PT85742B - Processo para a producao de antibioticos glicopeptidicos - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS GLICOPEPTÍDICOS

parável à da vancomicina.

O processo de preparação consiste, essêncialmente, em se fazer a cultura das referidas estirpes, num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos, sob condições de fermentação aeróbica submersa.

È também objecto do presente invento a referida cultura biologicamente purificada.

Este invento relaciona-se com novos antibióticos glicopeptídicos do grupo vancomicina. Em particular, relaciona-se com o antibiótico A82846, com os seus componentes individuais A82846A, A82846B e A82846C e com a sua preparação por cultura de novas estirpes de microorganismos.

Embora haja hoje em dia muitos antibióticos benéficos disponíveis, continua a existir a necessidade de encontrar antibióticos aperfeiçoados para terapêutica humana. Por exemplo, a vancomicina é um antibiótico que obteve êxito comercial tendo salvado muitas vidas. Contudo, a vancomicina pode causar problemas, por exemplo pode causar ototoxicidade e nefrotoxicidade. Assim, são necessários antibióticos que possuam uma actividade semelhante à da vancomicina mas queapresentem uma melhor farmacocinética ou menos efeitos secundários.

De acordo com o invento descobriu-se actualmente que podem ser produzidos antibióticos glicopeptídicos de grande valor por meio de fermentação aeróbica submersa de Nocardia orientalis NRRL 18098, NRRL 18099 ou NRRL 18100 num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono, de azoto e de sais inorgânicos. Designamos arbitrariamente estes antibióticos glicopeptídicos como A82846 e seus componentes.

O antibiótico A82846 é estruturalmente semelhante à vancomicina, mas possui uma actividade in vitro e in vivo melhorada contra as bactérias Gram-positivas, assim como propriedades farmacocinéticas melhoradas que resultam de uma meia vida muito mais longa do que a da vancomicina .

Os componentes de A82846 possuem essêncialmente as seguintes propriedades físicas e espectrais.

Características de A82846A

Peso Molecular: 1556

Fórmula Empírica: ^C73^Hgg^Nj_o°26^Ci

BAR-EM (tioglicerol): (M+l) Encontrados: 1557,5803;

Calculados 1557,5716 (ver fig. 4)

UV (H₂O) max: 281 nm ( fc5.052) , desvios para 300 nm com base

IV (KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 e 1015 cm^-'' (ver fig. 1)

RMN /(CD^)2^S°7^{: ver} fig· 7 pKa (H₂O): 4,7, 9,5 (66% DMF): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4, 12,3 (peso mol. aparente 1542)

Características de A82846B

Peso Molecular: 1590

Fórmula Empírica:

FAB-MS (tioglicerol): (M+l) Encontrados: 1591,5315;

Calculados ^-73^39^^10^26^^2 ⁼ 1591,5327 (ver fig. 5)

UV (f^O) ( £ 5.192), desvios para

300 nm com base

IV (KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023, e 1018 cm^-1 (ver fig. 2)

RMN / (CD₃)₂SO7: ver fig. 8 pKa (H₂O): 4,65, 9,5

Características de A82846C

Peso Molecular: 1522

Fórmula Empírica: ^c-73^9q^jq^O26

FAB-MS (tioglicerol): (M+Na) Encontrados: 1545,5998;

Calculados ^C73^H9Q^N]_Q^O26^Na=-’-5^5,5925 (ver Fig. 6)

UV (H₂0) ylmax: 280 nm (£5.198), desvios para 300 nm com base

IV (KBr): 3600—^3004 (amplo), 2999,

2991, 2950, 1187-^1650, (amplo), 1585, 1570, 1509, 1503,

1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 e 1014 cm^-1 (ver fig. 3)

RMN /“(CD₃)₂SO_7: ver fig. 9 pKa (H₂O): 4,6, 9,4

A análise dos amino ácidos de A82846A, A82846B e A82846C, após hidrólise com HC1 6N, indicou a presença de ácido aspártico e de dois picos amplos com um vestígio de glicina . Os dois picos parece correspondenrem a amino ácidos actinoidinico e vancomicinico, que estão ambos presentes em glicopeptídeos da classe vancomicina.

Estudos de RMN comparativos indicam que A82846A, A82846B e A82846C contêm cada um deles o novo amino-açucar 4-epi-vancosamina-(3-metil-acosamina):

A fórmula molecular de A82846A corresponde à da vancomicina ) menos um átomo de cloro mais os elementos de um açúcar amino adicional do tipo vancomicina (C-yH^NC^).

I A fórmula molecular de A82846B corresponde à de A82846A em que um átomo de hidrogénio é substituído por um átomo de cloro.

A fórmula molecular de A82846C corresponde à de A82846A em que um átomo de cloro foi substituiI do por hidrogénio.

Os componentes A82846 parecem constituir uma nova família de glicopeptídos que se parecem com a molécula de vancomicina na sua composição geral, diferindo principalmente no conteúdo de cloro e na presença de uma sub-unidade adicional tendo uma composição como a da vancosamina.

Os componentes A82846 parece terem as seguintes fórmulas estruturais:

A82846A :	X=H	Y=C1
A82846B :	X=C1	Y=C1
A82846C :	X=H	Y=H

* A configuração absoluta dos grupos açúcar nos compostos A82846 ainda não foi determinada.

A82846 e os seus componentes individuais A82846A, A82846B e A82846C podem reagir para formar vários sais. Todas essas formas destes antibióticos fazem parte I deste invento. Os sais de A82846 são úteis, por exemplo, para separar e purificar A82946. Além disso, os sais possuem uma melhor solubilidade na água.

Os sais de A82846 são preparados usando processos padrão para a preparação de sal. Por exemplo, A82846 pode ser neutralizado com um ácido apropriado para formar um sal de adição de ácido.

Os sais de adição de ácido são particularmente úteis. Os sais apropriados representativos incluem os sais formados por reacções padrão com ácidos tanto orgâ) nicos como inorgânicos tais como, por exemplo, sulfúrico, clorídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, célico, pamoico, múcico, D-glutâmico, d-canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, laurico, esteárico, salicílico, metanossulfónico, ) benzenossulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinâmico e ácidos afins.

Sais de adição de ácido farmacêuticamente aceitáveis constituem um grupo especialmente preferido de sais deste invento.

antibiótico A82846 pode ser produzido por cultura de uma estirpe de Nocardia orientalis produtora

de A82846 em condições de submersão aeróbica num meio de cultura apropriado até se produzir uma actividade antibiótica substancial. 0 antibiótico pode ser recuperado usando vários processos de isolamento e de purificação conhecidos nesta técnica.

Este invento também se relaciona com uma cultura purificada biologicamente de um microorganismo seleccionado entre Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 18100 ou um mutante, variante ou recombinante destas estirpes produtor de A82846. Estes microorganismos são úteis porque produzem antibiótico A82846. Por razões de conveniência na discussão que se segue, a estirpe NRRL 18099 foi designada cultura A82846, a estirpe NRRL 18099 foi designada cultura A82846.1 e a estirpe NRRL 18100 foi designada cultura A82846.2. A cultura A82846 foi isolada a partir de uma amostra de solo do Haiti. A cultura A82846.1 foi obtida a partir da cultura A82846 por mutagénese guímica, e a cultura A82846.2 é uma variante natural isolada da cultura A82846.

As culturas A82846, A82846.1 e A82846.2 foram depositadas e passaram a fazer parte do estoque da colecção de culturas do Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Steet, Peoria, Illinois, 61604, em 8 de Agosto de 1986. As culturas, encontram-se à disponibilidade do público sob os números de matrícula NRRL 18098 (A82846, a estirpe mãe), NRR1 18099 (A82846.1, a estirpe mutante) e NRRL 18100 (A82846.2, a estirpe variante).

