FI90993B - Menetelmä glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi ja niitä tuottavia mikro-organismiviljelmiä - Google Patents

Description

90993

Menetelmä glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi ja niitä tuottavia mikro-organismiviljelmiä 5 Tämä keksintö koskee menetelmää uusien vankomysii- niryhmän glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi. Erityisesti se koskee antibiootin A82846 ja sen yksittäisten komponenttien Ά82846Α, A82846B ja A82846C valmistusta viljelemällä uusia mikro-organismien kantoja.

10 Vaikka tällä hetkellä on saatavissa monia hyödyl lisiä antibiootteja, tarve löytää parempia antibiootteja ihmislääketieteeseen jatkuu. Esimerkiksi vankomysiini on kaupallisesti menestyksekäs antibiootti, joka on pelastanut monta elämää. Vankomysiini saattaa kuitenkin aiheut-15 taa ongelmia; se voi olla toksinen korville ja munuaisille. Siten tarvitaan antibiootteja, joilla on vankomysii-nin vaikutukset, mutta joiden farmakokinetiikka on parempi tai joilla on vähemmän sivuvaikutuksia.

Tämän keksinnön mukaisesti on nyt keksitty, että 20 erittäin hyödyllisiä glykopeptidiantibiootteja voidaan tuottaa käyttäen Nocardia orientalis -kantojen NRRL 18098, NRRL 18099 tai NRRL 18100 submerssiä aerobista fermentointia viljelyväliaineessa, joka sisältää assimiloitavia hiilen, typen ja epäorgaanisten suolojen lähtei-25 tä. Olemme mielivaltaisesti nimenneet nämä glykopeptidi-antibiootit A82846:ksi sekä sen komponenteiksi.

Antibiootti A82846 on rakenteeltaan samanlainen kuin vankomysiini, mutta sillä on parempi vaikutus in vitro ja in vivo gram -positiivisia bakteereja vastaan 30 samoin kuin parempi farmakokinetiikka, jolloin saadaan paljon pitempi puoliintumisaika kuin vankomysiinin puoliintumisaika .

A82846:n komponenteilla on oleellisesti seuraavat fysikaaliset ja spektraaliset ominaisuudet: 2 A82846A:n ominaisuudet Molekyylipaino: 1556 Empiirinen kaava: o°26C^ FAB-MS (tioglyseroli): (M+1) Saatu: 1557, 5803; 5 laskettu yhdisteelle C^2HgoNl0^26^ = · 5716 (katso kuvio 4) UV (H~0) λ : 281 nm (¢5052), siirtyy 300 nm: iin

^ ItldX

emäksellä IR (KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 10 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 ja 1015 cm"1 (katso kuvio 1) NMR / (CD^SO/: katso kuvio 7 pKa (H20): 4,7, 9,5 (66 % DMF): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4, 12,3 15 (näennäinen molekyylipaino 1542) A82846B:n ominaisuudet Molekyylipaino: 1590

Empiirinen kaava: C73Hq8N1 0°26C1'2 FAB-MS (tioglyseroli): (M+1) Saatu: 1591, 5315; 20 Laskettu yhdisteelle C73Hg9N-jq°26C12 = 1591, 5327 (katso kuvio 5) UV (H~0) X : 280 nm (€ 5192), siirtyy 300 nm:iin emäksellä IR (KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 25 1135, 1105, 1065, 1023 ja 1018 cm 1 (katso kuvio 2) NMR /"(CDg) 2SO_7: katso kuvio 8 pKa (H20): 4,65, 9,5 A82846C:n ominaisuudet Molekyylipaino: 1522 30 Empiirinen kaava: C^gHgQN^Q02g FAB-MS (tioglyseroli): (M+Na) Saatu: 1545, 5998; Laskettu yhdisteelle C73H9QN-j^O^Na = 1545, 5925 (katso kuvio 6) UV (H~0): \ : 280 nm (€.5198), siirtyy 300 nm:iin

i ITlclX

35 emäksellä li 90993 3 IR (KBr): 3600-»3004 (laaja), 2999, 2991, 2950, 1687 —> 1650 (laaja), 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 ja 1014 cm"1 (katso kuvio 3) 5 NMR katso kuvio 9 pKA (H20): 4,6, 9,4 A82846A:n, A82846B:n ja A82846C:n aminohappoanalyy-sit 6 mol/1 HClilla hydrolyysin jälkeen osoittivat aspara-giinihapon ja kahden laajan piikin sekä pienen määrän gly-10 siiniä läsnäoloa. Kaksi piikkiä näyttävät vastaavan aktinoi- diniini- ja vankomysiniiniaminohappoja, joita molelmpia esiintyy vankomysiiniluokan glykopeptideissä.

Vertailevat NMR-tutkimukset osoittavat, että sekä A82846A, A82846B että A82846C sisältävät uuden aminosokerin 15 4-epi-vankosamiini-(3-metyyliakosamiinin):

.rwOR

CHa—-» o CHs

Jr—1 20 HO—V "Ha A82846A:n molekyylikaava vastaa vankomysiinin mole-kyylikaavaa (cg6H75N9°24C12^' 7osta puuttuu yksi klooriato-mi ja jossa on vankosamiinityyppinen ylimääräinen aminoso-25 keri (C?H14N02).

A82846B:n molekyylikaava vastaa A82846A:n molekyyli-kaavaa, jossa vetyatomi on korvattu klooriatomilla.

A82846C:n molekyylikaava vastaa A82846A:n molekyyli-kaavaa, jossa klooriatomi on korvattu vedyllä.

30 A82846:n komponentit näyttävät muodostavan uuden, ylei seltä koostumukseltaan vankomysiinimolekyyliä muistuttavien ja siitä pääasiassa kloorisisällön ja vankosamiinikokoomuksen omaavan ylimääräisen alayksikön esiintymisen suhteen poikkeavien glykopeptidien perheen.

4 A82846:n komponenteilla näyttää olevan seuraavat rakennekaavat:

NHj MO

"Λ ia

* O-^V-CHjOH

5 NH, C ' V-5o

^X· A

ch, | jp 1Γ i jL

m ° h-^°H <?«’

10 O-^/V = NH /N. / " ί*ΝΗ I

TH =^NH--/ NH—____^ \ *H

HN O 0 XL-Η

H"*X Jv / 'H

“Y\ ΓΙ V / o ^-CH· li “* \ 15 hoA^oh Ah A82846A: X = H Y r Cl A82846B : X = Cl Y = Cl 20

A82846C : X = H Y = H

A82846-yhdisteiden sokeriryhmien absoluuttista konfiguraatiota ei ole vielä määritetty.

A82846 ja sen yksittäiset komponentit A82846A, 25 A82846B ja A82846C voivat reagoida edelleen, jolloin muo dostuu erilaisia suoloja. Kaikki näiden antibioottien tällaiset muodot ovat osa tätä keksintöä. A82846-suoloja voidaan käyttää esimerkiksi A82846:n eristämisessä ja puhdistuksessa. Lisäksi suolat liukenevat paremmin veteen.

30 A82846-suolat valmistetaan käyttäen suolojen valmis tuksen normaaleja menetelmiä. Esimerkiksi A82846 voidaan neutraloida sopivalla hapolla, jolloin muodostuu happoad-ditiosuola.

Happoadditiosuolat ovat erityisen käyttökelpoisia.

35 Edustavia sopivia suoloja ovat suolat, joita muodostuu normaaleissa reaktioissa sekä orgaanisten että epäorgaanisten li 90993 5 happojen kanssa, kuten esimerkiksi rikki-, kloorivety-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleii-ni-, fumaari-, kooli-, pamoiini-, lima-, D-glutamiini-, d-kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, muura-5 hais-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe- ja kane-lihapon sekä vastaavien happojen kanssa. Farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat ovat erityisen edullinen ryhmä tämän keksinnön mukaisia suoloja.

10 Antibioottia A82846 voidaan tuottaa viljelemällä A82846:tta tuottavaa Nocardia orientalis-kantaa submers-seissä, aerobisissa olosuhteissa sopivassa viljelyväliai-neessa, kunnes saadaan paljon antibioottista aktiivisuutta. Antibiootti voidaan ottaa talteen käyttäen erilaisia 15 alalla tunnettuja eristys- ja puhdistusmenetelmiä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Tämä keksintö koskee myös mikro-organismin biologisesti puhdistettua viljelmää, joka mikro-organismi voi ol-20 la Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 18100 tai näiden kantojen A82846:tta tuottava jälkeläinen. Nämä mikro-organismit ovat käyttökelpoisia, koska ne tuottavat antibioottia A82846. Seuraavan keskustelun helpottamiseksi NRRL 18098-25 kanta on nimetty viljelmä A82846:ksi, NRRL 18099-kanta on nimetty viljelmä A82846.1:ksi ja NRRL 18100-kanta on nimetty viljelmä A82846.2:ksi. Viljelmä A82846 eristettiin Haitilta saadusta maaperänäytteestä. Viljelmä A82846.1 saatiin viljelmästä A82846 kemiallisen mutageneesin avulla 30 ja viljelmä A82846.2 on viljelmästä A82846 eristetty luonnollinen variantti.

Viljelmät A82846, A82846.1 ja A82846.2 talletettiin ja liitettiin Midwest Area Northern Regional Research Center -laitoksen, Agricultural Research Service, United 35 States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, kantaviljelmäkokoelmaan 6 elokuun 8. päivänä 1986. Viljelmät ovat yleisessä käytössä talletusnumeroilla NRRL 18098 (A82846, lähtökanta), NRRL 18099 (A82846.1, mutanttikanta) ja NRRL 18100 (A82846.2, varian-tinkanta).

5 Viljelmien A82846, A82846.1 ja A82846.2 taksonomiset tutkimukset suoritti Frederick P. Mertz Lilly Research Laboratories -tutkimuslaboratoriosta. Näiden tutkimusten perusteella uudet organismit luokiteltiin Nocardia orientalis -kannoiksi (Pittenger ja Brigham, 1956) Pridham ja Lyons 10 1969, tyyppikanta ATCC 19795 pittenger, R.C. ja Brigham, R.B., "Streptomyces orientalis n. sp., the Source of Vancomycin", Antibiotics and Chemotherapy 6 (1956) 642-647.7. Tämä luokitus perustuu suoriin, laboratoriossa tehtyihin vertailuihin ja julkaistujen kuvausten tutkimisteen 15 /Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos,

Buchanan, R.E. ja Gibbons, N.E., toim., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; Goodfellow, M. ja Schaal, K.P., "Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus" kirjassa Identification Methods for 20 Microbiologists, 2. painos, Skinner, F.A. ja Lovelock, D.W., toim. Society for Applied Bacteriology Technical Series Nro 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, s. 261; Gordon, R.E., Barnett, D.A., Handerhan, J.E. ja Pang, C.H., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica and the Nocardin 25 Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), (1974) 54-63;

Gordon, R.E., Mishra, S.K. ja Barnett, D.A., "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. aarnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis, and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109 (1978) 69-78; Mishra, S.J., Gordon, 30 R.E. ja Barnett, D.A., "Identification of Nocardiae and

Streptomyces of Medical Importance", J. Clin. Microbiol.

