowego w terminalnej grupie aminowej. Hydroliza kazdego ze skladników daje nastepujace aminokwasy: 1 Eminokwas 1 kwas asparaginowy *) glicyna alanina seryna treonina tryptofan ornityna kymirenina 1 kwas 3-metyloglutamino- wy**} . Liczba moli 4 2 ¦1 1 1 ' * ' 1 1 1 1 : *) moze byc jeden mol asparaginy **) moze byc 3-metyloglutamina Kazdy ze skladników mieszaniny A-21978C za¬ wiera rodnik .acylowy kwasu tluszczowego. W tab¬ licy 1 zestawiono liczbe atomów wegla i podano nazwy chemiczne tych kwasów, których struktura zostala zbadana. .* Tablica 1 A-21978C Skladnik Ci c2 c, Co C4 C5 Liczba atomów wegla Cu C12 .C13 C10 C« Cl2 Nazwa chemiczna kwas 7-metylononano- karboksylowy-1 kwas 9-metylodekano- karboksylowy-1 kwas 9-metyloundeka- nokarboksylowy-1 — — — lt 15 35 40 45 50 Substraktywna analiza Edmana wykasuje, ze N-terminalnym aminokwasem jest tryptofan, a nas¬ tepnym, przylegajacym do niego czlonem jest kwas asparaginowy.Spektrografia masowa sprzezona z chromato¬ grafia gazowa wykazuje dla skladnika C2 dwie mozliwe sekwencje aminokwasów, mianowicie: 1) C11H23CONH - Trp--Asx-Thr-Gly-Orn-Asx-Ala- -Asx-Gly-Ser-MeGlx-Kyn. 2) C11H23CONH - Trp-Asx-Thr-Gly-Orn-Asx-Ala- -Asx-Asx-Gly-Ser-Me-Glx-Kyn.(Asx oznacza kwas asparaginowy lub asparagine, a MeGlx oznacza kwas 3-metyloglutaminowy lub 3-metyloglutamine).Enzymatyczna hydroliza skladnika C2 za pomoca karboksypeptydazy Y wykazuje, ze C-terminalnym aminokwasem jest kynurenina i ze C-terminalna grupa karboksylowa tego aminokwasu moze estry¬ fikowac grupe wodorotlenowa treoniny.Na podstawie powyzszych badan nieobowiazujaco przyjeto dla antybiotyków A-21978C strukture przedstawiona wzorem 1, w którym. 3 MG oznacza kwas L-treo-3-metyloglutaminy, a R oznacza rod¬ nik acylowy kwasu tluszczowego. Znaczenie szcze¬ gólowe rodnika R jest nastepujace: x A-21978C skladnik Ci:7-metylononakarbonylowy C2:9-metylodekanokarbonylowy C3:9-metyloundekanokarbo- nylowy Co:Cio-alkanokarbohylowy* C4:Ci2-alkanokarbonylowy* C5:Ci2-alkanokarbonylowy* * struktura nie okreslona Mieszanina A-21978C i poszczególne jej sklad¬ niki (o postaci soli sodowych) sa rozpuszczalne w wodzie i w roztworach kwasnych i zasadowych, w zakresie pH powyzej okolo 3,5; w nizszych alko¬ holach, jak metanol, etanol, propanol i butanol; oraz w dwumetyloformamidzie, dwumetylosulfotlenku, dioksanie i czterowodorofuranie. W acetonie, chloro¬ formie, eterze dwuetylowym, octanie etylu i roz¬ puszczalnikach weglowodorowych rozpuszczalnosc ich jest mala lub w ogóle nie sa rozpuszczalne.A-21978C i poszczególne skladniki mieszaniny w postaci soli sa rozpuszczalne w wodzie, metanolu, dwumetyloformamidzie i dwumetylosulfotlenku lecz nie sa rozpuszczalne w takich rozpuszczalnikach jak etanol, butanol i dioksan.W tablicy 2 zestawiono przyblizony procentowy sklad elementarny . poszczególnych skladników A-21978C w postaci soli sodowych.Tablica 2 Pierwia¬ stek wegiel wodór azot tlen sód*) Co obliczono 52,61 , 6,07 ' 13,63 26,28 1,40 znale¬ ziono 52,07 5,95 12,73 25,84 3,41 Ci obliczono 1 52,89 6,14 13,52 26,06 1,39 znale¬ ziono | 52,47 5,93 13,38 26,19 2,03 °2 Doliczono 53,17 6,21 13,41 25,84 1,38 znale- ziono\ 51,87 6,05 13,66 , 25,86 1 2,56 | °3 obliczono 53,44 6,28 13,29 25,63 1,36 | znale¬ ziono 54,18 6,35 ' 13,34 25,06 1,07 C4 znale¬ ziono 52,73 5,99 14,07 25,81 1,40 1 Cs 1 znale- 1 ziono 52,76 6,71' 13,97 25,60 0,96 | *) z róznicy5 122 756 6 Widma absorpcji w podczerwieni mieszaniny A-21978C i jej skladników (w postaci soli Na) w KBr przedstawiono na fig. 1—7 zalaczonych rysun¬ ków. W tablicy 3 zestawiono najwazniejsze maksi¬ ma absorpcji.Tablica 3 Maksima widm w podczerwieni (cm-1) mieszaniny A-21978C i jej skladników 1 Miesza¬ nina 3310 3050 2910 2840 1655 1540 1450 1395 1310 1240 1160 1065 745 645 555 | 518 Co 3300 3050 2910 2840 1650 1540 1445 1395 1215 115^ 1060 .745 Ci 3300 3040 2910 2840 1650 1535 1450 1395, 1220 1160 1065 745 C2 3310 3050 2910 2840 1665 1535 1450 1400 1225 , 1160 1065 745 c3 3310 3040 2910 2835 1650 1535 1450 1395 1225 1160 1060 745 c4 3320 3050 2920 2850 1655 1525 1455 1395 1220 1160 1065 740 C5 3300 3045 2910 2840 1650 1525 1445 1390- 1215 1155 1055 735 Ciezary czasteczkowe i wzory sumaryczne sklad¬ ników A-21978C zestawiono w tablicy 4.Tablica 4 A-21978C skladnik Co Ci c2 c3 c4 | C5 Ciezar czasteczkowy 1622 1636 1650 1664 1650 1650 ' Wzór sumaryczny C72H100N16O27 C73H102N16O27 .C74H104N16O27 C75H106N16O27 C74H104N16O27 C74H104N16O27 | - W tablicy 5 zestawiono maksima absorpcji w wTidmie w nadfiolecie trzech glównych skladników A-21978C (w postaci soli sodowych) w etanolowym roztworze o odczynie obojetnym.Tablica 5 Maksima w widmie w nadfiolecie (obojetny roztwór etanolowy) E lem 'nm 223 260 280 290 1 360 c 307 62 39 * 35 33 c2 303 62 % 41 36 33 C3 1 300 63 42 38 32 1 W tablicy 6 zestawiono dane miareczkowania elektrometrycznego, z oznaczenia w 66'% wodnym dwumetyloformamidzie, dla trzech glównych sklad¬ ników A-21978C i dla mieszaniny A-21978C (w pos¬ taci soli sodowych).Tablica 6 A-21978C skladnik Ci ** skladnik C2 ** skladnik C3 ** mieszanina Wartosci pK *a 1 5.7 5,9 5.8 5,93 5,73 5,75 5,62 7,16 7,2 7,6 7,6 7,63 7,54 7,58 * wszystkie skladniki wykazywaly slabiej zaznaczone pKa w zakresie 11,5—12 ** dwa oznaczenia W tablicy 7 zsumowano wartosci skrecalnosci optycznej skladników A-21978C (soli Na), [a]^ , oz¬ naczone w roztworze wodnym.Tablica 7 Skrecalnosc optyczna A-21978C Skladnik Co Ci c2 C3. c4 C5 +11,9° +16,9° +18,6° +20,9° +14,8° +17,9° Skrecalnosc ' (c 0,7; (c 0,7; (c 0,9; (c 0,4; (c 0,7; (c 0,7; H20) H2O) H20) H20) H20) H20) Skladniki A-21978C mozna rozdzielic wysoko- sprawna chromatografia cieczowa (HPLC) w naste¬ pujacych warunkach: kolumna: szlana, 1X21 cm, wypelnienie: zel krzemionkowy/Ci8 (Quantum BP-I) rozpuszczalnik: woda (metanol) acetonitryl (95:30:75) zawierajace 0,2% kwasu octowego i 0,2% pirydyny, detektor: absorpcja w nadfiolecie przy 285 nm cisnienie: 7 atmosfer.Czasy retencji skladników A-21978C (soli Na) zsumowano w tablicy 8.Tablica 8 Czasy retencji w HPLC A-21978C Skladnik Co Ci C4 c2 C5 C* Czas (minut) 6 8 9 13 14 19 Oznaczenie biologiczne (Micrococcus luteus,), jednostek/mg 966 1663 1410 1390 1246 803 Mieszanine A-21978C mozna wydzielic z miesza¬ niny A-21978 i odróznic od skladników A, B, D i E za pomoca chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na zelu krzemionkowym. Korzystnym ukladem roz¬ wijajacym jest acetonitryl:woda (3:1), a korzyst¬ nym sposobem wykrywania bioautografia z zastoso¬ waniem szczepu Micrococcus luteus. Wartosci Rf skladników A-21978 (w postaci soli sodowych) zes¬ tawiono w tablicy 9. 