FI90993C - Menetelmä glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi ja niitä tuottavia mikro-organismiviljelmiä - Google Patents

Description

90993 i

Menetelmå glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi ja niita tuottavia mikro-organismiviljelmiå 5 Tama keksinto koskee menetelmaa uusien vankomysii- niryhmån glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi. Eri-tyisesti se koskee antibiootin A82846 ja sen yksittåisten komponenttien A82846A, A82846B ja A82846C valmistusta viljelemållå uusia mikro-organismien kantoja.

10 Vaikka tållå hetkellå on saatavissa monia hyodyl- lisiå antibiootteja, tarve loytåå parempia antibiootteja ihmislååketieteeseen jatkuu. Esimerkiksi vankomysiini on kaupallisesti menestyksekås antibiootti, joka on pelasta-nut monta elåmåå. Vankomysiini saattaa kuitenkin aiheut-15 taa ongelmia; se vox olla toksinen korville ja munuaisil-le. Siten tarvitaan antibiootteja, joilla on vankomysii-nin vaikutukset, mutta joiden farmakokinetiikka on parem-pi tax joilla on våhemmån sivuvaikutuksia.

Tåmån keksinnon mukaisesti on nyt keksitty, ettå 20 erittåin hyodyllisiå glykopeptidiantibiootteja voidaan tuottaa kåyttåen Nocardia orientalis -kantojen NRRL 18098, NRRL 18099 tax NRRL 18100 submerssiå aerobista fermentointia viljelyvåliaineessa, joka sisåltåå assimi-loitavia hiilen, typen ja epåorgaanisten suolojen låhtei-25 tå. Olemme mielivaltaisesti nimenneet nåmå glykopeptidi-antibiootit A82846:ksi sekå sen komponenteiksi.

Antibiootti A82846 on rakenteeltaan samanlainen kuin vankomysiini, mutta sillå on parempi vaikutus in vitro ja in vivo gram -positiivisia bakteereja vastaan 30 samoin kuin parempi farmakokinetiikka, jolloin saadaan paljon pitempi puoliintumisaika kuin vankomysiinin puo-liintumisaika.

A82846:n komponenteilla on oleellisesti seuraavat fysikaaliset ja spektraaliset ominaisuudet: 2 A82846A:n ominaisuudet Molekyylipaino: 1556 Empiirinen kaava: o°26C^ FAB-MS (tioglyseroli): (M+1) Saatu: 1557, 5803; 5 laskettu yhdisteelle C^2HgoNl0^26^^" = · 5716 (katso kuvio 4) UV (H~0) λ : 281 run (¢5052), siirtyy 300 nm: iin

^ ItldX

emåksellå IR (KBr); 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 10 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 ja 1015 cm"1 (katso kuvio 1) NMR / (CD^SO/: katso kuvio 7 pKa (H20): 4,7, 9,5 (66 % DMF): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4, 12,3 15 (nåennåinen molekyylipaino 1542) A82846B:n ominaisuudet Molekyylipaino; 1590

Empiirinen kaava; C73Hq8N1 0Ο26ε1·2 FAB-MS (tioglyseroli): (M+1) Saatu: 1591, 5315; 20 Laskettu yhdisteelle C73Hg9N-jq°26C12 = 1591, 5327 (katso kuvio 5) UV (H~0) X : 280 nm (€ 5192), siirtyy 300 nmriin emåksellå IR (KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 25 1135, 1105, 1065, 1023 ja 1018 cm 1 (katso kuvio 2) NMR /"(CDg) 2SO_7: katso kuvio 8 pKa (H20): 4,65, 9,5 A82846C:n ominaisuudet Molekyylipaino: 1522 30 Empiirinen kaava: C^gHgQN^Q02g FAB-MS (tioglyseroli): (M+Na) Saatu: 1545, 5998; Laskettu yhdisteelle C73H9QN-j^O^Na = 1545, 5925 (katso kuvio 6) UV (H~0): \ : 280 nm (€.5198), siirtyy 300 nm:iin i ma.x 35 emåksellå li 90993 3 IR (KBr): 3600-»3004 (laaja), 2999, 2991, 2950, 1687 —> 1650 (laaja), 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 ja 1014 cm"1 (katso ku-vio 3) 5 NMR Z~(CD2)2SQ7: katso kuvio 9 pKA (H20): 4,6, 9,4 A82846A:n, A82846B:n ja A82846C:n aminohappoanalyy-sit 6 mol/1 HClilla hydrolyysin jSlkeen osoittivat aspara-giinihapon ja kahden laajan piikin seka pienen maSran gly-10 siiniå lSsnåoloa. Kaksi piikkia nåyttavåt vastaavan aktinoi- diniini- ja vankomysiniiniaminohappoja, joita molelmpia esiin-tyy vankomysiiniluokan glykopeptideisså.

Vertailevat NMR-tutkimukset osoittavat, etta seka A82846A, A82846B etta A82846C sisåltåvåt uuden aminosokerin 15 4-epi-vankosamiini-(3-metyyliakosamiinin):

.rwOR

CHa—-» (j CHs Æ-^ 20 H0—V "Ha A82846A:n molekyylikaava vastaa vankomysiinin mole-kyylikaavaa (cg6H75N9°24C12^' 7osta puuttuu yksi klooriato-mi ja jossa on vankosamiinityyppinen ylimaaråinen aminoso-25 keri (C7H14N02).

A82846B:n molekyylikaava vastaa A82846A:n molekyyli-kaavaa, jossa vetyatomi on korvattu klooriatomilla.

A82846C:n molekyylikaava vastaa A82846A:n molekyyli-kaavaa, jossa klooriatomi on korvattu vedylia.

30 A82846:n komponentit nayttavat muodostavan uuden, ylei- selta koostumukseltaan vankomysiinimolekyylia muistuttavien ja siita paaasiassa kloorisisålldn ja vankosamiinikokoomuksen omaavan ylimaåråisen alayksikdn esiintymisen suhteen poikkea-vien glykopeptidien perheen.

4 A82846:n komponenteilla nåyttåå olevan seuraavat rakennekaavat:

NHj NO

La

I O-^V-CHjOH

5 NH, C ' V-5o

ch, i jp 1Γ i jL

in o „Jl°H <?«’

10 O-^/V = NH / " ί*ΝΗ I

TH =AH / NH— ^ \ *H

°Y\ ri V / 8 A-V1 .A'«· a-ch·

IT “· H

15 koA^oh oh A82846A: X = Η Y r Cl A82846B : X = Cl Y = Cl 20

A82846C : X = H Y = H

A82846-yhdisteiden sokeriryhmien absoluuttista konfi-guraatiota ei ole vielå mååritetty.

A82846 ja sen yksittåiset komponentit A82846A, 25 A82846B ja A82846C voivat reagoida edelleen, jolloin rauo- dostuu erilaisia suoloja. Kaikki nåiden antibioottien tål-laiset muodot ovat osa tåtå keksintSå. A82846-suoloja voi-daan kayttåå esimerkiksi A82846:n eriståmisesså ja puhdis-tuksessa. Lisåksi suolat liukenevat paremmin veteen.

30 A82846-suolat valmistetaan kåyttåen suolojen valmis- tuksen normaaleja menetelmiå. Esimerkiksi A82846 voidaan neutraloida sopivalla hapolla, jolloin muodostuu happoad-ditiosuola.

Happoadditiosuolat ovat erityisen kåyttokelpoisia.

35 Edustavia sopivia suoloja ovat suolat, joita muodostuu nor-maaleissa reaktioissa sekå orgaanisten ettå epåorgaanisten li 5 90993 happojen kanssa, kuten esimerkiksi rikki-, kloorivety-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleii-ni-, fumaari-, kooli-, pamoiini-, lima-, D-glutamiini-, d-kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, muura-5 hais-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe- ja kane-lihapon seka vastaavien happojen kanssa. Farmaseuttisesti hyvåksyttåvåt happoadditiosuolat ovat erityisen edullinen ryhmå tåmån keksinnon mukaisia suoloja.

10 Antibioottia A82846 voidaan tuottaa viljelemållå A82846:tta tuottavaa Nocardia orientalis-kantaa submers-seisså, aerobisissa olosuhteissa sopivassa viljelyvåliai-neessa, kunnes saadaan paljon antibioottista aktiivisuut-ta. Antibiootti voidaan ottaa talteen kayttaen erilaisia 15 alalla tunnettuja eristys- ja puhdistusmenetelmiå. Keksinnon mukaiselle menetelmålle on tunnusomaista se, mitå pa-tenttivaatimuksessa 1 esitetåån.

Tama keksinto koskee myos mikro-organismin biologisesti puhdistettua viljelmåa, joka mikro-organismi voi ol-20 la Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 18100 tai nåiden kanto jen A82846:tta tuottava jålkelåinen. Nåmå mikro-organismi t ovat kåyttokelpoisia, koska ne tuottavat antibioottia A82846. Seuraavan keskustelun helpottamiseksi NRRL 18098-25 kanta on nimetty viljelmå A82846:ksi, NRRL 18099-kanta on nimetty viljelmå A82846.1:ksi ja NRRL 18100-kanta on nimetty viljelmå A82846.2:ksi. Viljelmå A82846 eristettiin Haitilta saadusta maaperånåytteestå. Viljelmå A82846.1 saatiin viljelmåstå A82846 kemiallisen mutageneesin avulla 30 ja viljelmå A82846.2 on viljelmåstå A82846 eristetty luon-nollinen variantti.

Viljelmåt A82846, A82846.1 ja A82846.2 talletettiin ja liitettiin Midwest Area Northern Regional Research Center -laitoksen, Agricultural Research Service, United 35 States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, kantaviljelmåkokoelmaan 6 elokuun 8. påivånå 1986. Viljelmat ovat yleisesså kåytdsså talletusnumeroilla NRRL 18098 (A82846, låhtokanta), NRRL 18099 (A82846.1, mutanttikanta) ja NRRL 18100 (A82846.2, varian-tinkanta).

5 Viljelmien A82846, A82846.1 ja Ά82846.2 taksonomiset tutkimukset suoritti Frederick P. Mertz Lilly Research Laboratories -tutkimuslaboratoriosta. Nåiden tutkimusten pe-rusteella uudet organismit luokiteltiin Nocardia orientalis -kannoiksi (Pittenger ja Brigham, 1956) Pridham ja Lyons 10 1969, tyyppikanta ATCC 19795 pittenger, R.C. ja Brigham, R.B., "Streptomyces orientalis n. sp., the Source of Vancomycin", Antibiotics and Chemotherapy 6 (1956) 642-647.7. TåinS luokitus perustuu suoriin, laboratoriossa tehtyihin vertailuihin ja julkaistujen kuvausten tutkimisteen 15 /Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos,

Buchanan, R.E. ja Gibbons, N.E., toim., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; Goodfellow, M. ja Schaal, K.P., "Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus" kirjassa Identification Methods for 20 Microbiologists, 2. painos, Skinner, F.A. ja Lovelock, D.W., toim. Society for Applied Bacteriology Technical Series Nro 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, s. 261; Gordon, R.E., Barnett, D.A., Handerhan, J.E. ja Pang, C.H., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica and the Nocardin 25 Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), (1974) 54-63;

Gordon, R.E., Mishra, S.K. ja Barnett, D.A., "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. oarnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis, and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109 (1978) 69-78; Mishra, S.J., Gordon, 30 R.E. ja Barnett, D.A., "Identification of Nocardiae and

Streptomyces of Medical Importance", J. Clin. Microbiol.