11 (6) (1980) 728-736; Mordarska, H. ja Mordarski, M., "Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology 71 (1972) 35 77-86; ja Shinobu, R. ja Kawato, M., "On Streptomyces aerocolonigenes nov. sp.. Forming the Secondary Colonies on the Aerial Mycelia", Bot. Mag. Tokyo 73 (1960) 213-216.7.

90993 7

Seuraavat menetelmät ovat Kansainvälisen Streptomyces-projektin (International Streptomyces Project, ISP) suosittelemia menetelmiä Streptomyces-lajien karakterisoimiseksi /Shirling, E.B. ja Gottlieb, D., "Methods for Characterization 5 of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (1966) 313-3407 sekä työryhmän Gordon, Bamett, Handerhan ja Pang, yllä, suosittelemia menetelmiä Nocardia-lajien karakterisoimi seksi .

Morfologia tutkittiin käyttäen optista valomikros-10 kooppia. Pyyhkäisyelektronimikroskooppia (SEM) käytettiin itiöiden pinnan kuvioiden tutkimiseen.

Resistenssi rifampiinille ja lysotsyymille mitattiin Gordonin ^pordon, R.E. ja Barnett, D.A., "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium 15 and Nocardia as a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol.

27 (3) (1977) 176-178jsuosittelemia menetelmiä käyttäen.

ISCC-NBS Centroid Color Charts -karttoja, vakionäyte nro 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department 20 of Cormmerce, Washington, D.C.) sekä Color Harmony Manual -käsikirjaa (4. painos, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) käytettiin värinimen (color names) määrittämiseksi.

Melanoidipigmentin tuotto (kromogeenisyys) määritet-25 tiin väliaineilla ISP nro 1 (tryptoni-hiivauute -liemi), ISP nro 6 (peptoni-hiivauute -liemi) ja ISP nro 7 (tyrosiini-agar).

Kokonaisten solujen hydrolysaattaen diaminopimeliini-hapon (DAP) isomeerit ja hiilihydraatit määritettiin Becker 30 et al.'n mukaisilla kromatografisilla menetelmillä /Becker, B., Lechevalier, M.P., Gordon, R.E. ja Lechevalier, H.A., "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appi. Microbiol. 12 (1964) 412-423J sekä Lechevalierin mukaisilla 35 kromatografisilla menetelmillä /Lechevalier, M.P., 8 "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med. 71 (1968) 934-944J.

Mykolihapot määritettiin käyttäen Minnikinin kuvaamiin menetelmiin perustuvaa menetelmää ^Minnikin, D.E., 5 Hutchinson, I.G. ja Caldicott, A.B., "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188 (1980) 221-2337.

Fosfataasi ja ureaasi määritettiin Blazevicin kuvaamia menetelmiä käyttäen T^lazevic, D.J. ja Ederer, G.M., 10 Principles of Biochemicals Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, s. 1367· Gelatiinin nesteentymistä käytettiin proteinaasiaktiivisuuden määrittämiseksi.

Antibioottiresistenssi mitattiin laittamalla anti-15 bioottiherkkyyskiekot ympättyjen ISP nro 2 -agarlevyjen pinnalle .

Tärkkelyksen hydrolyysi mitattiin testaamalla jodilla tärkkelyksen läsnäolo ISP nro 4 (epäorgaaniset suolat -tärkkelys) -agarlevyillä (katso Blazevic ja Ederer, yllä).

20 Hippuraattihydrolyysi mitattiin käyttäen Bacto

Differentiation Disks -kiekkoja, jotka nopeasti toteavat hippuraatin hydrolyysin.

Viljelmät A82846 ja A82846.2 kasvoivat hyvin kaikissa monimutkaisissa ja määritellyissä väliaineissa. Nämä vil-25 jelmät tuottivat ilmarihmastoja useimmilla väliaineilla.

Ilmarihmaston itiömassan väri oli valkoinen tai harmaa väliaineesta riippuen. Selvästi erottuvaa ruskeaa, liukoista pigmenttiä tuotettiin monissa väliaineissa; alapuoli (reverse side) oli ruskeasta kellertävänvalkoiseen.

30 Viljelmä A82846.1 kasvoi myös kaikissa käytetyissä väliaineissa, mutta sen kasvu ei ollut niin runsasta kuin emoviljelmän kasvu. A82846.1 tuotti ilmarihmastoja vain harvoin. Kun rihmastoa esiintyi, sen väri oli valkoinen. Satunnaista, ei selvästi erottuvaa, vaaleanruskeaa pigmenttiä 35 tuotettiin muutamissa väliaineissa; alapuolen väri vaihteli ruskeasta kellertävänvalkoiseen.

|j 90993 9

Viljelmien A82846, A82846.1 ja A82846.2 viljelyominaisuuksien yhteenveto on esitetty taulukossa 1. Viljelmät A82846 ja A82846.2 olivat hyvin samanlaiset ja poikkesivat toisistaan vain muutamien viljelyominaisuuksien suhteen.

5 Lisävertailuja ei tehty, koska A82846 ja A82846.2 ovat samankaltaisia ja koska A82846.2 on A82846:n luonnollinen variantti.

Taulukko I

A82846:n, A82846.1:n ja A82846.2:n viljelyominaisuudet eri agar-väliaineissaa'^ 10 _

Agar- A82846 A82846.1 A82846.2 väliaine G: Runsas Runsas (pinta kuoriintuu) Runsas ISP R: 59.d.Br 57.1. Br 58.m.Br ^ nro 2 Am: Runsaasti: g Ei lainkaan Hieman keskiharmaa

Sp: Tummanruskea Ei lainkaan Vaaleanruskea pigmentti - ei _pH:n muutosta___ G: Hyvä Huono Hyvä ISP R: 92.y valkoinen 92.y valkoinen 92.y valkoinen nro 3 Am: Paljon: a Vähän: a Kohtalaises- 20 valkoinen valkoinen ti: a valkoinen _S£j_Ei lainkaan_Ei lainkaan_Ei lainkaan G: Runsas Huono Hyvä ISP R: 56 syvä Br 92.y. valkoinen 77.m. y Br nro 4 Am: Runsaasti: a Vähän: a Paljon:a valkoinen valkoinen valkoinen _Sp:_Ei lainkaan___Ei lainkaan_Ei lainkaan 25 G: Runsas Runsas Runsas ISP R: 47.d.gy.rBr 47.d.gy.rBr 47.d.gy.rBr nro 5 Am: Paljon: d Ei lainkaan Paljon: d vaaleanharmaa vaaleanharmaa _Sjj:_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea

Taulukko I (jatkuu) 10

Agar- A82846 A82846.1 A82846.2 väliaine_ 5 G: Runsas Hyvä Runsas ISP R: 59.d.Br 78.d.yBr 59.d.Br nro 7 Am: Runsaasti: e Hieman Runsaasti: d keskiruskea vaaleanruskea

Sp: Tummanruskea Vaaleanruskea Tummanruskea pigmentti - ei pigmentti pigmentti _E« :n muutosta____ G: Runsas Hyvä Runsas

Czapek's R: 56. syvä Br 47.d.gy.rBr 5b. syvä Br

Am: Runsaasti: a Ei lainkaan Runsaasti: a valkoinen valkoinen

Sp: Ei lainkaan Punaisen oranssi vaalea punaisen- _oranssi_ G: Hyvä Hyvä Hyvä

Glukoosi- R: 58.m.Br (vain lai- 77.m.yBr 58.m.Br 15 asparagii- . kuttain) ni Am: Kohtalaisesti: A Ei lainkaan Ei lainkaan valkoinen _Sp: Ei lainkaan_Ei lainkaan_Ei lainkaan G: Runsas (pinta kuo- Hyvä (ryppyinen, Hyvä (ryppyinen, riintuu) kostea pinta) kostea pinta)

Glukoosi- R: 21. mustanpunainen 77.m.yBr 77.m.yBr 2 Q hiivauute

Am: Ei lainkaan Ei lainkaan Ei lainkaan __S£j_Syvä punaisenruskea Ei lainkaan_Vaaleanruskea G: Hyvä Hyvä Kohtalainen

Ravinto- R: 45.1.gy.rBr 76.1.yBr 79.1.9y.yBr agar Am: Ei lainkaan Ei lainkaan Vähän _Sp: Vaaleanruskea_Ei lainkaan_Ei lainkaan 11

Taulukko I (jatkuu) 90993

Agar- A82846 A82846.1 A82846.2 väliaine_ 5 G: Runsas Runsas Runsas

Tomaatti- R: 47.d.gy.rBr 57. l.Br 47.d.9y.rBr tahnakau- Am: Runsaasti: d Hieman: a Paljon: d rajauhe vaaleanharmaa valkoinen vaaleanharmaa

Sp: Tumma punaisen- Ei lainkaan Punaisenruskea __ruskea_ G: Kohtalainen Kohtalainen Hyvä

Vesijoh- R: 92.y valkoinen 92.y valkoinen 92.y valkoinen tovesi- Am: Kohtalaisesti: Kohtalaisesti: Paljon: a agar a valkoinen b harmaanvalkoinen valkoinen _Sp:_Ei lainkaan_Ei lainkaan_Ei lainkaan G: Kohtalainen (ei Hyvä (hydrolyysiä) Kohtalainen (ei hydrolyysiä) hydrolyysiä)

Kalsium- R: 57.l.Br 58.m.Br 57.l.Br malaatti Am: Hieman Ei lainkaan Hieman 15 _Sp:_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea a G = kasvu; R = alapuoli; Am = ilmarihmasto; Sp =liukoinen pigmentti bInkuboitu 30°C:ssa 21 päivän ajan

Viljelmät A82846, A82846.1 ja A82846.2 tuottivat runsaasti substraattirihmastoa. Ilmarihmastot muodostivat pitkiä 20 konidiaketjuja, joiden ulkonäkö oli hämähäkinverkkoinainen, mikä on luokiteltu nostreptomycetes-lajien ominaisuudeksi Bergey's Manual of Determinative Bacteriology-käsikirjassa.

Kaikissa viljelmissä itiöiden pinnan kuviointi oli sileä ja itiöt olivat muodoltaan sylinterimäisiä. Itiöiden ^ koko vaihteli välillä 1,2 - 1,3 x 0,4 - 0,5 ^um A82846:llä ja välillä 1,4 - 2,2 x 0,3 - 0,4 ^um A82846.1:llä.

Kasvatettaessa submersseissä olosuhteissa ravistellen A82846 fragmentoitui minimaalisesti, A82846.1 fragmentoitui huomattavasti jaA82846.2 fragmentoitui kohtalaisesti.

^ Sekä A82846 että A82846.1 tuottivat happoa arabinoosis- ta, sellobioosista, dekstraanista, fruktoosista, galaktoosis- ta, glukoosista, oi-metyyli-D-glykosidista, glyserolista, ino- sitolista, laktoosista, maltoosista, mannitolista, mannoosista, melibioosista, ramnoosista, riboosista, sakkaroosista, tre-3 3 haloosista ja ksyloosista, mutta eivät tuottaneet happoa ado-nitolista, selluloosasta, dulsitolista, erytritolista, inulii- 12 nista, sorbitolista eivätkä ksylitolista. A82846 tuotti happoa myös etanolista, glykogeenista, meletsitoosista, raffi-noosista ja salisiinista, kun taas A82846.1 ei tuottanut. Molemmat viljelmät käyttivät asetaattia, sitraattia, laktaat-5 tia, malaattia, oksalaattia, propionaattia, pyruvaattia ja sukkinaattia, mutta eivät käyttäneet bentsoaattia, mukaat-tia eivätkä tartraattia. Viljelmä A82846.1 käytti butyraat-tia, kun taas A82846 ei käyttänyt.