Foram realizados estudos taxonómicos de cultura A82846, A82846.1 e A82846.2 por Frederick P. Mertz de Lilly Reserach Laboratories. Tendo como base estes estudos, os novos organismos são classificados como estirpes de Nocardia orientalis (Pittenger and Brigham, 1956) Pridham

and Lyons 1969, tipo de estirpe: ATCC 19795 /^-R.C. Pittenger and R.B. Brigham, Streptomyces orientalis n. sp., the Source of Vancomycin, Antibiotics and Chemoterapy 6, 642-647 (1956) 7· Esta classificação baseia-se em comparações laboratoriais directas e exame de descrições publicadas Z~Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, Eds., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; M. Goodfellow and K.P. Schaal, Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus, in Identification Methods for Microbiologist, 2nd ed., Skinner and D.W. Lovelock, Eds., Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, p. 261; R.E. Gordon, D.A. Barnett, J.E. Handerhan and C.H. Pang, Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the Nocardia Strain, Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974); R.E. Gordon, S. K. Mishra and D.A. Barnett, Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensia, N. orientalis, and N. aerocolonigenes'¹, J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); S.J. Mishra, R.E. Gordon, and D.A. Barnett, Identification of Nocardiae and Streptomyces of Medicai Importance, J. Clin. Microbiol. 11(6), 728-736 (1980); H. Mordarska and M. Mordarski, Chemotaxonomic Characters and Classification of } Some Nocardioform Bactéria, J. Gen. Microbiology 71, 77-86 (1972); and R. Shinobu and M. Kawato, On Streptomyces aerocolonigenes nov. sp., Forming the Secondary Colonies on the Aerial Mycelia, Bot. Mag. Tokyo 73, 213-216 (1960)_7.

I

Métodos Usados

Os métodos seguidos foram os recomenda. dos pelo International Streptomyces Project (ISP) para a caracterização da espécie de Streptomyces /~E.B. Shirling and Gottlieb, Methods for Characterization of Streptomyces Species, Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340 (1966)_7 e os recomendados para a caracterização das espécies Nocardia por Gordon, Barnett, Handerhan and Pang, supra.

A morfologia foi estudada usando um microscópio óptico. Foi usado um microscópio electrónico scanning (ou de varredura) (SEM) para estudar a estrutura da superfície do esporo.

A resistência em relação ao rifampin e à lisozima foi medida por métodos recomendados por Gordon /~R.E. Gordon and D.A. Barnett, Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomic Tool, Int. J. Syst. Bacteriol. 27(3), 176-178 (1977)_7.

Foram usados para atribuir nomes das cores, ISCO-NBS Centroid Color Charts, amostra padrão No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department õf Commerce, Washington, D.C.) e o Color Harmony Manual (4 th ed., Container Corporation of América, Chicago Illinois, 1958 ) .

A produção de pigmento melanoide (cromogenicidade) foi determinada com meios ISP No. 1 (triptona-caldo de extracto de levedura), ISP No. 6 (peptona-agar de ferro extracto de levedura) e ISP No. 7 (agar tirosina).

Os isómeros de ácido diaminopimélico (DAP) e os hidratos de carbono em hidrolisados de células totais foram estabelecidos pelos métodós cromatográficos de Becker et al. /~B. Becker, M.P, Lechevalier, R. E.Gordon and H.A. Lechevalier, Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolisates, Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)_7 and of Lechevalier /M.P. Lechevalier, Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinicai Importance, J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968) 7.

Os ácidos micólicos foram determinados por um método baseado em técnicas descritas por Minnikin /~D.E. Minnikin, I.G. Hutchinson and A.B. Caldicott, Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bactéria, J. Chromatography 188, 221-233 (1980)7.

A fosfatase e a urease foram determinadas por métodos descritos por Blazevic, (D.J. Blazevic and G.M. Ederer, Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, Jonh Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, p. 136). Foi usada liquefacção de gelatina para determinar a actividade da proteinase.

A resistência aos antibióticos foi medida acolchoando discos de sensibilidade ao antibiótico sobre a superfície de placas de agar ISP No. 2 semeadas.

A hidrólise do amido foi determinada testando quanto à presença de amido com iodo sobre placas de agar (sais inorgânicos-amido) ISP No. 4 (Ver Blazevic and Ederer, supra).

A hidrólise do hipurato foi medida usando Discos de Diferenciação Bacto os guais detectam rapidamente a hidrólise do hipurato.

Caracteristicas das Culturas

As culturas A82846 e A82846.2 cresceram bem sobre todos os meios complexos e definidos usados. Estas culturas produziram micélios aéreos na maior parte dos meios. A cor da massa do esporo aéreo era branca ou cinzenta, dependendo do meio. Foi produzido em muitos meios um pigmento solúvel castanho identificativo; o lado reverso tinha uma côr de castanho a branco amarelado.

A cultura Α82846.1 também cresceu em todos os meios usados mas o seu crescimento foi menos abundan te do que a da cultura mãe. A82846.1 só raramente produziu micélios aéreos. Quando presente, a côr dos micelios era branca. Nalguns meios foi produzido um pigmento solúvel cas tanho claro não identificativo ocasional; a côr do lado reverso variava entre castanho e branco amarelado.

As caracteristicas do cultivo das culturas A82846, A82846.1 e A82846.2 são resumidas no Quadro I. As culturas A82846 e A82846.2 eram muito semelhantes, diferindo apenas nalgumas propriedades do cultivo. Devido à sua semelhança e visto que A82846.2 é uma variante natural de A82846, nao foram feitas outras comparações.

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Características Morofológicas

As culturas A82846, A82846.1 e A82846.2 produziram um substrato micelial extenso. As hifas aéreas formaram longas cadeias de conídias com um aspecto de teia I de aranha que é classificada como sendo característica dos não estreptomicetas no Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, supra.

Em todas as culturas a estrutura da superfície dos esporos mostrava-se lisa e a forma dos espo► ros era cilíndrica. 0 tamanho do esporo variava entre 1,2-1,3 x 0,4-0,5 pM para A82846 e 1,4-2,2 x 0,3-0,4 pM para A82846.1.

Quando cresce em condições de agitação submersa, A82846 apresenta uma fragmentação mínima, A82846.1 apresenta uma fragmentação extensa e A828462apresenta uma fragmentação moderada.

Características Fisiológicas

As culturas A82846 e 82846.1 ambas produziram ácido a partir de: arabinose, celobiose, dextrano, fructose, galactose, glucose, alfa-metil-D-glucosido, glicerol, inositol, lactose, maltose, manitol, manose, melibiose, ramnose, ribose, sucrose, trehalose e xilose, mas não produziram ácido a partir de adonitol, celulose, dulcitol, eritritol, inulina, sorbitol e xilitol. A82846 também produziu ácido a partir de: etanol,glicogénio, melezitose, rafinose e salicina, mas tal não aconteceu com A82846.1. Ambas as culturas utilizaram acetato, citrato, lactato, malato, oxalato, propionato, piruvato e succinato, mas não utilizaram benzoato, mucato e tartrato. A cultura A82846.1 utilizou butirato, mas tal não aconteceu com A82846.

A82846 e A82846.1 decompuzeram a caseína, hipoxantina, tirosina, ureia e DNA, mas não decompuzeram a adenina, malato de cálcio ou xantina.. Ambas as culturas hidrolisaram amido, não hidrolisaram a esculina ou o hipurato, reduziram o nitrato, liquefizeram a gelatina, sobreviveram a 50SC durante 8 horas e produziram catalase, H₂S e fosfatase.

As culturas A82846 e A82846.1 modelos idênticos de resistência aos antibióticos. Revelaram-se resistentes em relação à bacitracina (10 unidades), cefalotina (30 pg) , gentamicina (10 pg) , lincomicina (2 Mg), oleandomicina (15 pg), penicilina G (10 unidades), estreptomicina (10 pg), vancomicina (30 pg), tobramicina (10 pg) , eritromicina (15 pg), ácido nalidixico (30 pg), polimixina B (300 unidades), trimetoprim (5 pg) e sulfadiazina (300 pg), e foram sensíveis em relação à neomicina (30 pg), rifampim (5 pg), tetraciclina (30 pg), cloramfenicol (30 pg), novobiocina (30 pg), e mandelamina (3 pg).