10 15 20 X 30 35 40 45 50 55 607 122 756 8 Tablica 9 A-21978 skladnik A B C mieszanina D Wartosc Rf 0,66 0,57 0,31 0,51 we C1-C4 alkiloamoniowe i hydroksy-C2-C4-alkilo- aminowe. Przykladami takich soli sa powstale w wyniku reakcji antybiotyku A-21978 z wodorotlen¬ kiem amonu, metyloamina, IIrz.-butyloamina, izo- s propyloamina, dwuetyloamina, dwuizopropyloami- na, etanoloamina, trójetyloamina, 3-aminopropaiio- lcm-1 i podobne. 1 E 0,48 1 Skladniki mieszaniny A-21978C mozna rozdzielic i rozróznic najdogodniej za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (Quan- tum Cis). Korzystnym ukladem rozwijajacym jest mieszanina woda/metanol/acetonitryl (45:15:40) za¬ wierajaca 0,2% pirydyny i 0,2% kwasu octowego.Detekcje mozna prowadzic w dlugofalowej czesci promieniowania nadfioletowego (365 nm). Przybli¬ zone wartosci Rf skladników A-21978C (soli sodo¬ wych) w powyzszym ukladzie zestawiono w tabli¬ cy 10.Tablica 10 A-21978C sklad Co : -Ci. • c2 c* c« c* —» I Wartosc Rf 1 0,71 0,64 0,56 0,47 0,63 0,53 | Skladniki i mieszanina A-21978C sa trwale w roztworach o pH 2—9 w 5°C w 25°C w ciagu co naj¬ mniej 7 dni. Przy pH 11 pelna inaktywacja naste¬ puje w ciagu 4 godzin, zarówno w 5PC, jak i w 25°C.Mieszaniny A-21978 i A-21978C oraz indywidual¬ ne skladniki mieszaniny A-21978C, tj. Co, Ci, C2, C^, C4 i C5 tworza sole. Wytwarzanie tych soli rów¬ niez wchodzi w zakres wynalazku. Takie sole sa uzyteczne np. w rozdzielaniu i oczyszczaniu mie¬ szanin i indywidualnych skladników. Szczególnie uzyteczne sa sole dopuszczalne w farmacji. Solami „dopuszczalnym w farmacji" sa takie, których tok¬ sycznosc wobec zwierzat cieplokrwistych nie jest wieksza od toksycznosci wolnych zwiazków.Antybiotyki A-21978 maja piec wolnych grup karboksylowych, które moga tworzyc sole. W za¬ kres wynalazku 'wchodzi wytwarzanie soli czes¬ ciowych, mieszanych i pelnych tych zwiazków.Przy wytwarzaniu tych soli nalezy unikac wartosci pH powyzej 10, poniewaz przy takim pH antybio¬ tyki sa nietrwale.Antybiotyki A-21978 maja równiez 2 wolne gru¬ py aminowe i dlatego moga tworzyc addycyjne sole z jedna lub dwiema czasteczkami kwasu.Szczególnie uzyteczne sposród dopuszczalnych w farmacji sa sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych i sole z aminami. Reprezentatywnymi i odpowiednimi solami metali alkalicznych i me¬ tali ziem alkalicznych antybiotyków A-21978 sa sole sodowe, potasowe, litowe, cezowe, rubinowe, barowe, wapniowe i magnezowe. Odpowiednimi solami aminowymi antybiotyków A-21978 sa sole amonowe oraz sole pierwszo-, drugo i trezciorzedo- Sole antybiotyków A-21978 z kationami metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych sporzadza !• sie konwencjonalnymi sposobami otrzymywania takich soli. Przykladowo, skladnik d mieszaniny A-21978C rozpuszcza sie w odpowiednim rozpusz¬ czalniku, jak cieply metanol lub etanol, a do roz¬ tworu dodaje stechiometrycznej ilosci odpowiedniej 15 nieorganicznej zasady w uwodnionym metanolu.Wytworzona sól mozna wyodrebnic sposobami ru¬ tynowymi, np. przez odsaczenie lub odparowanie rozpuszczalnika.* W podobny sposób mozna otrzymac sole z orga¬ nicznymi aminami. Przykladowo, do roztworu skladnika Ci antybiotyku A-21&78C w odpowied¬ nim rozpuszczalniku, jak aceton, mozna wprowa¬ dzic gazowa lub ciekla amine; rozpuszczalnik i nad¬ miar aminy mozna odpedzic przez odparowanie.Reprezentatywnymi i odpowiednimi addycyjnymi solami antybiotyków A-21978 z kwasami sa sole otrzymywane w standardowych reakcjach z kwa¬ sami organicznymi i nieorganicznymi, jak np. sol- 33 ny, siarkowy, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, maleinowy, fumarowy, pal¬ mitynowy, cholowy, pamoinowy, sluzowy, D-glu- taminowy, d-kamforowy, glutarowy, glikolowy, ftalowy, winowy, laurynowy, stearynowy, calicy- jj Iowy, metanosulfonowy, benzenosulfónowy, sorbo- wy, pikrynowy, benzoesowy, cynamonowy i po¬ dobne.W farmacji weterynaryjnej dobrze wiajiomo, ze postac antybiotyku podawanego zwierzeciu zwykle 40 nie ma wiekszego znaczenia. W wiekszosci przy¬ padków warunki w organizmie zwierzecia zmie¬ niaja postac leku w inna niz ta, w jakiej zostal podany. Nie ma wiec wiekszego znaczenia, w pos¬ taci jakiej soli zostaje lek podany. Postac soli 45 mozna jednakze dobierac kierujac sie wzgledami ekonomicznymi, latwoscia wytwarzania i toksycz¬ noscia.Mikroorganizm. Mikroorganizm stosowany w spo¬ sobie wedlug wynalazku byl badany i scharaktery- 60 zowany przez Fredericka P. Mertza i Ralpha E. Kastnera z Lilly Research Laboratories.Nowy organizm, uzyteczny w wytwarzaniu anty¬ biotyków A-21978C zostal wyodrebniony z próbki gleby zebranej na górze Ararat w Turcji. Organizm zostal sklasyfikowany jako nowy szczep Strepto- myces roseosporus, Falcao de Morias i Delia Main 1961. Klasyfikacja opiera sie na porównaniu z pub- liowanymi opisami (R. E. Buchanan i N. E. Gib- bons, „Eergey's Manual of Determinative Bacterio- logy", The Williams and Wilkins Company, wyda¬ nie ósme, 1974 i E. B. Shirling i D. Gottlieb, „Co- operative Description of Type Strairis of Strepto- myces, „Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 65 808—809 (1972)). 55 60 A B C mieszanina D E 0,66 0,57 0,31 0,51 0,48122 756 9 10 W klasyfikacji zastosowano sposoby zalecane dla International Streptomyces Project (E. B. Shirling i D. Gottlieb, „Methods of Characterization of Streptomyces Species", Intern. Journal of Syste- matic Bacteriol. 16, 313—340 (1966) oraz pewne próby dodatkowe. Utylizacje wegla zbadano na po¬ zywce podstawowej ISP 9, do której dodano zródla wegla w ilosci odpowiadajacej koncowemu steze¬ niu 1%. Zródla wegla sterylizowano przez saczenie, a pozywke podstawowa przez autoklawowanie.Plytki odczytywano po 14 dniach inkubacji w 30°C.Cukry sciany komórkowej oznaczono zmodyfiko¬ wanym sposobem Lechevaliera (M. P. Lechewalier, „Chemical Methods as Criteria fos the Separation of Aciinomycetes into Genera", praca finansowana przez Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, dr thomas G Pridham, Convenor; wykonana w Institute of Microbiology, Rutgers Univer-sity, Uniwersytet Stanowy New Jersey, New Brunvwick, New Jersey, 1971). Izomer kwasu dwuaminopimelinowego ozna¬ czono sposobem Beckera i innych (B. Becker i inni „Rapid Differentation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Celi hydrolysate", Appel. Microbiol. 