A82846 ja A82846.1 hajoittivat kaseiinia, hypoksan-10 tiinia, tyrosiinia, ureaa ja DNA:ta, mutta eivät hajoitta- neet adeniinia, kalsiummalaattia eivätkä ksantiinia. Molemmat viljelmät hydrolysoivat tärkkelystä, eivät hydroly-soneet eskuliinia eivätkä hippuraattia, pelkistivät nitraattia, tekivät gelatiinin nestemäiseksi, pysyivät hengissä 50°C:ssa 8 tunnin ajan sekä tuottivat katalaasia. I^Ssää 15 ja fosfataasia.

Viljelmillä A82846 ja A82846.1 oli identtiset an-tibioottiresistenssikaaviot. Ne olivat resistenttejä ba-sitrasiinille (10 yksikköä), kefalotiinille (30 ^ug), gen-tamysiinille (10 ^ug), linkomysiinille (2 yug), oleandomy-20 siinille (15 ^ug), penisilliini G:lle (10 yksikköä), strep tomysiinille (10 yug) , vankomysiinille (30 ^,ug) , tobramy-siinille (10 ^ug), erytromysiinille (15 ^ug), nalidiksiini-hapolle (30 ^ug), polymyksiini B:lle (300 yksikköä), trime-topriimille (5 ^ug) sekä sulfadiatsiinille (300 ^ug) ja 25 olivat herkkiä neomysiinille (30 ^ug), rifampisiinille (5 yug), tetrasykliinille (30 yug), kloramfenikolille (30 yug), novobiosiinille (30 yUg) ja mandelamiinille (3 /ug) .

Sekä A82846 että A82846.1 värjäytyivät gram-positii-visesti, mutta eivät värjäytyneet haponkestävästi (acid 30 fast) .

A82846:n hydrolysoidut kokonaiset solut sisälsivät diaminopimeliinihapon meso-isomeeriä sekä sokereita arba-binoosi ja galaktoosi. Viljelmillä on tyyppi IV:n saluseinä Becker et ai.'n yllä, mukaisesti. Sokerikaavio on tyyppiä A 35 (Lechevalier, yllä). Viljelmät eivät tuottaneet mykolihap- poja (LCN-A).

13 90993

Kannan A82846 kemotaksonomiset ja yleiset viljelyominaisuudet ovat yhtäpitäviä sen määräämiseen sukuun Nocardia Trevisan 1889 kanssa /Skerman, V.B.D., McGowan, V. ja Sneath, P.H.A., toim., "Approved Lists of Bacterial Names", 5 Int. J. Syst. Bacteriol. 30 (1980) 225-4207·

Vastaavuuskertoimet laskettiin työryhmän Gordon,

Mishra ja Barnett, yllä, julkaisemien 14 Nocardia-lajin sekä Lillyn viljelmäkokoelman viiden kannan ominaisuuksista. Käytettiin Jaccardin kerrointa 7£atso Sneath, P.H.A., 10 "The Application of Computers to Taxonomy", J. Gen.Microbiol.

17 (1957) 2017 ja yksinkertaista täsmäävyyskerrointa /katso Sokal, R.R. ja Michener, C.D., "A Statistical Method for Evaluating Systematic Relationships", Kan. Univ. Sci. Bull.

38 (1958) 14097· Näiden vertailujen tulosten yhteenveto on 15 esitetty taulukossa II.

14

Taulukko II

A82846:n ja 19 muun Nocardia-lajin vastaa-vuuskertoimet

Viljelmä Vastaavuuskerroin 5 _S sm_Sj A82846 100 100 N. aerocolonigenes 84 76 N. aerocolonigenes (A42125)* 83 78 N. orientalis (M43-05865) 78 72 10 N. orientalis (A51568.1) 78 72 N. orientalis 75 68 N. orientalis (M5-18215) 73 66 N. orientalis (M5-18260) 73 66 N. madurae 73 63 N. hirsuta 62 60 N. autotrophica 62 53 N. dassonvillei 62 50 N. amarae 62 46 N. brasiliensis 56 43 20 N. vaccinci 56 43 N. transvalensis 48 38 N. caviae 48 32 N. pelletieri 48 24 N. asteroides 46 23 25 N. came a 43 25 *

Suluissa olevat luvut osoittavat Lillyn viljelmäkokoel-man kannat

Koska N. madurae on siirretty sukuun Actinomadura, 30 se jätettiin ottamatta huomioon. Kahdella lajilla, N. aerocolonignes'llä ja N. orientalis'11a on hyvät vastaa vuuskertoimet. Suoritettiin laboratoriovertailu ja A82846:n ja näiden kahden lajin välillä. Näiden vertailujen tulokset on annettu taulukossa III.

li 15 90993

Taulukko III

A82846:n, N. orientalis'n ja N. aerocolonigenes'π ominaisuuksien vertailu a Vilielnäa N.

Ominaisuus ϊί· aerocolon- 62846 orientalis igenes TUottaa ilmarihmastoja + + +

Ilmarihnastojen väri valkoinen + + +

Tuottaa konidioita + + +

Itiöiden pinta sileä + + +

Itiöt sylinterinmuotoisia + +

Tuottaa liukoista pigmenttiä +

Gram+ + + + 15 Haponkestävä - -

Fragmentoituu + + +

Tuottaa katalaasia + + +

Hydrolysoi: eskuliinia + + 2 g hippuraattia - - tärkkelystä + + +

Ca-malaattia + +

Pelkistää nitraattia + +

Hajoittaa: 2 5 adeniinia - kaseiinia + + + hypcksantiinia + + + tyros iinia + + + ureaa + + + 3 0 ksantiinia

Taulukko III jatkuu 16 ___Viljelmä3,_ N.

N. aerocolon- g Citunaisuus 82846 orientalis igeaes

Tekee gelatiinin nesteiräiseksi + +

Tuottaa fosfataasia + + +

Pysyy hengissä 50°C:ssa, 8 h + + luottaa happoa: 10 adonitolista + arabinoosista + + + sellobioosista + + + erytritolista + glukoosista + + + 15 o^-Me-glukosidista + + glyserolista + + + inositolista + + + laktoosista + + + maltoosista + + + 20 mannitolista + + + mannoosista + + + meletsitoosista + melibioosista + - + raffinoosista + 25 ramnoosista + + + sorbitolista “ trehaloos i sta + + + ksyloosista + + + kontrolli - 17

Taulukko III jatkuu 90993

Vi 1 iplTTwa ------N.

aerocolon- 5 Ominaisuus 82846 orientalis igenes Käyttää: bentsoaattia _ sitraa ttia + + + irukaattia _ 1 g sukkinaattia + + + tartraattia _ kontrolli _

Resistenssi: basitrasiinille (10 yksikköä) + 15 kefalotiinille (30 ^,ug) + + + gentaitysiinille (10 ^ug) + linkcrysiinille (2 ^ug) + + + neccnysiinille (30 ^ug) _ oleandorrysiinille (15 ^ug) + 20 penisilliini G:lle (10 yksikköä) + + + rifampisiinille (5 ^ug) - - - streptonysiinille (10 yUg) + + tetrasykliinille (30 yug) - toöramysiinille (10 ^ug) + + 25 vankcmysiinille (30 ^ug) + + kloramfenikolille (30 ^,ug) - erytronysiinille (15 ^ug) + nalidiksiinihapolle (30 ^ug) + + novobiosiinille (30 ^ug) + 30 polyityksiini B:lle (300 yksikköä) + + + trimetopriimille (5 ^ug) + + + a + = kannalla on mainittu ominaisuus; - = kannalla ei ole mainittua ominaisuutta 18

Vastaavuuskertoimet laskettiin uudelleen käyttäen suurta lukumäärää yksittäisiä lukuja. Tulosten yhteenveto on esitetty taulukossa IV.

Taulukko IV

5 A82846:n, Nocardia orientalis'n ja Nocardia aerocolonigenes'n vastaavuuskerroin

Viljelmä Vastaavuuskerroin 10 _Ssm_Sj_ A82846 100 100 N. orientalis 81 76 N. aerocolonigenes 73 65

Ei N. orientalis'11a eikä N. aerocolonigenes'llä 15 ole mykolihappoja soluseinässään. Gordon, yllä, kuvaa kol me avainominaisuutta, jotka auttavat erottamaan N .orientalis’n N. aerocolonigenes'sta. A82846:n vertailu Nocardia-lajeihin käyttäen Gordonin avainominaisuuksia on esitetty taulukossa V.

20 Taulukko V

A82846:n, Nocardia orientalis'n ja Nocardia aerocolonigenes'n avainominaisuuksien vertailu

Ominaisuus 25 Tuottaa happoa Resistentti erytrito- Me-©/- lysotsyymille Viljelmä lista gluko- _sidista_ A82846 - + + 30 N. orientalis + + N. aerocolonigenes - - +

Vaikka A82846 ei identtisesti täsmääkään kummankaan Nocardia-lajin avainominaisuuksien kanssa, sen viljelyominaisuudet muistuttavat enemmän N. orientalis'n viljelyomi-35 naisuuksia ja sillä on korkea vastaavuuskerroin N. orientalis’n l! 90993 19 kanssa. Se myös muistuttaa N. orientalis' ia siinä, että se tuottaa glykopeptidiantibioottia. Siksi A82846 luokitellaan Nocardia orientalis (Pittenger and Brigham, 1956)

Pridham ja Lyons 1969 -kannaksi. Koska N. orientalis tun-5 netaan Approved Lists of Bacterial Names -luettelossa, yllä, se on pitävästi julkaistu laji.

Viljelmä A82846.1 on A82846-viljelmän kemiallisesti aiheutettu mutantti. Piirteet, joiden suhteen A82846.1 poikkeaa A82846:sta, on esitetty taulukossa VI.

10 Taulukko VI

A82846:n ja A82846.1:n eroavaisuuksien vertailu

Ominaisuus_A82846_A82846.1_ 15 Fragmentoituminen minimaalinen runsas

Pesäkkeen keko 7 rrm 5 nm

Pesäkkeen pinta kova pehmeä

Ilmar ilmastot runsaasti hieman

Alapuolen väri tumnanruskea vaaleanruskea 20 Liukoinen pigmentti +

Tuottaa happoa: etanolista + glykogeenista + meletsitoosista + 25 raffinoosista + salisiinista + Käyttää: c*-Me-glukosidia + glykogeenia + 3 0 meletsitoosia + sorboosia + butyraattia - +

Melanoidipigmenttejä + 20 A82846.1 eroaa A82846:sta myös tuottamansa antibioot-tiaktiivisuuden määrässä. Muita erittäin näkyviä eroja kantojen välillä ovat, että, toisin kuin A82846, A82846.1 ei tuota ilmarihmastoa eikä selvästi erottuvaa, liukoista pig-5 menttiä.