11 (6) (1980) 728-736; Mordarska, H. ja Mordarski, M., "Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology 71 (1972) 35 77-86; ja Shinobu, R. ja Kawato, M., "On Streptomyces aerocolonigenes nov. sp.. Forming the Secondary Colonies on the Aerial Mycelia", Bot. Mag. Tokyo 73 (1960) 213-216.7.

7 90993

Seuraavat menetelmåt ovat Kansainvålisen Streptomyces-projektin (International Streptomyces Project, ISP) suosit-telemia menetelmiå Streptomyces-lajien karakterisoimiseksi /Shirling, E.B. ja Gottlieb, D., "Methods for Characterization 5 of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (1966) 313-3407 sekå tydryhmån Gordon, Barnett, Handerhan ja Pang, yllå, suosittelemia menetelmiå Nocardia-lajien karakterisoimiseksi .

Morfologia tutkittiin kåyttåen optista valomikros-10 kooppia. Pyyhkåisyelektronimikroskooppia (SEM) kåytettiin itioiden pinnan kuvioiden tutkimiseen.

Resistenssi rifampiinille ja lysotsyymille mitattiin Gordonin ^pordon, R.E. ja Barnett, D.A., "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium 15 and Nocardia as a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol.

27 (3) (1977) 176-178jsuosittelemia menetelmiå kåyttåen.

ISCC-NBS Centroid Color Charts -karttoja, vakionåyte nro 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department 20 of Cormmerce, Washington, D.C.) sekå Color Harmony Manual -kåsikirjaa (4. painos, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) kåytettiin vårinimen (color names) måårittåmiseksi.

Melanoidipigmentin tuotto (kromogeenisyys) mååritet-25 tiin våliaineilla ISP nro 1 (tryptoni-hiivauute -liemi), ISP nro 6 (peptoni-hiivauute -liemi) ja ISP nro 7 (tyrosiini-agar).

Kokonaisten solujen hydrolysaattien diaminopimeliini-hapon (DAP) isomeerit ja hiilihydraatit mååritettiin Becker 30 et al.'n mukaisilla kromatografisilla menetelmillå /Becker, B., Lechevalier, M.P., Gordon, R.E. ja Lechevalier, H.A., "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12 (1964) 412-423J sekå Lechevalierin mukaisilla 35 kromatografisilla menetelmillå /Lechevalier, M.P., 8 "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med. 71 (1968) 934-944J.

Mykolihapot mååritettiin kåyttaen Minnikinin kuvaa-miin menetelmiin perustuvaa menetelmaa ^JMinnikin, D.E., 5 Hutchinson, I.G. ja Caldicott, A.B., "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188 (1980) 221-2337.

Fosfataasi ja ureaasi maåritettiin Blazevicin kuvaa-mia menetelmiå kåyttåen T^lazevic, D.J. ja Ederer, G.M., 10 Principles of Biochemicals Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, s. 1367· Gelatii-nin nesteentymistå kåytettiin proteinaasiaktiivisuuden maa-rittåmiseksi.

Antibioottiresistenssi mitattiin laittamalla anti-15 bioottiherkkyyskiekot ympattyjen ISP nro 2 -agarlevyjen pin-nalle.

Tårkkelyksen hydrolyysi mitattiin testaamalla jodilla tårkkelyksen låsnåolo ISP nro 4 (epåorgaaniset suolat -tårkkelys) -agarlevyillå (katso Blazevic ja Ederer, yllå).

20 Hippuraattihydrolyysi mitattiin kåyttaen Bacto

Differentiation Disks -kiekkoja, jotka nopeasti toteavat hippuraatin hydrolyysin.

Viljelmåt A82846 ja A82846.2 kasvoivat hyvin kaikis-sa monimutkaisissa ja mååritellyisså våliaineissa. Nåmå vil-25 jelmåt tuottivat ilmarihmastoja useimmilla våliaineilla.

Ilmarihmaston itiomassan våri oli valkoinen tai harmaa vå-liaineesta riippuen. Selvåsti erottuvaa ruskeaa, liukoista pigmenttiå tuotettiin monissa våliaineissa; alapuoli (reverse side) oli ruskeasta kellertavånvalkoiseen.

30 Viljelmå A82846.1 kasvoi myos kaikissa kåytetyisså våliaineissa, mutta sen kasvu ei ollut niin runsasta kuin emoviljelman kasvu. A82846.1 tuotti ilmarihmastoja vain har-voin. Kun rihmastoa esiintyi, sen våri oli valkoinen. Sa-tunnaista, ei selvåsti erottuvaa, vaaleanruskeaa pigmenttiå 35 tuotettiin muutamissa våliaineissa; alapuolen våri vaihteli ruskeasta kellertåvånvalkoiseen.

|j 9 90993

Viljelmien A82846, A82846.1 ja A82846.2 viljelyominai-suuksien yhteenveto on esitetty taulukossa 1. Viljelmåt A82846 ja A82846.2 olivat hyvin samanlaiset ja poikkesivat toisistaan vain muutamien viljelyominaisuuksien suhteen.

5 Lisavertailuja ei tehty, koska A82846 ja A82846.2 ovat saman- kaltaisia ja koska A82846.2 on A82846:n luonnollinen variantti.

Taulukko I

A82846:n, A82846.1:n ja A82846.2:n viljelyominaisuudet eri agar-våliaineissaa'^ 10 _

Agar- A82846 A82846.1 A82846.2 våliaine G: Runsas Runsas (pinta kuoriintuu) Runsas ISP R: 59.d.Br 57.1. Br 58.m.Br ^ nro 2 Am: Runsaasti: g Ei lainkaan Hieman keskiharmaa

Sp: Tummanruskea Ei lainkaan Vaaleanruskea pigmentti - ei _pH:n muutosta___ G: Hyvå Huono Hyvå ISP R: 92.y valkoinen 92.y valkoinen 92.y valkoinen nro 3 Am: Paljon: a Våhån: a Kohtalaises- 20 valkoinen valkoinen ti: a valkoinen _S£j_Ei lainkaan_Ei lainkaan_Ei lainkaan G: Runsas Huono Hyvå ISP R: 56 syvå Br 92.y. valkoinen 77.m. y Br nro 4 Am: Runsaasti: a Våhån: a Paljon:a valkoinen valkoinen valkoinen _Sp:_Ei lainkaan___Ei lainkaan_Ei lainkaan 25 G: Runsas Runsas Runsas ISP R: 47.d.gy.rBr 47.d.gy.rBr 47.d.gy.rBr nro 5 Am: Paljon: d Ei lainkaan Paljon: d vaaleanharmaa vaaleanharmaa _Sjj:_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea 10

Taulukko I (jatkuu)

Agar- A82846 A82846.1 A82846.2 våliaine_ 5 G: Runsas Hyvå Runsas ISP R: 59.d.Br 78.d.yBr 59.d.Br nro 7 Am: Runsaasti: e Hieman Runsaasti: d keskiruskea vaaleanruskea

Sp: Tummanruskea Vaaleanruskea Tummanruskea pigmentti - ei pigmentti pigmentti _£H :n muutosta____ G: Runsas Hyvå Runsas

Czapek's R: 56. syvå Br 47.d.gy.rBr 5b. syvå Br

Am: Runsaasti: a Ei lainkaan Runsaasti: a valkoinen valkoinen

Sp: Ei lainkaan Punaisen oranssi vaalea punaisen- _oranssi_ G: Hyvå Hyvå Hyvå

Glukoosi- R: 58.m.Br (vain lai- 77.m.yBr 58.m.Br 15 asparagii- . kuttain) ni Am: Kohtalaisesti: A Ei lainkaan Ei lainkaan valkoinen _Sp: Ei lainkaan_Ei lainkaan_Ei lainkaan G: Runsas (pinta kuo- Hyvå (ryppyinen, Hyvå (ryppyinen, riintuu) kostea pinta) kostea pinta)

Glukoosi- R: 21. mustanpunainen 77.m.yBr 77.m.yBr 2 ø hiivauute

Am: Ei lainkaan Ei lainkaan Ei lainkaan __S£j_Syvå punaisenruskea Ei lainkaan_Vaaleanruskea G: Hyvå Hyvå Kohtalainen

Ravinto- R: 45.1.gy.rBr 76.1.yBr 79.1.9y.yBr agar Am: Ei lainkaan Ei lainkaan Våhån _Sp: Vaaleanruskea_Ei lainkaan_Ei lainkaan i*.

Taulukko I (jatkuu) 90993 11

Agar- A82846 A82846.1 A82846.2 valiaine_ 5 G: Runsas Runsas Runsas

Tomaatti- R: 47.d.gy.rBr 57. l.Br 47.d.9y.rBr tahnakau- Am: Runsaasti: d Hieman: a Paljon: d rajauhe vaaleanharmaa valkoinen vaaleanharmaa

Sp: Tumma punaisen- Ei lainkaan Punaisenruskea __ruskea_ G: Kohtalainen Kohtalainen Hyvå

Vesijoh- R: 92.y valkoinen 92.y valkoinen 92.y valkoinen tovesi- Am: Kohtalaisesti: Kohtalaisesti: Paljon: a agar a valkoinen b harmaanvalkoinen valkoinen _Sp:_Ei lainkaan_Ei lainkaan_Ei lainkaan G: Kohtalainen (ei Hyvå (hydrolyysiå) Kohtalainen (ei hydrolyysiå) hydrolyysiå)

Kalsium- R: 57.l.Br 58.m.Br 57.l.Br malaatti Am: Hieman Ei lainkaan Hieman 15 _Sp:_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea_Vaaleanruskea a G = kasvu; R = alapuoli; Am = ilmarihmasto; Sp =liukoinen pigmentti bInkuboitu 30°C:ssa 21 påivån ajan

Viljelmåt A82846, A82846.1 ja A82846.2 tuottivat runsaasti substraattirihmastoa. Ilmarihmastot muodostivat pitkiM

20 konidiaketjuja, joiden ulkonåko oli håmåhåkinverkkomainen, mika on luokiteltu nostreptomycetes-lajien ominaisuudeksi Bergey's Manual of Determinative Bacteriology-kåsikirjassa.

Kaikissa viljelmisså itididen pinnan kuviointi oli sileå ja itiot olivat muodoltaan sylinterimaisiå. Itididen ^ koko vaihteli valilla 1,2 - 1,3 x 0,4 - 0,5 ^um A82846:llå ja valilla 1,4 - 2,2 x 0,3 - 0,4 ^um A82846.1:llå.

Kasvatettaessa submersseissa olosuhteissa ravistellen A82846 fragmentoitui minimaalisesti, A82846.1 fragmentoitui huomattavasti jaA82846.2 fragmentoitui kohtalaisesti.

^ Seka A82846 ettå A82846.1 tuottivat happoa arabinoosis- ta, sellobioosista, dekstraanista, fruktoosista, galaktoosis- ta, glukoosista, O^-metyyli-D-glykosidista, glyserolista, ino- sitolista, laktoosista, maltoosista, mannitolista, mannoosista, melibioosista, ramnoosista, riboosista, sakkaroosista, tre-3 3 haloosista ja ksyloosista, mutta eivåt tuottaneet happoa ado-nitolista, selluloosasta, dulsitolista, erytritolista, inulii- 12 nista, sorbitolista eivatka ksylitolista. A82846 tuotti hap-poa myos etanolista, glykogeenista, meletsitoosista, raffi-noosista ja salisiinista, kun taas A82846.1 ei tuottanut. Molemmat viljelmåt kåyttivåt asetaattia, sitraattia, laktaat-5 tia, malaattia, oksalaattia, propionaattia, pyruvaattia ja sukkinaattia, mutta eivat kåyttåneet bentsoaattia, mukaat-tia eivatka tartraattia. Viljelmå A82846.1 kåytti butyraat-tia, kun taas A82846 ei kayttånyt.