11, 421—423 (1961)), fklad aminokwasowy oznaczono dla prze¬ mytych fragmentów scian komórkowych.Pi meiity melanoidowe oznaczono stosujac ISP=1 (ekstrakt drozdzowy z tryptonem), ISP=6 (agar z peptonem, ekstraktem drozdzowym i zelazem) iv ¦? = 7 (agar tyrozynowy), ISP = 7 zmodyfikowany (ISP= 7 bez tyrozyny) i próbka tyrozynowa (Yuzuru Mikami i inni, „Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces", Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 27 (3) 290 (1977). Hydrolize skrobi oznaczono przez badanie obecnosci skrobi za pomoca jodu.Zakres temperatury, tolerancje na NaCl, za¬ kres pH i wrazliwosc na antybiotyki oznaczono stosujac pozywke agarowa ISP = 2. Zakresem tem¬ peratury bylo 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 i 55°C.Tolerancje na NaCl oznaczono dodajac do agaru NaCl w ilosci 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 i 12P/o. Próby irJlubowano w 30°C. Zakres pH mierzono dopro¬ wadzajac agar do pH 3,0—11,0, w odstepach 1,0 jednostki, bezposrednio przed rozlaniem. Wrazli¬ wosc na antybiotyki oznaczono stosujac krazki na¬ kladane na posiane plyty agarowe.Nazwy barw przyjeto wedlug ISCC-NBS (K. L.Kelly i D.B. Judd, „The ISOC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Na- mes", U. S. Department of Comerce Corc. 553, Washington D. C, 1955).Liczby w nawiasach sa oznaczeniami wedlug serii barw Tresnera i Backusa (H. D. Tresner i E. J.Backus, „System of Color Wheels-for Streptomy- cc-te Taxon©my", Appl. Microbiol. 11, 335—338 (1936). W nawiasach kwadratowych podano ozna¬ czenia barw wedlug Maerza.i M. R. Paul, „Dictio¬ nary of Color", McCraw-Hill Book Company, Inc., New York, N. Y., 1950).Charakterystyka szczepu wytwarzajacego A-21978.Morfologia. Morfologia szczepu A-21978.6 wytwa¬ rzajacego antybiotyki A-21978 sklada sie ze sporo- forów klasyfikowanych jako Rectus-Flexibilis (RF).Lancuchy zarodników inaja 10 zarodników. Po¬ wierzchnia zarodników jest gladka.Hodowla A-21978.6 charakteryzuje sie wytwarza- 5 niem glównie masy zarodników powietrznych bar¬ wy czerwonej, w odwrocie czerwonawobrazowej.Obecny jest równiez rozpuszczalny w wodzie jas- nobrazowy pigment. Ta charakterystyka ujawnia sie na 3 sposród 14 pozywek agarowych (ISP = 2, io ISP = 7, TPO. Tylko na tych pozywkach wystepuje obfity wzrost powietrzny i wegetatywny.Dwie pozywki agarowe, ISP = 4 i agar glukozo- wo-asparaginowy, wytwarzaja mase zarodników powietrznych barwy bialej do szarej, w odwrocie u zóltej. Nie obserwuje sie rozpuszczalnego w wodzie pigmentu. Na tych dwóch pozywkach wystepuje dobry lecz nie obfity wzrost powietrzny i wegeta¬ tywny.Na 9 innych pozywkach agarowych wzrost i za- 20 rodnikowanie byly slabe lub zadne. Wzrost po¬ wietrzny, jezeli wystepowal, mial zabarwienie biale do szarego.Pigmenty melanoidowe nie wystepowaly. Glów¬ nymi skladnikami sciany komórkowej byly: u LL-DAP, glicyna, glukoza i ryboza. Wskazuje to na sciane komórkowa typu J i wzór cukrowy typu C (R. E. Buchanan i N. E. Gibbons, wydawcy, „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams and WOkins Company, wydanie M ósme, 1974, strona 658).W próbkach laboratoryjnych porównano A-21978.6 z nastepujacymi piecioma szczepami: Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 u Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891 Streptomyces moderatus ISP 5520; ATCC 23443 Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23^58 Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497 Szczepy te naleza do serii barwy bialej i czer- 40 wonej, morfologie sporoforów maja typu RF, Org- namentacje powierzchni sporów gladka i, wedlug opisów ISP, sa melaminowo ujemne i nie maja j wyraznej barwy odwrotu ani rozpuszczalnych w j wodzie pigmentów. Powiyzsza charakterystyka, u lacznie z 'wzorcem utylizacji wegla i innymi drugo- rzedowymi cechami, odiwjwiada cechom Szczepu A-21978.6.Po porównaniu powyzszych szczepów z A-21978.6 w warunkach laboratoryjnych odrzucono cztery.M S. Candidus i S. setonii wykazywaly mase sporów powietrznych barwy zóltej na wielu pozywkach, rózniac sie tym od szczepu A-21978.6. S. albovina- ceus i S. moderatus wykazywaly ciemna, wyrazna barwe odwrotu i rozpuszczalne w wodzie pigmenty 55 i wytwarzaly pigmenty melanoidowe, czym róznily sie od szczepu A-21978.6. Opis ISP.S. moderatus po¬ daje, czerwonawobrazowe lub silnie brazowe za¬ barwienie odwrotu, lecz brak tych danych w opisie S. albovinaceuous. Zaden z powyzszych szczepów nie jest melaninowo dodatni.Na podstawie uzyskanych danych -sklasyfikowa¬ no A-21978.6 jako szczep Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias i Dalia Maia 1961. Klasyfikacje gg oparto na porównaniu z- opublikowanymi opisami122 756 11 12 i bezposrednich porównaniach laboratoryjnych. Po¬ nizsza charakterystyka hodowlana podsumowuje bezposrednie badania porównawcze.Tablica 11 Charakterystyka szczepu Morfologia A 21978.6 S. roseosporus Sposofory proste do sprezystych (RF), nie obserwuje sie haczyków, petli lub spiral. Lancuchy zarod¬ ników 10. Powierzchnia zarodników gladka, z oznaczenia skaningowa spektroskopia elektronowa zarodniki: srednie wymiary: zakres: podluzne do owalnych 0,85X1,78 pM 0,65—0,97X0,97 — 2,6 pM podluzne do cylindrycznych 1,01X2,47 pM 0,97—1,3X1,63—3,25 pM Tablica lla Charakterystyka szczepu A-21978.6 S. roseosporus wzrost barwa wzrost barwa powietrzny: dobry wegetatywny: obfity powietrzny: dobry wegetatywny: obfity powietrzny: dosta¬ teczny wegetatywny: dobry [—10A1] powietrzny: obfity (R) 5cb wegetatywny: obfity [5D10] powietrzny: dosta¬ teczny wegetatywny: dosta¬ teczny powietrzny: dobry wegetatywny: dobry powietrzny: dosta¬ teczny wegetatywny: dobry przekrój marchwi szara c rózowa I brak brazowa | dobry brak rozpuszczalnego pig¬ mentu przekrój ziemniaka szara c rózowa I brak brazowa [ dostateczny ciemnobrazowy rozpuszczal¬ ny pigment ISP = 1 (agar z tryptonem i ekstraktem drozdzowym) (W) a biala skapy skapy [10E2] jasnozóltozielona brak rozpuszczalnego pig¬ mentu ISP = 2 (agar z ekstraktem z drozdzy i slodu obfity (R) 3ca czerwonobrazowa | obfity [12L7] jasnobrazowy rozpuszczalny pigment ISP = 3 (agar z maka owsiana) (W) a biala skapy dostateczny [10A2] blada zóltorózowa jasnobrazowy rozpuszczalny pigment ISP = 4 (agar z nieorganicznymi solami i skrobia) (W) bbiala I dobry [lObl] blada zóltozielona obfity ISP = 5 (agar z gliceryna i asparagina) (W) 13ba purpurowawobiala [3b7] zóltorózowa rozpuszczalny pigment sza- roworózowy dostateczny dobry brak zóltobrazowa brak rozpuszczalnego pig¬ mentu brak pomaranczowobroazowa brak rozpuszczalnego pig¬ mentu (W) a biala jasnozóltozielona brak