Viljelmä A82846.2 on viljelmän A82846 luonnollinen variantti. Siten A82846.2:ta identifioivat ominaisuudet ovat oleellisesti samat kuin A82846:n vastaavat ominaisuudet. Tärkein ero A82846:n ja A82846.2:n välillä on se, 10 että A82846.2-viljelmä tuottaa huomattavista suurempia mää riä antibioottia A82846 kuin A82846-viljelmä kasvatettaessa ravistuspulloissa.

Kuten muillakin organismeilla tapahtuu, tämän keksinnön mukaisten A82846:tta tuottavien viljelmien, Nocardia 15 orientalis -kantojen NRRL 18098, NRRL 18099 ja NRRL 18100 ominaisuudet muuttuvat. Siten näiden kantojen jälkipolvia, esim. rekombinantteja, mutantteja ja variantteja, voidaan saada käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä. Esimerkiksi variantteja voidaan saada luonnollisen valinnan kautta ja 20 mutantteja voidaan saada käsittelemällä erilaisilla tunnetuilla fysikaalisilla ja kemiallisilla mutageeneillä, kuten ultraviolettivalolla, röntgensäteillä, gammasäteillä ja kemikaaleilla kuten N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosogu-anidiinilla.

25 Rekombinanttikantoja voidaan kehittää transformoi malla Nocardia orientalis -kantoja käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Koska Nocardia ja Streptomyces ovat keskenään samankaltaisia, Streptomyces'lie kehitettyjä transformointimenetelmiä ja yhdistelmävektoreita voidaan 30 käyttää myös transformoimaan Nocardia-kantoja. Käyttämällä yhdistelmä-DNA-menetelmiä Nocardia orientalis -kantoja voidaan transformoida ekspressoimaan lukuisia geeni-tuotteita näiden kantojen tuottamien antibioottien lisäksi. Esimerkiksi kannat voidaan transformoida yhdistelmävekto-35 rilla, joka tuottaa resistenssin antibiootille, jolle kannat normaalisti ovat herkkiä. Näin saadut transformantit 11 21 90993 tuottavat A82846-antibioottien lisäksi myös resistenssin antavaa entsyymiä, jolloin transformoidut solut voidaan valikoida villityyppisistä soluista. Edelleen samanlaisia menetelmiä käyttäen nämä kannat voidaan modifioida siten, 5 että niissä esiintyy monia kopioita endogeenisistä anti-biootti-biosynteesigeeneistä, jolloin saadaan suuremmat antibioottisaannot. Nocardia orientalis -kantojen NRRL 18098, NRRL 18099 ja NRRL 18100 jälkipolvi, tämä tarkoittaa luonnolliset ja aiheutetut variantit, mutantit ja 10 rekombinantit, jossa on säilynyt A82846:n tuottamisominai-suus, ovat osa tätä keksintöä.

Viljelyväliaine, jota käytetään Nocardia orientalis -viljelmien kasvattamiseen, voi olla mikä tahansa lukuisista väliaineista. Tuotannon taloudellisuuden, optimisaannon 15 sekä tuotteen eristyksen helppouden takia tietyt viljely- väliaineet ovat kuitenkin edullisia. Siten esimerkiksi edullisia hiilihydraattilähteitä laajassa mittakaavassa suoritetussa fermentoinnnissa ovat glukoosi ja perunadekst-riini, vaikka riboosia, ksyloosia, fruktoosia, galaktoosia, 20 mannoosia, mannitolia, liukoista tärkkelystä ja vastaavia aineita voidaan myös käyttää.

Edullisia typpilähteitä ovat entsyymillä hydrolysoitu kaseiini ja lihapeptonit, vaikka hiivauutetta, happo-hydrolysoitua kaseiinia, häränlihauutetta, kalajauhoa, mak-25 sajauhoa ja vastaavia aineita voidaan myös käyttää.

Epäorgaanisia ravinnesuoloja, joita viljelyväliai-neet voivat sisältää, ovat tavanomaiset liukoiset suolat, joista voidaan saada sinkki-, natrium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti- ja nitraatti-30 ioneja sekä vastaavia ioneja.

Välttämättömiä hivenaineita, jotka ovat tarpeellisia organismin kasvulle ja kehittymiselle, tulisi myös sisällyttää viljelyväliaineeseen. Tällaisia hivenaineita esiintyy yleisesti epäpuhtauksina väliaineen muissa substituen-35 teissä riittäviä määriä organismin kasvutarpeiden tyydyttä miseksi. Jos vaahtoaminen on ongelma, laajassa mittakaavassa 22 suoritetussa fermentoinnissa väliaineeseen voidaan lisätä pieniä määriä (tämä tarkoittaa 0,2 ml/1) vaahtoamista estävää ainetta, kuten polypropyleeniglykolia.

Huomattavien määrien A82846-antibiootteja tuotta-5 miseksi submerssi aerobinen fermentointi tankeissa on edul lista. Pieniä määriä antibiootteja voidaan saada käyttämällä ravistuspulloviljelmää. Koska isojen tankkien siirros-tukseen organismin itiömuodolla liittyy yleisesti aikaviive antibiootin tuotannossa, on edullista käyttää vegetatii-10 vista ymppiä. Vegetatiivinen ymppi valmistetaan siirros- tamalla pieni määrä viljelyväliainetta organismin itiömuodolla tai rihmastofragmenteilla, jolloin saadaan tuore, aktiivisesti kasvava organismin viljelmä. Sitten vegetatiivinen ymppi siirretään suurempaan tankkiin. Vegetatiivi-sen ympin väliaine voi olla sama kuin suuremmissa fermen-toinneissa käytetty väliaine, mutta myös muut väliaineet ovat sopivia.

A82846:tta tuottavat organismit tuottavat A82846-antibiootteja kasvatettaessa niitä lämpötiloissa noin 23 -20 37°C:ssa. Optimilämpötila A82846:n tuotannolle näyttää ole van noin 30-31°C.

Kuten submersseissä aerobisissa viljelyprosesseissa on tapana, steriiliä ilmaa puhalletaan astiaan pohjasta samalla, kun väliainetta sekoitetaan tavanomaisilla tur-25 biinisekoittimilla. Tähän mennessä käytetyissä olosuhteis sa fermentoinnin maksimihapenotto ei ole ylittänyt 0,2 mM/l/minuutti. Yleensä ilmastus- ja ravistelunopeuk-sien tulisi olla riittäviä ylläpitämään liuonneen hapen määrä 50 %:n kyllästysasteessa tai tätä suuremmassa kyl-30 lästysasteessa.

A82846-antibioottien tuottamista voidaan seurata fermentoinnin aikana testaamalla käymislieminäytteet anti-bioottiaktiivisuuden suhteen käyttämällä organismeja, joiden tiedetään olevan herkkiä antibiootille. Eräs käyttökel-35 poinen määritysorganismi on Bacillus subtilis ATCC 6633.

Biologinen määritys suoritetaan helposti käyttäen agar-kuop-palevytestiä.

li 90993 23

Kun A82846-antibiootit on tuotettu submersseissä, aerobisissa fermentointiolosuhteissa, ne voidaan ottaa talteen fermentointiväliaineesta käyttäen alalla käytettyjä menetelmiä. A82846:tta tuottavien organismien fermentoin-5 nin aikana tuotettua antibioottiaktiivisuutta esiintyy sekä rihmastossa että käymisliemessä. Siksi A82846:n maksimaalinen talteenotto suoritetaan säätämällä aluksi pH 10,5:een, jolloin A82846 vapautuu rihamstosta, ja suodattamalla väliaine käymisliemen erottamiseksi rihmastomassasta.

10 A 82846 voidaan ottaa talteen suodatetusta käymis- liemestä monia menetelmiä käyttäen. Edullisessa menetelmässä suodatetun käymisliemen pH säädetään noin 7:ään ja käymisliemi adsorboidaan kationinvaihtohartsiin, esim.

Dowex XF5-43278 -, Dowex-50- tai Amberlite IR-120 -hartsiin.

15 Aktiivinen aine eluoidaan hartsista sopivalla liuottimena, kuten esimerkiksi laimealla NH.OH-liuoksella. Sitten aktii- 4 viset fraktiot konsentroidaan vakuumissa, adsorboidaan mak-roretikulaariseen hartsiin, esimerkiksi Diaion HP-20- ja Amberlite XAD-4 -hartsiin, ja eluoidaan sopivalla liuotti-20 mella, kuten vesi:isopropanoli-seoksella (95:5), joka si sältää 1 % etikkahappoa, jolloin saadaan A82846. Aktiivinen materiaali voidaan eluoida myös vesi:asetonitriili- tai vesi:metanoli-seoksilla, jotka sisältävät pienet määrät happoa.

25 A82846 voidaan erottaa yksittäisiksi komponenteiksi A82846A, A82846B ja A82846C samanlaisia menetelmiä käyttäen. Edullinen erotusmenetelmä sisältää käänteisfaasi-silikagee-li (C^g tai Cg) -kromatografiän.

Vaihtoehtoisesti viljelmän kiinteät aineet, mukaan-30 lukien väliaineen komponentit ja rihmasto voidaan käyttää uuttamatta tai erottelematta, mutta edullisesti veden poistamisen jälkeen, A82846:n lähteenä. Esimerkiksi A82846:n tuottamisen jälkeen koko käymisliemi voidaan kuivata kylmä-kuivaamalla, rumpukuivaamalla tai atseotrooppisella tis-35 lauksella ja kuivaamalla. Kuivattu käymisliemi sekoitetaan sitten suoraan syöttösekoitteeseen (feed premix).

24 A82846-antibiooteilla on erinomainen in vitro- ja in vivo -vaikutus gram-positiivia patogeenisiä bakteereja vastaan. Erityisen odottamaton näiden antibioottien ominaisuus on niiden pitkä puoliintumisaika seerumissa. Esimerkik-5 si rotille suoneen annettaessa vankomysiinin puoliintumisaika seerumissa oli 45 minuuttia, kun taas sekä Ά82846Ά:η että A82846B:n puoliintumisajät olivat 2,2 tuntia.

Pienimmät inhiboivat pitoisuudet (MIC:t), joilla A82846-antibiootit inhiboivat tiettyjä bakteereja, on an-10 nettu taulukoissa VII ja VIII. Taulukoiden VII ja VIII MIC~ arvot määritettiin käyttäen normaalia agar-laimennusmääri-tysmenetelmää.

li 25 90993

U

Λ VO _ι u S ω t S 5 5 IV 1

3 jSS

“ « -PC

3 \ ΒιΛ m λ ifl m m "ti 3 5 -P tTOCNCNCNCNminCNCNu") Ö * Tj 1 -NSo' o' o~ o- = o' o' o =- o'.....3 2 g 2 a s g ! a = in c

C Q) *H *H

CD i—I in <i) c ri P ·& •h -d ^ * rH Cmmiom »ΛιΛ H m y (M OCNCNCNCNlOu-ICNCNu-) TJ .¾

«β 00-^^^·~·-*-· ^«~ΙΙΙΙΙ H H P

·* cmoooooooooo d d d HP ¢0 m -S 0 H 0» < 3 3 « > +» -P Η Λί * <U H 0 O «0 ΗΗ JS H -n X Xi o es Ό J2 2 -H cn Jd -H _* 3 £ Ä ^ ^ cn JS ° - * Λ P § V. § S ·! J 8 fc *3 ^ve vog a^> (0 «JvOOUH ^ X H 3.