A82846 e A82846.1 eram ambas Gram + mas não coraram rapidamente com ácido. A82846 produziu pigmentos melanoides, enquanto que com A82846.1 tal não aconteceu .

Análise da Parede das Células

Células totais de A82846 hidrolisadas continham o isómero meso de ácido diaminopimélico e os açucares arabinose e galactose. As culturas possuem uma parede celular do Tipo IV, de acordo com Backer et al., supra. O modelo do açúcar é do tipo A (Lechevalier, supra) . As culturas não produziram ácidos micólicos (LCN-A).

Identidade da Estirpe A82846

As características quimiotaxonómicas e gerais de cultivo da estirpe A82846 são consistentes com a sua relação com o género Nocardia Trevisan 1889 /~V. B. D. Skerman, V. McGowan and P.H.A. Sneath, Eds., Approved Lists of Bacterial Names, Int. J, Syst. Bacteriol. 30, 225-420 (1980) 7.

Foram calculados coeficientes de semelhança a partir das propriedades de catorze espécies de Nocardia publicadas por Gordon, Mishra and Barnett, supra, e cinco estirpes a partir da colecção de culturas Lilly. Foram usados o coeficiente de Jaccard /ver P.H.A. Sneath, The Application of Computers to Taxonomy, J. Gen. Microbiol. 17, 201 (1957) 7 e o coeficiente simples de semelhança /_2 ^ver R.R. Sokal and C. D. Michener, A Statistical Method for Evaluating Systemic Relationships, Kan. Univ. Sei. Buli. 38, 1409 (1958) 7. Os resultados destas comparações são resumidos no Quadro II.

Quadro II: Coeficientes de Semelhança para A82846 e Outras

Espécies de Nocardia

Cultura	Coeficiente de Semelhança
Ssm	Sj
A82846	100	100
N. aerocolonigenes	84	76
N. aerocolonigenes (A42125)*	83	78
N. orientalis (M43-05865)	78	72
N. orientalis (A51568.1)	78	72
N. orientalis	75	68
N. orientalis (M5-18215)	73	66
N. orientalis (M5-18260)	73	66
N. maduras	73	63
N. hirsuta	62	60
N. autotrophica	62	53
N. dassonvillei	62	50
N. amarae	62	46
N. brasiliensis	56	43
N. vaccinii	56	43
N. transvalensis	48	38
N. caviae	48	32
N. pelletieri	48	24
N. asteroides	46	23
N. carnea	43	25

Números entre parenteses indicam estirpes da colecção de culturas Lilly.

Como N. maduras foi transferida para o género Actinomadura, deixou de ser considerada. Duas espécies, N. aerocolonigenes e N. orientalis, apresentaram bons coeficientes de semelhança. Foram feitas comparações laboratoriais entre A82846 e estas duas espécies. O Quadro III indica os resultados destas comparações.

Quadro III: Comparação entre as propriedades de A82846,

N. orientalis e N. aerocolonigenes

Propriedade

Produz hifas aereas

Cor aérea branca

Produz Conidia

Superfície lisa dos esporos

Forma cilíndrica dos esporos

Produz pigmento solúvel Gram⁺

Rapidez do ácido

Apresenta fragmentação

Produz catalase

Hidrolisa:

esculina hipurato amido malato de Ca

Reduz nitrato

Decompõe:

edenina caseína hipoxantina tirosina ureia xantina

Cultura³

82846	N. orien- talis	N. aerocolonigenes
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Quadro III, continuação

Cultura³

Propriedade	82846	N. orien- talis	N. aerocolo- nigenes
Liquefaz gelatina	+	+	-
Produz fosfatase	+	+	+
Sobrevive a 502C, 8 h	+	+	-
Produz ácido a partir de:
adonitol	-	+	-
arabinose	+	+	+
celobiose	+	+	+
eritritol	-	+	-
glucose	+	+	+
alfa-Me-glucosido	+	+	-
glicerol	+	+	+
inositol	+	+	+
lactose	+	+	+
maltose	+	+	+
manitol	+	+	+
manose	+	+	+
melezitose	+	-	-
melibiose	+	-	+
rafinose	+	-	-
ramnose	+	+	-|™
sorbitol	-	-	-
tre-halose	+	+	+
xilose	+	+	+
controlo (testemunha)		—	—

-23Quadro III, continuação

Cultura³

Propriedade	82846	N. orien- talis	N. aerocolonigenes
Utiliza:
benzoato	-	-	-
citrato	+	+	+
mucato	-	-	-
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tartrato	-		-
controlo (testemunha)	-	-	-
Resistência a:
bacitracina (10 unidades)	+	-	-
cefalotina (30 pg)	+	+	+
gentamicina (10 pg)	+	-	-
lincomicina (2 pg)	+		+
neomicina (30 pg)	-	-	-
oleandomicina (15 pg)	+	-	-
penicilina G (10 unidades)	+		+
rifampina (5 pg)	-	-	-
estreptomicina (10 pg)	+	+	-
tetraciclina (30 pg)	-	-	-
tobramicina (10 pg)	+	+	-
vancomicina (30 pg)	+	+	-
cloramfenicol (30 pg)	-	-	-
eritromicina (15 pg)	+	-	-
ácido nalidixico (30 pg)	+	+	-
novobiocina (30 pg)	-	+	-
polimixina (300 unidades)	+	-h	+
trimetoprima (5 pg)	+		+
a+ = a estirpe tem a propriedade; - =	a estirpe não tem a

propriedade

Foram de novo calculados coeficientes de semelhança usando um maior número de características unitárias. Os resultados são resumidos no Quadro IV.

Quadro IV: Coeficiente de Semelhança para A82846,

Nocardia orientalis e Nocardia aerocolonigenes

Cultura	Coeficiente de Semelhança
Ssm	Sj
A82846	100	100
N. orientalis	81	76
N. aerocolonigenes	73	65

Nem a N. orientalis nem a N. aerocolonigenes possuem ácidos micólicos na sua parede celular. Gordon, supra, descreve três propriedades chave para auxiliar a fazer a distinção entre N. orientalis e N. aerocolonigenes. A comparação entre A82846 e a espécie Nocardia usando as propriedades chave de Gordon é indicada no Quadro V.

Quadro V: Comparação das Propriedades Chave de A82846, Nocardia orientalis e Nocardia aerocolonigenes

Cultura	Propriedade
Produz Ácido	a Partir de	Resistência ao Lysozima
Eritritol	Me-alfaglucosido
A82846	—	+	+
N. orientalis	+	+	-
N. aerocolonigenes	—	—	+

-25Embora A82846 não corresponda identicamente às propriedades chave de qualquer uma das estirpes Nocardia, possui uma maior afinidade em relação à N. orientalis quanto a características de cultivo e um coeficiente de semelhança elevado com N. orientalis. Também se assemelha à N. orientalis pelo facto de produzir um antibiótico glicopeptído. A82846 é, assim, classificada como uma estirpe de Nocardia orientalis (Pittenger and Brigham, 1956) Pridham and Lyons 1969. Como N. orientalis é reconhecida nas Listas Aprovadas de Nomes de Bactérias, supra, ela constitui uma espécie válidamente publicada.

A cultura A82846.1 constitui um mutante induzido quimicamente da cultura A82846. As características pelas quais A82846.1 difere de A82846 são indicadas no Quadro VI.