A82846 ja A82846.1 hajoittivat kaseiinia, hypoksan-10 tiinia, tyrosiinia, ureaa ja DNA:ta, mutta eivåt hajoitta- neet adeniinia, kalsiummalaattia eivatka ksantiinia. Mo-lemxnat viljelmåt hydrolysoivat tårkkelystå, eivåt hydroly-soneet eskuliinia eivatka hippuraattia, pelkistivåt nitraat-tia, tekivåt gelatiinin nestemåiseksi, pysyivat hengisså 50°C:ssa 8 tunnin ajan sekå tuottivat katalaasia. I^Ssåå 15 ja fosfataasia.

Viljelmillå A82846 ja A82846.1 oli identtiset an-tibioottiresistenssikaaviot. Ne olivat resistentteja ba-sitrasiinille (10 yksikk5å), kefalotiinille (30 ^ug), gen-tamysiinille (10 ^ug), linkomysiinille (2 yug), oleandomy-20 siinille (15 ^ug), penisilliini G:lle (10 yksikkoå), strep- tomysiinille (10 ^,ug) , vankomysiinille (30 ^,ug) , tobramy-siinille (10 ^ug), erytromysiinille (15 ^ug) , nalidiksiini-hapolle (30 ^ug), polymyksiini B:lle (300 yksikkbå), trime-topriimille (5 ^ug) seka sulfadiatsiinille (300 ^ug) ja 25 olivat herkkia neomysiinille (30 ^ug), rifampisiinille (5 yug), tetrasykliinille (30 yug), kloramfenikolille (30 yug), novobiosiinille (30 yUg) ja mandelamiinille (3 /ug) .

Seka A82846 etta A82846.1 vårjåytyivåt gram-positii-visesti, mutta eivat vårjaytyneet haponkeståvåsti (acid 30 fast) .

A82846:n hydrolysoidut kokonaiset solut sisalsivat diaminopimeliinihapon meso-isomeeriå sekå sokereita arba-binoosi ja galaktoosi. Viljelmillå on tyyppi IV:n saluseina Becker et al.'n ylla, mukaisesti. Sokerikaavio on tyyppia A 35 (Lechevalier, ylla). Viljelmåt eivåt tuottaneet mykolihap- poja (LCN-A).

13 90993

Kannan A82846 kemotaksonomiset ja yleiset viljely-ominaisuudet ovat yhtåpitåvia sen måårååmiseen sukuun Nocardia Trevisan 1889 kanssa /Skerman, V.B.D., McGowan, V. ja Sneath, P.H.A., toim., "Approved Lists of Bacterial Names", 5 Int. J. Syst. Bacteriol. 30 (1980) 225-4207·

Vastaavuuskertoimet laskettiin tyoryhmån Gordon,

Mishra ja Barnett, yllå, julkaisemien 14 Nocardia-lajin se-ka Lillyn viljelmakokoelman viiden kannan ominaisuuksista. Kåytettiin Jaccardin kerrointa T£atso Sneath, P.H.A., 10 "The Application of Computers to Taxonomy", J. Gen.Microbiol.

17 (1957) 2017 ja yksinkertaista tåsmaåvyyskerrointa /fcatso Sokal, R.R. ja Michener, C.D., "A Statistical Method for Evaluating Systematic Relationships", Kan. Univ. Sci. Bull.

38 (1958) 14097· NSiden vertailujen tulosten yhteenveto on 15 esitetty taulukossa II.

14

Taulukko II

A82846:n ja 19 muun Nocardia-lajin vastaa-vuuskertoimet

Viljelma Vastaavuuskerroin 5 Ssm_Sj A82846 100 100 N. aerocolonigenes 84 76 N. aerocolonigenes (A42125)* 83 78 N. orientalis (M43-05865) 78 72 10 N. orientalis (A51568.1) 78 72 N. orientalis 75 68 N. orientalis (M5-18215) 73 66 N. orientalis (M5-18260) 73 66 N. madurae 73 63 N. hirsuta 62 60 N. autotrophica 62 53 N. dassonvillei 62 50 N. amarae 62 46 N. brasiliensis 56 43 20 N. vaccinci 56 43 N. transvalensis 48 38 N. caviae 48 32 N. pelletieri 48 24 N. asteroides 46 23 25 N. carnea 43 25 *

Suluissa olevat luvut osoittavat Lillyn viljelmakokoel-man kannat

Koska N. madurae on siirretty sukuun Actinomadura, 30 se jåtettiin ottamatta huomioon. Kahdella lajilla, N. aerocolonignes'11S ja N. orientalis'11a on hyvat vas-taavuuskertoimet. Suoritettiin laboratoriovertailu ja A82846:n ja naiden kahden lajin valillS. Naiden vertailu-jen tulokset on annettu taulukossa III.

li i 5 90993

Taulukko III

A82846:n, N. orientalis'n ja N. aerocolonigenes'π ominaisuuksien vertailu c Vilielnaa N.

Ominaisuus ϊί· aerocolon- <2846 orientalis isenes TUottaa ilmarihinastoja + + +

Ilmarihnastojen var i valkoinen + + +

Tuottaa konidioita + + +

Itioiden pin ta silea + + +

Itiot sylin ter inrtuotoisia + +

Tuottaa liukoista pigmenttia +

Gram+ + + + 5 Haponkestava - -

Fragmentoituu + + +

Tuottaa katalaasia + + +

Hydrolysoi: eskuliinia + + 2 g hippuraattia - - tarkkelysta + + +

Ca-malaattia + +

Pelkistaa nitraattia + +

Hajoittaa: 2 5 adeniinia - kaseiinia + + + hypcksantiinia + + + tyros iinia + + + ureaa + + + 3 0 ksantiinia

Taulukko III jatkuu 16 ___Vilielmaa_ N.

N. aerocolon- g Cimnaisuus 82846 orientalis igeaes

Tekee gelatilnin nestemaiseksi + +

Tuottaa fosfataasia + + +

Pysyy hengisså 50°C:ssa, 8 h + +

Tuottaa happoa: 10 adonitolista + arabinoosista + + + sellobioosista + + + erytritolista + glukoosista + + + 15 o^-Me-glukosidista + + glyserolista + + + inositolista + + + laktoosista + + + naltoosista + + + 20 mannitolista + + + mannoosista + + + meletsitoosista + melibioosista + - + raffinoosista + 25 ramnoosista + + + sorbitolista · trehaloos i sta + + + ksyloosista + + + kontrolli - 17

Taulukko III jatkuu 90993

ViljplTTwa -------- aerocolon- 5 Ominaisuus 82846 orientalis igenes

Kayttaa: bentsoaattia _ sitraattia + + + irukaattia _ 1 g sukkinaattia + + + tartraattia _ kontrolli _

Resistenssi: basitrasiinille (10 yksikkoa) + 15 kefalotiinille (30 ^,ug) + + + gentamysiinille (10 ^ug) + linkcrysiinille (2 ^ug) + + + neccnysiinille (30 ^ug) _ oleandorrysiinille (15 ^ug) + 20 penisilliini G:lle (10 yksikkoa) + + + rifairpisiinille (5 ^ug) - - - streptonysiinille (10 yUg) + + tetrasykliinille (30 yug) - tobrarnysiinille (10 ^ug) + + 25 vankanysiinille (30 ^ug) + + kloramfenikolille (30 ^,ug) - erytramysiinille (15 ^ug) + nalidiksiinihapolle (30 ^ug) + + novobiosiinille (30 ^ug) + 30 polymyksiini B:lle (300 yksikkoa) + + + trimetopriimille (5 ^ug) + + + a + = kannalla on mainittu ominaisuus; - = kannalla ei ole mainittua cminaisuutta 18

Vastaavuuskertoimet laskettiin uudelleen kayttaen suurta lukumaaråå yksittaisiå lukuja. Tulosten yhteenveto on esitetty taulukossa IV.

Taulukko IV

5 A82846:n, Nocardia orientalis'n ja Nocardia aerocolonigenes'n vastaavuuskerroin

Viljelmå Vastaavuuskerroin 10 _Ssm_Sj_ A82846 100 100 N. orientalis 81 76 N. aerocolonigenes 73 65

Ei N. orientalis'11a eikS N. aerocolonigenes'11a 15 ole mykolihappoja soluseinåssåån. Gordon, yllS, kuvaa kol- me avainominaisuutta, jotka auttavat erottamaan N .orientalis’n N. aerocolonigenes'sta. A82846:n vertailu Nocardia-lajeihin kåyttMen Gordonin avainominaisuuksia on esitetty taulukossa V.

20 Taulukko V

A82846:n, Nocardia orientalis'n ja Nocardia aerocolonigenes'n avainominaisuuksien vertailu

Ominaisuus 25 Tuottaa happoa Resistentti erytrito- Me-©/- lysotsyymille Viljelma lista gluko- _sidista_ A82846 - ++ 30 N. orientalis + +- N. aerocolonigenes - -+

Vaikka A82846 ei identtisesti tåsmaåkaån kununankaan Nocardia-lajin avainominaisuuksien kanssa, sen viljelyomi-naisuudet muistuttavat enemmån N. orientalis'n viljelyomi-35 naisuuksia ja sillå on korkea vastaavuuskerroin N. orientalis’n l! 90993 19 kanssa. Se myos muistuttaa N. orientalis' ia siinå, etta se tuottaa glykopeptidiantibioottia. Siksi A82846 luokitel-laan Nocardia orientalis (Pittenger and Brigham, 1956)

Pridham ja Lyons 1969 -kannaksi. Koska N. orientalis tun-5 netaan Approved Lists of Bacterial Names -luettelossa, yllå, se on pitavasti julkaistu laji.

Viljelma A82846.1 on A82846-viljelmån kemiallises-ti aiheutettu mutantti. Piirteet, joiden suhteen A82846.1 poikkeaa A82846:sta, on esitetty taulukossa VI.

10 Taulukko VI

A82846:n ja A82846.1:n eroavaisuuksien vertailu

Omlnaisuus_A82846_A82846.1_ 15 Fragmentoituminen mininaalinen runsas

Pesakkeen kcko 7 rrm 5 rrm

Pesakkeen pinta kova pehmea

Ilnarihmastot runsaasti hiesnan

Alapuolen vari tumnanruskea vaaleanruskea 20 Liukoinen pigmentti +

Tuottaa happoa: etanolista + glykogeenista + meletsitoosista + 25 raffinoosista + salisiinista +

Kayttaa: ^-Me-glukosidia + glykogeenia + 3 0 meletsitoosia + sorboosia + butyraattia - +

Melanoidipigmenttejå + 20 A82846.1 eroaa A82846:sta myos tuottamansa antibioot-tiaktiivisuuden maarassa. Muita erittain nåkyviå eroja kan-tojen vålillå ovat, ettå, toisin kuin A82846, A82846.1 ei tuota ilmarihmastoa eikå selvåsti erottuvaa, liukoista pig-5 menttiå.

Viljelmå A82846.2 on viljelmån A82846 luonnollinen variantti. Siten A82846.2:ta identifioivat ominaisuudet ovat oleellisesti samat kuin A82846:n vastaavat ominaisuudet. Tårkein ero A82846:n ja A82846.2:n vålilla on se, 10 etta A82846.2-viljelmå tuottaa huomattavista suurempia måå- riå antibioottia A82846 kuin A82846-viljelmå kasvatettaes-sa ravistuspulloissa.