E-*C X > X OO -h ·η fl X Μ X X £ ^ ^ ti E S <o ή 4J4J «e ro

® wiacawuiPiJCQafefe'i'Jw dl^SS

H 33334J4JCO N N *“· <0 O -P C IN

P D a; aj QJ T3 Ό QJ S ·*τ« ΙΓΓΪ C G O ή c -P Γυ «— 4J uuSu.H-^öi3:Sg««jwS'!i £ ·*< _.

0 .H3333aaouS,g33 ooc w ro

x ceuueon^fitl^HHirjBS "S 'SS

f» q.q.CiCjhm-ii—i3>-i tn ^ in

H w eeo«<u H 2 <P

Λ C333333WM«l«eHHOe«e o> h >ϋ T-l PUUUUUU3333 « <U O) 3 ji WiOouuouuuuucoto<e ia P .G p d. POOOOOOUUUUSS’Hiej ra C nUUUUUUOOOOHpHJSHC <D <1) ·Η

n) ‘Moooooouuuu-hhuho »—t ·—t Q

1 ArH>—IrHi—1^1—I O O O O.C.fi 'H 4J E Hi—I -P

* js j: js js js λ aaaaoojw’a G G Di

„ &&o.Q,a,aa>4JejuEE.c,a3 H H

°o <β(ο<β<ο<β3>-<Ρκ^α)β}Ρβ)4) H -H ro CN rH rH 4·* 00 ΙΛΐηΐΛ«ΛΙΛΙΛΟΟ(Ζ1(ΛΙΛΧΧωΧ0- H H in

< M M B

1 II

^cS ? 26 •woo c —

Woo W1 O O IN

-¾ - - I - I

s, M N ΙΟ <M H in

g I I 1H I I (N

o momooininiw A «k S ♦*.

5 OrHOOiWOOO |> VII

3 m m

β N M O

o *· ·-· o ·- S’ - o o o iw

O \ rn iW *· I I *W I

w «— 3 I iw m m I m -P w m I n n ιλ in in n

•W U oo MinHHNNNH

> gS''*'"*'"-''·' Ä S? oooooooo c **

•W

-P

a) m m in o cm cm in *✓* ·· o n ·· o in ·-

3 . rH O O - v- O

Η -P <5 I CM I I fW O I

h 0 S m I m m I i in h M qo n in n h m m cn

> -W IN HCNtWOlNOCNH

(¾ GQ ·· ►· n k k ·· *·

O > ^ OOOOOiWOO

M v«

M C

0 -H

rH C

3 H . .

re -W 3 13 E-· in -P c iW ae

>, pfg 1-1 OOINOOH^IN

£ 4j .* fi »0 IN (N iH IN IN

2 M C-nE

·* O (3 Q 3 C E-ι ·η -P Σί 10 —

> in Q

•H

rtj Ό O

•π ή nJ yrt in

E in -h I -H

β in w « β S μ in .. 3DCObL«J-Htn

ca 0O0Ej-i>3C

ίο p -π o' 3 -η σ « ττ 3 α o o · ή β -o co <UOl>.fiQJ<e<e3

in oi oJ iöl u ra E

co tn tn

33intntntntntn 00333333 .. OOOOOOOO

c OOOOOOOO

„ .OOOOOOOO

fC Έ OOOOOOOO

vo S -HrHOOOOOO

ς. -W >->.+J-P+J-P4->-P

ao a jzxsaaaaaa

Wj 2,0.0.04)00)00 on g1 0J«xjtwJw!wJ-i0i)w

5 ä+j+j+j+j+J+J+J-P

^ ιηιηιηΐΛΐηιηιηιη 90993 27 A82846-yhdisteiden antimikrobiaalisen vaikutuksen eräs tärkeä piirre on niiden vaikutus anaerobisia bakteereja vastaan. Tätä vaikutusta kuvataan taulukossa IX, jossa on esitetty yhteenveto A82846A:n ja A82846B:n vaikutuksesta 5 eri anaerobisia bakteereja vastaan normaalilla agar-laimen- nusmääritysmenetelmällä määritettynä. Loppupisteet luettiin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen.

28

•H

•5 »3· t-ι «s vo «a·

•H »3 I II*-*»—* vO

n i *-**-· in m i i i

>, ΙΛ N M N H *-*CMCMinC4 CM

ö O ov o" os > m m

CM <N

cq »* m -» m vo O V.

>3 0 O I 00 O

co i i >3 m i i _ <—v <n Ό voi m cm vo m m eo rt i-3 oo ommmo-<*-<M*-o<McN cm ’Π g <J n* H. PH ^ V S »H k s.

Q) ^H OOOOO O O O O O A

Lj oc v | VII

M il m ε ^

Q) w «M

4J < **

>> CJ VO »—* -H

rt >-* <r I o <n X Σ oo mm mm iimm

•Q C\l CM CM CM M m Ό VO CM (M

oo *-* — m*---CMmcMO© — - oo <0 < h-o«-ooi---*~oo «m •H O VH O VII VII ** O O O O VII VII *-*

CO A

-H

X 2 .β£ ^ 2) r* Γ0 o s 81,¾ -

2 10 83% « S

52 3 δ I S -2 £ <—i 3. a s 3 o -o oj 3+) t-*J0Ä ·η o E ··

rt 3 *j ce H U* 4J

ta ta >. 3 « « co rt ^ c e *-* mu *o 4-1 o d -<~i o ii vo -<-· a e e e e (0 r-l Oi g ·Η 1* r-li-M 10 Ή U CO tfl

> | -H C 3 O « Ή -H «0 ,£ -H

Ju-Hueojeu^uMtom —·

rt -ra.Hl-i-rtVMOO<04J333E+J'H

^ ä9i4*V-*4JOU>-H«0CUU3(l)OC

" "JU-iUftUlOOJUCMCJU-HMiO

CQ T3-HVVHW1Ui<oOIOOO)-i-HI-i ?)-oaJio<e<oaJ>osuuv > m*

(rt n j O O 4-1 -H

.JL In T|ESSe<oncoMM4J4JU-Hui 8{ιι±3 333333333β.α«+)0Ι -2ϋΙ3·Η·Η·ι^·Ηουοϋο«,β,.ο rt ό C o Tl f®. .1*0 -O-OUlUUUUU UIV4T4 tri·**

·· -Mm Kill·*-! -H-HV000004J4JC <0 O

.a* c- H * Viis u»*ui4Juoyoutoceo c u* .¾ rt 5l®}ya4J4J4Juooooooo-H u _T 2 ='Hä9«9iaiai04J4-l4J4J4->4-l4JO g 4-1 ·" 2 -5 o οο·οααο.αα&αο S u 00 4-1 S JS rrSSl'-M -4-434)tUU4)4l4)4JU £ <0 (N DI **· -u '-'^U UOHhhSihhPihlli O β oo rt < >

II

90993 29 Ή

S

Η οο

CO CM

J>1 ^ ^ ^ rH

E sO A Ό \0

CO

Ό /—s <r 00 00 00 00 00 00

hJ 00CM<M<MCM<MCM

g CM ^ ^* **** ^* *·* ^ 00 A A Λ ÖC < u

E

O

►rt £ <

vO

>» eo oo co oo oo oo eo CS CS CN CS es es C'J rt H H fH H r*

00 Λ A

<

Praia Γ-l CS rt·1 «-1 r-1 ^ SS §3 „

pfrrvn E C

OM

u a _

U U E

•H ·Η S

se 1 ϋ ora äo ie k vt m xs _ -M 4-> o en s o α 3 -H o e -h ra ·η o 3 H -rt -H «J Ό ,£) w ra M e Λ o E o

Tj ra 4-i m oc V4 >< ra T, 43 ra <-η u tai e 2, Ä£rasoe_

•n (0 4J E > U E E

Λ 3 3 si 01 m « M Ή -rt rj +j ra ra ra ra i4 u 0) o ·ό ό ό ra ra _ [fl -rt -rt -rt -H 4-1 4-1 O -h o o o o o o >2 n u i-i i4 l-ι m m v ?3 ra ra ra ra .o λ "rt p 4.» 4J 4-1 4-» o o P ra o u o u oi 03 'j e a co ra ra s s 3 C aa cq co 03 P‘4 (*4 (C .5! E-· 30 A82846-antibiooteilla on myös ollut in vivo -anti-mikrobiaalinen vaikutus kokeellisesti aiheutettuja labora-torioeläinten tulehduksia vastaan. Kun koeorganismilla kokeellisesti infektoiduille hiirille annettiin kaksi annos- 5 ta koeyhdistettä, havaittu vaikutus mitattiin ED...-arvona du /mg/kg:ina annettu tehoava annos, joka suojasi 50 % koe-eläimistä: katso Warren Wick et ai., J. Bacteriol. 81 (1961) 233-235/. Havaitut ED^Q-arvot erimerkkiyhdisteille on annettu taulukossa X.

10 Taulukko X

A82846-antibioottien in vivo -vaikutus ED^Q-arvoa . Staphylococcus Streptococcus Streptococcus

Yhdiste aureus pyogenes pneumoniae 15 ------ A82846A 0.19 0,19 0,17 A82846B 0f19 0,20 0f18 A82846C 2,18 2,71 5,87

Vankanysiini 1/>3 0,72 1,52 20 amgAg x 2; annokset annettiin hiirille ihon alle 1 ja 4 tuntia infektion jälkeen

Eräs tärkeä A82846-antibioottien antibakteriaalisen vaikutuksen piirre on se, että niitä voidaan käyttää hoidettaessa pyelonefriittiä (munuaisaltaan ja munuaisen tuleh- 25 dusta). Esimerkiksi A828464A ja A82846B olivat tehokkaampia kuin vankomysiini suojaamaan rottien kokeellisessa laskevassa pyelonefriitti-infektiossa. Tämä koe suoritettiin käyttäen US-patenttijulkaisussa 4 208 403 kuvatun menetelmän kaltaista menetelmää. Havaittujen tulosten yhteenveto on esi- 30 tetty taulukossa XI.

90993 31

Taulukko XI

Αδ2846Α:η ja B:n vaikutus rotan laskeva pyelonef-riitti -kokeessa 5___

Prosenttia Prosenttia rottia,

Annostus rottia, jot- joiden tiitterit las-

Yhdiste (mgAg x 12)a ka paranivat kivat 4 logaritmia 10 A82846A 10 88 100 5 75 88 2 63 100 A82846B 10 100 100 5 100 100 2 50 88 15 Vtakonysiini 10 63 100 5 38 88 2 38 75 aAnnokset kahdesti päivässä ihon alle 6 päivän ajan

A82846-antibiootteja voidaan käyttää myös sydämen 20 sisäkalvon tulehduksen hoitoon. Esimerkiksi A82846A ja B

olivat yhtä tehokkaita kuin vankomysiini hoidettaessa kokeellisesti katetrilla aiheutettua sydämen sisäkalvon tulehdusta rotissa. Tässä kokeessa rotat käsiteltiin työntämällä muovinen katetri oikeanpuolimaiseen kaulavaltimoon, 25 syöttämällä se alas sydämen oikeaan kammioon ja kiinnittä mällä se tukevasti paikoilleen. Eläinten annettiin levätä kaksi päivää, jonka jälkeen koeorganismi, Streptococcus faecalis X-66, annettiin suoneen. Organismitiitteri oli g noin 5 x 10 ml; annosteltiin 0,5 ml.