Quadro VI: Comparação das Diferenças entre A82846 e

A82846.1

Propriedade A82846 A82846.1

Fragmentação

Tamanho da colónia

Superfície da colónia

Hifas aéreas

Cor reversa

Pigmento solúvel

Produz ácido a partir de: etanol glicogénio melezitose rafinose salicilina

Utiliza:

alfa-Me-glucosido glicogénio melezitose sorbose butirato

Pigmentos melanoides

mínima	abundante
7 mm	5 mm
áspero	lisa
abundantes	vestígios
castanho escuro	castanho claro

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

Α82846.1 também difere de A82846 na quantidade de actividade antibiótica que produz. As outras diferenças mais aparentes entre as estirpes são constituídas pelo facto de, ao contrário de A82846, A82846.1 não produzir mecélios aéreos e um pigmento solúvel distintivo.

A cultura A82846.2 é uma variante natural da cultura A82846. Assim, as características de identificação de A82846.2 são essêncialmente as mesmas que as de A82846. A principal diferença entre A82846 e A82846.2 é constituída pelo facto da cultura A82846.2 produzir quantidades significativamente maiores de antibiótico A82846 do que a cultura A82846 em frascos agitados.

Tal como acontece com outros organismos, as características das culturas produtoras de A82846 deste invento, Nocardia orientalis estirpes NRRL 18098, NRRL 18099 e NRRL 18100, são submetidas a variação. Assim, a descêndencia destas estirpes, por exemplo, recombinantes, mutantes e variantes, pode ser obtida por métodos conhecidos nesta técnica. Por exemplo, as variantes podem ser obtidas por selecção natural e os mutantes podem ser obtidos por tratamento com vários mutagéneos físicos e químicos conhecidos tais como luz ultravioleta, raios X, raios gama e produtos químicos tais como N-metil-N¹-nitro-N-nitrosoguanidina.

As estirpes recombinantes podem ser desenvolvidas transformando as estirpes de Nocardia orientalís , usando processos bem conhecidos nesta técnica. Devido à semelhança entre Nocardia e Streptomyces, as técnicas de transformação e os vectores recombinantes desenvolvidos para utilização com Streptomyces podem também ser usados para transformar as éstirpes de Nocardia. Através da utilização da tecnologia recombinante, as estirpes de Nocardia orientalis podem ser transformadas para expressar uma série de

produtos genéticos para além dos antibióticos que estas estirpes produzem. Por exemplo, pode-se transformar as estirpes com um vector recombinante que confere resistência a um antibiótico em relação ao qual as estirpes são normalmente sensíveis. Os transformantes assim obtidos produzirão I não apenas os antibióticos A82846 mas também o enzima que confere resistência que permite selecção das transformadas a partir de células de tipo selvagem. Além disso, usando técnicas semelhantes, pode-se modificar as estirpes presentes para introduzir cópias múltiplas dos genes de biossíntese endógena de antibiótico para se conseguir uma maior ) produção de antibiótico. A descendência, isto é os variantes mutantes e recombinantes naturais e induzidas, de Nocardia orientalis estirpes NRRL 18098, NRRL 18099 e NRRL 18100 que retêm a característica de produção de A82846 fazem parte deste invento.

O meio de cultura usado para fazer crescer as culturas de Nocardia orientalis pode ser qualquer um de entre um certo número de meios. Contudo certos meios de cultura são preferidos para economia na produção, rendimento óptimo, e facilidade no isolamento do produto. Assim, por exemplo, as fontes preferidas de hidratos de carbono I numa fermentação em grande escala são glucose e dextrina da batata, embora possam ser usados ribose, xilose, frutose, galactose, manose, manitol, amido solúvel, etc.

As fontes preferidas de azoto são caseína hidrolisada por enzima e peptonas da carne, embora também se possam usar extracto de levedura, caseina hidrolisada por ácido, extracto de carne, farinha de peixe, farinha de figado, etc.

Entre os sais inorgânicos nutrientes encontram-se os sais solúveis habituais capazes de proporcionarem zinco, sódio, magnésio, cálcio, amónio, cloreto, carbonato, sulfato, nitrato e iões afins.

Elementos vestigiais necessários para o crescimento e desenvolvimento do organismo devem ser também incluídos no meio de cultura.Esses elementos vestigiais ocorrem habitualmente como impurezas noutros substítuintes do meio em quantidades suficientes para irem ao encontro das necessidades de crescimento do organismo. Se a formação e espuma constituir um problema, pode-se adicionar a meios de fermentação em grande escala pequenas quantidades (isto é 0,2 mL/L) de um agente anti-espuma tal como polipropileno glicol.

Para produção de quantidades substanciais de antibióticos A82846, é preferida fermentação aeróbica submersa em tanques. Podem ser obtidas pequenas quantidades de antibióticos por cultura em frascos agitados. Devido à demora na produção de antibiótico habitualmente associada à inoculação de tanques grandes com a forma esporo do organismo, é preferível usar um inoculo vegetativo. O inoculo vegatativo é preparado inoculando um pequeno volume de meio de cultura com a forma esporo ou com fragmentos 'miceliais do organismo para se obter uma cultura fresca com crescimento activo do organismo. O inoculo vegatativo é então transferido para um tanque maior. 0 meio com inoculo vegetativo pode ser igual ao usado para maiores fermentações, mas são também apropriados outros meios.

Os antibióticos A82846 são produzidos pelos organismos que produzem A82846 quando feitos crescer a temperaturas entre cerca de 232 e cerca de 372C. As temperaturas óptimas para a produção de A82846 parecem variar entre cerca de 30 e 312C.

Tal como é hábito nos processos de cultura aeróbica submersa, é feito soprar ar estéril para o recipiente a partir do fundo enquanto o meio é agitado com impulsores de turbina convencionais. A fixação máxima de oxi-30-

génio na fermentação nas condições aqui usadas não excedeu cerca de 0,2 mM/l/minuto. Em geral, o grau de arejamento e o grau de agitação devem ser suficientes para manter o nível do oxigénio dissolvido a ou acima de 50% de saturação.

A produção dos antibióticos A82846 pode ser seguida durante a fermentação por amostras de ensaio do caldo quanto à actividade antibiótica contra organismos que se sabe serem sensíveis aos antibióticos. Um organismo de ensaio útil é o Bacillus subtilis ATCC 6633. O bioensaio é realizado convenientemente pelo teste na placa com reservatório de agar.

A seguir à sua produção em condições de fermentação aeróbica submersa, os antibióticos A82846 podem ser recuperados a partir do meio de fermentação por métodos utilizados nesta técnica. A actividade antibiótica produzida durante a fermentação dos organismos produtores de A82846 ocorre tanto nos micélios como no caldo. A recuperação máxima de A82846 é assim realizada, ajustando inicialmente o pH para 10,5 para libertar A82846 a partir dos micélios e filtrando o meio para separar o caldo da massa micelial.

A82846 pode ser recuperado do caldo filtrado por meio de uma série de técnicas. Uma técnica preferida envolve o ajustamento do caldo filtrado para um pH de cerca de 7 e a sua adsorção por uma resina de permuta catiónica, por exemplo Dowex XF5-43278, Dowex-50 ou Amberlite IR-120. O material activo é eluido a partir da resina com um solvente apropriado tal como, por exemplo, solução diluida de NH^OH. As fracções activas são então concentradas sob vacuo, adsorvidas por uma resina macroreticular, por exemplo Diaion HP-20 e Amberlite XAD-4, fazendo-se a eluição com'um solvente apropriado, tal como água:isopropanol (95:5) contendo ácido acético a 1%, para dar origem a A82846. O material activo pode também ser eluido com mistu-31-

ras de água:acetonitrilo ou água:metanol contendo pequenas quantidades de ácido.

A82846 pode ser separado em componentes individuais A82846A,A82846B e A82846C por meio de proI cessos semelhantes. Um processo de separação preferido envolve cromatografia de gel de sílica (C^g ou Cg) de fase reversa.

Alternativamente, os sólidos da cultura, incluindo os constituintes do meio e o micélio podem ser ) usados sem extracção ou separação, mas de preferência após remoção de água, como uma fonte de A82846. Por exemplo, após produção de A82846, o caldo de fermentação total pode ser seco por liofilização, por secagem em tambor, ou por destilação azeotrópica e secagem. 0 caldo seco é então misturado directamente com prémistura fornecida.