Kuten muillakin organismeilla tapahtuu, tåmån kek-sinnon mukaisten A82846:tta tuottavien viljelmien, Nocardia 15 orientalis -kantojen NRRL 18098, NRRL 18099 ja NRRL 18100 ominaisuudet muuttuvat. Siten nåiden kantojen jålkipolvia, esim. rekombinantteja, mutantteja ja variantteja, voidaan saada kåyttåmållå alalla tunnettuja menetelmiå. Esimerkiksi variantteja voidaan saada luonnollisen valinnan kautta ja 20 mutantteja voidaan saada kåsittelemållå erilaisilla tunne-tuilla fysikaalisilla ja kemiallisilla mutageeneillå, kuten ultraviolettivalolla, rontgensåteillå, gammasåteillå ja kemikaaleilla kuten N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosogu-anidiinilla.

25 Rekombinanttikantoja voidaan kehittåå transformoi- malla Nocardia orientalis -kantoja kåyttåen alalla hyvin tunnettuja menetelmiå. Koska Nocardia ja Streptomyces ovat keskenåån samankaltaisia, Streptomyces'Ile kehitettyjå transformointimenetelmiå ja yhdistelmavektoreita voidaan 30 kåyttåå myos transformoimaan Nocardia-kantoja. Kåyttåmållå yhdistelmå-DNA-menetelmiå Nocardia orientalis -kantoja voidaan transformoida ekspressoimaan lukuisia geeni-tuotteita nåiden kantojen tuottamien antibioottien lisåksi. Esimerkiksi kannat voidaan transformoida yhdistelmåvekto-35 rilla, joka tuottaa resistenssin antibiootille, jolle kannat normaalisti ovat herkkiå. Nåin saadut transformantit 11 21 90993 tuottavat A82846-antibioottien lisaksi myos resistenssin antavaa entsyymiå, jolloin transformoidut solut voidaan valikoida villityyppisistå soluista. Edelleen samanlaisia menetelmia kåyttaen nåma kannat voidaan modifioida siten, 5 ettå niisså esiintyy monia kopioita endogeenisistå anti-biootti-biosynteesigeeneista, jolloin saadaan suuremmat antibioottisaannot. Nocardia orientalis -kantojen NRRL 18098, NRRL 18099 ja NRRL 18100 jålkipolvi, tåma tarkoit-taa luonnolliset ja aiheutetut variantit, mutantit ja 10 rekombinantit, jossa on sailynyt A82846:n tuottamisominai-suus, ovat osa tå tå keksintoa.

Viljelyvåliaine, jota kåytetaån Nocardia orientalis -viljelmien kasvattamiseen, voi olla mika tahansa lukuisis-ta våliaineista. Tuotannon taloudellisuuden, optimisaannon 15 sekå tuotteen eristyksen helppouden takia tietyt viljely- våliaineet ovat kuitenkin edullisia. Siten esimerkiksi edullisia hiilihydraattilåhteitå laajassa mittakaavassa suoritetussa fermentoinnnissa ovat glukoosi ja perunadekst-riini, vaikka riboosia, ksyloosia, fruktoosia, galaktoosia, 20 mannoosia, mannitolia, liukoista tårkkelystå ja vastaavia aineita voidaan mybs kayttåå.

Edullisia typpilahteitå ovat entsyymillå hydroly-soitu kaseiini ja lihapeptonit, vaikka hiivauutetta, happo-hydrolysoitua kaseiinia, haranlihauutetta, kalajauhoa, mak-25 sajauhoa ja vastaavia aineita voidaan myos kåyttåå.

Epaorgaanisia ravinnesuoloja, joita viljelyvåliai-neet voivat sisSltaa, ovat tavanomaiset liukoiset suolat, joista voidaan saada sinkki-, natrium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti- ja nitraatti-30 ioneja seka vastaavia ioneja.

Valttamåttdmia hivenaineita, jotka ovat tarpeelli-sia organismin kasvulle ja kehittymiselle, tulisi myos si-sållyttaa viljelyvåliaineeseen. Tallaisia hivenaineita esiintyy yleisesti epåpuhtauksina våliaineen muissa substituen-35 teissa riittåviS maaria organismin kasvutarpeiden tyydyttå- miseksi. Jos vaahtoaminen on ongelma, laajassa mittakaavassa 22 suoritetussa fermentoinnissa våliaineeseen voidaan lisata pienia måaria (tåmå tarkoittaa 0,2 ml/1) vaahtoamista eståvåå ainetta, kuten polypropyleeniglykolia.

Huomattavien maårien A82846-antibiootteja tuotta-5 miseksi submerssi aerobinen fermentointi tankeissa on edul- lista. Pienia maaria antibiootteja voidaan saada kåyttåmål-1M ravistuspulloviljelmåå. Koska isojen tankkien siirros-tukseen organismin itiomuodolla liittyy yleisesti aikavii-ve antibiootin tuotannossa, on edullista kayttåa vegetatii-10 vista ymppia. Vegetatiivinen ymppi valmistetaan siirros- tamalla pieni måårå viljelyvåliainetta organismin itiomuodolla tai rihmastofragmenteilla, jolloin saadaan tuore, ak-tiivisesti kasvava organismin viljelma. Sitten vegetatiivinen ymppi siirretåcln suurempaan tankkiin. Vegetatiivi-sen ympin våliaine voi olla sama kuin suuremmissa fermen-toinneissa kåytetty valiaine, mutta myos muut valiaineet ovat sopivia.

A82846:tta tuottavat organismit tuottavat A82846-antibiootteja kasvatettaessa niita låmpotiloissa noin 23 -20 37°C:ssa. Optimilampdtila A82846:n tuotannolle nåyttSS ole- van noin 30-31°C.

Kuten submersseisså aerobisissa viljelyprosesseissa on tapana, steriilia ilmaa puhalletaan astiaan pohjasta samalla, kun valiainetta sekoitetaan tavanomaisilla tur-25 biinisekoittimilla. Tåhån mennesså kaytetyissa olosuhteis- sa fermentoinnin maksimihapenotto ei ole ylittånyt 0,2 mM/l/minuutti. Yleensa ilmastus- ja ravistelunopeuk-sien tulisi olla riittaviå yllåpitamaån liuonneen hapen måårå 50 %:n kyllåstysasteessa tai tata suuremmassa kyl-30 låstysasteessa.

Αδ2846-antibioottien tuottamista voidaan seurata fermentoinnin aikana testaamalla kaymislieminaytteet anti-bioottiaktiivisuuden suhteen kayttamallå organismeja, joi-den tiedetåån olevan herkkia antibiootille. Eras kayttokel-35 poinen mååritysorganismi on Bacillus subtilis ATCC 6633.

Biologinen mååritys suoritetaan helposti kayttaen agar-kuop-palevytestia.

li 90993 23

Kun A82846-antibiootit on tuotettu submersseisså, aerobisissa fermentointiolosuhteissa, ne voidaan ottaa talteen fermentointivaliaineesta kåyttåen alalla kåytetty- ja menetelmia. A82846:tta tuottavien organismien fermentoin- 5 nin aikana tuotettua antibioottiaktiivisuutta esiintyy seka rihmastossa ettS kåymisliemessa. Siksi A82846 :n maksimaali- nen talteenotto suoritetaan såHtåmallå aluksi pH 10,5:een, jolloin A82846 vapautuu rihamstosta, ja suodattamalla våli- aine kåymisliemen erottamiseksi rihmastomassasta.

10 A 82846 voidaan ottaa talteen suodatetusta kåymis- liemestå monia menetelmiå kåyttåen. Edullisessa menetel- måsså suodatetun kåymisliemen pH såådetåån noin 7:åån ja kåymisliemi adsorboidaan kationinvaihtohartsiin, esim.

Dowex XF5-43278 -, Dowex-50- tai Amberlite IR-120 -hartsiin.

15 Aktiivinen aine eluoidaan hartsista sopivalla liuottimella, kuten esimerkiksi laimealla NH,ΟΗ-liuoksella. Sitten aktii- 4 viset fraktiot konsentroidaan vakuumissa, adsorboidaan mak-roretikulaariseen hartsiin, esimerkiksi Diaion HP-20- ja Amberlite XAD-4 -hartsiin, ja eluoidaan sopivalla liuotti-20 mella, kuten vesi:isopropanoli-seoksella (95:5), joka si- såltåå 1 % etikkahappoa, jolloin saadaan A82846. Aktiivinen materiaali voidaan eluoida myos vesi:asetonitriili- tai vesi:metanoli-seoksilla, jotka sisåltavat pienet mSarSt happoa.

25 A82846 voidaan erottaa yksittaisiksi komponenteiksi A82846A, A82846B ja A82846C samanlaisia menetelmia kayttåen. Edullinen erotusmenetelma sisaltaa kåånteisfaasi-silikagee-li (C^g tai Cg) -kromatografian.

Vaihtoehtoisesti viljelman kiinteåt aineet, mukaan-30 lukien våliaineen komponentit ja rihmasto voidaan kåyttåå uuttamatta tai erottelematta, mutta edullisesti veden pois-tamisen jalkeen, A82846:n låhteenå. Esimerkiksi A82846:n tuottamisen jålkeen koko kaymisliemi voidaan kuivata kylmå-kuivaamalla, rumpukuivaamalla tai atseotrooppisella tis-35 lauksella ja kuivaamalla. Kuivattu kaymisliemi sekoitetaan sitten suoraan sySttosekoitteeseen (feed premix).

24 A82846-antibiooteilla on erinomainen in vitro- ja in vivo -vaikutus gram-positiivia patogeenisia bakteereja vastaan. Erityisen odottamaton nåiden antibioottien ominai-suus on niiden pitka puoliintumisaika seerumissa. Esimerkik-5 si rotille suoneen annettaessa vankomysiinin puoliintumisaika seerumissa oli 45 minuuttia, kun taas seka A82846A:n etta A82846B:n puoliintumisajat olivat 2,2 tuntia.

Pienimmat inhiboivat pitoisuudet (MIC:t), joilla A82846-antibiootit inhiboivat tiettyjå bakteereja, on an-10 nettu taulukoissa VII ja VIII. Taulukoiden VII ja VIII MIC~ arvot mååritettiin kayttaen normaalia agar-laimennusmååri-tysmenetelmaa.

li 25 90993

U

Λ νΟ _ι u S ® t s a 5 iγ1 3 -J5

“ « -PC

3 \ ΒιΛ m λ ifl m m ti S 3 -P tJ1O<MiSCMCNinin<M<Min S * Tj

S ^a» o-o" =r ="='=-==-=..... S3 I

S s s 8 1* = cn c

C Q) *H *H

CD i—i in <i) •Η ri ^ n rH Cmmiom »ΛιΛ H m y (M OCNCNCMCNlOu-ltMiNu·) Ti _5J ·* «β 00-^^^·~·-*-· ^«~ΙΙΙΙΙ Η H ij ·* cmoooooooooo η ί τί Η Ρ CO Μ -S 0 Η 0» < 5 3 « > +» -Ρ ι—I Λί * S Η Ο Ο 10 HH J2 ·Η -η Λ! Λ ο <ν Λ ω 2 -Η Γ— CN Μ -Η _ί

t ΐ Ό ^ « S ° . * Λ I I

3 § V. g s .! J 8 fc *3 ^νβ vog a^> (0 4J vO O U r- x [0 3 E-*C X > X OO ·η ·η fl X CM Λ1 X _ * IT ^ EStO’H 4J 4J <8 (0 ® ΜβίΜΜί-ρααααΜβ'ίΐυΜ p -p a>

H 33331liJCO N N *“· <0 O -P C IN

P D a; aj QJ TO Ό il Ξ *fr< 1ΓΓΪ c GO'H C -P (u <— 4j ι*^2ρ·ΗΡθί3:0ε«»«Μ5·;·ι C λ; 0 .HSsssaaouja.gs^ oM o jd X gi« <C (0 <0 II 4J ^ C 'S >1 Γ1 ί ϋί § 5 m'Sm w o. a, ti* P m m i-i 3 >-i tn χ in •H pjmWMMHM W eeojj« ·Η 2 Φ

Λ rj333S3S«e«MM-H-»*uee W M 'O

•P 3UUUUUU3333 OJ <U<U3

Jj WiOOUUOUUUUUCOBl« Μ P .3 3

SoooooouuuuaS’H«« a C nUUUUUUOOOOp-HpHjSr^C (DO Ή

(0 ‘}ri000000UUUU-H-r4Ui-40 i—II—I Q

1 ArH>—IrHi—l^i—I O O O OJ3J--H 4J E r-ji—j-P

* js jz js js j: ααα&ο o α “Έ 53°4 „ o.&ftaaai>4)ejuEEJ3Æ3 -h-h °o <flrc<e<o<d<o>-<PutiaiejPe)4) Ή Ή id CN rH rH 4·* oo ioooooiooooooocooocoSXWXC1- <—· —J w

< Μ W B

III

«ρ/ s 26 •woo c —

Woo W1 O O IN

-¾ - - I - I

s, Μ N ΙΟ <M H in

g I I 1H I I (N

o momooininiw A S ♦*.