30 Yhdisteet annettiin ihon alle 15 minuuttia ennen infektiota ja 12 tunnin välein 14 päivän ajan, kaikkiaan 28 käsittelyä. Eläimiä pidettiin elossa kaksi päivää hoidon jälkeen; sitten sydämet poistettiin, homogenisoitiin, laimennettiin ja levitettiin tryptikaasi-soija-agarille.

35 Levyjä inkuboitiin 48 tuntia ennen laskemista.

32 Näiden kokeiden tulosten yhteenveto on esitetty taulukossa XII.

Taulukko XXI

A82846A:n ja B:n vaikutus rotan sydämen sisäkalvon 5 tulehduskokeessaa 16 päivää

Annostus*3 % parantunei- % eläimiä, joilla oli Yhdiste (mg/kg x 28) ta eiäimUi 4 log:n lasku0 10 A82846A 20 100 100 A82846B 20 100 100

Vankempiini 20 100 100 aKatetrilla aiheutettu sydämen sisäkalvon tulehdus Streptococcus 15 faecal is X-66: tta käyttäen ^Ihonalaiset annokset 12 tunnin välein 14 päivän ajan

Q

% tapettuja eläimiä, joilla oli 4 logaritmin lasku A82846-antibioottien farmaseuttiset formulaatiot ovat myös osa tätä keksintöä. Siten antibiootti, edulli-20 sesti farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana, voidaan for muloida suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuoliseen annosteluun käytettäväksi bakteeritulehdusten terapeuttiseen tai ennaltaehkäisevään hoitoon. Esimerkiksi yhdiste voidaan sekoittaa tavanomaisiin farmaseuttisiin kantajiin ja 25 apuaineisiin ja käyttää tabletteina, kapseleina, eliksii reinä, suspensioina, siirappeina, suuvoiteina (wafers) ja vastaavina.

A82846-antibiootin sisältävät koostumukset sisältävät noin 0,1 - 90 paino-% aktiivista yhdistettä ja yleisem-30 min noin 10-30 %. Koostumukset voivat sisältää tavallisia kantaja-aineita ja apuaineita, kuten maissitärkkelystä tai gelatiinia, laktoosia, sakkaroosia, mikrokiteistä selluloosaa, kaoliinia, mannitolia, dikalsiumfosfaattia, natrium-kloridia ja alginiinihappoa. Tässä kuvatuissa 35 formulaatioissa tavallisesti käytettyjä dispergoivia aineita 90993 33 (disintegrators) ovat kroskarmelloosinatrium, mikrokitei-nen selluloosa, maissitärkkelys, natriumtärkkelysglykolaat-ti ja alginiinihappo.

Tabletoinnissa sidosapuaineita, joita voidaan ottaa 5 mukaan, ovat akaasia, metyyliselluloosa, natriumkarboksi- metyyliselluloosa, polyvinyylipyrrolidoni (Povidone), hyd-roksipropyylimetyyliselluloosa, sakkaroosi, tärkkelys ja etyyliselluloosa.

Voitelevia aineita, joita voidaan käyttää, ovat mag-10 nesiumstearaatti tai muut metallistearaatit, steariinihap- po, silikonineste, talkki, vahat, öljyt ja kolloidinen piimää.

Makuaineita, kuten piparminttu, gaulteriaöljy (oil of wintergreen), kirsikanmakuaine tai vastaavat, 15 voidaan myös käyttää.

Väriaine saatetaan haluta lisätä tekemään annos-tusmuoto ulkonäöltään esteettisemmäksi tai auttamaan tuotteen tunnistamista.

Suonensisäiseen (IV) käyttöön antibiootin veteen 20 liukeneva muoto voidaan liuottaa johonkin tavallisesti käytettyyn suonensisäiseen annosteluun tarkoitettuun nesteeseen ja antaa infuusiona. Liuoksia, kuten esimerkiksi fysiologinen suolaliuos, Ringerin liuos tai 5 % dekstroo-siliuos, voidaan käyttää.

25 Lihakseen annettavissa valmisteissa sopiva yhdis teen liukoinen suolamuoto, esimerkiksi vetykloridisuola, voidaan liuottaa ja annostella farmaseuttisessa liuotti-messa, kuten steriilissä vedessä (Water-for-Injection), fysiologisessa suolaliuoksessa tai 5 % glukoosiliuokses-30 sa. Sopiva yhdisteen liukenematon muoto voidaan valmistaa ja annostella suspensiona vesipitoisessa pohjassa tai farmaseuttisesti hyväksyttävässä öljypohjassa, esim. pitkä-ketjuisen rasvahapon esterissä kuten etyylioleaatissa.

Suun kautta annettavaan käyttöön antibiootin sopi-35 van suolamuodon, esimerkiksi vetykloridisuolan, steriili formulaatio, formuloituna liuottimessa kuten tislatussa tai ionivapaassa vedessä, on erityisen käyttökelpoinen.

34

Vaihtoehtoisesti antibiootin yksikköannostusmuoto voi olla antibioottiliuos, edullisesti sen suolamuodossa, sopivassa liuottimessa steriileissä, ilmatiiviisti suljetuissa ampulloissa. Antibiootin pitoisuus yksikköannostuk-5 sessa saattaa vaihdella esim. noin 1-50 prosenttiin an tibiootin erityisestä muodosta ja sen liukoisuudesta sekä lääkärin toivomasta annoksesta riippuen.

Lisäpiirteissään tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän hoitaa tartuntatauteja, erityisesti gram-positiivis-10 ten mikro-organismien aiheuttamia tartuntatauteja, eläimissä.

Eläin voi olla joko altis tai infektoitunut mikro-organismilla. Menetelmässä eläimelle annetaan A82846-anti-bioottia määrä, joka tehoaa tähän tarkoitukseen. Yleisesti A82846-antibiootin tehoava määrä on noin 0,5 - 100 mg/kg:n 15 suuruinen annos. Edullinen annos on noin 1-60 mg/kg aktii vista yhdistettä. Tyypillinen päivittäinen annos aikuiselle ihmiselle on noin 50 mg:sta 1 g:aan.

Käytettäessä tätä menetelmää antibiootti voidaan antaa yhtenä päivittäisenä annoksena tai monina annoksina 20 päivässä. Hoito-ohjeet saattavat vaatia annostelua pitkien aikajaksojen aikana, esim. useiden päivien tai yhdestä kuuteen viikon ajan. Määrä annettua annosta kohti tai annettu kokonaismäärä riippuu sellaisista tekijöistä kuin tulehduksen luonteesta ja vakavuudesta, potilaan iästä ja yleises-25 tä terveydentilasta, potilaan antibiootinsiedosta ja tuleh duksen aiheuttavasta mikro-organismista tai mikro-organismeista.

Tarkoituksenmukainen menetelmä käyttää hoitomenetelmää on annostella antibiootti IV-infuusion kautta. Tässä 30 menetelmässä steriili antibiootin sopivan liukoisen suolan formulaatio yhdistetään fysiologiseen nesteeseen, kuten 5 % destraaniliuokseen, ja saatu liuos annetaan hitaasti IV-infuusiona. Vaihtoehtoisesti IV-infuusion piggyback -menetelmää voidaan myös käyttää.

li 90993 35

Muissa suoritusmuodoissa tässä kuvataan 1) menetelmiä lisätä ravinnonkäytön tehokkuutta eläimissä, kuten siipikarjassa, sioissa, lampaissa ja nautakarjassa; 2) menetelmiä edistää lihantuotantoa varten kasvatettavien eläinten, kuten 5 siipikarjan, sikojen, lampaiden ja nautakarjan, kasvua; sekä 3) menetelmiä lisätä maidoneristystä maitoa tuottavilla märehtijöillä. Ravinnon hyväksikäytöntehokkuuden lisäämiseksi ja kasvun edistämiseksi, A82846-antibiootti annetaan suun kautta sopivassa ravinnossa määränä noin 2 - 200 grammaa 10 kokonaisravintotonnia kohti. Lihakarjalle esimerkiksi annos 12 - 3000 mg/pää/päivä on sopiva. Maidonerityksen lisäämiseksi maitoa tuottavilla märehtijöillä ehdotetaan suun kautta tapahtuvaa, päivittäistä annostelua määrinä noin 0,04 -16 mg/kg ruumiinpainoa (tai noin 25 - 5000 mg/eläin/päivä).

15 Näissä yhteyksissä kuvattuja yhdisteitä myytäisiin normaalisti eläinten ravintoon sekoitettavassa muodossa; tällaiset sekoitteet sisältävät yhden tai useamman agrono-misesti hyväksyttävän kantajan.

Tämän keksinnön toiminnan valaisemiseksi täydellisem-20 min annetaan seuraavat esimerkit:

Esimerkki 1 A82846:n HPLC-määritysmenetelmä

Seuraavia analyyttisiä HPLC-systeemejä voidaan käyttää A82846-komponenteille: 25 1. Kationinvaihtohartsipylväs *

Pylvään kantaja-aine: Zorbax SCX (4,6 x 150 mm)

Systeemi: Gradienttieluutio A:B:stä (4:1) A:B:hen (1:9) 5 minuutissa, eluointia jatketaan 15 minuutin ajan.

A = MeOH:0,1 mol/1 NaH2P04 (1:9) 30 B = MeOH:0,9 mol/1 NaH2P04 (1:9)

Virtausnopeus: 1,0 ml/min Toteaminen: UV aallonpituudella 225 nm Retentioajat: ovat pitoisuudesta riippuvaisia, mutta ovat noin: 36 A82846C = 6.6 min t A82846B = 8^9 min A82846A = 9,5 min 2. Käänteisfaasipylväs * 5 Pylvään kantaja-aine: Zorbax ODS (4,6 x 150 mm)

Systeemi: Gradienttieluutio 1 % (NH^)i^PO^^H^CN (95:5):sta (1:1):een 20 minuutissa Virtausnopeus: 1,0 ml/min Toteaminen: UV aallonpituudella 225 nm 10 Retentioajat: A82846A =7,3 min A82846C = 7,6 min A82846B = 8,0 min

A

15 Zorbax-pylväät ovat E. I. duPont de Nemours & Co,

Inc. -yhtiön tuotteita, Wilmington, Delaware 19898 Esimerkki 2

Antibiootti A82846:n valmistus käyttäen viljelmää A82846 20 A. Viljelmän A82846 ravistuspullofermentointi

Viljelmää Nocardia orientalis NRRL 18098, joko kylmäkuivattuna sakkana tai nestemäisessä typessä säilytettynä suspensiona, käytetään seuraavan koostumuksen omaavan ymppiväliaineen siirrostamiseen: 25 Ymppiväliaine

Aineosa Määrä (%)

Glukoosi 1,0

Liukoinen tärkkelys 2,0

Hiivauute 0,5 * 30 Kaseiinin entsymaattinen hydrolysaatti 0,5

CaCC>3 0,1

Ionivapaa vesi q.s. 1 litra Säädä väliaineen pH noin 7,5:ksi NaOH:lla ennen ste- 35 rilointia.