rozpuszczalnego pig¬ mentu jasnopomaranczowozólta jasnooliwkowobrazowa jasnobrazowy rozpuszczalny pigment (W) a biala blada zielonkawoszara brak rozpuszczalnego pig¬ mentu (R) 3c2 blada pomaranczo- wozólta [1115] szarawozólta brak rozpuszczalnego pig¬ mentu (W) b biala [10C2] szarawozólta rozpuszczalny pigment jasno¬ brazowy122 756 16 Tablica 13 Charakterystyka Pigmenty melanoidowe ISP # 1 (tryptoii-ekistrakt z drozdzy) ISP #6 (pepton-efcstrakt z drozdzy-zelazo) ISP # 7 (agar tyrozynowy) ISP # 7 zmodyfikowany (ISP 7 bet tyrozyny) uplynnianie zelatyny dzialanie odtluszczonego mleka hydroliza skrobi zakres pH zakres temperatury redukcja azotanów tolerancja na NaCl; wzrost do A-21978.6 — — — — nieznaczna hydroliza + 5—11 25^lO°C — 10% S. roseosporus — — — — nieznaczna hydroliza + 5—11 25—45°C + 6% | Tablica 14 Wrazliwosc na antybiotyki Antybiotyk erytromycyna cefalotyna linkomycyna nystatyna polimyksyna B streptomycyna | tetracyklina wankomycyna Stezenie/krazek 15 /xg 30 fig 2 fig 100 jednostek 300 jednostek io m 30 fig 30 [ig Klasa makrolid /Maktam glikozyd polien peptyd aminoglikozyd tetracyklina glikopeptyd A-21978.6 + + — — + + + + S. roseosporus + + — — —. + + i + + = wrazliwy (strefy hamowania) — = oporny (brak stref hamowania) Pewne cechy charakterystyczne wytwarzajacego A-21978 szczepu S. roseosporus NRRL 11379 sa rózne od opisanych dla S. roseosporus, dotyczy to wielkosci zarodników, wzrostu na przekrojonej marchwi i ziemniaka, tolerancji na NaCl i redukcji azotanów.Szczep Streptomyces reseosporus uzyteczny w produkcji antybiotyków A-21978 zostal zdeponowa¬ ny i stanowi czesc zbiorów mikroorganizmów Northern Regional Research Center, U. S. Depart¬ ment of Agriculture, Agricultupral Research Service, Peoria, Illinois, 61604, gdzie jest ogólnie dostepny pod numerem NRRL 11379.Jak w przypadku innych organizmów, charakte¬ rystyka wytwarzajacego A-21978 szczepu Strepto¬ myces reseosporus NRRL 11379 ulega zmianom.Przykladowo, sztuczne warianty i mutanty szczepu NRRL 11379 mozna otrzymac dzialajac róznymi znanymi czynnikami mutagennymi, jak promienio¬ wanie nadfioletowe, promieniowanie rentgenowskie, fale wysokiej czestotliwosci, promieniowanie radio¬ aktywne i pewne zwiazki chemiczne. W sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac wszystkie na¬ turalne i sztuczne warianty i mutanty Strepto¬ myces roseosporus NRRL 11379, które wytwarzaja antybiotyki A-21978.Jako pozywke do hodowli Streptomyces rese¬ osporus NRRL 11379 mozna stosowac jakakolwiek sposród pozywek znanych. Jednakze ze wzgledu na ekonomie wytwarzania, optymalne wydajnosci i latwosc wyodrebniania produktu, pewne pozywki sa korzystne. Tak wiec np. korzystnym zródlem wegla w fermentacji na duza skale jest dekstryna tapiokowa, aczkolwiek mozna stosowac glukoze, fruktoze, galaktoze, maltoze, mannoze, olej nasiona bawelny , oleinian metylu, gliceryne, rafinowany olej sojowy i podobne. Korzystnym zródlem azotu jest enzymatycznie hydrolizowana kazeina, lecz mozna stosowac rozpuszczalny pepton miesny, make sojowa, hydrolizat sojowy, kasze sojowa, drozdze, aminokwasy, jak L-asparagine i DL-leu- cyne i podobne. Jako nieorganiczne sole odzywcze mozna do pozywek hodowlanych wprowadzac roz¬ puszczalne sole dostarczajace jonów potasu, amonu, chlorkowych, siarczanowych, azotanowych i podob¬ nych. Szczególnie uzyteczny w wytwarzaniu anty¬ biotyków jest K2S04. Uzyteczne sa równiez takie produkty jak popiól z melasy, dializat popiolu i syntetyczne mieszanki mineralne.Pozywke fermentacyjna do wytwarzania anty¬ biotyków A-21978 korzystnie sporzadza sie na wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Niektóre sposród nieorganicznych skladników wody wodo¬ ciagowej, jak np. wapn i weglany, niekorzystnie wplywaja na wytwarzanie antybiotyku.Do pozywki hodowlanej nalezy wprowadzac rów¬ niez podstawowe pierwiastki sladowe, konieczne dla wzrostu i rozwoju organizmu. Takie pierwiastki$ 122 756 17 18 sladowe zwykle wystepuja jako zanieczyszczenia w innych skladnikach pozywki, w ilosciach wys¬ tarczajacych do pokrycia zapotrzebowania wzrasta¬ jacego mikroorganizmu.Konieczne moze byc dodanie malej ilosci (np. 5 0,2 ml/L) czynnika przeciwpiennego jak glikol poli¬ etylenowy, jezeli pienienie staje sie problemem w fermentacji prowadzonej na duza skale.Do wytwarzania znacznych ilosci antybiotyków A-21978 korzystne sa tanki do podpowierzchniowej io fermentacji aerobowej. Male ilosci antybiotyków A-21978 mozna otrzymywac w hodowli w kolbach na trzesawce. Z powodu opóznienia w wytwarzaniu antybiotyków, zwykle zwiazanego z inokulacja du¬ zych tanków organizmem w postaci zarodników, 15 korzystne jest stosowanie inokulum wegetatywne¬ go. Inkulum wegetatywnego sporzadza sie inkulu- jac mala objetosc pozywki hodowlanej zarodnikami lub fragmentami grzybni organizmu, otrzymujac swieza, aktywnie wzrastajaca hodowle. Inokulum 20 wegetatywne przenosi sie nastepnie do wiekszego tanku.Hodowle organizmu wytwarzajacego A-21978 mozna prowadzic w 20 do okolo 37°C. Optymalne wytwarzanie A-21978C wysteguje w zakresie okolo 25 30^32°C.Jak zwykle w procesach podpowierzchniowej ho¬ dowli aerobowej, przez pozywke hodowlana prze¬ puszcza sie sterylne powietrze. Dla wydajnego wytwarzania antybiotyków A-21978, nasycone po- 30 wietrzem w fermentacji w tanku winno byc ponad 20%, korzystnie ponad 30% (w 30°C i pod cisnie¬ niem 1 atmosfery).W fermentacji prowadzonej w tanku korzystnie jest utrzymywac pH pozywki fermentacyjnej w za¬ kresie okolo 6,5—7,0. Mozna to uzyskac dodajac od¬ powiedniej ilosci np. wodorotlenku sodu (we wczes¬ nych stadiach) i kwasu solnego (w stadiach póz¬ niejszych).Wytwarzanie antybiotyków A-21978 mozna sle¬ dzic w trakcie fermentacji badajac próbki brzeczki lub ekstrakty stalej grzybni na czynnosc antybio- tyczna wobec organizmów znanych z wrazliwosci na antybiotyki. Jednym z organizmów testowanych uzytecznych w badaniach tych antybiotyków jest Micrococcus luteus. Oznaczenia biologiczne korzyst¬ nie prowadzi sie za pomoca krazków bibuly na plytach agarowych.Po wytworzeniu w warunkach podpowierzchnio¬ wej fermentacji aerobowej, antybiotyki A-21978 mozna wyodrebnic z pozywki fermentacyjnej spo¬ sobami uznanymi w dziedzinie fermentacyjnej.Czynnosc antybiotyczna wytworzona w trakcie fer- Tablica 15 MIC ^g/ml 35 40 45 50 mentacji organizmu wytwarzajacego A-21978 zwy¬ kle wystepuje w brzeczce. Maksymalnego odzysku antybiotyków A-21978 dokonuje sie zwykle po wstepnym odsaczeniu masy grzybni. Przesaczona brzeczke mozna oczyscic róznymi