5 OrHOOiWOOO |> VII

3 in m

β N Μ O

o o ·- S’ - ο ο o iw w «— 3 i iw m m i in -P w m i Μ n ιλ in in n

•W U oo MinHHNNNH

> gg''*'"*'--'-·' *· S? oooooooo c **

•W

-P

a) m in in o cm cm in *✓* ·· o n ·· o in - 0 . rH v, Ο Ο - V- o

Η -P <5 I CM I I fW Ο I

h 0 S in i in in i i in η M qo n in n h m m cn

> -W IN HCNtWOlNOCNH

(¾ GQ ·· ►· n k k ·· *·

O > ^ OOOOOiWOO

Μ V»

M C

0 -H

rH C

3 H . .

re -W 3 13 E-ι in {i c h 3d

>, +Jf3 1-1 OOCNOOrW^CN

£ flj .* G »0 IN (N iH IN IN

2 M C-nE

·* οι g q g G E-ι ·η -P Σί 10 —

> in Q

•H

as Ό O

•π ή nJ yrt in

E in -η I -H

G inwueSnin .. 3DCObL«J-Htn

ca 0JO4)6u1>3C

ίο O -w O’ 3 ·Η O <d tt 3 q ο ο · ή g -p co <o5)l>.coJ«j«d3

(N Qj Qj ΰΐ 10 Id S

co in in

33intnintninin 00333333 * OOOOOOOO

c OOOOOOOO

„ .oooooooo fC Έ oooooooo

m S -HrHOOOOOO

ς. -W >>··ΡΡ·Ρ·Ρ·ΡΡ ao Gjzxsaaaaaa

Wj 2,aa<ua»iu<i)ii><i)

on R’rdrOMUiMMUiO

5 g+J+J-PP-P-PPP

^ ιηιηιηΐΛΐηιηιηιη 90993 27 A82846-yhdisteiden antimikrobiaalisen vaikutuksen eras tårkeå piirre on niiden vaikutus anaerobisia baktee-reja vastaan. Tåtå vaikutusta kuvataan taulukossa IX, jossa on esitetty yhteenveto A82846A:n ja A82846B:n vaikutuksesta 5 eri anaerobisia bakteereja vastaan normaalilla agar-laimen- nusmaåritysmenetelmalla mSSritettyncl. Loppupisteet luet-tiin 24 tunnin inkuboinnin jalkeen.

28 •Η •5 »3· i-· cm vo «S' •H »i I 111-11-1 \0

(0 I li I— m m I I

>, m CM CM CM pi 11 CM CM in CM CM

S o ov o" os > m m

CM CM

cq i m i m vo 1 —i O V.

>3 0 O I 00 O

co i i >3 tn i i _ i—N cm Ό voi mcMvomm eo <0 i-3 oo oinminonncMnocMcM cm ’Π g H PH ^ *H S »H K s. **

Q) ^H OOOOO O O O O O A

tj Ofi VI Vil M n m ε ^

Q> w CM

4J < pi

1 CJ Ό H -H

i n >3 I O CM

X Σ oo mm mm iimm

JJ CM CM CM CM CM mOvOCMCM

oo n — m*-iCMmeMOO --- oo

<a < h-Oh-OOI — -i«-00 CM

H O vn O VII VII pi O O O O vil Vil Pi

CO A

-H

x 2 si ^ 2) r* Η H fO -«J r·* CO 00 CO CTN Γ0 o s 81,¾ - 2 10 83% « s 52 3 δ 1 S -2 £

1-1 3- fiSri U -O 4J

3+) tiJO^ ·η O E ·· <ri 3 4J to H ti 4-> ta ta >. 3 u « to rt ^ c G-ι eau to 4-1 ιυ d

-ci 4JU V O Ί ed C C C C

<0 ri ae g -i li pi pi to ή u to ta

> l-HCSOe-pt-Hpl « ,£ -H

jJ o-ptocejSUÆtitotata -i

1 1^-plM-H>4iUOe04J333E4-)-H

i ja^iH4joo>-Htacou3(D« " "JU-iMftUtOUtieMtJU-PlMto CQ Tj-H4J4J4l«ltitoO<eOOti.Hti ?)t3aJta<e(oaJ>oSuu4j >m re i) Z3 o o -ι-i -Η ii ni TlEEEEtatataoatatJiJU-Hta 9{·ι±3 333333333β.α«+)», -!1ϋΐ3·Η·Η·ρΐ·Ηυυυυυ««ίΛ 3 -o C o Tj /¾ ,.ι Ό -O-Onououu ti ti ·ι ήι -i ·· Ή S K'J-1 -1-H1I000004J*JC φ ο .a· η Η * tiis uv*wi4Juoyouceceo c ti 5 S 5l®}ya4J4J4Juooooooo-H i « ® 5 rrtTj £j 9 ta 03 M t04j4->4-)4->4-»4-l4J Q. g 4-1 ·" 2 -5 o ooÆ&ftaaa&ao S u 00 -P tj S Mgi r1rl34IHIl>4)4>4)4JU Si to cm en «. .u ‘sVi^r u cjowatSuftiOudiPucuCLt o * 00 It) < >

II

90993 29 Ή

S

Η 00

CO CM

Ϊ>1 ^ ^ rH

C sO A Ό \0

CO

Ό /—s <r 00 00 00 00 00 00

hJ 00CM<M<MCM<MCM

g CM ^ ^* ** ** ^* *·* ^ 00 A A Λ ec < u

E

o

HH

£ <

vO

>» eo oo co oo oo oo

00 CN CN CN CM CS CN

C'J Η H fH Η r*

00 Λ A

<

Praia Η N rt rt Η I" $S S3 „

pfrrvn £ C

O D9 u a _

U U E

•Η ·Η S

E C g £ ora so in oc n (o .e _ -1-) 4-1 o cn s ο a 3 -H o c ·η ra ·η o 3 Η Ή -H 4-) Ό -o w dincnoEu Τι $4J(ooch>ira T, 43 ra ^ )-> tal c 2, .¾ .fi ra 3 ο e _

•n 73 4J ε > u € E

Λ 3 3 bi μ to «η es ·Η ·Η rj 4Juurara)4C4 0) τ3 ·ό ό ό ra ra _ [fl -Η --4 -Η ·Η 4-1 4-1 Ο ·Η Ο Ο Ο Ο ο Ο >2 η u i-ι 14 )-ι «) (ο ν ό ra ra ra ra .ο λ *3 Ρ 4.» 4J 4-1 4-1 ο ο Ρ 01 υ υ ο υ μ 03 'J nj <0 <0 <β Λ 3 3 3 e η η α β lo h (0 1¾ Ε-ι 30 A82846-antibiooteilla on myos ollut in vivo -anti-mikrobiaalinen vaikutus kokeellisesti aiheutettuja labora-torioelåinten tulehduksia vastaan. Kun koeorganismilla kokeellisesti infektoiduille hiirille annettiin kaksi annos- 5 ta koeyhdistettå, havaittu vaikutus mitattiin EDcn-arvona du /mg/kg:ina annettu tehoava annos, joka suojasi 50 % koe-elåimistå: katso Warren Wick et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 233-235/. Havaitut ED^Q-arvot erimerkkiyhdisteille on annettu taulukossa X.

10 Taulukko X

A82846-antibioottien in vivo -vaikutus ED^Q-arvoa . Staphylococcus Streptococcus Streptococcus

Yhdiste aureus pyogenes pneumoniae 15 ------ A82846A 0.19 0,19 0,17 A82846B 0f19 0,20 0f18 A82846C 2,18 2,71 5,87

Vankanysiini 1/>3 0,72 1,52 20 amg/kg x 2; annekset annettiin hiirille ihen alle 1 ja 4 tuntia infektion jalkeen

Eras tarkeS A82846-antibioottien antibakteriaalisen vaikutuksen piirre on se, ettå niita voidaan kayttåå hoidet-taessa pyelonefriittia (munuaisaltaan ja munuaisen tuleh- 25 dusta). Esimerkiksi A828464A ja A82846B olivat tehokkaampia kuin vankomysiini suojaamaan rottien kokeellisessa laske-vassa pyelonefriitti-infektiossa. TåmS koe suoritettiin kåyt-tåen US-patenttijulkaisussa 4 208 403 kuvatun menetelman kal-taista menetelmåå. Havaittujen tulosten yhteenveto on esi- 30 tetty taulukossa XI.

90993 31

Taulukko XI

Αδ2846Α:η ja B:n vaikutus rotan laskeva pyelonef-riitti -kokeessa 5___

Prosenttia Prosenttia rottia,

Annostus rottia, jot- joiden tiitterit las-

Yhdiste (mgAg x 12)a ka paranivat kivat 4 logaritmia 10 A82846A 10 88 100 5 75 88 2 63 100 A82846B 10 100 100 5 100 100 2 50 88 15 Vtakonysiini 10 63 100 5 38 88 2 38 75 aAnnokset kahdesti paivassa ihon alle 6 paivan ajan

A82846-antibiootteja voidaan kåyttåå myos sydåmen 20 sisåkalvon tulehduksen hoitoon. Esimerkiksi A82846A ja B

olivat yhta tehokkaita kuin vankomysiini hoidettaessa ko-keellisesti katetrilla aiheutettua sydamen sisåkalvon tu-lehdusta rotissa. Tåsså kokeessa rotat kåsiteltiin tyonta-mållå muovinen katetri oikeanpuolimaiseen kaulavaltimoon, 25 syottåmållå se alas sydåmen oikeaan kammioon ja kiinnittå- mållå se tukevasti paikoilleen. Elåinten annettiin levåtå kaksi paivåå, jonka jålkeen koeorganismi, Streptococcus faecalis X-66, annettiin suoneen. Organismitiitteri oli g noin 5 x 10 ml; annosteltiin 0,5 ml.

30 Yhdisteet annettiin ihon alle 15 minuuttia ennen infektiota ja 12 tunnin vålein 14 paivan ajan, kaikkiaan 28 kåsittelyå. Elåimiå pidettiin elossa kaksi paivåå hoi-don jålkeen; sitten sydåmet poistettiin, homogenisoitiin, laimennettiin ja levitettiin tryptikaasi-soija-agarille.