Os antibióticos A82846 possuem uma excelente actividade in vitro e in vivo contra as bactérias patogénicas Gram positivas. Um atributo particularmente inesperado destes antibióticos é a sua longa meia-vida no soro. Por exemplo, quando administrada intravenosamente a | ratos, a vancomocina tinha uma meia-vida no soro de 45 minutos, enquanto que A82846A e A82846B tinham uma meia vida de 2,2 horas.

As concentrações inibidoras mínimas ! (CIMs) nas quais os antibióticos A82846 inibem certas bactérias são indicadas nos Quadros VII e VIII. As CIMs nos Quadros VII e VIII foram determinadas por meio de ensaios padrão de diluição de agar.

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Quadro VII: Actividade Antibacteriana In Vitro dos Antibióticos A82846

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Quadro VIII: Actividade In Vitro de A82846A, A82846B e Vancomicina j E tn

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Um aspecto importante da actividade antibacteriana dos compostos A82846 é a sua actividade contra bactérias anaeróbicas. Esta actividade é ilustrada no Quadro IX, que resume, a actividade de A82846A e de A82846B contra várias bactérias anaeróbicas, tal como é determinado por ensaio padrão de diluição de agar. Os pontos finais foram lidos após incubação de 24 horas.

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Quadro IX: Actividade de A82846A e B Contra Bactérias Anaérobicas

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-36QuadroIX (continuação)

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Os antibióticos A82846 também revelaram actividade antimicrobiana in vivo contra infecções induzidas experimentalmente em animais de laboratório. Quando se administraram duas doses do composto do teste a ratinhos infectados experimentalmente com o organismo do ensaio, a actividade observada foi medida como um valor EDç/dose eficaz em mg/kg para proteger 50% dos animais do teste: ver Warren Wick, et al., J. Bacteriol, 81, 233-235 (1961)_7. Os valores Εϋ^θ observados em relação aos compostos ilustrativos são indicados no Quadro X.

Quadro X: Actividade In Vivo dos Antibióticos A82846

Composto	ED50
Staphylococcus aureus	Streptococcus pyogenes	Streptococcus
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A82846A	0,19	0,19	0,17
A82846B	0,19	0,20	0,18
A82846C	2,18	2,71	5,87
Vancomicina	1,3	0,72	1,52

^amg/kg x 2; doses administradas subscutâneamente a ratinhos 1 e 4 horas após a infecção

Num aspecto importante da sua actividade antibacteriana os antibióticos A82846 são úteis para o tratamento da pielonefrite. Por exemplo, A82846A e A82846B foram mais eficazes do que a vancomicina para proporcionarem protecção numa infecção do tipo pielonefrite descendente experimental em ratos. Este teste foi realizado usando um processo como o descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.208.403. Os resultados observados são resumidos no Quadro XI.

Quadro XI: Actividade de A82846A e B no Teste de

Pielonefrite Descendente do Rato

Composto	Dosagem (mg/kgxl2)a	Percentagem de Ratos Curados	Percentagem de Ratos com uma Redução 4-Log no Título
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Vancomicina	10	63	100
	5	38	88
	2	38	75
Doses duas	vezes por dia	subcutâneamente	durante 6 dias

Os antibióticos A82846 são também · úteis no tratamento da endocardite. Por exemplo, A82846A e B foram têo eficazes como a vancomicina no tratamento de endocardite experimental induzida por cateter em ratos. Neste teste, os ratos foram preparados inserindo um cateter de plástico na artéria carótida direita, colocando-a para baixo para o ventrículo direito e fixando-a com segurança. Os animais foram deixados a descansar durante dois dias, sendo então o organismo do teste, Streptococcus faecalis X-66, administrado intravenosamente. 0 título do organismo foi g de aproximadamente 5x10 /mL; administrou-se 0,5 mL.

Os compostos foram administrados subcutâneamente 15 minutos antes da infacção e com intervalos de 12 horas durante 14 dias, num total de 28 tratamentos. Os animais foram mantidos 2 dias após a terapêutica; então, os corações foram retirados, homogenizados, diluídos e colocados em placas com agar de soja tripticase. As placas foram incubadas 48 horas antes da contagem.

Os resultados destes estudos estão re sumidos no Quadro XII.

Quadro XII: Actividade de A82846A e B no Teste da Endocardite do Rato tQ O n (0 ff ff O

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As formulações farmacêuticas dos antibióticos A82846 constituem também uma parte deste invento. Assim, o antibiótico, de preferência sob a forma de um sal farmacêuticamente aceitável, pode ser formulado para administração oral ou parentérica para a terapêutica ou tratamento profilático das infecções bacterianas. Por exemplo o composto pode ser misturado com veículos e excipientes farmacêuticos convencionais e pode ser usado sob a forma de comprimidos, cápsulas, colutórios, suspensões, xaropes, hóstias, etc.

As composições compreendendo um antibiótico A82846 contêm de cerca de 0,1 a cerca de 90% em peso do composto activo, e mais geralmente de cerca de 10 a cerca de 30%. As composições podem conter veículos e excipientes comuns, tais como amido de milho ou gelatina, lactose, sucrose, celulose microcristalina, caolino, manitol, fosfato dicalcico, cloreto de sódio e ácido algínico. Os agentes de desintegração habitualmente usados nas formulações deste invento incluem croscarmellose de sódio, celulose microcristalina, amido de milho, glicolato de amido de sódio e ácido algínico.

Os agentes de ligação dos comprimidos que podem ser incluídos são acácia, celulose metílica, celulose carboximetílica de sódio, polivinilpirrolidona (Povidone), celulose hidroxipropil metilica, sucrose, amido e celulose etílica. ’

Os lubrificantes que podem ser usados incluem estearato de magnésio ou outros estearatos metálicos ácido esteárico, fluído de silicone, talco, ceras, óleos e sílica coloidal.

Os agentes aromatizantes tais como hortelã pimenta, óleo de gaultéria, aroma de cereja, etc.,podem

também ser usados.

Pode ser desejável adicionar um agente de coloração para que a forma de dosagem tenha um aspecto mais estético ou para ajudar a identificar o produto.

Para utilização intravenosa (IV), uma forma do antibiótico solúvel na água pode ser dissolvida num dos fluídos intravenosos habitualmente usados e administrada por infusão. Podem ser usados fluídos tais como, por exemplo, solução salina fisiológica, solução de Ringer ou solução de dextrose a 5%.

Para as preparações intramusculares, uma formulação estéril de uma forma de sal solúvel apropriado do composto, por exemplo o sal clorohidreto, pode ser dissolvida e administrada num diluente farmacêutico tal como Agua-para-Injecção, solução salina fisiológica ou solução de glucose a 5%. Pode ser preparada e administrada uma forma insolúvel apropriada do composto sob a forma de uma suspensão numa base aquosa ou numa base oleosa farmacêuticamente aceitável, por exemplo um éster de um ácido gordo de cadeia longa tal como oleato de etilo.

Para utilização oral, é particularmente útil uma formulação estéril de uma forma de sal apropriada do antibiótico, por exemplo, o sal clorohidreto, formulado num diluente tal como água destilada ou desionizada.

Alternativamente, a forma de dosagem unitária do antibiótico pode ser uma solução do antibiótico, de preferência na sua forma salina, num diluente apropriado em ampolas herméticamente seladas, estéreis. A concentração do antibiótico na dosagem unitária pode variar, por exemplo entre cerca de 1 por cento e de 50 por cento dependendo da forma particular do antibiótico e da sua solubilidade e da dose desejada pelo médico.