*

NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, NY

37 90993

Vinopinnat tai levyt valmistetaan lisäämällä 2,5 % agaria ymppiväliaineeseen. Siirrostettua vinopintaa inku-boidaan 30°C:ssa noin 10-14 päivää. Kypsä vinopintaviljel-mä raaputetaan steriilillä välineellä itiöiden irroitta-5 miseksi ja rihmastomaton poistamiseksi ja maskeroimiseksi.

Noin yksi neljäsosa näin saaduista irroitetuista itiöistä ja viljelmäkasvusta käytetään siirrostamaan 50 ml:aa ensimmäisen vaiheen ymppiväliainetta.

Siirrostettua ensimmäisen vaiheen väliainetta inku-10 boidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa 30°C:ssa noin 24-48 tunnin ajan ravistelijassa, joka pyörii 5,08 cm:n ympyrää kierrosnopeudella 250 rpm.

Tätä inkuboitua ensimmäisen vaiheen väliainetta (0,5 ml) käytetään siirrostamaan 50 ml:aa tuotantoväliai-15 netta, jonka koostumus on seuraava:

Aineosa Määrä (%)

Glukoosi 2,5

Soijapapujauhe 1,5

Perunadekstriini 3,0 20 CaC03 0,25

Sokeriruokomelassi 0,3 *

Happohydrolysoitu kaseiini 0,5

Ionivapaa vesi q.s. 1 litra (Ennen sterilointia pH säädetty 7,5:ksi NaOHrlla) * 25 Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

Siirrostettua tuotantoväliainetta inkuboidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa 30°C:ssa 4-5 päivää ravisteli-jassa, joka pyörii 5,08 cm:n ympyrää kierrosnopeudella 250 rpm.

30 B. Viljelmän A82846 tankkifermentointi

Jotta saataisiin suurempi tilavuus ymppiä, 10 ml inkuboitua ensimmäisen vaiheen väliainetta, joka oli valmistettu kuten kohdassa A on kuvattu, käytetään siirrostamaan 400 ml toisen vaiheen kasvuväliainetta, jonka koostu-35 mus on sama kuin ensimmäisen vaiheen väliaineen koostumus.

38 Tätä toisen vaiheen vegetatiivista väliainetta inkuboidaan 2 l:n laajasuisessa Erlenmeyer-pullossa noin 48 tunnin ajan 30°C:ssa ravistelijassa, joka pyörii 5,08 cm:n ympyrää kier-rosnopeudella 250 rpm.

5 Näin valmistettua inkuboitua toisen vaiheen vegeta tiivista väliainetta (1000 ml) käytetään siirrostamaan 100 litraa steriiliä tuotantoväliainetta, joka on valmistettu kuten kohdassa A on kuvattu paitsi, että P-2000-vaahtoami-sen estoainetta (0,3 g/1) lisätään. Siirrostetun tuotanto-10 väliaineen annetaan käydä 165 l:n sekoitetussa fermentointi- tankissa 90 - 100 tunnin ajan 30°C:een lämpötilassa. Sekoitetun astian (80 rpm) ilmavirtaus säädetään siten, että liuenneen hapen taso pysyy yli 50 %:n ilmakyllästystasolla.

C. Viljelmän Ά82846 vaihtoehtoinen tankkifermentointi 15 Kohdan B menetelmää seurataan paitsi, että käytetään sopivaa määrää vegetatiivista väliainetta siirrostamaan noin 3402 litraa tuotantoväliainetta 4536 l:n fermentoin-titankissa.

Esimerkki 3 20 Antibiootti A82846:n valmistus käyttäen viljelmää A82846.1

Viljelmää Nocardia orientalis NRRL 18099, joko kylmäkuivattuna sakkana tai nestemäisessä typessä säilytettynä suspensiona, viljellään käyttäen esimerkissä 2 kuvattua 25 menetelmää paitsi, että tuotantoväliaineen koostumus on seuraava:

Aineosa Määrä (%)

Glukoosi 1,0

Perunadekstriini 2,0 * 30 Peptoni 1,0

CaC03 0,2

Sokeriruokomelassi 2,0

Ionivapaa vesi q.s. 1 litra pH:ta ei säädetä * 35 Bacto-peptone (Difco Laboratories) li 90993 39

Esimerkki 4

Antibiootti A82846:n valmistus käyttäen viljelmää A82846.2

Viljelmää Nocardia orientalis NRRL 18100, joko kyl-5 mäkuivattuna sakkana tai nestemäisessä typessä säilytetty nä suspensiona, viljellään käyttäen esimerkissä 2 kuvattua menetelmää paitsi, että käytetty happohydrolysoitu kaseiini on Amicase (Sheffield Chemical Co.).

Esimerkki 5 10 Raaka-A82846:n valmistus 4536 l:n fermenttorista saatu käymisliemi (4200 1), joka oli valmistettu kuten esimerkissä 2, kohta C, on kuvattu, säädettiin pH:hon 10,5 5 mol/1 NaOH:lla ja 3 %

Celite 545:ttä (suodatuksen apuaine) lisättiin. Seos suo-15 datettiin suodatinpuristimen läpi ja puristin pestiin ve dellä. Yhdistetty suodos ja pesuvesi (4200 1) säädetiin pH 7:ään 5 N HCl:lla (tai 5 N H2SO^:llä) ja laitettiin Dowex-XFS-43278 (NH^+) -hartsipylvääseen (200 1 suodos-ta/10 1 hartsia). Pylvästä eluoitiin virtausnopeudella 20 750 ml/min. Fraktiot määritettiin joko biologisella mää ritysmenetelmällä käyttäen Bacillus subtilis'ta tai HPLC:llä.

Pylväs pestiin 5 pylvään tilavuudella vettä ja 100 l:n fraktiot kerättiin.

25 Aktiivinen aine eluoitiin hartsista 5 pylvään tila vuudella 0,05 N NH^OH ja 25 l:n fraktiot kerättiin.

A82846:tta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin vakuumissa noin 30 l:n tilavuuteen. Tämä liuos laitettiin 10 l:n Diaion HP-20 -hartsipylvääseen. Pylvästä pes-30 tiin 3 pylvään tilavuudella vettä virtausnopeudella 300 ml/min. Pesuvesi heitettiin pois. Aktiivinen aine eluoitiin pylväästä H20:iPrOH (95:5) -seoksella, joka sisälsi 1,0 % etikkahappoa, virtausnopeudella 100 ml/min, ja 4 l:n fraktiot kerättiin ja analysoitiin biologisella 35 määritysmenetelmällä ja HPLC:llä. A82846:tta sisältävät 40 fraktiot (nrot 6-14) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumis-sa ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 356 g raaka-A82846:tta.

Esimerkki 6 A82846A:n ja A82846B:n eristys 5 A. Rikastetun A82846A:n ja A82846B:n erottaminen A82846 (30 g), joka oli valmistettu kuten esimerkissä 5 on kuvattu, liuotettiin veteen (500 ml) ja laitettiin paineen alla olevaan (pressurized) 30 l:n ruostumattomasta teräksestä valmistettuun pylvääseen, joka oli täytetty 10 1 % NH4H2P04:ssa tasapainotetulla silikageeli LP-1/C^g-gee- lillä. Pylväs kehitettiin käyttäen gradienttia 1 % NH4H2P04:stä (60 1) vesi:asetonitriili (88:12) -seokseen, joka sisälsi 1 % NH4H2P04, (60 1) virtausnopeudella 250 -300 ml/min (maksimipaine 4137 kPa), ja 4 l:n fraktiot kerät-15 tiin ja eluutiota monitoroitiin käyttäen UV-detektoria aal lonpituudella 254 nm. Yksittäiset fraktiot analysoitiin analyyttisellä HPLC:llä. Fraktiot, jotka sisälsivät runsaasti A82846A:ta (nrot 6-9), ja fraktiot, jotka sisälsivät runsaasti A82846B:tä (nrot 10-17), yhdistettiin kummatkin ja kon-20 sentroitiin vakuumissa.

B. A82846A:n puhdistus

Runsaasti A82846A:ta sisältävistä konsentraateista, jotka oli saatu kahdesta kohdaassa A kuvatulla tavalla suoritetusta ajosta, poistettiin suolat 1750 ml:n Diaion HP-20 25 SS -pylväässä pesten vedellä, eluoiden H20:iPr0H (95:5) -seoksella, joka sisälsi 0,5 % etikkahappoa, ja määrittäen analyyttisellä HPLC:llä. A82846A:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 7,4 g A82846A:lla rikastettua valmistetta.

30 A82846A-rikastettu valmiste (7,2 g) liuotettiin ve teen ja laitettiin preparatiiviseen, silikageeli LP-1/C^g-geeliä 1 % (NH4)H2P04:ssä sisältävään HPLC-pylvääseen. Pylväs kehitettiin käyttäen gradienttia 1 % (NH4)H2P04:sta 1 % (NH4)h2P04:asetonitriili (9:1) -seokseen monitoroiden 35 eluutiota analyyttisellä HPLC:llä aallonpituudella 254 nm ja

II

90993 41 eluoiden virtausnopeudella 48 ml/min. Kun ensimmäiset 10 litraa oli eluoitu, 500 ml:n fraktiot kerättiin.

A82846A:ta sisältävät fraktiot (nrot 4-10) ja A82846B:tä sisältävät fraktiot (nrot 12-20) yhdistettiin kum-5 matkin ja konsentroitiin vakuumissa. Kolmesta ajosta saadut A82846A-konsentraatit yhdistettiin ja laitettiin 1750 ml:n Diaion HP-20 SS -pylvääseen suolojen poistamiseksi liuoksesta. Pylväs pestiin vedellä ja A82846A eluoitiin I^OsiPrOH (95:5) -seoksella, joka sisälsi 0,5 % etikkahappoa. Eluu-10 tiota monitoroitiin HPLCrllä. A82846A:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 7,9 g puhdistettua A82846A:ta.

A82846A:n KBr-kiekossa ajettu IR-spektri on esitetty kuviossa 1; A82846A:n tioglyserolissa ajettu FAB-MS on esi-15 tetty kuviossa 4; Bruker AM500 -spektrometrillä (HDO-suppres-soitu) ja saatu A82846A-hydrokloridin (metyylisulfoksidi)-dg:ssa ajettu NMR-spektri on esitetty kuviossa 7.

C. A82846B:n puhdistus

Kolmesta preparatiivisesta HPLC-ajosta, jossa erotet-20 tiin A82846A ja A82846B, kohdassa B kuvatulla tavalla saadut, rikastetut A82846B-fraktiot yhdistettiin ja suolat poistettiin 1750 ml:n Diaion HP-20 SS-pylväällä pesten vedellä ja eluoiden H20:iPr0H (95:5) -seoksella, joka sisälsi 0,5 % etikkahappoa. Eluutiota monitoroitiin HPLC:llä ja A82846B-?5 fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja kylmä- kuivattiin, jolloin saatiin 8,8 g puhdistettua A82846B:tä.

A82846B:n KBr-kiekossa ajettu IR-spektri on esitetty kuviossa 2; A82846B:n tioglyserolissa ajettu FAB-MS on esitetty kuviossa 5; ja Bruker AM500 -spektrometrillä 60°C:ssa 30 saatu A82846B-asetaatin (metyylisulfoksidi)-dg:ssa ajettu NMR-spektri on esitetty kuviossa 8.