35 Levyjå inkuboitiin 48 tuntia ennen laskemista.

32 Nåiden kokeiden tulosten yhteenveto on esitetty taulukossa XII.

Taulukko XXI

A82846A:n ja B:n vaikutus rotan sydåmen sisakalvon 5 tulehduskokeessaa 16 paivSå

Annostois*3 % parantunei- % eiaimia, joilla oli Vhdiste (mg/kg x 28) ta eiaimUi 4 log:n laskuC

10 A82846A 20 100 100 A82846B 20 100 100

Vankcnysiini 20 100 10Q

aKatetrilla aiheutettu sy damen sisakalvon tnlehdus Streptococcus 15 faecal is X-66: tta kayttaen ^Ihonalaiset annokset 12 tunnin valein 14 paivan ajan

Q

% tapettuja eiaimia, joilla oli 4 logaritmin lasku A82846-antibioottien farmaseuttiset formulaatiot ovat myos osa tatå keksintoa. Siten antibiootti, edulli-20 sesti farmaseuttisesti hyvåksyttåvånå suolana, voidaan for- muloida suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuoliseen annosteluun kåytettåvåksi bakteeritulehdusten terapeutti-seen tai erinaltaehkåisevaan hoitoon. Esimerkiksi yhdiste voidaan sekoittaa tavanomaisiin farmaseuttisiin kantajiin ja 25 apuaineisiin ja kåyttaa tabletteina, kapseleina, eliksii- reinS, suspensioina, siirappeina, suuvoiteina (wafers) ja vastaavina.

A82846-antibiootin sisåltSvMt koostumukset sisSlta-våt noin 0,1 - 90 paino-% aktiivista yhdistetta ja yleisem-30 min noin 10-30 %. Koostumukset voivat sisåltåå tavallisia kantaja-aineita ja apuaineita, kuten maissitårkkelystå tai gelatiinia, laktoosia, sakkaroosia, mikrokiteistå sellu-loosaa, kaoliinia, mannitolia, dikalsiumfosfaattia, natrium-kloridia ja alginiinihappoa. Tassa kuvatuissa 35 formulaatioissa tavallisesti kåytettyjS dispergoivia aineita 90993 33 (disintegrators) ovat kroskarmelloosinatrium, mikrokitei-nen selluloosa, maissitarkkelys, natriumtårkkelysglykolaat-ti ja alginiinihappo.

Tabletoinnissa sidosapuaineita, joita voidaan ottaa 5 mukaan, ovat akaasia, metyyliselluloosa, natriumkarboksi- metyyliselluloosa, polyvinyylipyrrolidoni (Povidone), hyd-roksipropyylimetyyliselluloosa, sakkaroosi, tarkkelys ja etyyliselluloosa.

Voitelevia aineita, joita voidaan kayttåå, ovat mag-10 nesiumstearaatti tai muut metallistearaatit, steariinihap- po, silikonineste, talkki, vahat, oljyt ja kolloidinen piimaa.

Makuaineita, kuten piparminttu, gaulteriaoljy (oil of wintergreen), kirsikanmakuaine tai vastaavat, 15 voidaan myos kayttåå.

Våriaine saatetaan haluta lisåtå tekemaån annos-tusmuoto ulkonåoltåan esteettisemmMksi tai auttamaan tuot-teen tunnistamista.

Suonensisåiseen (IV) kayttoon antibiootin veteen 20 liukeneva muoto voidaan liuottaa johonkin tavallisesti kåytettyyn suonensisåiseen annosteluun tarkoitettuun nes-teeseen ja antaa infuusiona. Liuoksia, kuten esimerkiksi fysiologinen suolaliuos, Ringerin liuos tai 5 % dekstroo-siliuos, voidaan kayttåå.

25 Lihakseen annettavissa valmisteissa sopiva yhdis- teen liukoinen suolamuoto, esimerkiksi vetykloridisuola, voidaan liuottaa ja annostella farmaseuttisessa liuotti-messa, kuten steriilisså vedesså (Water-for-Injection), fysiologisessa suolaliuoksessa tai 5 % glukoosiliuokses-30 sa. Sopiva yhdisteen liukenematon muoto voidaan valmistaa ja annostella suspensiona vesipitoisessa pohjassa tai far-maseuttisesti hyvåksyttåvåsså oljypohjassa, esim. pitkå-ketjuisen rasvahapon esterissa kuten etyylioleaatissa.

Suun kautta annettavaan kåyttQon antibiootin sopi-35 van suolamuodon, esimerkiksi vetykloridisuolan, steriili formulaatio, formuloituna liuottimessa kuten tislatussa tai ionivapaassa vedesså, on erityisen kayttokelpoinen.

34

Vaihtoehtoisesti antibiootin yksikkoannostusmuoto voi olla antibioottiliuos, edullisesti sen suolamuodossa, sopivassa liuottimessa steriileisså, ilmatiiviisti sulje-tuissa ampulloissa. Antibiootin pitoisuus yksikkoannostuk-5 sessa saattaa vaihdella esim. noin 1-50 prosenttiin an tibiootin erityisestå muodosta ja sen liukoisuudesta seka låakårin toivomasta annoksesta riippuen.

Lisåpiirteissaan tama keksinto antaa kåyttoon mene-telmån hoitaa tartuntatauteja, erityisesti gram-positiivis-10 ten mikro-organismien aiheuttamia tartuntatauteja, elaimissa.

Elåin voi olla joko altis tai infektoitunut mikro-organismilla. Menetelmåsså elåimelle annetaan A82846-anti-bioottia maåra, joka tehoaa tahan tarkoitukseen. Yleisesti A82846-antibiootin tehoava maåra on noin 0,5 - 100 mg/kg:n 15 suuruinen annos. Edullinen annos on noin 1-60 mg/kg aktii- vista yhdistetta. Tyypillinen påivittainen annos aikuisel-le ihmiselle on noin 50 mg:sta 1 g:aan.

Kaytettaessa tata menetelmaa antibiootti voidaan antaa yhtenå påivittåisenå annoksena tai monina annoksina 20 påivåssa. Hoito-ohjeet saattavat vaatia annostelua pitkien aikajaksojen aikana, esim. useiden påivien tai yhdestå kuu-teen viikon ajan. Maåra annettua annosta kohti tai annettu kokonaismåårå riippuu sellaisista tekijoistå kuin tulehduk-sen luonteesta ja vakavuudesta. potilaan iåstå ja yleises-25 tå terveydentilasta, potilaan antibiootinsiedosta ja tuleh- duksen aiheuttavasta mikro-organismista tai mikro-organis-meista.

Tarkoituksenmukainen menetelmå kåyttåå hoitomenetel-måå on annostella antibiootti IV-infuusion kautta. Tåsså 30 menetelmåsså steriili antibiootin sopivan liukoisen suolan formulaatio yhdistetåån fysiologiseen nesteeseen, kuten 5 % destraaniliuokseen, ja saatu liuos annetaan hitaasti IV-infuusiona. Vaihtoehtoisesti IV-infuusion piggy-back -menetelmåå voidaan myos kåyttåå.

Ii 90993 35

Muissa suoritusmuodoissa tassa kuvataan 1) mene-telmia lisatå ravinnonkåyton tehokkiiutta elåimisså, kuten sii-pikarjassa, sioissa, larapaissa ja nautakarjassa; 2) menetelmia ediståa lihantuotantoa vårten kasvatettavien elåinten, kuten 5 siipikarjan, sikojen, lampaiden ja nautakarjan, kasvua; seka 3) menetelmia lisatå maidoneristystå maitoa tuottavilla ma-rehtijdillå. Ravinnon hyvåksikåytSntehokkuuden lisååmiseksi ja kasvun ediståmiseksi, A82846-antibiootti annetaan suun kautta sopivassa ravinnossa måårånå noin 2 - 200 grammaa 10 kokonaisravintotonnia kohti. Lihakarjalle esimerkiksi annos 12 - 3000 mg/påå/påivå on sopiva. Maidonerityksen lisååmiseksi maitoa tuottavilla mårehtijoillå ehdotetaan suun kautta tapahtuvaa, påivittåistå annostelua måårinå noin 0,04 -16 mg/kg ruumiinpainoa (tai noin 25 - 5000 mg/elåin/påivå).

15 Nåisså yhteyksisså kuvattuja yhdisteitå myytåisiin normaalisti elåinten ravintoon sekoitettavassa muodossa; tållaiset sekoitteet sisåltåvåt yhden tai useamman agrono-misesti hyvåksyttåvån kantajan.

Tåmån keksinnon toiminnan valaisemiseksi tåydellisem-20 min annetaan seuraavat esimerkit:

Esimerkki 1 A82846:n HPLC-mååritysmenetelmå

Seuraavia analyyttisiå HPLC-systeemejå voidaan kåyt- tåå A82846-komponenteille: 25 1. Kationinvaihtohartsipylvås *

Pylvåån kantaja-aine: Zorbax SCX (4,6 x 150 mm)

Systeemi: Gradienttieluutio A:B:stå (4:1) A:B:hen (1:9) 5 minuutissa, eluointia jatketaan 15 minuutin ajan.

A = MeOH:0,1 mol/1 NaH2P04 (1:9) 30 B = MeOH:0,9 mol/1 NaH2P04 (1:9)

Virtausnopeus: 1,0 ml/min Toteaminen: UV aallonpituudella 225 nm Retentioajat: ovat pitoisuudesta riippuvaisia, mutta ovat noin: 36 A82846C = 6.6 min t A82846B = 8^9 min A82846A = 9,5 min 2. KåcLnteisfaasipylvas * 5 Pylvåån kantaja-aine: Zorbax ODS (4,6 x 150 mm)

Systeemi: Gradienttieluutio 1 % (NH^)i^PO^rCH^CN (95:5):sta (1:1):een 20 minuutissa Virtausnopeus: 1,0 ml/min Toteaminen: UV aallonpituudella 225 nm 10 Retentioajat: A82846A =7,3 min A82846C = 7,6 min A82846B = 8,0 min

A

15 Zorbax-pylvååt ovat E. I. duPont de Nemours & Co,

Inc. -yhtidn tuotteita, Wilmington, Delaware 19898 Esimerkki 2

Antibiootti A82846:n valmistus kåyttåen viljelmaå A82846 20 A. Viljelman A82846 ravistuspullofermentointi

Viljelmåå Nocardia orientalis NRRL 18098, joko kyl-makuivattuna sakkana tai nestemaisesså typesså såilytetty-nå suspensiona, kåytetåån seuraavan koostumuksen omaavan ymppivåliaineen siirrostamiseen: 25 Ymppivåliaine

Aineosa Maårå (%)

Glukoosi 1,0

Liukoinen tårkkelys 2,0

Hiivauute 0,5 k 30 Kaseiinin entsymaattinen hydrolysaatti 0,5

CaCO^ 0,1

Ionivapaa vesi 1 litra Såadå våliaineen pH noin 7,5:ksi NaOH:lla ennen ste- 35 rilointia.

*

NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, NY

37 90993

Vinopinnat tai levyt valmistetaan lisaamalla 2,5 % agaria ymppivåliaineeseen. Siirrostettua vinopintaa inku- boidaan 30°C:ssa noin 10-14 påivåå. Kypså vinopintaviljel- må raaputetaan steriilillå vålineellå itioiden irroitta- 5 miseksi ja rihmastomaton poistamiseksi ja maskeroimiseksi.