Num outro aspecto, este invento proporciona um método para o tratamento de doenças infecciosas, especialmente as causadas por microorganismos Gram-positivos, em animais. 0 animal pode ou ser susceptível a, ou ser infectado com, o microorganismo. 0 médico compreende a adI ministração ao animal de uma quantidade de um antibiótico

A82846 que seja eficaz para esta finalidade. Em geral, uma quantidade eficaz do antibiótico A82846 é uma dose que varia entrecerca de 0,5 a cerca de 100 mg/kg. Uma dose preferida varia entre cerca de 1 e cerca de 60 mg/kg de composto activo. Uma dose diária típica para um ser humano adulto vaI ria entre cerca de 50 mg e cerca de 1,0 g.

Ao realizar este método, o antibiótico pode ser administrado numa dose diária ou em doses múltiplas por dia. O regime de tratamento pode requerer uma administração durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, durante vários dias ou de uma a seis semanas. A quantidade por dose administrada ou ou a quantidade total administrada dependerá de factores tais como a natureza e a gravidade da infecção, da idade e do estado geral de saúde do doente, da tolerância do doente em relação ao antibiótico e do microorganismo ou microorganismos envolvidos na in| fecção.

Um método conveniente para realizar o método de tratamento consiste em administrar o antibiótico pela via de infusão IV. Neste processo uma formulação esI téril de um sal solúvel apropriado do antibiótico é incorporada num fluído fisiológico, tal como solução de dextrose a 5%, e a solução resultante é administrada por infusão IV lentamente. Alternativamente, pode também ser utilizado o método de infusão IV piggy-back.

Noutras apresentações, este invento relaciona-se com 1) método para aumentar a eficácia da utitilização de rações em animais tais como aves domésticas,

porcos e gado vacum, 2) métodos para promover o crescimento em animais tais como criação, porcos, carneiros e gado vacum para a produção de carne e 3) métodos para aumentar a produção de leite nos ruminantes em período de lactação. Para aumentar a eficácia da utilização das rações e promover o crescimento, administra-se um antibiótico A82846 oralmente numa ração apropriada numa quantidade que varia entre cerca de 2 e cerca de 200 gramas por tonelada da totalidade da ração. Para a carne de gado vacum, por exemplo, é apropriada uma variação entre cerca de 12 e 3.000 mg/cabeça/dia. Para aumentar a produção de leite em ruminantes em lactação, é sugerida a administração oral de uma quantidade diária de cerca de 0,04 a cerca de 16 mg/kg do peso corporal (ou cerca de 25 a cerca de.5.000 mg/animal/dia) .

Nestes aspectos, os compostos do invento seriam normalmente vendidos sob a forma de uma pré-mistura de ração animal, compreendendo essa pré-mistura um ou mais veículos agronómicamente aceitáveis para esse fim.

A fim de ilustrar mais completamente a operação deste invento, são fornecidos os exemplos que se seguem:

Exemplo 1

Método de Ensaio CLEP de A82846

Os sistemas CLEP analíticos que seseguem são úteis para os componentes de A82846:

1. Coluna de Resina de Permuta Catiónica

Suporte da Coluna: Zorbax* SCX (4,6 x 150 mm)

Sistema: Gradiente de Eluição A:B (4:1) a A:B (1:9) em 5 min., mantido durante 15 min.

A = MeOH: NaH₂PO₄ 0,1 M (1:9)

B = MeOH: NaH₂PO₄ 0,9 M (1:9)

Caudal : 1,0 ml/min

Detecção : UV a 225 nm

Tempos de Retenção: são dependentes da concentração, mas são aproximadamente:

A82846C = 6,6 min

A82846B = 8,9 min

A82846A = 9,5 min

2. Coluna de Fase Reversa

Suporte da Coluna: Zorbax* ODS (4,6xl50nm)

Sistema: Gradiente de Eluição 1 % (NH₄)H₂PO₄:CHgCN (95:5) a (1:1) em 20 min.

Caudal: 1,0 ml/min

Detecção: UV a 225 nm

Tempos de Retenção: A82846A = 7,3 min

A82846C = 7,6 min

A82846B =8,0 min *

As colunas Zorbax são produtos de E.I. duPont de Nemours &

Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898.

Exemplo 2

Preparação de Antibiótico A82846 Usando Cultura A82846

A. Fermentação em Frasco Agitado de Cultura A82846

A cultura de Nocardia orientalis NRRL

18098, quer sob a forma de pastilha liofilizada quer sob a

I

forma de uma suspensão mantida em azoto líquido, é usada para inocular um meio de sementeira tendo a composição que se segue:

MEIO DE SEMENTEIRA

Ingrediente

Glucose

Amido solúvel

Extracto de levedura

Hidrolisado enzimático de caseina

CaCO₃

Água desionizada

Quantidade (%)

1,0

2,0

0,5

0,5

0,1

q.b. 1 litro

Ajustou-se o pH do meio para cerca de 7,5 com NaOH antes da esterilização.

*NZ Amina A, Sheffield Chemical Co. , Norwich, NY

São preparados planos inclinados ou placas adicionando agar ao meio de sementeira. O plano inclinado semeado é incubado a 302C, de cerca de 10 a cerca de 14 dias. A cultura madura em plano inclinado é raspada com um utensílio estéril para soltar os esporos e remover e macerar o emaranhado micelial. Cerca de um quarto dos esporos soltos e o crescimento da cultura assim obtido são usados para inocular 50 mL de um meio de sementeira de primeiro estádio.

meio inoculado de primeiro estádio é incubado num frasco de Erlenmeyer de 250 mL a 30QC durante cerca de 24-48 horas num agitador fazendo a sua órbita num círculo de duas polegadas (5,08 cm) a 250 rpm.

Este meio incubado de primeiro estádio (0,5 mL) é usado para inocular 50 mL de um meio de produção

tendo a composição que se segue:

Ingrediente	Quantidade	(%)
Glucose	2,5
Farinha de soja	1,5
Dextrina de batata	3,0
CaCOg	0,25
Melaços de cana	0,3
Caseina hidrolisada por	ácido* 0,5
égua desionizada	q.b. para	1 litro

(pH de pré-esterilização ajustado para 7,5 com NaOH) *Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

O meio de produção inoculado é incubado num frasco de Erlenmeyer de boca larga de 250 mL a 30°C durante 4 a 5 dias num agitador tendo como órbita um círculo com duas polegadas a 250 rpm.

B. Tanque de Fermentação da Cultura A82846

A fim de proporcionar um maior volume de inoculo, 10 mL de meio incubado do primeiro estádio, preparado tal como foi descrito na Secção A, são usados para inocular 400 mL de um meio de crescimento do segundo estádio tendo a mesma composição que o meio do primeiro estádio. Este meio vegetativo do segundo estádio é incubado num frasco de Erlenmeyer de boca larga de 2 L durante cerca de 48 horas a 30°C. num agitador tendo uma órbita de duas polegadas a 250 rpm.

O meio vegetativo de segundo estádio incubado (1.000 mL) assim preparado é usado para inocular 100 litros de meio de produção estéril, preparado tal como foi descrito na Secção A exceptuando o facto de se adicionar um agente anti-espuma P-2.000 (0,3 g/L). Deixa-se o meio de

produção inoculado fermentar num tanque de fermentação agitado com 165 L durante 90 a 100 horas à temperatura de 30°C. A corrente do ar no recipiente agitado (80 RPM) é ajustada para se manter um nível de oxigénio dissolvido acima de 50% de saturação do ar.

C. Fermentação em Tanque Alternativa da Cultura A82846

È seguido o processo da Secção B exceptuando o facto de se usar uma quantidade apropriada de meio vegetativo para inocular aproximadamente 1.200 galões de produção num tanque de fermentação de 1.600 galões (4.536 L).

Exemplo 3

Preparação de Antibiótico A82846

Usando Cultura A82846.1

A cultura de Nocardia orientalis NRRL

18099, quer sob a forma de uma pastilha liofilizada quer sob a forma de uma suspensão mantida em azoto líquido, é cultivada usando o processo descrito no Exemplo 2, exceptuan do o facto do meio de produção ter a composição que se segue:

Ingrediente

Glucose

Dextrina de batata *

Peptona

CaCO₃

Molassos de Cana

Água desionizada

Sem ajustamento do pH *Bacto-peptona (Difco

Quantidade (%)

1,0

2,0

1,0

0,2

2,0

q.b. para 1 litro

Laboratories).