sposobami, otrzy¬ mujac mieszanine A-21978. Korzystny sposób obej¬ muje ekstrakcje i wytracanie mieszaniny A-21978.Dalsze oczyszczanie i wydzielanie mieszaniny A-21978 i indywidualnych skladników obejmuje dalsze zabiegi adsorpcyjne i ekstrakcyjne. Uzytecz¬ nymi materialami adsorpcyjnymi do oczyszczania mieszaniny A-21978 i jej skladników sa: 1) zywice anionitowe — a) silnie zasadowe; polisterynowe Bio-Rad AG 1 i 2, Bio-Rex, Dowex 1 i 2, Amber- lite IRA 400, 401, 410; srednio zasadowe; epoksypo- liaminowa Biorex i Dualite A30B; c) polistyrenowe lub fenolowe poliaminy Bio-Rad AG3, Duolite A-6, A-7, Amberlite IRA-68, IR-45, IR-4B; 2) zel krze¬ mionkowy; 3) florisil; 4) adsorbenty polimeryczne (XAD-2 i 4); 5) polimer wysoce porowaty (Diaion HP-20); 6) Spehadex G-10, G-25 i G-50, Bio-Gel P-2 i PIO; 7) zywice z odwróconymi fazami, zel krze¬ mionkowy (Cis i zel krzemionkowy C8); 8) wegiel; 9) celuloza DEAE, Sephadex DEAE; 10) poliamidy; 11) tlenek glinu; oraz 12) mikroceluloza. Zródla: zywice Bio-Rad i Bio-Gel-Bio Rad Laboratories, Richmond, Cal., Zywice Amberlite i XAD — Rohm and Haus Co, Philadelphia, Pa.; zywice Duolite — Diamond Sharmrock Chemical Co., Redwood City, Cal.; zywice Sephadex Pharmacia Fine Chemi¬ cals AB, Uppsala, Szwecja, zywice Dowex — Dow Chemical co., Midland, Mich.; Diaion — Mitsu¬ bishi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japonia; zywice XAD, zel krzemionkowy (Ci8 i zel krze¬ mionkowy/Cs — E. Merck, Darmstadt, RFN.Alternatywnie, jako zródlo antybiotyku mozna uzyc stale skladniki hodowli, w tym skladniki po¬ zywki i grzybni, bez ekstrakcji lub rozdzialu, lecz korzystnie po usunieciu wody. Przykladowo, po wytworzeniu aktywnosci antybiotycznej A-21978 po¬ zywke mozna wysuszyc przez liofilizacje i wmie¬ szac bezposrednio do przedmieszki paszowej.Mieszanina A-21978C i jej indywidualne sklad¬ niki byly stosowane w omawianych próbach w pos¬ taci soli sodowych.Mieszaniny A-21978 i A-21978C oraz indywidu¬ alne skladniki mieszaniny A-21978C, tj. Co, Ci, C2, C3, C4 i C5 hamuja wzrost pewnych organizmów chorobotwórczych, zwlaszcza bakterii gramdodat- nich. Najmniejsze stezenie hamujace (MIC), przy których mieszanina A-21978C i jej skladniki hamu¬ ja wzrost wybranych bakterii, oznaczone standar¬ dowym sposobem rozcienczen na agarze, sa zesta¬ wione w tablicy 15.Organizm (aerobowy) Staphylococcus aureus 3055 Streptococcus 282 grupa D Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumoniae Park I Viridnas Streptococcus 9943 , Meisseria gonorrhoeae 111076-4 Miesza¬ nina 0,13 0,25 0,13 0,13 0,5 8,0 Co 1,0 2,0 0,25 0,5 1,0 NT* Ci 0,5 1,0 0,13 0,13 0,5 16,0 C2 0,13 0,25 0,13 0,25 1,0 4,0 c3 0,06 0,13 0,25 0,13 0,5 4,0 c4 0,25 1,0 0,13 0,5 1,0 NT C5 0,13 0,13 0,06 0,06 0,13 NT | ? NT = nie badano19 122 756 23 Najmniejsze stezenie hamujace, przy jakim mie¬ szanina A-21978C i jej glówne skladniki hamuja wzrost i wybranych bakterii, oznaczone w prób¬ kach rozcienczen w bulionie, sa zestawione w tab¬ licy 16.W jednym z waznych aspektów, antybiotyki A-21978C hamuja wzrost organizmów opornych na inne antybiotyki. W tablicy 17 zsumowano wartosci MIC z rozcienczen na agarze dla skladników Co, Ci, C2, C3 i C5 antybiotyku A-21978C wobec repre¬ zentatywnych organizmów.Tablica 16 MIC (//g/ml) Organizm (aerobowy) Staphylococcus aureus 3055 Streptococcus 282 grupa D Streptococcus pyogenes C101 Streptococcus pneumoniie Park I Viridans Strep¬ tococcus 9943 Mieszanina 0,25 0,25 0,13 0,5 8,0 Ci 1,0 2,0 0,5 2,0 3?-,0 c2 0,5 1,0 0,25 1,0 16,0 c3 0,13 0,13 1 0,13 0,5 32,0 !122 756 23 24 Antybiotyki A-21978C hamuja równiez wzrost ników Ci, C2 i C3 wobec róznych bakterii anaerobo- pewnych bakterii anaerobowych. W tablicy 14 zest- wych, oznaczona standardowa próba rozcienczen na tawiono czynnosc mieszaniny A-21978C i jej sklad- agarze.Tablica 18 MIC mcg/ml Organizm testowy Actinomyces israelii Clostdidiub perfringens Clostridium sep- ticum Eubacterium se- rofaciens Peptococcus asac- charolyticus Peptococcus pre- voti Peptostreptococ- cus anaerobius Peptostreptococ- cus intermedius Propionibac- terium acnes Bacterioides fra- gilis Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum Co 2 2 4 4 4 4 0,25 2 1 128 4 2 Ci 4 16 4 16 4 2 2 4 8 128 128 64 c2 1,0 8 1,0 8 2 1,0 1,0 1,0 2 128 128 64 c3 1,0 8 1,0 4 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 128 16 32 . c4 1,0 1,0 1,0 2 1,0 2 0,25 1,0 0,5 128 4 4 C5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,25 128 2 0,5 Mieszanina 1,0 8 1,0 8 1,0 0,5 1,0 . i,o 2 128 128 128 Skladniki mieszaniny A-21978C wykazaly czyn¬ nosc in vivo wobec doswiadczalnych zakazen bak¬ teryjnych. Przy podawaniu badanego zwiazku myszy w dwóch dawkach w ilustratywnych zaka¬ zeniach, obserwowana czynnosc mierzono jako wartosc EDso (dawka efektywna w mg/kg, chro- Tablica 19 Porównanie czynnosci in vitro i in vivo Antybiotyk A-21978Ci A-21978C2 A-21978C3 A-21978C0 A-21978C4 A-21978Cs A-21978C mie¬ szanina erytromycyna Staphylococcus aureus MIC1 0,5 0,13 0,06 0,13 0,13 ED5o2 0,22 0,16 0,08 0,18 0,5 Streptococcus pyogenes MIC 0,13 0,13 0,06 0,25 0,13 0,06 0,03 0,13 ED502 0,064 0,032 0,032 0,16 0,10 0,053 0,043 0,64 ED508 93 59 66 Streptococcus pneumoniae MIC 0,13 0,13 0,03 0,5 0,5 0,06 0,13 0,5 ED502 0,3 0,14 0,09 0,88 0,36 0,17 0,1 7,3 niaca 50°'0 badanych zwierzat: patrz Warren Wiek i inni, J. Bacteriol. 81, 233—235 (1961)). Wartosci ED50 obserwowane dla mieszaniny A-21978C i jej skladników Ci, C2, C3, Co, C4 i C5 podano w tab¬ licy 15. 1 MIC =? najmniejsze stezenie hamujace wg/ml, rozcienczenie na agarze 2 podanie podskórne 3 podanie doustne25 122 756 26 W waznym aspekcie wynalazku, skladniki A-21978C i mieszanina A-21978C sa skuteczne w lecezniu zapalenia odmiedniczkowo-nerkowego.Przykladowo, w doswiadczalnym zstepujacym za¬ paleniu odmiedniczkowio-nerkowym u szczurów, skladniki A-21978C daly ochrone lepsza od dawa¬ nej przez wankomycyne. W tej próbie zastosowano hodowle bakteryjna Streptococcus faecalis (Guze).Hodowle prowadzono na agarze tryptykazowo- -sojowym (BBL), zawieszonym w bulionie do in- fuzji mózgowo-sercowej (BBL), podzielonym na porcje 0,2 ml i zamrozonym w cieklym azocie. Za¬ wiesiny bakteryjne do inokulacji szczura sporza¬ dzano codziennie, przez posianie w 50 ml kolbach z bulionem tryptykazowo-sojowym (BBL) z zamro¬ zonej ampulki i inkubacje hodowli w ciagu nocy w 37°C na wstrzasarce. Hodowle S. faecalis roz¬ cienczono do 5X108 jednostek koloniotwórczych w ml. Badane zwiazki wstrzykiwano podskórnie raz dziennie w ciagu 7 