Noin yksi neljasosa nåin saaduista irroitetuista itidistå ja viljelmåkasvusta kaytetåån siirrostamaan 50 ml:aa ensim- måisen vaiheen ymppivåliainetta.

Siirrostettua ensimmåisen vaiheen valiainetta inku- 10 boidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa 30°C:ssa noin 24-48 tunnin ajan ravistelijassa, joka pyorii 5,08 cm:n ympyraå kierrosnopeudella 250 rpm.

Tåta inkuboitua ensimmåisen vaiheen valiainetta (0,5 ml) kåytetaan siirrostamaan 50 ml:aa tuotantovaliai- 15 netta, jonka koostumus on seuraava:

Aineosa Maara (%)

Glukoosi 2,5

Soijapapujauhe 1,5

Perunadekstriini 3,0 20 CaC03 0,25

Sokeriruokomelassi 0,3 *

Happohydrolysoitu kaseiini 0,5

Ionivapaa vesi q.s. 1 litra (Ennen sterilointia pH såådetty 7,5:ksi NaOHrlla) * 25 Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

Siirrostettua tuotantovaliainetta inkuboidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa 30°C:ssa 4-5 paivaa ravisteli-jassa, joka py5rii 5,08 cm:n ympyraå kierrosnopeudella 250 rpm.

30 B. Viljelmån A82846 tankkifermentointi

Jotta saataisiin suurempi tilavuus ymppiå, 10 ml inkuboitua ensimmåisen vaiheen våliainetta, joka oli val-mistettu kuten kohdassa A on kuvattu, kåytetåån siirrostamaan 400 ml toisen vaiheen kasvuvåliainetta, jonka koostu-35 mus on sama kuin ensimmåisen vaiheen våliaineen koostumus.

38 Tåtå toisen vaiheen vegetatiivista våliainetta inkuboidaan 2 l:n laajasuisessa Erlenmeyer-pullossa noin 48 tunnin ajan 30°C:ssa ravistelijassa, joka pyorii 5,08 cm:n ympyråå kier-rosnopeudella 250 rpm.

5 Nåin valmistettua inkuboitua toisen vaiheen vegeta tiivista våliainetta (1000 ml) kåytetåån siirrostamaan 100 litraa steriilia tuotantovåliainetta, joka on valmistettu kuten kohdassa A on kuvattu paitsi, etta P-2000-vaahtoami-sen estoainetta (0,3 g/1) lisåtåån. Siirrostetun tuotanto-10 våliaineen annetaan kayda 165 l:n sekoitetussa fermentointi- tankissa 90 - 100 tunnin ajan 30°C:een låmpbtilassa. Sekoi-tetun astian (80 rpm) ilmavirtaus såådetåån siten, etta liuenneen hapen taso pysyy yli 50 %:n ilmakyllåstystasolla.

C. Viljelman Ά82846 vaihtoehtoinen tankkifermentointi 15 Kohdan B menetelmåå seurataan paitsi, etta kåytetåån sopivaa måaråa vegetatiivista valiainetta siirrostamaan noin 3402 litraa tuotantovåliainetta 4536 l:n fermentoin-titankissa.

Esimerkki 3 20 Antibiootti A82846:n valmistus kåyttåen viljelmåå A82846.1

Viljelmåå Nocardia orientalis NRRL 18099, joko kyl-måkuivattuna sakkana tai nestemåisesså typesså såilytettynå suspensiona, viljellåån kåyttåen esimerkisså 2 kuvattua 25 menetelmåå paitsi, ettå tuotantovåliaineen koostumus on seuraava:

Aineosa Måårå (%)

Glukoosi 1,0

Perunadekstriini 2,0 * 30 Peptoni 1,0

CaC03 0,2

Sokeriruokomelassi 2,0

Ionivapaa vesi q.s. 1 litra pH:ta ei såådetå * 35 Bacto-peptone (Difco Laboratories) li 90993 39

Esimerkki 4

Antibiootti A82846:n valmistus kåyttåen viljelmåå A82846.2

Viljelmåå Nocardia orientalis NRRL 18100, joko kyl-5 måkuivattuna sakkana tai nestemåisesså typesså såilytetty- nå suspensiona, viljellåån kåyttåen esimerkisså 2 kuvattua menetelmåå paitsi, ettå kåytetty happohydrolysoitu kaseii-ni on Amicase (Sheffield Chemical Co.).

Esimerkki 5 10 Raaka-A82846:n valmistus 4536 l:n fermenttorista saatu kåymisliemi (4200 1), joka oli valmistettu kuten esimerkisså 2, kohta C, on ku-vattu, såådettiin pH:hon 10,5 5 mol/1 NaOH:lla ja 3 %

Celite 545:ttå (suodatuksen apuaine) lisåttiin. Seos suo-15 datettiin suodatinpuristimen låpi ja puristin pestiin ve- dellå. Yhdistetty suodos ja pesuvesi (4200 1) såådetiin pH 7:åån 5 N HCl:lla (tai 5 N H2SO^:llå) ja laitettiin Dowex-XFS-43278 (NH^+) -hartsipylvååseen (200 1 suodos-ta/10 1 hartsia). Pylvåstå eluoitiin virtausnopeudella 20 750 ml/min. Fraktiot mååritettiin joko biologisella måå- ritysmenetelmållå kåyttåen Bacillus subtilis'ta tai HPLC:llå.

Pylvås pestiin 5 pylvåån tilavuudella vettå ja 100 l:n fraktiot keråttiin.

25 Aktiivinen aine eluoitiin hartsista 5 pylvåån tila vuudella 0,05 N NH^OH ja 25 l:n fraktiot keråttiin.

A82846:tta sisåltåvåt fraktiot yhdistettiin ja konsentroi-tiin vakuumissa noin 30 l:n tilavuuteen. Tåmå liuos laitettiin 10 l:n Diaion HP-20 -hartsipylvååseen. Pylvåstå pes-30 tiin 3 pylvåån tilavuudella vettå virtausnopeudella 300 ml/min. Pesuvesi heitettiin pois. Aktiivinen aine eluoitiin pylvååstå H20:iPrOH (95:5) -seoksella, joka sisålsi 1,0 % etikkahappoa, virtausnopeudella 100 ml/min, ja 4 l:n fraktiot keråttiin ja analysoitiin biologisella 35 mååritysmenetelmållå ja HPLC:llå. A82846:tta sisåltåvåt 40 fraktiot (nrot 6-14) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumis-sa ja kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 356 g raaka-A82846:tta.

Esimerkki 6 A82846A:n ja A82846B:n eristys 5 A. Rikastetun A82846A:n ja A82846B:n erottaminen A82846 (30 g), joka oli valmistettu kuten esimerkis-så 5 on kuvattu, liuotettiin veteen (500 ml) ja laitettiin paineen alia olevaan (pressurized) 30 l:n ruostumattomasta teråksestå valmistettuun pylvååseen, joka oli taytetty 10 1 % NH4H2P04:ssa tasapainotetulla silikageeli LP-1/C^g-gee- lilla. Pylvås kehitettiin kåyttåen gradienttia 1 % NH4H2P04:sta (60 1) vesi:asetonitriili (88:12) -seokseen, joka sisålsi 1 % NH4H2P04, (60 1) virtausnopeudella 250 -300 ml/min (maksimipaine 4137 kPa), ja 4 l:n fraktiot keråt-15 tiin ja eluutiota monitoroitiin kåyttåen UV-detektoria aal- lonpituudella 254 nm. Yksittåiset fraktiot analysoitiin ana-lyyttisellå HPLC:llå. Fraktiot, jotka sisalsivåt runsaasti A82846A:ta (nrot 6-9), ja fraktiot, jotka sisålsivåt runsaasti A82846B:tå (nrot 10-17), yhdistettiin kummatkin ja kon-20 sentroitiin vakuumissa.

B. A82846A:n puhdistus

Runsaasti A82846A:ta sisåltåvistå konsentraateista, jotka oli saatu kahdesta kohdaassa A kuvatulla tavalla suo-ritetusta ajosta, poistettiin suolat 1750 ml:n Diaion HP-20 25 SS -pylvååsså pesten vedellå, eluoiden H20:iPr0H (95:5) -seoksella, joka sisålsi 0,5 % etikkahappoa, ja måårittåen analyyttisellå HPLC:llå. A82846A:ta sisåltåvåt fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 7,4 g A82846A:lla rikastettua valmistetta.

30 A82846A-rikastettu valmiste (7,2 g) liuotettiin ve teen ja laitettiin preparatiiviseen, silikageeli LP-1/C^g-geeliå 1 % (NH4)H2P04:sså sisåltåvåån HPLC-pylvååseen. Pyl-vås kehitettiin kåyttåen gradienttia 1 % (NH4)H2P04:sta 1 % (NH4)h2P04:asetonitriili (9:1) -seokseen monitoroiden 35 eluutiota analyyttisellå HPLC:llå aallonpituudella 254 nm ja

II

90993 41 eluoiden virtausnopeudella 48 ml/min. Kun ensimmaiset 10 lit-raa oli eluoitu, 500 ml:n fraktiot kerattiin.

A82846A:ta sisåltåvåt fraktiot (nrot 4-10) ja A82846B:ta sisåltåvåt fraktiot (nrot 12-20) yhdistettiin kum-5 matkin ja konsentroitiin vakuumissa. Kolmesta ajosta saadut A82846A-konsentraatit yhdistettiin ja laitettiin 1750 ml:n Diaion HP-20 SS -pylvååseen suolojen poistamiseksi liuokses-ta. Pylvås pestiin vedellå ja A82846A eluoitiin H20:iPrOH (95:5) -seoksella, joka sisålsi 0,5 % etikkahappoa. Eluu-10 tiota monitoroitiin HPLCrllS. A82846A:ta sisåltåvåt fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmakuivattiin, jolloin saa-tiin 7,9 g puhdistettua A82846A:ta.

A82846A:n KBr-kiekossa ajettu IR-spektri on esitetty kuviossa 1; A82846A:n tioglyserolissa ajettu FAB-MS on esi-15 tetty kuviossa 4; Bruker AM500 -spektrometrilla (HDO-suppres-soitu) ja saatu A82846A-hydrokloridin (metyylisulfoksidi)-dg:ssa ajettu NMR-spektri on esitetty kuviossa 7.

C. A82846B:n puhdistus

Kolmesta preparatiivisesta HPLC-ajosta, jossa erotet-20 tiin A82846A ja A82846B, kohdassa B kuvatulla tavalla saadut, rikastetut A82846B-fraktiot yhdistettiin ja suolat poistet-tiin 1750 ml:n Diaion HP-20 SS-pylvåållå pesten vedellå ja eluoiden H20:iPr0H (95:5) -seoksella, joka sisålsi 0,5 % etikkahappoa. Eluutiota monitoroitiin HPLC:llå ja A82846B-?5 fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja kylmå- kuivattiin, jolloin saatiin 8,8 g puhdistettua A82846B:tå.

A82846B:n KBr-kiekossa ajettu IR-spektri on esitetty kuviossa 2; A82846B:n tioglyserolissa ajettu FAB-MS on esitetty kuviossa 5; ja Bruker AM500 -spektrometrillå 60°C:ssa 30 saatu A82846B-asetaatin (metyylisulfoksidi)-dg:ssa ajettu NMR-spektri on esitetty kuviossa 8.

D. Suolojen poisto

Suolojen poisto voidaan suorittaa myos kåyttåen Diaion HP-20 -hartsia ja eluoiden MeOH:H20 (4:1) -seoksella, 35 joka sisåltåå 0,1 % etikkahappoa.