Exemplo 4

Preparação de Antibiótico A82846

Usando Cultura A82846.2

A cultura de Nocardia orientalis

NRRL 18100, quer sob a forma de uma pastilha liofilizada quer sob a forma de uma suspensão mantida em azoto líquido, é cultivada usando o processo descrito no Exemplo 2 exceptuando o facto da caseina hidrolisada por ácido usada ser a Amicase (Sheffield Chemical Co.).

Exemplo 5

Preparação de A82846 Bruto

O Caldo de fermentação (4.200 L) a partir de um fermentador de 1.600 galões, preparado tal como foi descrito no Exemplo 2, Secção C, foi ajustado para um pH de 10,5 com NaOH 5N, e foi adicionada Celite 545 a 3% (auxiliar de filtração). A mistura foi filtrada através de uma prensa de filtração, e a prensa foi lavada com água. 0 filtrado e o produto de lavagem combinados (4.200 L) foram ajustados para um pH 7 com HC1 5N (ou f^SO^) e aplicados a uma coluna de resina Dowex-XFS-43278 (NH^+) (200 L filtrado/10 L resina). A coluna foi eluida com um fluxo de 750 mL/ /min. As fracções foram ensaiadas ou por bioensaio usando ) Bacillus subtilis ou por CLEP.

A coluna foi lavada com 5 volumes da coluna de água, recolhendo-se partes aliquotas de 100 L.

O material activo foi eluido a partir da resina com 5 volumes da coluna de NH^OH 0,05N, recolhendo-se fracções de 25 L. Fracções contendo A82846 foram combi-50-

nadas e concentradas in vacuo até um volume de cerca de 30 L. Esta solução foi aplicada a uma coluna de 10 L de resina HP-20 Diaion em água. A coluna foi lavada com 3 volumes da coluna de água num fluxo de 300 mL/min. O lavado com água foi eliminado. O material activo foi eluido a partir da coluna com uma solução de E^O: iPrOH (95:5) contendo 1,0% de ácido acético num ritmo de lOOmL/min, recolhendo-se fracções de 4 L e fazendo-se um teste por bio-ensaio e CLEP. As fracções contendo A82846 (# 6-14) foram combinadas, concentradas in vacuo e secas por congelação para proporcionar 356 g de A82846 crú.

Exemplo 6

Isolamento de A82846A e de A82846B

A. Separação de A82846A e A82846B Enriquecidos

A82846 (30 g), preparado tal como foi descrito no Exemplo 5, foi dissolvido em água (500 mL) e aplicado a uma coluna pressurizada de aço inoxidável com 30 L de gel de sílica LP-l/C^g equilibrada em ΝΗ^^ΡΟ^ a 1%. A colunafoi desenvolvida usando um gradiente de NH^E^PO^ a 1% (60 L) para água:acetonitrilo (88:12) contendo NH^E^PO^ a 1% (60 L) num fluxo de 250-300 mL/min (pressão max de 600 psi -libras por polegada quadrada), recolhendo-se fracções de 4 L e monitorizando-se a eluição usando um detector UV a 254 nm. As fracções individuais foram ensaiadas por CLEP analítica. As fracções ricas em A82846A (# 6-9) e as fracções ricas em A82846B (^10-17) foram cada uma delas combinada e concentrada in vacuo.

Β. Purificação de A82846A

Concentrados ricos em A82846A a partir de trajectos de 30 g realizados tal como foi descrito no Sect. A foram dessalinizados sobre uma coluna de 1750 mL de Diaion HP-20 SS, fazendo-se a lavagem com água, fazendo-se a eluição com F^OiiPrOH (95:5) contendo ácido acético a 0,5% e fazendo-se o ensaio por meio de CLEP analítico. As fracções contendo A82846A foram combinadas, concentradas e secas por congelação para proporcionar 7,4 g de preparação enriquecida de A82846A.

A preparação enriquecida de A82846A (7,2 g) foi dissolvida em água e aplicada a uma coluna para CLEP de gel de sílica LP-l/C^g em (NH^HgPO^ a 1%. A coluna foi desenvolvida com um gradiente de (NH^Jt^PO^ a 1% para (ΝΗ₄)Η₂ΡΟ₄ a 1%:acetonitrilo (9:1), monitorizando-se a eluição por CLEP analítico a 254 nm e fazendo-se a eluição com um fluxo de 48 mL/min. Após terem sido eluidos os primeiros 10 L, foram recolhidos fracções de 500 mL.

As fracções contendo A82846A ( 4-10) e as fracções contendo A82846B (#^12-20) foram combinadas e concentradas cada uma delas in vacuo. Os concentrados de A82846A a partir de 3 trajectórias foram combinados e aplicados a uma coluna de 1750 mL de Diaion HP-20 SS para dessalinizar a solução. A coluna foi lavada com água, sendo A82846A eluido com H₂O:iPrOH (95:5) contendo ácido acético a 0,5%. A eluição foi monitorizada por CLEP. As fracções contendo A82846A foram combinadas, concentradas e secas por congelação para proporcionar 7,9 g de A82846A purificado.

O espectro IV de A82846A em disco de KBr é indicado na Figura 1; O FAB-MS de A82846A em tioglicerol é indicado na Figura 4; e o espectro RMN de clorohidreto de A82846A em (sulfóxido de metilo)-άθ num espectrómetro Bru-52-

ker AM500 (HDO suprimido) a 602C é indicado na Figura 7.

C. Purificação de A82846B

Fracções enriquecidas de A82846B a

I partir de 3 trajectos de CLEP preparativa que separaram

A82846A e A82846B, obtidas tal como foi descrito na Secção B, foram combinadas e dessalinizadas numa coluna de 1750 mL de Diaion HP-20 SS, lavando com água e fazendo a eluição com F^OiiPrOH (95:5) contendo 0,5% de ácido acético. A eluição foi monitorizada por CLEP e as fracções de A82846B foram ) combinadas, concentradas in vacuo e secas por congelação para proporcionar 8,8 g de A82846B purificado.

O espectro IV de A82846B em disco de

KBr é indicado na Figura 2; o FAB-MS de A82846B em tioglicerol é indicado em Figura 5; e o espectro RMN de acetato de A82846B em (sulfóxido de metilo-dg num espectrometro Bruker AM500 a 60QC é indicado na Figura 8.

D. Dessalinização

A dessalinização pode também ser rea| lizada usando resina Diaion HP-20 fazendo-se a eluição com

MeOH:H2O (4:1) contendo 0,1% de ácido acético.

Exemplo 7

Isolamento de A82846C

A. Separação de A82846

O caldo de fermentação (461 L), obtido a partir de quatro fermentações de 165 L realizadas tal como foi descrito no Exemplo 2, Secção B, foi ajustado para um pH

I

de 10,5 com NaOH 5N e filtrado com um auxiliar de filtro Hyflo Supercel a 3%. O filtrado (430 L) foi ajustado para um pH de 7 com HC1 5N e aplicado a uma coluna contendo 10 L de resina Dowex-XFS-43278 (NH^⁺). A coluna foi lavada com 50 L de água, e o material activo foi eluido com NH^OH 0,05N ) (50 L), recolhendo-se fracções de 4 L. A eluição foi monitorizada por bioensaio. As fracções activas (& 1-7) foram combinadas, concentradas in vacuo até um volume de cerca de 1.700 mL e secas por congelação para proporcionar 283,9 g de A82846 crú.