dni. Wszystkie zwiazki za¬ wieszano w 0,125% karbdksymetylocelulozie.Doswiadczalne zakazenie szczura przeprowadzano nastepujacym sposobem: samice bialego szczura (Cox Wistar) o wadze 190 do 210 g znieczulano przez dootrzewnowa injekcje 12 mg methohexitalu sodu, uzupelniona w razie potrzeby. Doswiadczalny model zapalenia odmiedniczkowo-nerkowego byl ii 29 oparty na badaniach Guzego i Beesona, w których na 20 minut zamykano lewy moczowód, a nastepnie do zyly udowej wprowadzono 0,5 ml organizmu .testowego. Terapie przeciwbakteryjna zaczynano 4 do 5 godzin po zakazeniu. W 4 godziny po ostat¬ nim zabiegu szczury usmiercano, pobierano lewa nerke i homogenizowano ja w mlynie Dualla, za¬ wierajacym 9 ml fizjologicznego roztworu soli.Odpowiada to rozcienczeniu tkanki nerkowej 10—*.Dodatkowe 10-krotnie rozcienczenia w solance opierano na oczekiwanym stezeniu komórek bakte¬ ryjnych w homogenacie tkankowym. Z kolei z kil¬ ku z tych rozcienczen sporzadzano podwójne plyty agarowe, które inkubowano w ciagu nocy w 37°C.Wyniki terapeutyczne wyrazano dwoma sposobami: (1) jako procent szczurów, u których liczba komó¬ rek bakteryjnych w przeliczeniu na gram tkanki nerkowej wynosila mniej niz 102, uznawanych za „wyleczone" oraz (2) jako procent szczurów z co najmniej 4-logio obnizeniem miana bakteryjnego w porównaniu z zakazonymi nerkami kontrolnymi.Szczury kontrolne traktowano jedynie 0,125% kar- boksymetyloceluloze. W przypadku tkanki nerko¬ wej z kontrolnych szczurów miano S, faecalis wy¬ nosilo od 1,2X108 do 4,6X108 na gram homogenizo¬ wanej tkanki. Wyniki powyzszych badan zesta¬ wiono w tablicy 16.Tablica 20 Badania zstepujacego zapalenia odmiedniczkowo-nerkowego u szczura, wywolanego przez Streptococcus faecalis Badany antybiotyk 1 wankomycyna A-21978Ci A-21978C2 A-21978C3 | A-21978C kompleks MIC1 //g/ml 1,0 1,0 0,25 0,13 0,25 Dawka2 mg/kg wagi szczura X 7 12,0 1,0 1,0 1,0 1,0 % szczurów z mianem obnizenia 4-log 55 50 100 78 89 N % szczurów wyleczonych 33 50 89 78 89 1 1 Wrazliwosc in vitro S. 2 Podanie podskórne Faecalis szczep Guze Dane dotyczace toksycznosci mieszaniny i glów¬ nych skladników A-21978C zestawiono w tablicy 17.Tablica 21 Toksycznosc A-21978C LD50 (mg/kg) i A-21978C skladnik Cj skladnik Cs skladnik Cs mieszanina Mysz dozylnie 250 150—250 <50 150 podskórnie 365 175 70—75 175—190 Szczur dozylnie 1 479±32 204±17 ' <160 1 169±10 ' 50 55 Jako czynnik przeciwbakteryjny, A-21978C mie¬ szanina lub indywidualne skladniki moga byc po¬ dane doustnie lub pozajelitowo. Jak to jest jasne dla fachowców, mieszanine lub indywidualne sklad¬ niki A-21978C podaje sie lacznie do farmaceutycz¬ nie dopuszczalnym nosnikiem lub rozcienczalni¬ kiem. Dawka A-21978C, mieszaniny lub skladnika, bedzie zalezna od róznych czynników, jak np. natu¬ ry i stopnia leczonego zakazenia. Dla fachowców jest oczywiste, ze odpowiedni zakres dawkowania i/lub dawke jednostkowa mozna okreslic na podstawie wartosci MIC i ED50 oraz danych dotyczacych tok¬ sycznosci, biorac pod uwage takie czynniki jak ga¬ tunek zakazonego organizmu i mikroorganizmu za¬ kazajacego. ;* ¦ Antybiotyki A-21978C sa uzyteczne równiez jako czynniki promotujace wzrost zwierzat. Np. w przy¬ padku kurczat mieszanina A-21978C polepsza przy¬ rost wagi i wydajnosc zywienia. W tablicy 18 zes¬ tawiono wyniki dwóch prób wykazujacych te czyn¬ nosc. W próbach tych mieszanine A-21978C poda¬ wano zwierzetom w stezeniu 25 g na tone paszy.Antybiotyk podawano w badaniach powtarzanych w czasie czterem replikom po 8 ptaków (lacznie 8 replik po 8 ptaków lub 64 ptaki). Próby prowa¬ dzono w ciagu 21 dni, a rozpoczynano ja na pta¬ kach w wieku 7—28 dni. Uzyskane dane (przyrost wagi, konsumpcja paszy i wydajnosc zywienia) porównano z uzyskanymi w 40 replikach prowa¬ dzonych równoczesnie badan kontrolnych.29 122 756 30 ¦Przesacz metanolowo-acetonowy, zawierajacy po¬ zostala czesc mieszaniny A-21978 (frakcje A i B) odparowano do pozostalosci, która rozpuszczono w mieszaninie IIIrz.butanol/H20 (5:1), a roztwór liofi¬ lizowano, otrzymujac 169 g mieszaniny A-21978.Przyklad III. A. Oczyszczanie mieszaniny A-21978C.Surowa mieszanine A-21978C (734 g), otrzymana jak opisano w przykladzie II, zawieszono w wodzie (25 litrów). Za pomoca 5 N NaOH doprowadzono mieszanine do pH 6,5, co spowodowalo calkowite rozpuszczenie materialu. Roztwór naniesiono na kolumne zawierajaca 20 litrów zywicy jonitowej (IRA 68, Rohm and Haas Co.) w cyklu octanowym.Kolumne przemyto 4 objetosciami wody (108 lit¬ rów), a nastepnie 5 objetosciami 0,1 N kwasu octo¬ wego (135 litrów). Material czynny eluowano 0,5 N kwasem octowym, zbierajac frakcje objetosci okolo 120 litrów, które badano na czynnosc biologiczna.Frakcje o duzej czynnosci polaczono i liofilizo¬ wano, otrzymujac 278 g brazowo zabarwionej mie¬ szaniny A-21978C (1100 jednostek/mg); frakcje o ,-malej czynnosci polaczono, otrzymujac 238 g brazowo zabarwionej mieszaniny A-21978C (S80 jed¬ nostek/mg).B. Dalsze oczyszczanie mieszaniny A-21978C.Czesc bardziej czynnej mieszaniny A-21978C (150 g) z kolumny IRA-68 zawieszono w wodzie (600 ml); zawiesine doprowadzono do pH 6,5, calko¬ wicie rozpuszczajac zawieszony material. Dodano suchego zelu krzemionkowego, w takiej ilosci, by calkowicie zaabsorbowac roztwór wodny. Wilgotny preparat zelu krzemionkowego wprowadzono do 30 litrowej kolumny z zelem krzemionkowym Gra¬ ce j62 (10X375 cm), upakowanym w acetonitrylu (zel krzemionkowy uprzednio przemyto woda, w celu usuniecia drobnych czastek, z kolei kolumne zaladowano zelem krzemionkowym zawieszonym w wodzie i przemyto 30 litrami acetonitrylu). Po zaladowaniu kolumne przemyto acetonitrylem (15 litrów) i rozwinieto mieszanina acetonitryl/woda (4:1), zbierajac frakcje o objetosci okolo 4 litrów.Elucje kontrolowano oznaczeniami czynnosci biolo¬ gicznej i chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym (CH3CN:H20 (3:1), z wywolaniem biologicznym. Frakcje zawierajace jedynie miesza¬ nine A-21978C (frakcje 43—60) polaczono, odparo¬ wano pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizowano, otrzymujac 86,2 g oczyszczonego kompleksu A-21978C (1160 jednostek/mg) barwy zóltobrazowej.Frakcje 21—29, zawierajace czynniki D i C, pola¬ czono i liofilizowano, otrzymujac 13 g zóltej barwy proszku o malej czynnosci biologicznej.Tak otrzymana oczyszczona mieszanine A-21973C (30 g) dalej odbarwiono, zawieszajac w minimalnej objejtosci wody i mieszajac z mala iloscia zelu krzemionkowego (typ LP-1, 10—20 mikronów, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield.N. J. 