D. Suolojen poisto

Suolojen poisto voidaan suorittaa myös käyttäen Diaion HP-20 -hartsia ja eluoiden MeOH;H20 (4:1) -seoksella, 35 joka sisältää 0,1 % etikkahappoa.

42

Esimerkki 7 A82846C:n eristys A. 82846:n erottaminen

Neljästä esimerkissä 2, kohta B, kuvatulla tavalla 5 suoritetusta 165 l:n fermentoinnista saatu käymisliemi (461 1) säädettiin pH:hon 10,5 5 mol/1 NaOHrlla ja suoda tettiin 3 % Hyflo Supercel -suodatuksen apuaineen kanssa. Suodoksen (430 1) pH säädettiin 7:ksi 5 mol/1 HCl:lla ja suodos laitettiin pylvääseen, joka sisälsi 10 1 10 Dowex-XFS-43278 (NH^+) -hartsia. Pylväs pestiin 50 1:11a vettä ja aktiivinen aine eluoitiin 0,05 N NH^OH:lla (50 1) keräten 4 l:n fraktioita. Eluutiota monitoroitiin biologisella määritysmenetelmällä. Aktiiviset fraktiot (nrot 1-7) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa tilavuuteen noin 15 1700 ml ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 283,9 g raaka- A8 2846:tta.

B. A82846A:n, B:n ja C:n erottaminen

Kohdassa A kuvatulla tavalla saatu raaka-A82846 (2 g) liuotettiin veteen ja laitettiin 5 x 114 cm:rv ruostumat-20 tomasta teräksestä valmistettuun, preparatiiviseen HPLC-pyl- vääseen, joka sisälsi 2110 ml silikageeli LP-1/C^g-hartsia 1 % (NH4)Η2?0^:ssä. Pylväs kehitettiin käyttäen gradient-tia 1 % (NH^)H^PO^:sta 1 % (NH4)H2P04:asetonitriili (92:8) -seokseen virtausnopeudella 70 ml/min keräten 400 ml:n frak-25 tioita ja monitoroiden UV:llä aallonpituudella 254 nm.

A82846A:ta sisältävät fraktiot (nrot 11-14) yhdistettiin seokseksi 1; A82846C:tä sisältävät fraktiot (nrot 16 - 20) yhdistettiin seokseksi 2; ja A82846B:tä sisältävät fraktiot (nrot 21-25) yhdistettiin seokseksi 3.

30 C. A82846C:n puhdistus

Seos 2 konsentroitiin tilavuuteen noin 200 ml ja laitettiin 7 x 45 cm:n lasipylvääseen, joka sisälsi 1800 ml Diaion HP-20 -hartsia suolojen poistoa varten. Aktiivinen materiaali eluoitiin MeOH:H20 (4:1) -seoksella, joka sisäl-35 si 0,1 % etikkahappoa, keräten 1 l:n fraktioita virtausno- li 90993 43 peudella 25 ml/min. C:tä sisältävät fraktiot (nrot 9-12) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 662,2 mg osittain puhdistettua A82846C:tä.

Osittain puhdistettu A82846C (500 mg) puhdistettiin 5 edelleen toistamalla käänteisfaasi-HPLC-vaiheet käyttäen 2,5 x 132 cm:n teräksistä pylvästä, joka sisälsi 450 ml silika-geeli LP-1/C^ -geeliä, gradienttia 1 % (NH^)I^PO^:stä 1 % (NH^)H2p04:asetonitriili (92:8) -seokseen ja virtausnopeutta 11 ml/min, sekä keräten 25 ml:n fraktioita ja mo-10 nitoroiden aallonpituudella 254 nm. A82846C:tä sisältävät fraktiot (nrot 169-210) yhdistettiin ja suolat poistettiin 5 x 45 cm:n lasipylväällä, joka sisälsi HP-20-hartsia. Pylväs eluoitiin MeOH:H20-seoksella (4:1), joka sisälsi 0,1 % etikkahappoa, keräten 100 ml:n fraktioita ja seuraten eluu-15 tiota analyyttisellä HPLC:llä UV:ssä aallonpituudella 225 nm.

A82846C:tä sisältävät fraktiot (nrot 5-11) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 127,3 mg A82846C:tä.

Seos 1, joka sisälsi A82846A:n, ja seos, joka sisälsi 20 A82846B:n, puhdistettiin samälla tavalla kuin A82846C, jol loin saatiin lisää puhdistettua A82846A:ta ja A82846B:tä.

D. A82846C:n lisäpuhdistus A82846C (70 mg) puhdistettiin edelleen käyttäen seu-raavaa preparatiivista kromatografista menetelmää: 25 Pylväs: Zorbax SCX (9,2 x 250 cm) -kationinvaihtaja

Liikkuva faasi: Lineaarinen gradientti alkaen 0,15 mol/1 Na^PC^-puskurista, joka sisälsi 10 % MeOH:ta, 0,9 mol/1 Na^PO^-puskuriin, joka sisälsi 10 % MeOH:ta, 6 minuutissa ja jatkaen eluutiota 5 min. (Puskurille ei tehty mi-30 tään säädöksiä).

Virtausnopeus: 6,0 ml/min Toteaminen: HV aallonpituudella 280 nm Näytemäärä: 6,0 mg/injektio H20:ssa A82846C kerättiin talteen käyttämällä automaattis-35 ta fraktionkerääjää (Gilson 201C), joka oli varustettu pii kin toteamismekanismilla. Liikkuva faasi annosteltiin 44

Millipore Waters M600 Gradient HPLC System -laitetta käyttäen ja näyteliuos injektoitiin Hitachin automaattisella näyt-teenannostelijalla.

A82846C:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin, kon-5 sentroitiin tilavuuteen 30 ml ja laitettiin HP-20 -pylvää seen (50 ml). Pylväs pestiin IVOilla ja eluoitiin I^Oiiso-propanoli (95:5) -seoksella, joka sisälsi 0,5 % HOAc:a keräten 25 ml:n fraktioita. A82846C:n sisältävät fraktiot (nrot 9-14) yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmäkuivattiin, 10 jolloin saatiin 37 mg puhdistettua A82846C:tä.

A82846C:n KBr-kiekossa ajettu IR-spektri on esitetty kuviossa 3; A82846C:n tioglyserolissa ajettu FAB-MS on esitetty kuviossa 6; ja Bruker AM500 -spektrometrillä (HDO-suppressoitu) 60°C:ssa saatu A82846C-asetaatin (metyy-15 lisulfoksidi)-dg:ssa ajettu NMR-spektri on esitetty kuvios sa 9 .

Esimerkki 8 A82846-suolojen valmistus

Menetelmä: 20 Jokaisessa tapauksessa A82846-komponentti (100 mg) liuotettiin ionivapaaseen veteen (10 ml). Tämän liuoksen pH säädettiin noin 3:ksi käyttäen 0,5 N happoa (HC1, I^SC^ ja H3P04). Liuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin sopiva suolamuoto. On tärkeää huomauttaa, että jos pH:ta alenne-25 taan liikaa pH 3:n alle (tämä tarkoittaa pH 2:een), kompo nentti hajoaa. Saatiin seuraavat saannot:

Saanto (mg)

Suola A82846A A82846B

HC1 93,8 88,1 30 H2S04 92,5 75,4 H3PO4 110,8 105,7 90993 45

Esimerkki 9 A82846A:n tabletiksi formulointi

Tabletit., jotka sisältävät A82846A:ta, voidaan valmistaa käyttäen seuraavia aineosia ja määriä: 5 Aineosa Paino A82846A-fosfaatti 282,9 mg

Mikrokiteinen selluloosa 101,1 mg

Kroskarmelloosinat- 10 rium 12,0 mg

Providone 12,0 mg

Magnesiumstearaatti 3,0 mg

Steariinihappo 4,0 mg

Puhdistettu vesi 0,16 ml 15 Lisää A82846A-fosfaatti, osa mikrokiteisestä selluloo sasta ja osa kroskarmelloosinatriumista sopivaan astiaan ja sekoita, kunnes seos on homogeeninen. Valmista Povidone'n vesiliuos ja lisää Povidone-liuos sekoitettuihin jauheisiin. Rakeista saatu seos, lajittele koon mukaan, jos on tarpeen, 20 ja kuivata. Lisää jäljellä oleva mikrokiteinen selluloosa ja kroskarmelloosinatrium kuivattuun seokseen ja sekoita. Lisää magnesiumstearaatti ja steariinihappo ja sekoita seos. Purista saatu jauheseos tableteiksi.

Esimerkki 9 25 A82846B-kapseleiden formulointi A82846B:tä sisältäviä kapseleita voidaan valmistaa käyttäen seuraavia aineosia ja määriä:

Aineosa Paino A82846B-hydrokloridi 262,2 mg 30 Maissitärkkelys -valuva jauhe 137,7 mg

Silikonineste 350 centistokes 2,7 mg

Maissitärkkelys 147,1 mg 46

Sekoita A82846B-hydrokloridi, tärkkelys -valuva jauhe, silikonineste 350 centistokes ja tärkkelysjauhe sopivassa sekoittimessa, kunnes seos on homogeeninen. Täytä sopivankokoisiin, kovasta gelatiinista valmistettuihin kap-5 seleihin.

Esimerkki 11 A82846A-suspension formulointi

Valmista steriili A82846A:n liukenematon muoto kiteyttämällä tai saostamalla. Jauho tai seulo partikkelikoko, 10 joka sopii suspensioon. Suspendoi A82846A seuraavaan vehik- keliin:

Aineosa Määrä

Lesitiini 1 %

Natriumsitraatti 2 % 15 Propyyliparabeeni 0,015 %

Steriili vesi q.s. haluttu tilavuus

Suspensio voidaan valmistaa suurena määränä ja täyttää pulloihin tai se voidaan valmistaa juuri ennen käyttöä lisäämällä vehikkeli pullossa olevaan A82846A:han.

li

Claims (4)

90993 47

1. Menetelmä antibiootin A82846 ja sen komponenttien A82846A, A82846B tai A82846C valmistamiseksi, joilla 5 on kaava nh2 sj "°l O" CH, || I <w\ Jc J H-f r Γ » 1 H> Λ NH-\—s vh H «ο y 'ή I I T CH» ' lv JL I ^ HO'' OH OH 20 jossa kaavassa X = H ja Y = Cl (A82846A), X = Cl ja Y = Cl (A82846B) tai X = H ja Y = H (A82846C), tunnettu siitä, että viljellään kantoja Nocardia orien-talis NRRL 18098, NRRL 18099 ja NRKL 18100 tai niiden 25 A82846:tta tuottavia jälkipolvia viljelyväliaineessa, joka sisältää assimiloitavia hiililähteitä, typpilähteitä ja epäorgaanisten suolojen lähteitä, submersseissä aerobisissa fermentointiolosuhteissa, ja tämän jälkeen erotetaan antibiootti fermentointiväliaineesta ja valinnaisesti muu-30 tetaan antibiootti suolaksi, jos se ei ole suolamuodossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan A82846A tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-35 n e t t u siitä, että valmistetaan A82846B tai sen far- 48 maseuttisesti hyväksyttävä suola.

4. Biologisesti puhdistettu viljelmä, tunnet-t u siitä, että se on Nocardia orientalis -kanta NRRL 18098, NRRL 18099 tai NRRL 18100 tai näiden A82846:tta 5 tuottava jälkeläinen. 90993 49