42

Esimerkki 7 A82846C:n eristys A. 82846:n erottaminen

Neljåstå esimerkisså 2, kohta B, kuvatulla tavalla 5 suoritetusta 165 l:n fermentoinnista saatu kaymisliemi (461 1) såadettiin pH:hon 10,5 5 mol/1 NaOHrlla ja suoda- tettiin 3 % Hyflo Supercel -suodatuksen apuaineen kanssa. Suodoksen (430 1) pH såadettiin 7:ksi 5 mol/1 HCl:lla ja suodos laitettiin pylvååseen, joka sisålsi 10 1 10 Dowex-XFS-43278 (NH^+) -hartsia. Pylvås pestiin 50 1:11a vettå ja aktiivinen aine eluoitiin 0,05 N NH^OH:lla (50 1) keråten 4 l:n fraktioita. Eluutiota monitoroitiin biologi-sella mååritysmenetelmållå. Aktiiviset fraktiot (nrot 1-7) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa tilavuuteen noin 15 1700 ml ja kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 283,9 g raaka- A8 2846:tta.

B. A82846A:n, B:n ja C:n erottaminen

Kohdassa A kuvatulla tavalla saatu raaka-A82846 (2 g) liuotettiin veteen ja laitettiin 5 x 114 cm:rv ruostumat-20 tomasta teråksestå valmistettuun, preparatiiviseen HPLC-pyl- vååseen, joka sisålsi 2110 ml silikageeli LP-1/C^g-hartsia 1 % (NH4)Η2?0^:sså. Pylvås kehitettiin kåyttåen gradient-tia 1 % (NH^)H^PO^:sta 1 % (NH4)H2P04:asetonitriili (92:8) -seokseen virtausnopeudella 70 ml/min keråten 400 ml:n frak-25 tioita ja monitoroiden UV:llå aallonpituudella 254 nm.

A82846A:ta sisåltåvåt fraktiot (nrot 11-14) yhdistettiin seokseksi 1; A82846C:tå sisåltåvåt fraktiot (nrot 16 -20) yhdistettiin seokseksi 2; ja A82846B:tå sisåltåvåt fraktiot (nrot 21-25) yhdistettiin seokseksi 3.

30 C. A82846C:n puhdistus

Seos 2 konsentroitiin tilavuuteen noin 200 ml ja laitettiin 7 x 45 cm:n lasipylvååseen, joka sisålsi 1800 ml Diaion HP-20 -hartsia suolojen poistoa vårten. Aktiivinen materiaali eluoitiin MeOH:H20 (4:1) -seoksella, joka sisål-35 si 0,1 % etikkahappoa, keråten 1 l:n fraktioita virtausno- li 90993 43 peudella 25 ml/min. C:tå sisåltavåt fraktiot (nrot 9-12) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 662,2 mg osittain puhdistettua A82846C:tå.

Osittain puhdistettu A82846C (500 mg) puhdistettiin 5 edelleen toistamalla kåånteisfaasi-HPLC-vaiheet kayttaen 2,5 x 132 cm:n teråksistå pylvåstå, joka sisalsi 450 ml silika-geeli LP-1/C^ -geeliå, gradienttia 1 % (NH4) H2P04: stå 1 % (NH^)H2p04:asetonitriili (92:8) -seokseen ja virtaus-nopeutta 11 ml/min, seka keraten 25 ml:n fraktioita ja mo-10 nitoroiden aallonpituudella 254 nm. A82846C:tå sisåltavåt fraktiot (nrot 169-210) yhdistettiin ja suolat poistettiin 5 x 45 cm:n lasipylvaållå, joka sisålsi HP-20-hartsia. Pyl-vås eluoitiin MeOH:H20-seoksella (4:1), joka sisålsi 0,1 % etikkahappoa, keråten 100 ml:n fraktioita ja seuraten eluu-15 tiota analyyttisellå HPLC:llå UV:sså aallonpituudella 225 nm.

A82846C:tå sisåltåvåt fraktiot (nrot 5-11) yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 127,3 mg A82846C:tå.

Seos 1, joka sisålsi A82846A:n, ja seos, joka sisålsi 20 A82846B:n, puhdistettiin samålla tavalla kuin A82846C, jol loin saatiin lisåå puhdistettua A82846A:ta ja A82846B:tå.

D. A82846C:n lisåpuhdistus A82846C (70 mg) puhdistettiin edelleen kayttaen seu-raavaa preparatiivista kromatografista menetelmåa: 25 Pylvås: Zorbax SCX (9,2 x 250 cm) -kationinvaihtaja

Liikkuva faasi: Lineaarinen gradientti alkaen 0,15 mol/1 NaH2P04~puskurista, joka sisålsi 10 % MeOH:ta, 0,9 mol/1 NaH2P04-puskuriin, joka sisålsi 10 % MeOH:ta, 6 minuu-tissa ja jatkaen eluutiota 5 min. (Puskurille ei tehty mi-30 tåån sååddksiå).

Virtausnopeus: 6,0 ml/min Toteaminen: UV aallonpituudella 280 nm Nåytemåårå: 6,0 mg/injektio H20:ssa A82846C keråttiin talteen kåyttåmållå automaattis-35 ta fraktionkerååjåå (Gilson 201C), joka oli varustettu pii- kin toteeunismekanismilla. Liikkuva faasi annosteltiin 44

Millipore Waters M600 Gradient HPLC System -laitetta kåyttaen ja nåyteliuos injektoitiin Hitachin automaattisella nåyt-teenannostelijalla.

A82846C:tå sisåltåvåt fraktiot yhdistettiin, kon-5 sentroitiin tilavuuteen 30 ml ja laitettiin HP-20 -pylvaå- seen (50 ml). Pylvås pestiin I^Oilla ja eluoitiin ^Chiso-propanoli (95:5) -seoksella, joka sisalsi 0,5 % HOAc:a ke-raten 25 ml:n fraktioita. A82846C:n sisåltåvåt fraktiot (nrot 9-14) yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmåkuivattiin, 10 jolloin saatiin 37 mg puhdistettua A82846C:tå.

A82846C:n KBr-kiekossa ajettu IR-spektri on esitetty kuviossa 3; A82846C:n tioglyserolissa ajettu FAB-MS on esitetty kuviossa 6; ja Bruker AM500 -spektrometrillå (HDO-suppressoitu) 60°C:ssa saatu A82846C-asetaatin (metyy-15 lisulfoksidi)-dg:ssa ajettu NMR-spektri on esitetty kuvios sa 9 .

Esimerkki 8 A82846-suolojen valmistus

Menetelmå: 20 Jokaisessa tapauksessa A82846-komponentti (100 mg) liuotettiin ionivapaaseen veteen (10 ml). Tåman liuoksen pH såådettiin noin 3:ksi kåyttaen 0,5 N happoa (HC1, I^SC^ ja H3P04). Liuos kylmakuivattiin, jolloin saatiin sopiva suolamuoto. On tarkeaå huomauttaa, ettå jos pH:ta alenne-25 taan liikaa pH 3:n alle (tåmå tarkoittaa pH 2:een), kompo nentti hajoaa. Saatiin seuraavat saannot:

Saanto (mg)

Suola A82846A A82846B

HC1 93,8 88,1 30 H2S04 92,5 75,4 H3PO4 110,8 105,7 90993 45

Esimerkki 9 A82846A:n tabletiksi formulointi

Tabletit., jotka sisåltåvåt A82846A:ta, voidaan valmis-taa kSyttaen seuraavia aineosia ja mååriå: 5 Aineosa Paino A82846A-fosfaatti 282,9 mg

Mikrokiteinen sellu-loosa 101,1 mg

Kroskarmelloosinat- 10 rium 12,0 mg

Providone 12,0 mg

Magnesiumstearaatti 3,0 mg

Steariinihappo 4,0 mg

Puhdistettu vesi 0,16 ml 15 Lisåå A82846A-fosfaatti, osa mikrokiteisesta selluloo- sasta ja osa kroskarmelloosinatriumista sopivaan astiaan ja sekoita, kunnes seos on homogeeninen. Valmista Povidone'n ve-siliuos ja lisaS Povidone-liuos sekoitettuihin jauheisiin. Rakeista saatu seos, lajittele koon mukaan, jos on tarpeen, 20 ja kuivata. Lisåa jåljellå oleva mikrokiteinen selluloosa ja kroskarmelloosinatrium kuivattuun seokseen ja sekoita. Lisåå magnesiumstearaatti ja steariinihappo ja sekoita seos. Pu-rista saatu jauheseos tableteiksi.

Esimerkki 9 25 A82846B-kapseleiden formulointi A82846B:tcl sisaltSvia kapseleita voidaan valmistaa kayttåen seuraavia aineosia ja mååria:

Aineosa Paino A82846B-hydrokloridi 262,2 mg 30 Maissitarkkelys -valu- va jauhe 137,7 mg

Silikonineste 350 centistokes 2,7 mg

Maissitarkkelys 147,1 mg 46

Sekoita A82846B-hydrokloridi, tarkkelys -valuva jauhe, silikonineste 350 centistokes ja tarkkelysjauhe so-pivassa sekoittimessa, kunnes seos on homogeeninen. Tåyta sopivankokoisiin, kovasta gelatiinista valmistettuihin kap-5 seleihin.

Esiinerkki 11 A82846A-suspension formulointi

Valmista steriili A82846A:n liukenematon muoto ki-teyttåmallå tai saostamalla. Jauho tai seulo partikkelikoko, 10 joka sopii suspensioon. Suspendoi A82846A seuraavaan vehik- keliin:

Aineosa Maåra

Lesitiini 1 %

Natriumsitraatti 2 % 15 Propyyliparabeeni 0,015 %

Steriili vesi q.s. haluttu tilavuus

Suspensio voidaan valmistaa suurena måarånå ja tåyt-taå pulloihin tai se voidaan valmistaa juuri ennen kåyttoå lisåamållå vehikkeli pullossa olevaan A82846A:han.

li

Claims (4)

90993 47

1. Menetelmå antibiootin A82846 ja een komponent-tien A82846A, A82846B tax A82846C valmistamiseksi, joilla 5 on kaava NH, H°—B<] OH CH, || I «--Λ, v„„ k j "4>»h r » 1 h> Λ ·ν"ο^χ„ »O \ H >"·""« /^CH* I I T CH* - JL I tø Her OH OH 20 jossa kaavassa X = H ja Y = Cl (A82846A), X = Cl ja Y = Cl (A82846B) tai X = H ja Y = H (A82846C), t u n -n e t t u siitå, ettå viljellåån kantoja Nocardla orien-talis NRRL 18098, NRRL 18099 ja NRKL 18100 tal nilden 25 A82846:tta tuottavla jålkipolvia viljelyvåliaineessa, joka sisåltåa asslmlloitavia hiililåhteitå, typpilåhteitå ja epåorgaanisten suolojen låhteitå, submersseisså aerobisis-sa fermentointiolosuhteissa, ja tåmån jålkeen erotetaan antibiootti fermentointivåliaineesta ja valinnaisesti muu-30 tetaan antibiootti suolaksi, jos se ei ole suolamuodossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnet t u siita, ettå valmistetaan A82846A tax sen far-maseuttisesti hyvåksyttåvå suola.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u n-35 n e t t u siitå, ettå valmistetaan A82846B tax sen far- 48 maseuttisesti hyvåksyttåvå suola.

4. Biologisesti puhdistettu viljelma, t u η n e t-t u siitå, etta se on Nocardia orientalis -kanta NRRL 18098, NRRL 18099 tai NRRL 18100 tai nåiden A82846:tta 5 tuottava jålkelåinen. 90993 49