07606). Wilgotna mieszanine zelu krzemionko¬ wego zawieszono w mieszaninie acetonitryl/meta¬ nol (4:1) i upakowano w szklanej kolumnie wpro¬ wadzajacej o wymiarach 4X30 cm, przylaczonej do 'kolumny szklanej o wymiarach 6,5X82 cm, zawie¬ rajacej 2,8 litra zelu krzemionkowego (Quantum WM) upakowanego w mieszaninie acetonitryl/me¬ tanol (4:1) (zel krzemionkowy uprzednio przemyto kolejno woda i mieszanina acetonitryl/metanol (4:1) pod cisnieniem 3,5—4,2 atmosfer). Kolumne wprowadzajaca i kolumne glówna przemyto 3 lit- 5 rami mieszaniny acetonitryl/metanol (4:1), pod cis¬ nieniem 3,5 atmosfer. Material czynny eluowano mieszanina acetonitryl/metanol/woda (55:20:25), zbierajac 300 ml frakcje. Elucje kontrolowano ana¬ liza biologiczna (Micrococcus luteus). Frakcje ie 14—25, o najwyzszej czynnosci, polaczono, zawezono i liofilizowano, otrzymujac 24 g jasnozóltej barwy,, czystej mieszaniny A-21978C w postaci soli sodo¬ wych (1250 jednostek/mg). Mniej czynne frakcje 20—32 polaczono, zatezono i liofilizowano, otrzy- 15 mujac 1,6 g mniejszej czystosci mieszaniny A-21978C (780 jednostek/mg).Przyklad IV. Wyodrebnianie skladników A-21978C.Oczyszczona mieszanine A-21978C (2 g), otrzy¬ ma mana jak opisano w przykladzie III, rozpuszczono w wodzie i za pomoca., pompy (FMI LAB Pump, Fluid Metering, Inc. 48 Summit St., Oyster Bay, NY 11771) pod cisnieniem 3,5 atmosfer naniesiono » na kolumne 4,1X60 cm z zelem krzemionkowym 25 o odwróconej fazie (Quantum LP-1 zel krzemion- kowy/Ci8 w ukladzie woda/metanol/aeetonitryl (100:15:85); zawierajacym 0,15% kwasu octowego i 0,15% pirydyny. Tym ukladem rozpuszczalników eluowano kolumne pod cisnieniem 4,5 atmosfer, 30 zbierajac frakcje objetosci 25 ml. Elucje skladni¬ ków kontrolowano przez pomiar absorpcji w swietle nadfioletowym przy 280 nm i analiza bio¬ logiczna. Indywidualne frakcje badano na kolumnie analitycznej na czystosc skladnika. Typowy roz- 35 dzial przedstawial sie nastepujaco: itakcje 33—37 zawieraly skladnik Co, frakcje 45—-531 zawieraly skladnik Ci, frakcje 75—92 zawiferaly skladnik C2, frakcje 112—134 zawieraly skladnik Cj, frakcje 54—74 zawieraly skladniki Ci, C2 i C^. a frakcje 40 93—111 zawieraly skladniki C2, C3 i Cs. Frakcje zawierajace mieszaniny skladników ponownie prze¬ puszczono przez kolumne, otrzymujac dalsSe, Up$ci skladników Ci, C2 i C3 oraz C4 i C5. Frakcje zawie¬ rajace jeden skladnik laczono, zatezono pod zirmiej- m szonym cisnieniem i liofilizowano, otrzymujac .jas¬ nozóltej barwy proszek kazdego ze skladników (w postaci soli sodowej). Z 60 g mieszaniny otrzy¬ mano: skladnika Ci — 5,55 g, skladnika Ct,•— 10; g, skladnika C3 — 6,61 g. Frakcje zawierajace mie¬ szaniny skladników ponownie przepuszczono przez kolumne z zywica o odwróconej fazie, otrzymujac dodatkowo skladnika Cb — 550 mg, skladnika Ci— 1,29 g, skladnika C2 — 1,99 g, skladnika Ot — 443 mg, skladnika Ca — 512 mg, skladnika C5 — 55 384 m2- Przyklad V. Wydzielanie i oczyszczanie skladników A-21978C na duza skale.Na wieksza skale skladniki rozdzielono chroma¬ tografia kolumnowa z odwrócona faza. Czysta mieszanine A-21978C (6 g), otrzymana jak opisano w przykladzie III, rozpuszczono w wodzie (80 ml).Za pomoca kwasu octowego doprowadzono roztwór do pH 4,4 i dodano czterowodorofuranu (20 ml).Roztwór przepompowano pod niskim cisnieniem cg (pompa Lapp) na kolumne stalowa (4,8X100 cm) \122 756 31 32 zawierajaca 1,77 litra nosnika zel krzemionko¬ wy/Cis (Quantum L-P-l, 10—20 mikronów, sililowa- ny oktadecylotrójchlorosilanem) upakowanego w mieszaninie woda/czterowodorofurnn (THF) (4:1).Kolumne przemyto pod cisnieniem okolo 7 atmos- 5 fer 150 ml mieszaniny H20/THF (4:1), a nastepnie pod cisnieniem okolo 7 atmosfer mieszanina woda/ /metanol/acetonitryl (47,5:15:37,5), zawierajaca 0,2% pirydyny i 0,2% kwasu octowego, z szybkoscia przeplywu 35 ml minuta, zbierajac frakcje obje- l0 tosci 175 ml. Elukcje kontrolowano w sposób ciagly na przyrzadzie zapisujacym z detektorem promie¬ niowania nadfioletowego 280 nm. Frakcje zawiera¬ jace pojedyncze skladniki, z polozenia pików na wykresie, dalej badano na kolumnie analitycznej M z zywica o odwróconej fazie. Frakcje zawierajace pojedynczy skladnik laczono i liofilizowano. W ty¬ powym przebiegu frakcje 12—16 zawieraly sklad¬ nik Co, frakcje 20—26 zawieraly skladnik Ci, frak¬ cje 38—50 zawieraly skladnik C2, frakcje 63—78 n zawieraly skladnik C3. Frakcje 27—37 (zawierajace skladniki Ci i C4) i frakcje 51—62 (zawierajace skladniki C2 i C5) ponownie przepuszczono przez kolumne, otrzymujac czyste skladniki C4 i C5. Na • kolumne wprowadzono 6—12 g materialu. Z 84 g M mieszaniny A-21978C otrzymano sumarycznie 1,9 g Co, 2,27 g Ci, 4,97 g C2 i 1,94 g C3. Wyzsze wydaj¬ nosci indywidualnych skladników uzyskano przez poddanie frakcji mieszanych wysokocisnieniowej chromatografii cieczowej w odpowiednim ukladzie 30 rozpuszczalników. Uklad dobierano w zaleznosci od skladu rozdzielanego, zywicy o odwróconej fazie i kolumny.Do rozdzialu mieszaniny A-21978C na indywidu- ^ alne skladniki nadaja sie nastepujace uklady: A. Uklady analityczne woda/metanol/acetonitryl (50:15:35) zawierajacy 0,2% kwasu octowego (HOAc), doprowadzony piry¬ dyna do pH5,5, 40 woda/metanol/acetonitryl (50:15:35) zawierajacy 0,2% HOAc i 0,2% pirydyny, woda/metanol/acetonitryl (50:15:35) zawierajacy 0.75% mrówczanu amonu, woda/metanol/acetonitryl (95:30:75) zawierajacy 45 0,2% HOAc i 0,2% pirydyny, woda/metanol/acetonitryl (105:15:80) zawierajacy 0,2% HOAc i 0,2% pirydyny, woda:metanol:THF (59:15:25) zawierajacy 0,5% HOAc i 0,5%pirydyny, w woda:metanol:THF (60:15:25) zawierajacy 0,5% mrówczanu amonu.B. Uklady preparatywne woda:metanol:acetonitryl (95:20:85) zawierajacy 0,15% HOAc i 0,15% pirydyny, 55 woda : metanol : acetonitryl (100:15:85) zawieraja¬ cy 0,15% HOAc i 0,15% pirydyny, woda : metanol : acetonitryl (50:10:40) zawierajacy 0,1% HOAc i 0,1% pirydyny, woda : metanol : acetonitryl (50:15:35) zawierajacy 0,75% mrówczanu amonu, woda : metanol : acetonitryl (55:10:35) zawierajacy 0,2% HOAc i 0,89/o pirydyny, woda : metanol : THF (52,5:15:32,5) zawierajacy 0,6% mrówczanuamonu, 65 60 woda : metanol : THF (50:15:35) zawierajacy 0,6% mrówczanu amonu.Przewaga ukladów z kwasem octowym i pirydy¬ na nad ukladami z mrówczanem amonu przejawia sie tym, ze te pierwsze mozna usunac w trakcie liofilizacji, natomiast usuniecie mrówczanu amonu w/m?.sfa zastosowania chromatografii kolumnowej (Sephacex G-25).Przyklad VI. Alternatywny sposób wyodreb¬ niania mieszaniny