I B. Separação de A82846A, B e C

A82846 bruto (2 g), obtido tal como foi descrito na Secção A, foi dissolvido em água e aplicado a uma coluna para CLEP preparativa de aço inoxidável 2 x 45 contendo 2.110 mL resina LP-l/C^g de gel de sílica em (NH₄)H₂PO₄ a 1%. A coluna foi desenvolvida usando um gradiente de (NH₄)H₂PO₄ a 1% a (NH₄)H₂PO₄ a 1%:acetonitrilo (92:8) com um fluxo de 70 mL/min. recolhendo-se fracções de 400 mL e fazendo-se a monitorização por UV a 254 nm.

As fracções contendo A82846A ( 11-14)

I foram combinadas como grupo 1; as fracções contendo A82846C (#16-20) foram combinadas como grupo 2; e as fracções contendo A82846B (#21-25) foram combinadas como grupo 3.

C. Purificação de A82846C

O grupo 2 foi concentrado até um volume de cerca de 200 mL e foi aplicado a uma coluna de vidro com 7- x 45-cm contendo 1.800 mL de resina Diaion HP-20 para dessalinização. O material activo foi eluido com MeOH:H₂O (4:1) contendo ácido acético a 0,1%, recolhendo-se fracções de 1 L com um fluxo de 25 mL/min. As fracções contendo C (#9-12) foram agrupadas, concentradas in vacuo e secas por

congelação para dar origem a 662,2 mg de A82846C semi-purificado .

A82846C semi-purificado (500 mg) foi depois purificado repetindo os passos de CLEP de fase reI versa, usando uma coluna de aço com 1 x 48 contendo 450 mL de gel de sílica LP-l/C^g, um gradiente de (NH^E^PO^ a 1% a (NH^f^PO^ a l%:acetonitrilo (92:8), um fluxo de 11 mL/min, recolhendo-se fracções de 25 mL e monitorizando-se a 254 nm. As fracções contendo A82846C (-^169-210) foram agrupadas e dessalinizadas numa coluna de vidro com 5- x 45-cm contendo I resina HP-20 . A coluna foi eluida com MeOHzf^O (4:1) contendo ácido acético a 0,1%, recolhendo-se fracções de 100 mL e seguindo-se a eluição por CLEP analítica com UV a 225 nm. As fracções contendo A82846C (^£5-11) foram combinadas, concentradas in vacuo e secas por congelação para proporcionar 127,3 mg de A82846C.

O grupo L contendo A82846A e o grupo 3 contendo A82846B foram purificados do mesmo modo que foi descrito para A82846C para se obter A82846A e A82846B purificados adicionais.

I ^D· Purificação Posterior de A82846C

A82846C (70 mg) foi purificado posteriormente usando o seguinte processo cromatográfico preparativo :

) Coluna: Zorbax SCX (9,2 x 250 mm) de permuta catiónica

Fase móvel: Um gradiente linear começando a partir de tampão Naf^PO^ O,15M contendo MeOH a 10% a tampão NaE^PO^ 0,9M contendo MeOH a 10% em 6 min. e mantendo 5 min. (sem ajustamento feito ao tampão).

Caudal: 6,0 mL/min.

Detecção: UV a 280 nm

Carga: 6,0 mg/injecção em ^H2^0,

A82846C foi recolhido por utilização de um colector de fracções automático (Gilson 201C) equipado com um mecanismo de detecção de pico. A fase móvel foi administrada por meio de um sistema CLEP de Gradiente M600 Millipore Waters, e a solução para amostra foi injectada } por meio de um auto verificador de amostras Hitachi.

As fracções contendo A82846C foram combinadas, concentradas até um volume de 30 mL e aplicadas a uma coluna HP-20 (50 mL). A coluna foi lavada com H^O e eluida com H₂0:isopropanol (95:5) contendo HOAc a 0,5%, reco) lhendo-se fracções de 25 mL. As fracções contendo A82846C (#9-14) foram combinadas, concentradas e liõfilizadas para proporcionar 37 mg de A82846C purificado.

espectro IV de A82846C em disco de KBr é indicado na Figura 3; o FAB-MS de A82846C em tioglicerol é indicado na Figura 6; e o espectro RMN de acetato de A82846C em (sulfóxido de metilo-dg num espectrómetro Bruker AM500 (HDO suprimido) a 60QC é indicado na Figura 9.

Exemplo 8

Preparação de Sais de A82846

Processo:

) Em cada caso, o componente A82846 (100 mg) foi dissolvido em água desionizada (10 mL). O pH desta solução foi ajustado para um pH de cerca de 3, usando ácido 0,5N (HC1, H₂SO₄ e HgPO₄). A solução foi liofilizada para dar origem à forma de sal apropriada. É importante notar que se se baixar o pH demasiadamente abaixo de pH 3 (isto é pH 2), o componente é degradado. Foram obtidos os seguintes rendimentos :

	Produção (mg)
Sal	A82846A	A82846B
HC1	93,8	88,1
H2S°4	92,5	75,4
H3PO4	110,8	105,7

Exemplo 9

Formulação do Comprimido de A82846A

Os comprimidos contendo A82846A podem ser preparados usando os seguintes ingredientes e quantidades :

Ingrediente	Peso
Fosfato de A82846A	282,9 mg
Celulose microcristalina	101,1 mg
Croscarmellose de sódio	12,0 mg
Providona 12,0 mg
Estearato de magnésio	3,0 mg
Ácido esteárico 4,o	mg
Água purificada	0,16 ml

Adiciona-se fosfatode A82846A, uma porção de celulose microcristalina e uma porção de croscarmellose de sódio num recipiente apropriado fazendo-se a mistura até à homogeeidade. Prepara-se uma solução de Povidona em água, e adieiona-se a solução de Povidona aos pós misturados. Granula-se a mistura resultante, calibra-se se necessário e seca-se. Adiciona-se a celulose microcristalina e a croscarmellose de sódio restantes à mistura seca e mistura-se. Adiciona-se estearato de magnésio e ácido esteárico, e mistura-se a mistura. Prensa-se a mistura em pó resultante em comprimidos.

7-

Exemplo 10

Formulação da Cápsula de A82846B

Podem ser preparadas cápsulas contendo

A82846B usando os seguintes ingredientes e quantidades:

Ingrediente	Peso
Cloroidrato de A82846B	262,2 mg
Pó fluente de amido de milho	137,7 mg
Silicone fluido 350 centiestoques	2,7 mg
Amido de milho	147,1 mg

Mistura-se clorohidreto de A82846B, pó fluente de amido, silicone fluido 350 centiestoques e pó de amido num misturador apropriado até à homogeneidade. Introduz-se em cápsulas de gelatina duras de tamanho apropriado.

Exemplo 11

Formulação da Suspensão de A82846A

Prepara-se uma forma de A82846A insolú-

vel estéril por cristalização ou por precipitação. Moe-se ou filtra-se para se obter um tamanho de partícula apropria-
do para suspensão. segue:	Suspende-se ο A82846A no veículo que se
Ingrediente	Quantidade
Lecitina	262,2 mg
Citrato de sódio	137,7 mg
Propilparabeno	2,7 mg
água para Injecção	q.b. para o volume desejadc

A suspensão pode ser produzida já junta e introduzida nos recipientes ou pode ser preparada extemporaneamente adicionando o veículo ao A82846A no frasco.

Claims (3)

1. li. - Processo para a produção de antibióticos A82846, A82846A, A82846B ou A82846C, caracterizado por compreender a cultura de estirpes NRRL 18098, NRRL ) 18099 ou NRRL 18100 de Nocardia orientalis ou uma sua progénie produtora de A82846, num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos sob condições de fermentação aeróbica submersa, seguida facultativamente por separação do antibiótico a partir do meio de fermentação e/ou salificação do antibiótico se não se apresen) tar sob a forma de sal.
2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar A82846A ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
3. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar A82846B, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável.

   -594ã. - Cultura purificada biologicamente, caracterizado por ser seleccionada a partir de estirpes NRRL 18098, NRRL 18099 e NRRL 19100 ou de uma sua progénie produtora de A82846.