A-21978C.Calosc brzeczki fermentacyjnej (97 litrów), otrzy¬ manej jak opisano w przykladzie I, przesaczono z dodatkiem pomocniczego materialu filtracyjnego (4% Hyflo Super-Cel). Otrzymywany przesacz w ciagu 2 godzin mieszano z 2 litrami niejonowego, makroporowatego polistyrenu sieciowanego dwu- winylobenzenem (zywica Diaion HP-20, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japonia). Ciecz zdekantowano, zywice przemyto woda (2 litry) od¬ rzucajac popluczyny. Nastepnie w ciagu 15 minut mieszano zywice z 8 litrami mieszaniny acetonit- ryl/woda (15:85); rozpuszczalnik odsaczono. A-21978C eluowano z zywicy mieszajac ja w ciagu godziny z 8 litrami mieszaniny acetonitryl/woda (2:3), z nas¬ tepnym odsaczeniem zywicy. Zabieg powtórzono, odzyskujac calosc mieszaniny A-21978C. Oba prze¬ sacze polaczono i pod zmniejszonym cisnieniem za- tezono do oleju, który rozpuszczono w minimalnej objetosci wody. Do podgrzanego roztworu dodano 2 objetosci metanolu, a nastepnie 30 objetosciami ace¬ tonu wytracono mieszanine A-21978C. Produkt od¬ saczono i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 13,6 g surowej mieszaniny A-21978C (570 jednostek/mg).Surowa mieszanine A-21978C oczyszczono chro¬ matografia kolumnowa na zelu krzemionkowym.Mieszanine (1 g) rozpuszczono w minimalnej obje¬ tosci wody; dodano zelu krzemionkowego (Grace 62) w ilosci wystarczajacej do zaadsorbowania wody, po czym zawieszono adsorbent w acetonitrylu. Za¬ wiesine wprowadzono do kolumny 1,5X40 cm z ze¬ lem krzemionkowym (Grace 62) upakowanym w acetonitrylu. Kolumne przemyto acetonitrylem, a antybiotyk eluowano mieszanina acetonitryl/woda (4:1) zbierajac 25 ml frakcje. Kontrole elucji pro¬ wadzono jak opisano w przykladzie III. Frakcje 21 do 46, zawierajace wiekszosc mieszaniny A-21978C, polaczono, pod zmniejszonym cisnieniem zatezono do malej objetosci i liofilizowano, otrzymujac 605 mg oczyszczonej mieszaniny A-21978C w potaci soli sodowych (900 jednostek/mg).Przyklad VII. Wytwarzanie mieszaniny A-21978C (postac kwasu).Mieszanine A-21978C w postaci soli sodowych (7g), otrzymana jak opisano w przykladzie VI, roz- pu.szcz.or.:w wodzie (150 ml), a do roztworu dodano — n-butar.clu (150 ml). Za pomoca 2 N HC1 doprowa¬ dzono roztwór do pH 3,5 i mieszano go w ciagu godziny. Faze n-butanolu oddzielono i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowano do pozostalosci, która rozpuszczono w wodzie i liofilizowano, otrzy¬ mujac 6 g mieszaniny A-21978C (postac kwasu).Tym samym sposobem w postac kwasu przeprowa¬ dza sie sole indywidualnych skladników P-21978C.33 122 756 34 Przyklad VIII. Wytwarzanie soli sodowej mieszaniny A-21978C z mieszaniny A-21978C w postaci kwasu.Mieszanine A-21978C w postaci kwasu (50 mg), otrzymana jak opisano, w przykladzie VII, rozpusz¬ czono w cieplym absolutnym etanolu (5 ml), wkrap- laniem 1N NaOH doprowadzono roztwór do pH 9,4 i w ciagu nocy utrzymywano w temperaturze pokojowej. Wytracony produkt odsaczono i wysu¬ szono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 32 mg mieszaniny A-21978C (sole sodowe). Z ozna¬ czenia metoda absorpcji atomowej zawartosc sodu wynosila 8%.Przyklad IX. Sposobem opisanym w przy¬ kladzie VIII sporzadzono mieszanine soli wapnio¬ wych A-21978C, dodajac CaCl2 w etanolu do etano- lowego roztworu mieszaniny A-21978C w postaci kwasu.Przyklad X. Oznaczenia mikrobiologiczne przy fermentacji A-21978C i wyodrebnianiu próbek.Oznaczen aktywnosci biologicznej A-21978C w brzeczce fermentacyjnej i próbkach pobieranych przy rozdziale dokonywano sposobem dyfuzji z krazków bibuly do agaru, stosujac jako organizm testowy Micrococcus luteus.Posiadane plyty agarowe sporzadzono inkulujac agarowa pozywke odpowiednia iloscia organizmu testowego i rozlewajac agar w ilosci po 8 ml na plastikowe plytki Petriego o wymiarach 20X100 mm.Jako standard zastosowano preparat mieszaniny A-21978C. Wysoce oczyszczona mieszanina A-21978C zawiera w 1 miligramie okolo 1250 jednostek. Z da¬ nych uzyskanych dla stezen 150-75-40-20-10 jed¬ nostek/ml sporzadzono krzywa wzorcowa. Jako roz¬ cienczalnik standardu i prób stosowano 0,1 M bufor fosforanowy o pH 6,0.Próbki i roztwory standardowe nanoszono na krazki bibuly o srednicy 12,7 mm, za pomoca auto¬ matycznej pipety. Inkubacje prowadzono w 30°C, w ciagu 16—18 godzin. Wielkosc stref .odczytywano za pomoca zmodyfikowanego aparatu Fisher-Lilly Antibiotic Zone Reader. 5 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A-21978, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle io szczepu Streptomyces.roseosporus NRRL 11379 lub jego mutantu wytwarzajacego A-21978, w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla weglowodanów, azotu i nieorganicznych soli, w warunkach podpo- wierzchniowej fermentacji aerobowej, do wytwo- 15 rzenia znacznego poziomu czynnosci antybiotycznej, i mieszanine A-21978 lub jej sól wydziela sie z brzeczki fermentacyjnej. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z mieszaniny antybiotycznej A-21978 wydziela sie 20 mieszanine A-21978C lub jej sól. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z wydzielonej mieszaniny A-21978C wydziela sie skladnik Co lub jego sól. 4. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze ag z wydzielonej mieszaniny A-21978C wydziela sie skladnik Ci lub jego sól. 5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z wydzielonej mieszaniny A-21978C wydziela sie skladnik C2 lub jego sól. 3i 6. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z wydzielonej mieszaniny A-21978C wydziela sie skladnik C3 lub jego sól. 7. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z wydzielonej mieszaniny A-21978C wydziela sie x skladnik C4 lub jego sól. 8. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z wydzielonej mieszaniny A-21978C wydziela sie skladnik C5 lub jego sól.^L-Aspx D-Ala Gly t \ L-Asp D-Ser L-Orn 3MG L-Kyn Gly \ 0 L-Thr t L-Asp t L-Asp t L-Trp I NH I R / i nzor t122 756 v IDU ¥..V C n mi 5 3 « ~A r~ \r krOny \ V f 1 W ^ r i; i< unit iiuil ^\v /-J V\,—s J mikrony £—^_ ""^ 3 < V^~~ » 7 K i j id U U rtlljo rtJtU liczba falowa {D* fig 2 •00 !?l!0 %J 60 j t00 4S0 250 mil-ery 400C J;-00 iOCG Liczba falona '» ' FIG 3 mikrony 3500 M00 2500 2000 fc£*£a palona WD 400 2if £ JS 1_ £iooj 1 mihony t 7 i s ;a t? m w*w :rn " 4000 3500 3000 2SM 20 W !*¦•'•) - mikrony •¦3 30 lCOi) :¦.:¦ :2L0 '"00 iczifl faleza «*'' mikrery 10 l? U W W 70 2SM4C /cczto palona FIG. 7 OZGraf. Z.P. Dz-wo, z. 374 (8D+15) 7.84 Ctna 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL