DE3782720T2

DE3782720T2 - Glykopeptid-antibiotika.

Info

Publication number: DE3782720T2
Application number: DE8787308219T
Authority: DE
Inventors: Robert L Hamill; James Albert Mabe; David Francis Mahoney; Walter Mitsuo Nakatsukasa; Raymond Che-Fong Yao
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2007-09-18
Also published as: DE3782720D1; AU608534B2; JPH09182581A; HK44393A; GR3006311T3; EP0265071A1; FI90993B; KR960013093B1; FI874082A; IE872529L; PT85742A; DK489787A; NZ221856A; CN87106483A; ZA877003B; IE60132B1; JP2634174B2; DK489787D0; JP2806912B2; HUT46365A

Description

Die Erfindung betrifft neue Glycopeptidantibiotika der Vancomycingruppe. Sie betrifft speziell Antibiotikum A82846, dessen einzelne Komponenten A82846A, A82846B und A82846C und dessen Herstellung durch Kultivierung neuer Mikroorganismenstämme.
Obwohl viele nützliche Antibiotika heute erhältlich sind, bleibt der Bedarf, verbesserte Antibiotika für die Humanmedizin zu finden, weiter bestehen. Vancomycin ist zum Beispiel ein kommerziell erfolgreiches Antibiotikum, das viele Leben gerettet hat. Trotzdem kann Vancomycin auch Probleme verursachen, wie Ototoxizität und Nephrotoxizität. Daher sind Antibiotika gefragt, die eine zu Vancomycin ähnliche Aktivität besitzen, aber verbesserte Pharmakokinetiken oder weniger Nebenwirkungen aufweisen.
Gemäß der Erfindung wurde jetzt erkannt, daß sehr wertvolle Glycopeptidantibiotika durch eine submerse, aerobe Fermentation von Nocardia orientalis NRRL 18098, NRRL 18099 oder NRRL 18100 in einem Kulturmedium hergestellt werden können, das assimilierbare Quellen an Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält. Diese Glycopeptidantibiotika werden als A82846 und Komponenten hiervon bezeichnet.
Das Antibiotikum A82846 ist strukturell zu Vancomycin ähnlich, aber hat verbesserte in vitro und in vivo Aktivität gegen Grampositive Bakterien und verbesserte Pharmakokinetiken, die durch eine viel längere Halbwertszeit als die von Vancomycin führen.
Die A82846 Komponenten haben im wesentlichen die folgenden physikalischen und spektralen Eigenschaften:

Eigenschaften von A82846A

Molekulargewicht: 1556
Empirische Formel: C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub9;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl
FAB-MS (Thioglycerin): (M+1) gefunden: 1557,5803;
berechnet: C&sub7;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl = 1557,5716 (siehe Figur 4);
UV (H&sub2;O)λmax: 281 nm (&epsi; 5,052), verschiebt sich auf 300 nm im Alkalischen;
IR (KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 und 1015 cm&supmin;¹ (siehe Figur 1);
NMR [(CD&sub3;)&sub2;SO] : siehe Figur 7;
pKa (H&sub2;O) : 4,7, 9,5
(66 % DMF): 5,5; 6,8; 7,9; 9,4; 12,3
(wahrscheinliches Molekulargewicht 1542)

Eigenschaften von A82846B

Molekulargewicht: 1590
Empirische Formal: C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub8;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl&sub2;
FAB-MS (Thioglycerin): (M+1) gefunden: 1591,5315;
berechnet: C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub9;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl&sub2; = 1591,5327 (siehe Figur 5);
UV (H&sub2;O) λmax: 280 nm (&epsi; 5,192), verschiebt sich auf 300 nm im Alkalischen;
IR (KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023 und 1018 cm&supmin;¹ (siehe Figur 2);
NMR [(CD&sub3;)&sub2;SO]: siehe Figur 8
pKa (H&sub2;O): 4,65; 9,5

Eigenschaften von A82846C

Molekulargewicht: 1522
Empirische Formel: C&sub7;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;
FAB-MS (Thioglycerin): (M+Na) gefunden: 1545,5998;
berechnet: C&sub7;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Na = 1545,5925 (siehe Figur 6);
UV (H&sub2;O) λmax: 280 nm (&epsi; 5,198), verschiebt sich auf 300 nm im Alkalischen;
IR (KBr) : 3600T3004 (breit) , 2999, 2991, 2950, 1687T1650 (breit), 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 und 1014 cm&supmin;¹ (siehe Figur 3);
NMR [(CD&sub3;)&sub2;SO]: siehe Figur 9
pKa (H&sub2;O) : 4,6; 9,4;
Die Aminosäureanalysen von A82846A, A82846B und A82846C zeigen nach Hydrolyse mit 6 N HCl das Vorkommen von Asparaginsäure und zwei breite Peaks mit einer Spur Glycin. Die zwei Peaks scheinen zu actinoidinischen und vancomycinischen Aminosäuren zu gehören, die beide in Glycopeptidantibiotika der Vancomycinklasse vorkommen.
Vergleichende NMR Untersuchungen zeigen, daß A82846A, A82846B und A82846C jeweils den neuen Aminozucker 4-epi-Vancosamin (3- Methylacosamin) enthalten:
Die Molekularformel von A82846A entspricht der von Vancomycin (C&sub6;&sub6;H&sub7;&sub5;N&sub9;O&sub2;&sub4;Cl&sub2;) minus einem Chloratom plus den Elementen eines zusätzlichen Aminozuckers vom Vancosamintyp (C&sub7;H&sub1;&sub4;NO&sub2;).
Die Molekularformel von A82846B entspricht der von A82846A, in der ein Wasserstoffatom durch ein Chloratom ersetzt ist.
Die Molekularformel von A82846C entspricht der von A82846A, in der ein Chloratom durch ein Wasserstoffatom ersetzt ist.
Die A82846 Komponenten scheinen eine neue Glycopeptidfamilie zu bilden, die dem Vancomycinmolekül in allgemeiner Zusammensetzung ähnelt, sich aber hauptsächlich im Chlorgehalt und durch das Vorkommen einer zusätzlichen Untereinheit mit einer Vancosaminzusammensetzung unterscheidet.
Die A82846 Komponenten scheinen die folgenden Strukturformeln zu besitzen:
Die absolute Konfiguration der Zuckergruppen in den A82846 Verbindungen wurde bis jetzt noch nicht bestimmt.
A82846 und dessen einzelne Komponenten A82846A, A82846B und A82846C können unter Bildung verschiedener Salze reagieren. Alle diese Antibiotikaformen sind Teil dieser Erfindung. A82846 Salze sind zum Beispiel für die Abtrennung und Reinigung von A82846 brauchbar. Zusätzlich besitzen die Salze eine bessere Wasserlöslichkeit.
A82846 Salze werden unter Verwendung von Standardverfahren zur Salzbildung hergestellt. A82846 kann zum Beispiel mit einer geeigneten Säure unter Bildung eines Säureadditionssalzes neutralisiert werden.
Die Säureadditionssalze sind besonders brauchbar. Representativ geeignete Salze schließen Salze ein, die durch Standardreaktionen mit organischen und anorganischen Säuren gebildet werden können, wie Schwefel-, Chlorwasserstoff-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Citronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Chol-, Pamoa-, Mucin-, D-Glutamin-, d-Campher-, Glutar-, Glycol-, Phtal-, Wein-, Ameisen-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Picrin-, Benzoe-, Zimt- und ähnliche Säuren.
Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze sind eine besonders bevorzugte Gruppe von Salzen dieser Erfindung.
Das Antibiotikum A82846 kann durch Kultivieren eines A82846 bildenden Stamms von Nocardia orientalis unter submersen aeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium hergestellt werden, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität gebildet ist. Das Antibiotikum kann durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Isolations- und Reinigungsverfahren gewonnen werden.
Diese Erfindung betrifft auch eine biologisch gereinigte Kultur eines Mikroorganismus, der aus Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 18100 oder einer A82846 bildenden Mutante, Variante oder Rekombinante dieser Stämme ausgewählt wird. Diese Organismen sind nützlich, weil sie das Antibiotikum A82846 bilden. Zur Vereinfachung der folgenden Diskussion wird der NRRL 18098 Stamm als Kultur A82846, der NRRL 18099 Stamm als Kultur A82846. 1 und der NRRL 18100 Stamm als Kultur A82846. 2 bezeichnet. Die Kultur A82846 wurde aus einer Bodenprobe von Haiti isoliert. Die Kultur A82846. 1 wurde von Kultur A82846 durch chemische Mutagenese erhalten und die Kultur A82846. 2 ist eine von der Kultur A82846 isolierte natürliche Variante.
Die Kulturen A82846, A82846. 1 und A82846. 2 wurden hinterlegt und so zum Bestandteil der ständigen Kulturensammlung des Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Departement of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604 am 8. August 1986 gemacht. Die Kulturen sind unter der Hinterlegungsnummer NRRL 18098 (der Ausgangsstamm A82846), NRRL 18099 (der mutierte Stamm A82846. 1) und NRRL 18100 (die Stammvariante A82846. 2) frei erhältlich.
Taxonomische Studien der Kulturen A82846, A82846. 1 und A82846. 2 wurden von Frederick P. Mertz von den Lilly Research Laboratories ausgeführt. Auf diesen Untersuchungen basierend werden die neuen Organismen als Nocardia orientalis Stämme klassifiziert (Pittenger und Brigham, 1956), Pridham und Lyons 1969, Typstamm: ATCC 19795 [R.C. Pittenger und R.B.Brigham, "Streptomyces orientalis n. sp., The Source of Vancomycin", Antibiotics and Chemotherapy 6, 642-647 (1956)]. Diese Klassifizierung basiert direkt auf Laborvergleichen und einer Prüfung der veröffentlichten Beschreibungen [Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., R. E. Buchanan and N. E. Gibbons, Autoren, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; M. Goodfellow and K.P. Schaal, "Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus, in Identification Methods for Microbiologists, 2nd ed., F. A. Skinner and D. W. Lovelock, Autoren, Society for Applied Bacteriology Technical Series Nr. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, Seite 261; R.E. Gordon, D.A. Barnett, J.E. Handerhan and C.H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica and the Norcardin Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24 (1), 54-63 (1974); R.E. Gordon, S.K. Mishra and D.A. Barnett, "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69- 78 (1978); S.J. Mishra, R.E. Gordon and D.A. Barnett, "Identification of Nocardiae and Streptomyces of Medical Importance", J. Clin. Microbiol. 11 (6), 728-736 (1980); H. Mordarska and M. Mordarski, Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology 71, 77-86 (1972); und R. Shinobu and M. Kawato, "On Streptomyces aerocolonigenes nov. sp., Forming the Secondary Colonies on the Aerial Mycelia, " Bot. Mag. Tokyo 73, 213-216 (1969)].

Verwendete Verfahren

Die folgenden Verfahren sind vom Internationalen Streptomyces Projekt (ISP) zur Charakterisierung von Streptomycesarten empfohlen [E.B. Shirling and D. Gottlieb, "Methods for Characterisation of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340 (1966) und für die Charakterisierung von Nocardiaarten durch Gordon, Barnett, Handerhan und Pan, siehe obige Literaturhinweise, empfohlen.
Die Morphologie wird unter Verwendung eines Lichtmikroskops untersucht. Ein Rasterelektronenmikroskop (REM) wird zur Untersuchung der Strukturierung der Sporenoberfläche verwendet.
Die Resistenz gegenüber Rifampicin und Lysozym wird durch Verfahren gemessen, die von Gordon empfohlen wurden [R.E. Gordon and D.A. Barnett, "Resistence to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol. 27 (3), 176-178 (1977)].
Die ISCC-NBS Centroid Color Charts, Standardprobe Nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D. C.) und das Color Harmony Manual (4th ed., Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) werden zur Zuordnung von Farbnamen verwendet.
Melanoide Pigmentbildung (Chromogenität) wird mit ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt Medium), ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt Eisenagar) und ISP Nr. 7 (Tyrosinagar) Medien bestimmt.
Die Isomeren der Diaminopimelinsäure (DAP) und die Kohlenhydrate in Hydrolysaten der ganzen Zellen werden durch die chromatographischen Verfahren von Becker et al. [B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon and H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] und von Lechevalier [M.P. Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med. 71, 934- 944 (1968)] bestimmt.
Mycolsäuren werden durch ein Verfahren bestimmt, das auf durch Minnikin beschriebene Techniken beruht [D.E. Minnikin, I.G. Hutchinson and A.B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid Containing Bacteria, J. Chromatography 188, 221-233 (1980)].
Phosphatase und Urease werden durch Verfahren bestimmt, die von Blazevic (D.J. Blazevic and G.M. Ederer, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, Seite 136) beschrieben wurden. Gelatineverflüssigung wird zur Bestimmung der Proteaseaktivität verwendet.
Die Resistenz gegenüber Antibiotika wird durch Auflegen von Antibiotika Empfindlichkeitsplättchen auf die Oberfläche der beimpften ISP Nr. 2 Agarplatten bestimmt.
Stärkehydrolyse wird durch Testen auf das Vorkommen von Stärke mit Iod auf ISP Nr. 4 Agarplatten (anorganische Salze-Stärke) (Siehe Blazevic und Ederer, obige Literaturstelle) bestimmt.
Hippurathydrolyse wird unter Verwendung von Bacto Differenzierungsplättchen gemessen, die schnell die Hydrolyse von Hippurat anzeigen.

Kulturmerkmale

Die Kulturen A82846 und A82846. 2 wachsen auf allen verwendeten Vollmedien und definierten Medien gut. Diese Kulturen bilden auf den meisten Medien Luftmycelien. Die Farbe der Luftmycelsporen ist in Abhängigkeit vom Medium weiß oder grau. Ein kennzeichnendes, braunes, lösliches Pigment wird auf vielen Medien gebildet und die Unterseite ist braun bis gelblich weiß.
Die Kultur A82846. 1 ist ebenfalls auf allen Medien grau, aber ihr Wachstum ist nicht so reichlich, wie das des Ursprungsstamms. A82846. 1 bildet nur selten Luftmycelien. Wenn diese vorhanden sind, ist ihre Farbe weiß. Ein gelegentliches, nicht-kennzeichnendes, hellbraunes, lösliches Pigment wird auf wenigen Medien gebildet und die Unterseite ist braun bis gelblich weiß.
Die Kulturmerkmale der Kulturen A82846, A82846. 1 und A82846. 2 sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Kulturen A82846 und A82846. 2 sind sehr ähnlich und unterscheiden sich nur in wenigen Kultureigenschaften. Wegen ihrer Ähnlichkeit und da A82846. 2 eine natürliche Variante von A82846 ist, werden keine weiteren Vergleiche angestellt. Tabelle I: Kulturmerkmale von A82846, A82846. 1 und A82846. 2 auf verschieden Agarmedien a,b Agarmedium Czapek's reichlich mittelgrau dunkelbraunes Pigment -keine pH-Veränderung gut weiß keines tief hellgrau hellbraun (Oberfläche schält sich) gering Spuren hellbraunes Pigment rötlich-orange Agarmedium Glucose Asparagin Glucose Hefe Extrakt Nährstoff Agar Tomatenmark Haferflocken Leitungswasser Agar Calciummalat gut (nur Flecken) beträchtlich weiß keines reichlich (Oberfläche schält sich) schwarzrot tief rotbraun hellbraun hellgrau dunkel rotbraun (keine Hydrolyse) Spuren (wellige, feuchte Oberfläche) austernweiß (Hydrolyse) gering aG = Wachstum; R = Unterseite; Am = Luftmycel; Sp = lösliches Pigment bInkubiert bei 30ºC für 21 Tage

Morphologische Merkmale

Die Kulturen A82846, A82846. 1 und A82846. 2 bilden ein ausgedehntes Substratmycel. Die Lufthyphen bilden lange Konidienketten mit einem spinnwebenartigen Aussehen, das als klassifizierendes Merkmal für Nichtstreptomyceten in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, siehe obige Literaturstelle, aufgeführt ist.
In allen Kulturen ist die Strukturierung der Sprorenoberfläche glatt und die Sporenform zylindrisch. Die Sporengröße liegt im Bereich von 1,2-1,3 x 0,4-0,5 um für A82846 und 1,4-2,2 x 0,3-0,4 um für A82846. 1.
Bei Wachstum unter submersen geschüttelten Bedingungen zeigt A82846 minimale Fragmentierung, A82846. 1 fragmentiert sehr stark und A82846. 2 zeigt eine mittelmäßige Fragmentierung.

Physiologische Merkmale

Die Kulturen A82846 und A82846. 1 bilden jeweils Säuren aus: Arabinose, Cellobiose, Dextran, Fructose, Galactose, Glucose, α- Methyl-D-Glucose, Glycerin, Inosit, Lactose, Maltose, Mannit, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Ribose, Saccharose, Trehalose und Xylose, aber bilden keine Säuren aus Adonit, Cellulose, Dulcit, Erythrit, Inulin, Sorbit und Xylit. A82846 bildet auch Säuren aus Ethanol, Glycogen, Melezitose, Raffinose und Salicin, aber A82846. 1 nicht. Beide Kulturen verwenden Acetat, Citrat, Lactat, Malat, Oxalat, Propionat, Pyruvat und Succinat, aber verwenden kein Benzoat, Mucat und Tartrat. Die Kultur A82846. 1 verwendet Butyrat, aber A82846 nicht.
A82846 und A82846. 1 bauen Casein, Hypoxanthin, Tyrosin, Harnstoff und DNA ab, aber nicht Adenin, Calciummalat oder Xanthin. Beide Kulturen hydrolysieren Stärke, aber nicht Äsculin oder Hippurat, reduzieren Nitrat, verflüssigen Gelatine, überleben bei 50ºC für 8 Stunden und bilden Katalase, H&sub2;S und Phosphatase.
Die Kulturen A82846 und A82846. 1 haben identische Antibiotikum Resistenzmuster. Sie sind resistent gegen Bacitracin (10 Einheiten), Cephalotin (30 ug), Gentamicin (10 ug), Lincomycin (2 ug), Oleandomycin (15 ug), Penicillin G (10 Einheiten), Streptomycin (10 ug), Vancomycin (30 ug), Tobramycin (10 ug), Erythromycin (15 ug), Nalidixinsäure (30 ug), Polymyxin (300 Einheiten), Trimethoprim (5 ug) und Sulfadiazin (300 ug) und sind sensitiv gegenüber Neomycin (30 ug), Rifampicin (5 ug), Tetracyclin (30 ug), Chloramphenicol (30 ug), Novobiocin (30 ug) und Mandelamin (3 ug).
A82846 und A82846. 1 färben jeweils grampositiv, aber nicht säurefest. A82846 bildet melanoide Pigmente, während A82846. 1 dies nicht tut.

Zellwandanalyse

Hydrolysate ganzer Zellen von A82846 enthalten das meso Isomer der Diaminopimelinsäure und die Zucker Arabinose und Galactose. Die Kulturen haben eine Zellwand vom Typ IV nach Becker et al., siehe obige Literaturstelle. Das Zuckermuster ist vom Typ A (Lechevalier, siehe obige Literaturstelle). Die Kulturen bilden keine Mycolsäuren (LCN-A).

Identität von Stamm A82846

Die chemotaxonomischen und allgemeinen Kulturmerkmale von Stamm A82846 stehen im Einklang mit dessen Zugehörigkeit zur Gattung Nocardia Trevisan 1889 [ Autoren V.B.D. Skerman, V. McGowan und P. H. A. Sneath, "Approved Lists of Bacterial Names", Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 225-420 (1980)].
Die Ähnlichkeitskoeffizienten werden aus den Eigenschaften der vierzehn von Gordon, Mishra und Barnett, siehe obige Literaturstelle, veröffentlichten Nocardia Arten und fünf Stämmen der Lilly Kulturensammlung errechnet. Der Koeffizient von Jaccard [siehe P. H. A. Sneath, "The Application of Computers to Taxonomy", J. Gen. Microbiol. 17, 201 (1957)] und der einfache Übereinstimmungskoeffizient [siehe R.R. Sokal and C.D. Michener, "A Statistical Method for Evaluating Systematic Relationships", Kan. Univ. Sci. Bull. 38, 1409 (1958)] werden verwendet. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II: Ähnlichkeitskoeffizienten für A82846 und 19 andere Nocardia Arten Kultur Ähnlichkeitskoeffizient N. aerocolonigenes N. orientalis N. madurae N. hirsuta N. autotrophica N. dassonvillei N. amarae N. brasiliensis N. vaccinci N. transvalensis N. caviae N. pelletieri N. asteroides N. carnea *Die Nummern in Klammern bezeichnen Stämme der Lilly Kulturensammlung
Da N. madurae zur Gattung Actinomadura gerechnet wird, wird er von der Betrachtung ausgeschlossen. Zwei Arten, N. aerocolonigenes und N. orientalis, haben gute Ähnlichkeitskoeffizienten. Laborvergleiche zwischen A82846 und diesen zwei Arten wurden angestellt. Tabelle III enthält die Ergebnisse dieser Vergleiche. Tabelle III Vergleich der Eigenschaften von A82846, N. orientalis und N. aerocolonigenes Eigenschaften Kultura N. orientalis N. aerocolonigenes Bildet Lufthyphen Lufthyphenfarbe weiß Bildet Konidien Sporenoberfläche glatt Sporenform zylindrisch Bildet lösliches Pigment Gram + Säurefest Zeigt Fragmentierung Bildet Katalase Hydrolysiert: Äsculin Hippurat Stärke Ca-Malat Reduziert Nitrat Baut ab: Adenin Casein Hypoxanthin Tyrosin Harnstoff Xanthin Verflüssigt Gelatine Bildet Phosphatase Überlebt bei 50ºC 8h Bildet Säuren aus: Adonit Arabinose Cellubiose Erythrit Glucose α-Me-Glucosid Glycerin Fortsetzung Tabelle III: Eigenschaften Kultura N. orientalis N. aerocolonigenes Inosit Lactose Maltose Mannit Mannose Melezitose Melibiose Raffinose Rhamnose Sorbit Trehalose Xylose Kontrolle Verwendet: Benzoat Citrat Mucat Succinat Tartrat Kontrolle Resistenz gegenüber: Bacitracin (10 Einheiten) Cephalothin (30 ug) Gentamicin (10 ug) Lincomycin (2 ug) Neomycin (30 ug) Oleandomycin (15 ug) Penicillin G (10 Einheiten) Rifampicin (5 ug) Streptomycin (10 ug) Tetracyclin (30 ug) Tobramycin (10 ug) Vancomycin (30 ug) Chloramphenicol (30 ug) Erythromycin (15 ug) Fortsetzung Tabelle III: Eigenschaften Kultura N. orientalis N. aerocolonigenes Nalidixinsäure (30 ug) Novobiocin (30 ug) Polymixin B (300 Einheiten) Trimethoprim (5 ug) a + = Stamm hat die Eigenschaft; - = Stamm hat die Eigenschaft nicht
Die Ähnlichkeitskoeffizienten wurden mit einer größeren Anzahl von Einzelmerkmalen nochmals berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Tabelle IV: Ähnlichkeitskoeffizient für A82846, Nocardia orientalis und Nocardia aerocolonigenes Kultur Ähnlichkeitskoeffizient N. orientalis N. aerocolonigenes
Weder N. orientalis noch N. aerocolonigenes haben Mycolsäuren in ihren Zellwänden. Gordon, siehe obige Literaturstelle, beschreibt drei Schlüsseleigenschaften, die bei der Unterscheidung von N. orientalis von N. aerocolonigenes helfen. Der Vergleich von A82846 mit den Nocardia Arten unter Verwendung von Gordon's Schlüsseleigenschaften ist in Tabelle V gezeigt. Tabelle V: Vergleich der Schlüsseleigenschaften von A82846, Nocardia orientalis und Nocardia aerocolonigenes Eigenschaft Bildet Säure aus Me-α- rythrit Glucosid Resistenz gegenüber Lysozym Kultur N. orientalis N. aerocolonigenes
Obwohl A82846 nicht identisch zu den Schlüsseleigenschaften irgendeines Nocardia Stamms paßt, hat die Kultur bei den Kulturmerkmalen einen stärkeren Bezug zu N. orientalis und einen hohen Ähnlichkeitskoeffizienten mit N. orientalis. Sie ähnelt N. orientalis auch in Bezug auf die Bildung eines Glycopeptidantibiotikums. A82846 wird deshalb als Stamm von Nocardia orientalis (Pittenger and Brigham, 1956) Pridham and Lyons 1969 klassifiziert. Da N. orientalis in den Approved Lists of Bacterial Names, siehe obige Literaturstelle, aufgeführt ist, ist es eine gültig veröffentlichte Art.
Die Kultur A82846. 1 ist eine chemisch hervorgerufene Mutante der A82846 Kultur. Die Merkmale, in denen A82846. 1 sich von A82846 unterscheidet, sind in Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI: Vergleich der Unterschiede zwischen A82846 und A82846. 1 Eigenschaft Fragmentierung Koloniegröße Kolonieoberfläche Lufthyphen Unterseitenfarbe Lösliches Pigment Bildet Säuren aus: Ethanol Glycogen Melezitose minimal hart verbreitet dunkelbraun reichlich weich selten hellbraun Fortsetzung Tabelle VI Eigenschaft Raffinose Salicin Verwendet: α-Me-glucosid Glycogen Melezitose Sorbose Butyrat Melanoide Pigmente
A82846. 1 unterscheidet sich auch von A82846 in der gebildeten Antibiotikummenge. Die anderen auffälligsten Unterschiede zwischen den Stämmen sind, dar A82846. 1 anders als A82846 kein Luftmycel und kein kennzeichnendes lösliches Pigment bildet.
Die Kultur A82846. 2 ist eine natürliche Variante der Kultur A82846. Daher sind die kennzeichnenden Merkmale von A82846. 2 im wesentlichen die selben wie die von A82846. Der Hauptunterschied zwischen A82846 und A82846. 2 ist, daß die A82846. 2 Kultur deutlich größere Mengen an Antibiotikum bildet als die Kultur A82846, wenn sie in einem Schüttelkolben gezogen wird.
Wie es auch bei anderen Organismen der Fall ist, unterliegen die Merkmale der erfindungsgemäßen A82846-bildenden Kulturen, Nocardia orientalis Stämme NRRL 18098, NRRL 18099 und NRRL 18100, der Variation. Daher können Abkömmlinge dieser Stämme, wie Rekombinanten, Mutanten und Varianten durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erhalten werden. Varianten können zum Beispiel durch natürliche Selektion erhalten werden und Mutanten durch Behandlung mit bekannten physikalischen oder chemischen Mutagenen, wie ultraviolettes Licht, Röntgenstrahlung, Gammastrahlung und Chemikalien, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.
Rekombinante Stämme können unter Verwendung im Fachgebiet gut bekannter Verfahren durch Transformation der Nocardia orientalis Stämme entwickelt werden. Durch die Ähnlichkeit zwischen Nocardia und Streptomyces können für Streptomyces entwickelte Transformationstechniken und rekombinante Vektoren auch zur Transformation von Nocardia Stämmen verwendet werden. Durch die Verwendung der Rekombiantionstechnologie können die Nocardia orientalis Stämme so transformiert werden, daß sie zusätzlich zu den Antibiotika, die diese Stämme bilden, eine Reihe an Genprodukten exprimieren. Man kann zum Beispiel die Stämme mit einem rekombinanten Vektor transformieren, der eine Resistenz gegeüber einem Antibiotikum verleiht, gegen das die Stämme normalerweise sensitiv sind. So erhaltene Transformanden werden nicht nur das Antibiotikum A82846 bilden, sondern auch das resistenzverleihende Enzym, das die Selektion der transformierten Zellen von den Wildtypzellen erlaubt. Weiterhin kann man unter Verwendung ähnlicher Techniken die vorliegenden Stämme unter Einführung mehrerer Kopien der endogen antibiotikum-biosynthetisierenden Gene modifizieren, um höhere Antibiotikumausbeuten zu erreichen. Abkömmlinge, wie natürliche und induzierte Varianten, Mutanten und Rekombinanten der Nocardia orientalis Stämme NRRL 18098, NRRL 18099 und NRRL 18100, die das Merkmal der A82846 Bildung erhalten, sind Teil dieser Erfindung.
Das zur Anzucht der Nocardia orientalis Kulturen verwendete Kulturmedium kann eines von vielen Medien sein. Für die ökonomische Produktion, optimale Ausbeute und einfache Produktisolierung sind jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Deswegen sind bevorzugte Kohlenhydratquellen bei Fermentationen in großem Maßstab Glucose und Kartoffeldextrin, obwohl Ribose, Xylose, Fructose, Galactose, Mannose, Mannit, lösliche Stärke und dergleichen auch verwendet werden können.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind enzymhydrolysiertes Casein und Fleischpeptone, obwohl Hefeextrakt, säurehydrolysiertes Casein, Rinderextrakt, Fischmehl, Lebermehl und dergleichen auch verwendet werden können.
Unter den anorganischen Nährsalzen, die in das Kulturmedium gegeben werden können, befinden sich die üblichen löslichen Salze, die Zink, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat, Nitrat und ähnliche Ionen ergeben.
Essentielle Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus notwendig sind, sollten auch im Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in ausreichenden Mengen zur Befriedigung der Wachstumsbedürfnisse des Organismus vorhanden. Falls Schäumen ein Problem darstellt, können geringe Mengen (beispielsweise 0,2 ml/l) Antischaummittel, wie Polypropylenglycol zum Medium der großtechnischen Fermentation gegeben werden.
Zur Produktion bedeutender Mengen der A82846 Antibiotika ist eine submerse, aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen der Antibiotika können in Schüttelkolbenkulturen erhalten werden. Da die Zeitverzögerung bei der Antibiotikumproduktion gewöhnlich mit der Beimpfung von großen Tanks mit der Sporenform des Organismus zusammenhängt, ist die Verwendung eines vegetativen Inoculums bevorzugt. Das vegetative Inoculum wird durch Beimpfung eines kleinen Volumen Kulturmediums mit der Sporenform oder Mycelfragmenten des Organismus hergestellt, wodurch man eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Inoculum wird dann in einen größeren Tank überführt. Das Medium für das vegetative Inoculum kann dasselbe wie das für größere Fermentationen verwendete sein, aber andere Medien sind ebenfalls geeignet.
Die A82846 Antibiotika werden durch die A82846-bildenden Organismen produziert, wenn diese zwischen etwa 23ºC und etwa 37ºC wachsen. Optimale Temperaturen für die A82846 Produktion scheinen bei 30-31ºC zu liegen.
Wie es bei submersen, aeroben Kuturverfahren üblich ist, wird während das Medium mit herkömmlichen Propellern gerührt wird, vom Boden aus sterile Luft in den Kessel geblasen. Die maximale Sauerstoffaufnahme der Fermentation unter den bisher verwendeten Bindungen lag nicht über etwa 0,2 mM/l/Minute. Im allgemeinen sollten die Belüftungsrate und das Ausmaß des Rührens ausreichen, um die Menge an gelöstem Sauerstoff über 50 % Sättigung zu halten.
Die Bildung der A82846 Antibiotika kann während der Fermentation durch Austesten von Medienproben auf Antibiotikum-Aktivität gegen bekanntermaßen für dieses Antibiotikum sensitive Organismen verfolgt werden. Ein brauchbarer Testorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Der Bioassay wird herkömmlich durch einen Agarplattenlochtest ausgeführt.
Durch Verfolgen ihrer Produktion unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen können die A82846 Antibiotika aus dem Fermentationsmedium durch im Fachgebiet verwendete Techniken gewonnen werden. Die während der Fermentation der A82846 bildenden Organismen produzierte Antibiotikum-Aktivität kommt im Medium und im Mycel vor. Die maximale Ausbeute von A82846 wird dadurch erreicht, daß der pH zur Freisetzung von A82846 aus dem Mycel zuerst auf 10, 5 eingestellt und dann das Medium zur Abtrennung der Brühe von der Mycelmasse filtriert wird.
A82846 kann aus der filtrierten Brühe durch eine Reihe an Techniken gewonnen werden. Eine bevorzugte Technik enthält ein Einstellen der filtrierten Brühe auf pH von etwa 7 und das Adsorbieren des Antibiotikums an ein Kationen-Austauscherharz, wie Dowex XF5-43278, Dowex-50 oder Amberlite IR-120. Das aktive Material wird vom Harz mit einem geeigneten Lösemittel eluiert, wie beispielsweise verdünnte NH&sub4;OH Lösung. Die aktiven Fraktionen werden dann unter Vakuum konzentriert, an ein grobmaschiges Harz adsorbiert, beispielsweise Diainon HP-20 und Amberlite XAD-4, und mit einem geeigneten Lösemittel, wie 1 % Essigsäure enthaltendem Wasser : Isopropanol (95: 5) eluiert, um A82846 zu ergeben. Das aktive Material kann auch mit Wasser : Acetonitril oder Wasser : Methanol Mischungen mit kleinen Säuremengen eluiert werden.
A82846 kann in einzelne Komponenten A82846A, A82846B, und A82846C durch ähnliche Verfahren getrennt werden. Ein bevorzugtes Trennverfahren besteht in einer Umkehrphasen Silicagelchromatographie (C&sub1;&sub8; oder C&sub8;).
Alternativ dazu können die festen Bestandteile des Kulturmediums, wie Medienbestandteile und Mycel ohne Extraktion oder Trennung, aber bevorzugt nach der Entfernung von Wasser, als Quelle für A82846 verwendet werden. Beispielsweise kann nach der Bildung von A82846 die gesamte Fermentationsbrühe getrocknet werden durch Lyophilisation, durch Trommeltrocknung oder durch azeotrope Destillation und Trocknung. Die getrocknete Brühe wird dann direkt in Futtervormischungen gemischt.
Die A82846 Antibiotika haben hervorragende in vitro und in vivo Aktivität gegen Grampositive, pathogene Bakterien. Eine besonders unerwartete Eigenschaft dieser Antibiotika ist ihre lange Serumhalbwertszeit. Wenn es beispielsweise Ratten intravenös verabreicht wird, hat Vancomycin eine Serumhalbwertszeit von 45 Minuten, während A82846A und A82846B jeweils eine Halbwertszeit von 2,2 Stunden aufweisen.
Die minimalen Hemmkonzetrationen (MHK Werte), bei denen die A82846 Antibiotika bestimmte Bakterien hemmen, sind in den Tabellen VII und VIII angegeben. Die MHK Werte in den Tabellen VII und VIII werden durch Standard-Agarverdünnungsassays bestimmt. Tabelle VII: Antibakterielle in vitro Aktivität der A82846 Antibiotika Testorganismus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus Haemophilus influenzae C.L.c Haemophilus influenzae 76d Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa aPenicillin-resistenter Stamm; bMethicillin-resistenter Stamm; cAmpicillin-sensitiver Stamm; dAmpicillin-resistenter Stamm; e- = nicht aktiv bei 128 ug/ml, der höchsten ausgetesteten Menge Tabelle VIII: In vitro Aktivitäten von A82846A, A82846B und Vancomycin Organismus Anzahl der getesteten Stämme Vancomycin Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Fortsetzung Tabelle VIII Organismus Anzahl der getesteten Stämme Vancomycin Streptococcus sp. Gruppe D Streptococcus salivaris Streotococcus sanguis Streotococcus mutans
Ein wichtiger Aspekt der antimikrobiellen Aktivität der A82846 Verbindungen ist ihre Aktivität gegen anaerobe Bakterien. Diese Aktivität ist in Tabelle IX dargestellt, die die Aktivität von A82846A und A82846B gegen verschiedene anaerobe Bakterien, durch Standard-Agarverdünnungsassays bestimmt, zusammenfaßt. Die Endwerte werden nach 24 stündiger Inkubation abgelesen. Tabelle IX: Aktivität von A82846A und B gegen anaerobe Bakterien Anaerobes Bakterium Anzahl der getesteten Stämme Vancomycin Grampositive Stämme: Clostridium difficile Clostridium perfringens Clostridium septicum Eubacterium aerofaciens Peptococcus asaccharolyticus Peptococcus prevoti Peptococcus variabilis Fortsetzung Tabelle IX Anaerobes Bakterium Anzahl der getesteten Stämme Vancomycin Peptococcus constellatus Peptococcus magnus Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus intermedius Propionibacterium acnes Gramnegative Stämme: Bacterioides fragilis Bacterioides thetaiotaomicron Bacterioides melaninogenicus Bacterioides vulgatis Bacterioides corrodens Fusobcterium symbiosum Fusobacterium necrophorum
Die A82846 Antibiotika zeigen auch in vivo antimikrobielle Aktivität gegen experimentell hervorgerufene Infektionen bei Labortieren. Falls zwei Dosen der Testverbindungen den experimentell mit dem Testorganismus infizierten Mäusen verabreicht werden, wird die beobachtete Aktivität als ED&sub5;&sub0; Wert gemessen [effektive Dosis in mg/kg, um 50 % der Testtiere zu schützen: siehe Warren Wick, et al., J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)]. Die für beispielsmäßige Verbindungen beobachteten ED&sub5;&sub0; Werte sind in Tabelle X angegeben. Tabelle X: In vivo Aktivität der A82846 Antibiotika ED&sub5;&sub0; Wert a Verbindung Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Vancomycin amg/kg x 2; Mäusen subkutan verabreichte Dosen 1 und 4 Stunden nach der Infektion
Ein wichtiger Aspekt ihrer antimikrobiellen Aktivität ist, daß die A82846 Antibiotika zur Behandlung von Pyelonephritis brauchbar sind. Beispielsweise gewähren A82846A und A82846B einen effektiveren Schutz bei einer experimentell hervorgerufene Pyelonephritis Infektion bei Ratten. Dieser Test wird unter Verwendung eines Verfahrens ausgeführt, das zu dem in US-A 4 208 403 beschriebenen ähnlich ist. Die beobachteten Resultate sind in Tabelle XI zusammengefaßt. Tabelle XI: Aktivität von A82846A und A82846B im Pyelomyelitistest bei Ratten Verbindung Dosierung (mg/kg x 12) Prozent geheilter Ratten Prozent an Ratten mit einer Titerreduktion um log 4 Vancomycin aDosen zweimal am Tag subkutan für 6 Tage
Die A82846 Antibiotika sind auch bei der Behandlung von Endocarditis brauchbar. Beispielsweise sind A82846A und A82846B genauso effektiv wie Vancomycin bei der Behandlung einer experimentellen, katheter-induzierten Endokarditisinfektion bei Ratten. Bei diesem Test werden die Ratten präpariert, indem man einen Plastikkatheter in die rechte Halsschlagader einführt, diesen herunterführt bis in den rechten Herzventrikel und ihn sicher verankert. Die Tiere läßt man zwei Tage ruhen und dann wird der Testorganismus Streptococcus faecalis X-66 intravenös verabreicht. Der Titer an Organismen ist etwa 5 x 10&sup8; pro ml, und 0, 5 ml werden verabreicht.
Die Verbindungen werden subkutan 15 Minuten vor der Infektion und in 12-Stunden Intervallen für 14 Tage bei einer Gesamtzahl von 28 Behandlungen verabreicht. Zwei Tage nach Beginn der Therapie werden den Tieren die Herzen entfernt, homogenisiert, verdünnt und auf Trypticase-Sojaagar ausplattiert. Die Platten werden vor dem Auszählen für 48 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle XII zusammengefaßt. Tabelle XII: Aktivität von A82846A und B im Ratten-Endokarditistesta Verbindung Dosierungb (mg/kg x 28) % geheilt % mit Rückgang um log 4 Vancomycin aKatheter-induzierte Endokarditis unter Verwendung von Streptococcus faecalis X-66 bSubkutane Dosen in 12-Stunden Intervallen für 14 Tage c % getötete Tiere mit einem Rückgang um log 4
Pharmazeutische Formulierungen der A82846 Antibiotika sind auch Teil der Erfindung. Daher kann das Antibiotikum bevorzugt in der Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zur oralen oder parenteral en Verabreichung zur therapeutischen Oder prophylaktischen Behandlung von bakteriellen Infektionen formuliert werden. Beispielsweise kann die Verbindung mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern und Hilfsstoffen gemischt werden und in Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Wafern und dergelichen verwendet werden.
Die ein A82846 Antibiotikum enthaltenden Zusammensetzungen enthalten etwa 0, 1 bis etwa 90 Gewichtsprozent Wirkstoff, im allgemeinen etwa 10 bis etwa 30 %. Die Zusammensetzungen können übliche Träger und Hilfsstoffe enthalten, wie Maisstärke oder Gelatine, Lactose, Saccharose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannit, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid oder Alginsäure. Zu in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendeten üblichen Zerfallshilfsmitteln gehören Natriumcroscarmellose, mikrokristalline Cellulose, Maisstärke, Natriumglycolatstärke und Alginsäure.
Tablettenbindemittel, die eingearbeitet werden können, sind Acazia, Methylcellulose, Natrium-Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon (Povidon), Hydroxypropyl-Methylcellulose, Saccharose, Stärke und Ethyl cellulose.
Zu verwendbaren Gleitmitteln gehören Magnesiumstearat oder andere Metallstearate, Stearinsäure, flüssige Silicone, Talkum, Wachse, Öle und kolloidales Siliciumdioxid..
Aromastoffe, wie Pfefferminze, Waldmeister, Kirscharoma oder dergleichen können auch verwendet werden.
Es kann wünschenswert sein, einen Farbstoff zum ästhetischeren Aussehen der Dosierungsform oder zur Identifizierungshilfe des Produkts zuzusetzen.
Zur intravenösen Anwendung (iv) kann eine wasserlösliche Form des Antibiotikums in einer der allgemein verwendeten intravenösen Flussigkeiten gelöst werden und durch Infusion verabreicht werden. Solche Flüssigkeiten, wie beispielsweise physiologische Kochsalzlösung, Ringerlösung oder 5 %tige Glucoselösung können verwendet werden.
Für intramuskuläre Zusammensetzungen kann eine sterile Formulierung einer geeignten, löslichen Salzform der Verbindung gelöst werden, beispielsweise das Hydrochlorid, und in einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel verabreicht werden, wie injizierbares Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder 5 %ige Glucoselösung. Eine geeignete, unlösliche Form der Verbindung kann hergestellt werden und als Suspension in einer wässrigen Grundlage oder pharmazeutisch annehmbaren Ölgrundlage verabreicht werden, beispielsweise einem Ester einer langkettigen Fettsäure, wie Ethyloleat.
Zur oralen Verwendung ist eine sterile Formulierung einer geeigneten Salzform des Antibiotikums, beispielsweise das Hydrochlorid, in einem Verdünnungsmittel formuliert, wie destilliertem oder deionisiertem Wasser, besonders brauchbar.
Alternativ dazu kann die Einheits-Dosierungsform des Antibiotikums eine Lösung dessen, bevorzugt in seiner Salzform, in einem geeigneten Verdünnungsmittel in sterilen, hermetisch versiegelten Ampullen sein. Die Konzentration des Antibiotikums in der Einheits-Dosierungsform kann in Abhängigkeit der besonderen Form des Antibiotikums, dessen Löslichkeit und der vom Artzt gewünschten Dosis variieren, beispielsweise von etwa 1 Prozent bis etwa 50 Prozent.
Weiterhin stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Infektionskrankheiten, speziell jene durch Grampositive Mikroorganismen verursachten, bei Tieren bereit. Das Tier muß entweder empfindlich gegen den Organismus oder mit diesem infiziert sein. Dieses Verfahren beruht auf einer Verabreichung einer wirksamen Menge an A82846 Antibiotikum an das Tier. Im allgemeinen liegt eine wirksame Dosis zwischen etwa 0,5 und etwa 100 mg/kg. Eine bevorzugte Dosis beträgt etwa 1 bis etwa 60 mg/kg Wirkstoff. Eine typische Tagesdosis für einen erwachsenen Menschen beträgt etwa 50 mg bis etwa 1,0 g.
Bei Anwendung dieses Verfahrens kann das Antibiotikum in einer einzelnen Tagesdosis oder in mehreren Dosen am Tag verabreicht werden. Die Behandlungsvorschrift kann die Verabreichung über ausgedehnte Zeitspannen erfordern, beispielsweise für mehrere Tage oder für ein bis sechs Wochen. Die Menge pro verabreichter Dosis oder die verabreichte Gesamtmenge hängt von Faktoren ab, wie der Art und der Schwere der Infektion, dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, der Verträglichkeit des Antibiotikums für den Patienten und dem Mikroorganismus oder den Mikroorganismen, die bei der Infektion vorkommen.
Eine einfache Methode, um das Behandlungsverfahren anzuwenden ist das Antibiotikum durch iv Infusion zu verabreichen. Bei diesem Verfahren ist eine sterile Formulierung eines geeigneten Salzes des Antibiotikums in einer physiologischen Flüssigkeit eingearbeitet, wie 5 %ige Glucoselösung, und die entstehende Lösung wird langsam iv infundiert. Alternativ dazu kann auch die sogenannte piggy-back-Methode zur iv Infusion verwendet werden.
In anderen Aspekten betrifft diese Erfindung 1) Verfahren zur Steigerung der Futterverwertungseffizienz bei Tieren, wie Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern, 2) Verfahren zur Förderung des Wachstums bei Tieren, wie zur Fleischproduktion gezogenes Geflügel, Schweine, Schafe und Rinder und 3) Verfahren zur Steigerung der Milchproduktion in milchgebenden Wiederkäuern. Zur Steigerung der Futterverwertungseffizienz und zur Förderung des Wachstums wird ein A82846 Antibiotikum oral in einem geeigneten Futter in einer Menge von etwa 2 bis etwa 200 Gramm pro Tonne (ton) Gesamtfutter verabreicht. Für Rinder ist beispielsweise ein Bereich von etwa 12 bis 3000 mg/Kopf/Tag geeignet. Zur Steigerung der Milchproduktion bei milchgebenden Wiederkäuern wird eine orale Verabreichung einer täglichen Dosis von etwa 0,04 bis etwa 16 mg/kg Körpergewicht (oder etwa 25 bis etwa 5000 mg/Tier/Tag) vorgeschlagen.
Unter diesen Aspekten würden die erfindungsgemäßen Verbindungen normalerweise in der Form einer Tierfuttervormischung verkauft werden, die einen oder mehrere landwirtschaftlich annehmbare Träger dafür enthalten.
Um die Wirksamkeit dieser Erfindung noch mehr darzustellen, dienen die folgenden Beispiele:

Beispiel 1

A82846 HPLC Assayverfahren

Das folgende analytische HPLC Sytem ist für die A82846 Komponenten brauchbar:

1. Kationenaustauscherharz-Säule:

Säulenmaterial: Zorbax* SCX (4,6 x 150 mm)
System: Gradientenelution A : B (4: 1) bis A : B (1: 9) in 5 min, für 15 min konstanthalten
A = MeOH : 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4; (1: 9)
B = MeOH : 0,9 M NaH&sub2;PO&sub4; (1:9)
Flußrate: 1,0 ml/min
Detektion: UV bei 225 nm
Retentionszeiten: Sind konzentrationsabhängig, aber ungefähr:
A82846C = 6,6 min
A82846B = 8,9 min
A82846A = 9,5 min

2. Umkehrphasensäule

Säulenmaterial: Zorbax* ODS (4,6 x 150 mm)
System: Gradientenelution 1 % (NH&sub4;)H&sub2;PO&sub4; : CH&sub3;CN (95: 5) bis (1: 1) in 20 min
Flußrate: 1,0 ml/min
Detektion: UV bei 225 nm
Retentionszeiten: A82846A = 7,3 min
A82846C = 7, 6 min
A82846B = 8,0 min
* Zorbax Säulen sind Produkte von E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898

Beispiel 2

Herstellung von Antibiotikum A82846 mit Kultur A82846

A. Schüttelkolben Fermentation der Kultur A82846

Die Kultur Nocardia orientalis NRRL 18098 wird entweder als lyophilisiertes Pellet oder als in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension zur Beimpfung eines Anzuchtmediums, das die folgende Zusammensetzung aufweist, verwendet: Anzuchtmedium Bestandteil Menge (%) Glucose Lösliche Stärke Hefeextrakt Enzymatisch hydrolysiertes Casein* Deionisiertes Wasser Einstellen des pH des Mediums auf etwa 7,5 mit NaOH vor dem Sterilisieren *NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, NY
Schrägagarröhrchen oder Platten werden durch Zugabe von 2,5 % Agar zum Anzuchtmedium hergestellt. Das beimpfte Schrägagarröhrchen wird bei 30ºC für etwa 10 bis etwa 14 Tage inkubiert. Die reife Kultur wird mit einem sterilen Werkzeug abgekratzt, um die Sporen abzulösen und die Mycelmatte zu Entfernen und Mazerieren. Etwa ein Viertel der so erhaltenen abgelösten Sporen und der gewachsenen Kultur werden zur Beimpfung von 50 ml eines Mediums der ersten Stufe verwendet.
Das beimpfte Medium der ersten Stufe wird in einem 250 ml Erlenmeyerkolben bei 30ºC für etwa 24-48 Stunden in einem 5,08 cm Kreis (2 inch) auf einem Schüttler kreisend inkubiert.
Dieses inkubierte Vorkulturmedium (0,5 ml) wird verwendet, um 50 ml eines Produktionsmediums mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: Bestandteil Menge (%) Glucose Sojabohnenmehl Kartoffeldextrin Rohrzuckermelasse Säurehydrolysiertes Casein* Deionisiertes Wasser (pH vor der Sterilisierung auf 7,5 mit NaOH eingestellt) *Hy-Case, Sheffield Chemical Co.
Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 250 ml Weithals Erlenmeyerkolben bei 30ºC für 4 bis 5 Tage in einem 5,08 cm Kreis (2 inch) bei 250 Upm auf einem Schüttler kreisend inkubiert.

B. Tankfermentation der Kultur A82846

Um ein größeres Volumen Inoculum bereitzustellen werden 10 ml des in Teil A beschriebenen inkubierten Mediums der ersten Stufe zur Beimpfung von 400 ml Nährmedium einer zweiten Stufe verwendet, das die selbe Zusammensetzung wie das Medium der ersten Stufe hat. Dieses wachstumsfördernde Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 l Weithals-Erlenmeyerkolben für 48 Stunden bei 30ºC auf einem Schüttler in einem 5,08 cm (2 inch) Kreis kreisend inkubiert.
Das so hergestellte, inkubierte, wachstumsfördernde Medium der zweiten Stufe (1000 ml) wird zur Beimpfung von 100 Litern sterilem Produktionsmedium verwendet, das wie in Teil A beschrieben hergestellt wird, außer daß P-200 Antischaum (0,3 g/l) zugegeben werden. Das beimpfte Produktionsmedium kann in einem gerührten 165 l Fermentationstank für 90 bis 100 Stunden bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren. Der Luftstrom im gerührten Kessel (80 Upm) wird eingestellt, um eine gelöste Sauerstoffmenge von über 50 % der Luftsättigung aufrecht zu erhalten.

C. Alternative Tankfermentation von Kultur A82846

Das Verfahren von Teil B wird befolgt, außer daß eine geeignete Menge an wachstumsfördenden Medium zur Beimpfung von etwa 3402 Litern (1200 Gallonen) Produktionsmedium in einem 4536 Liter (1600 Gallonen) Fermentationstank verwendet werden.

Beispiel 3

Herstellung von Antibiotikum A82846 mit Kultur A82846. 1

Die Kultur Nocardia orientalis NRRL 18099 wird entweder als lyophilisiertes Pellet oder als in flüssigen Stickstoff gehaltene Suspension unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens kultiviert, außer daß das Produktionsmedium die folgende Zusammensetzung hat: Bestandteil Menge (%) Glucose Kartoffeldextrin Pepton* Rohrzuckermelasse Deionisiertes Wasser Keine pH Einstellung *Bacto-Pepton (Difco Laboratories)

Beispiel 4

Herstellung von Antibiotikum A82846 mit Kultur A82846. 2

Die Kultur Nocardia orientalis NRRL 18100 wird entweder als lyophilisiertes Pellet oder als in flüssigen Stickstoff gehaltene Suspension unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens kultiviert, außer, daß das verwendete säurehydrolysierte Casein Amicase (Sheffield Chemical Co. ) ist.

Beispiel 5

Herstellung von rohem A82846

Die Fermentationsbrühe (4200 l) von einem 4536 Liter (1600 Gallonen) Fermenter, hergestellt wie in Beispiel 2, Teil C wird mit 5 N NaOH auf pH 10,5 eingestellt und 3 % Celite 545 (Filtrationshilfe) werden zugegeben. Das Gemisch wird durch eine Filterpresse filtriert und die Presse wird mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrat- und Waschlösungen (4200 l) werden mit 5 N HCl (oder H&sub2;SO&sub4;) auf pH 7 eingestellt und auf eine Dowex XFS 43278 Harz Säule (NH&sub4;&spplus;) (200 l Filtrat/10 l Harz) aufgetragen. Die Säule wird mit einer Flußrate von 750 ml/min eluiert. Die Fraktionen werden entweder durch Bioassay mit Bacillus subtilis oder HPLC getestet.
Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen Wasser unter Sammeln von 100 l Aliquots gewaschen.
Das aktive Material wird vom Harz mit 5 Säulenvolumen 0, 05 N NH&sub4;OH unter Sammeln von 25 l Fraktionen eluiert. Die A82846 enthaltenden Fraktionen werden vereint und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 30 l konzentriert. Diese Lösung wird in Wasser auf eine 10 l Diaion HP-20 Harz Säule aufgetragen. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumen Wasser bei einer Flußrate von 300 ml/min gewaschen. Die Wasserwaschlösung wird verworfen. Das aktive Material wird von der Säule mit einer Lösung von 1 % Essigsäure enthaltendem H&sub2;O : iPrOH (95:5) bei einer Flußrate von 100 ml/min unter Sammeln von 4 l Fraktionen eluiert und durch Bioassay und HPLC ausgetestet. Die A82846 enthaltenden Fraktionen (Nr. 6-14) werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und unter Bildung von 356 g rohem A82846 gefriergetrocknet.

Beispiel 6

Isolierung von A82846A und A82846B

A. Trennung von angereichertem A82846A und A82846B

A82846 (30 g), hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, werden in Wasser (500 ml) gelöst und auf eine unter Druck stehende, mit 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; equilibrierte 30 l Silicagel LP-1/C&sub1;&sub8; Edelstahlsäule aufgetragen. Die Säule wird unter Verwendung eines Gradienten von 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (60 l) zu Wasser : Acetonitril (88:12) mit 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (60 l) bei einer Flußrate von 250-300 ml/min (Maximaldruck 40.8 bar (600 psi)) unter Sammeln von 4 l Fraktionen und Verfolgen der Elution mit einem UV Detektor bei 254 nm entwickelt. Einzelne Fraktionen werden durch analytische HPLC getestet. Die Fraktionen mit viel A82846A (Nr. 6-9) und Fraktionen mit viel A82846B (Nr. 10-17) werden jeweils vereinigt und im Vakuum konzentriert.

B. Reinigung von A82846A

A82846A-reiche Konzentrate von zwei wie in Teil A beschrieben ausgeführten 30 g Läufen werden auf einer 1750 ml Diaion HP-20 SS Säule entsalzt, mit Wasser gewaschen, mit 0,5 % Essigsäure enthaltenden H&sub2;O : iPrOH (95: 5) eluiert und durch analytische HPLC getestet. Die A82846A enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und unter Erhalt von 7, 4 g einer angereicherten A82846A-Präparation gefriergetrocknet.
Die A82846A-angereicherte Präparation (7,2 g) wird in Wasser gelöst und auf eine präparative Silicagel P-1/C&sub1;&sub8; HPLC Säule in 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; aufgetragen. Die Säule wird mit einem Gradient von 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; bis 1% NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; : Acetonitril (9:1) unter Verfolgen der Elution durch analytische HPLC bei 254 nm und Eluieren bei einer Flußrate von 48 ml/min entwickelt. Nachdem die ersten 10 l eluiert sind, werden 500 ml Fraktionen gesammelt.
Die A82846A enthaltenden Fraktionen (Nr. 4-10) und A82846B enthaltende Fraktionen (Nr. 12-20) werden jeweils vereinigt und im Vakuum konzentriert. Die Konzentrate von A82846A aus 3 Läufen werden vereinigt und auf eine 1750 ml Diaion HP-20 SS Säule zum Entsalzen der Lösung aufgetragen. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und A82846A wird mit 0,5 % Essigsäure enthaltendem H&sub2;O : iPrOH (95: 5) eluiert. Die Elution wird durch HPLC verfolgt. Die A82846A enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und unter Erhalt von 7, 9 g gereinigtem A82846A gefriergetrocknet.
Das IR Spektrum von A82846A in KBr Scheiben ist in Figur 1 gezeigt, das FAB-MS von A82846A in Thioglycerin ist in Figur 4 gezeigt und das NMR Spektrum von A82846A-Hydrochlorid in (Methylsulfoxid)-d&sub6; bei 60ºC auf einem Bruker AM500 Spektrometer (HDO unterdrückt) ist in Figur 7 gezeigt.

C. Reinigung von A82846B

A82846-angereicherte Fraktionen aus 3 präparativen HPLC Läufen, die wie in Teil B beschrieben erhalten werden und A82846A und A82846B trennen, werden vereinigt und auf einer 1750 ml Diaion HP-20 SS Säule mit Wasser gewaschen und mit 0, 5 % Essigsäure enthaltendem H&sub2;O : iPrOH (95:5) eluiert. Die Elution wird durch HPLC verfolgt und die A82846B Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und unter Erhalt von 8,8 g gereinigten A82846B gefriergetrocknet.
Das IR Spektrum von A82846B in KBr Scheiben ist in Figur 2 gezeigt, das FAB-MS von A82846B in Thioglycerin ist in Figur 5 gezeigt und das NMR Spektrum von A82846B Acetat in (Methylsulfoxid)- d&sub6; bei 60ºC auf einem Bruker AM500 Spektrometer ist in Figur 8 gezeigt.

D. Entsalzen

Das Entsalzen kann auch durch Verwendung eines Diaion HP-20 Harzes und Elution mit 0, 1 % Essigsäure enthaltendem MeOH : H&sub2;O (4: 1) ausgeführt werden.

Beispiel 7

Isolierung von A82846C

A. Abtrennung von A82846C

Die aus vier, wie in Beispiel 2 Teil B beschrieben ausgeführten 165 l Fermentationen werden mit 5 N NaOH auf pH 10,5 eingestellt und mit 3 % Hyflo Supercel Filtrationshilfe filtriert. Das Filtrat (430 l) wird mit 5 N HCl auf pH 7 eingestellt und auf eine 10 l Dowex XFS 43278 (NH&sub4;&spplus;) Harz enthaltende Säule aufgetragen. Die Säule wird mit 50 l Wasser gewaschen und das aktive Material wird mit 0,05 N NH&sub4;OH (50 l) unter Sammeln von 4 l Fraktionen eluiert. Die Elution wird durch Bioassays verfolgt. Die aktiven Fraktionen (Nr. 1-7) werden vereinigt, im Vakuum auf ein Volumen von etwa 1700 ml konzentriert und unter Erhalt von 283,9 g rohem A82846 gefriergetrocknet.

B. Trennung von A82846A, B und C

Rohes A82846 (2 g), erhalten wie in Teil A beschrieben, wird in Wasser gelöst und auf eine 5,08 cm (2 inch) x 114,3 cm (45 inch) präparative HPLC Säule aus Edelstahl aufgetragen, die 2110 ml Slicagel LP-1/C&sub1;&sub8; Harz in 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; enthält. Die Säule wird unter Verwendung eines Gradienten von 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; bis 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; : Acetonitril (92: 8) bei einer Flußrate von 70 ml/min unter Sammeln von 400 ml Fraktionen und durch UV Aufzeichnung bei 254 nm entwickelt.
Die A82846A enthaltenden Fraktionen (Nr. 11-14) werden als Pool 1, die A82846C enthaltenden Fraktionen (Nr. 16-20) als Pool 2 und die A82846B enthaltenden Fraktionen (Nr. 21-25) als Pool 3 vereinigt.

C. Reingung von A82846C

Pool 2 wird auf ein Volumen von etwa 200 ml konzentriert und auf eine 7 x 45 cm Glassäule aufgetragen, die 1800 ml Diaion HP-20 Harz zum Entsalzen enthält. Das aktive Material wird mit 0, 1 % Essigsäure enthaltendem MeOH : H&sub2;O (4:1) unter Sammeln von 1 l Fraktionen bei einer Flußrate von 25 ml/min eluiert. Die A82846C enthaltenden Fraktionen (Nr. 9-12) werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und unter Erhalt von 662, 2 mg angereinigtem A82846C gefriergetrocknet.
Das angereinigte A82846C (500 mg) wird weiter gereinigt durch Wiederholung der Umkehrphasen HPLC Schritte unter Verwendung einer 450 ml Silicagel LP-1/C&sub1;&sub8; enthaltenden 2,54 cm (1 inch) x 121,9 cm (48 inch) Stahlsäule, eines Gradienten von 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; bis 1 % NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; : Acetonitril (92:8), einer Flußrate von 11 ml/min, Sammeln von 25 ml Fraktionen und Aufzeichnung bei 254 nm. Die A82846C enthaltenden Fraktionen (Nr. 169-210) werden vereinigt und auf einer 5 x 45 cm Glassäule mit HP-20 Harz entsalzt. Die Säule wird mit 0, 1 % Essigsäure enthaltendem MeOH : H&sub2;O (4: 1) eluiert, 100 ml Fraktionen werden gesammelt und die Elution durch analytische HPLC mit UV bei 225 nm verfolgt. Die A82846C enthaltenden Fraktionen (Nr. 5-11) werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und unter Erhalt von 127,3 mg A82846C gefriergetrocknet.
Der A82846A enthaltende Pool 1 und der A82846B enthaltende Pool 3 werden in der selben Weise, wie für A82846C beschrieben, gereinigt, um weiteres gereinigtes A82846A und A82846B zu erhalten.

D. Weitere Reinigung von A82846C

A82846C (70 mg) wird weiter unter Verwendung des folgenden präparativen Chromatographieverfahrens gereinigt:
Säule: Zorbax SCX Kationenaustauscher (9,2 x 250 mm )
Mobile Phase: Ein linearer Gradient beginnend bei 10 % MeOH enthaltenden 0, 15 M NaH&sub2;PO&sub4; Puffer bis 10 % MeOH enthaltenden 0, 9 M NaH&sub2;PO&sub4; Puffer in 6 min und 5 min konstanthalten ( der Puffer wird nicht eingestellt)
Flußrate: 6,0 ml/min
Detektion: UV bei 280 nm
Beladung: 6,0 mg / Injektion in H&sub2;O
A82846C wird unter Verwendung eines mit einem Peak-Detektionsmechanismus ausgerüsteten automatisierten Fraktionssammler (Gilson 201C) gesammelt. Die mobile Phase wird von einem Millipore Waters M600 Gradienten HPLC System geliefert und die Probenlösung wird durch einen automatischen Probenaufträger von Hitachi injiziert.
Die A82846C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, auf ein Volumen von 30 ml konzentriert und auf eine HP-20 Säule (50 ml) aufgetragen. Die Säule wird mit H&sub2;O gewaschen und mit 0, 5 % HOAc enthaltendem H&sub2;O : Isopropanol (95: 5) unter Sammeln von 25 ml Fraktionen eluiert. Die A82846C enthaltenden Fraktionen (Nr. 9-14) werden vereinigt, konzentriert und unter Erhalt von 37 mg gereinigtem A82846C lyophilisiert.
Das IR Spektrum von A82846C in KBr Scheiben ist in Figur 3 gezeigt, das FAB-MS von A82846C in Thioglycerin ist in Figur 6 gezeigt und das NMR Spektrum von A82846C-Acetat in (Methylsulfoxid)- d&sub6; bei 60ºC auf einem Bruker AM500 Spektrometer (HDO unterdrückt) ist in Figur 9 gezeigt.

Beispiel 8

Herstellung der A82846 Salze

Verfahren:

Die A82846 Komponente (100 mg) wird jeweils in deionisiertem Wasser (10 ml) gelöst. Der pH dieser Lösung wird auf etwa pH 3 unter Verwendung 0,5 N Säure (HCL, H²SO&sub4; und H&sub3;PO&sub4;) eingestellt. Die Lösung wird unter Erhalt der entsprechenden Salzform lyophilisiert. Es ist wichtig zu bemerken, daß falls der pH zu weit unter 3 erniedrigt wird (beispielsweise pH 2), die Verbindung zersetzt wird. Die folgenden Ausbeuten werden erhalten: Salz Ausbeute (mg)

Beispiel 9

A82846A Tablettenformulierung

A82846A enthaltende Tabletten können unter Verwendung der folgenden Bestandteile und Mengen hergestellt werden: Bestandteil Menge A82846A Phosphat Mikrocristalline Cellulose Natriumcroscarmellose Providon Magnesiumstearat Stearinsäure Gerinigtes Waser
Man gibt A82846A Phosphat, einen Teil der mikrokristallinen Cellulose und einen Teil der Natriumcroscarmellose in einen geeigneten Behälter und vermischt bis zur Homogenität. Man stellt eine Lösung von Povidon in Wasser her und gibt die Povidonlösung zu den gemischten Pulvern. Man granuliert die entstehende Mischung, klassiert erforderlichenfalls und trochnet. Man gibt die verbliebene mikrokristalline Cellulose und Natriumcrocarmellose zur getrockneten Mischung und mischt. Man gibt Magnesiumstearat und Stearinsäure zu und mischt das Ganze. Die entstehende Pulvermischung wird zu Tabletten verpreßt.

Beispiel 10

A82846B Kapselformulierung

A82846B enthaltende Kapseln können unter Verwendung der folgenden Bestandteile und Mengen hergestellt werden: Bestandteil Menge A82846B Hydrochlorid Maisstärke als fließfähiges Pulver Siliconflüssigkeit mit 350 Centistokes Maisstärke
Man mischt A82846B Hydrochlorid, Stärke als fließfähiges Pulver, Siliconflüssigkeit mit 350 Centistokes und Stärkepulver in einem geeignten Mischer bis zur Homogenität und füllt das Ganze in Hartgelatinekapseln mit geeigneter Größe.

Beispiel 11

A82846A Suspensionsformulierung

Man stellt eine sterile, unlösliche Form von A82846A durch Kristallisation oder Fällung her. Man mahlt oder sortiert eine für die Suspension geeignete Partikelgröße und suspendiert das A82846A im folgenden Träger. Bestandteil Menge Lecithin Natriumcitrat Propylparaben Wasser zur Injektion ad gewünschtes Volumen
Die Suspension kann in großen Mengen hergestellt werden und in Gläßchen gefüllt werden oder frisch durch Zugabe des Trägers zum A82846A im Glas hergestellt werden.

Claims

1. Glycopeptidantibiotikum A82846, umfassend Komponenten, die im wesentlichen die folgenden physikalischen und spektralen Eigenschaften haben:

Eigenschaften von A82846A

Molekulargewicht: 1556

Empirische Formel: C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub9;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl

FAB-MS (Thioglycerin): (M+1) gefunden: 1557,5803;

berechnet: C&sub7;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl = 1557,5716 (siehe Figur 4);

UV (H&sub2;O)λmax: 281 nm (&epsi;5,052), verschiebt sich auf 300 nm im Alkalischen;

IR (KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 und 1015 cm&supmin;¹ (siehe Figur 1);

NMR [(CD&sub3;)&sub2;SO] : siehe Figur 7;

pKa (H&sub2;O) : 4,7, 9,5

(66 % DMF) : 5,5; 6,8; 7,9; 9,4; 12,3

(wahrscheinliches Molekulargewicht 1542)

Eigenschaften von A82846B

Molekulargewicht: 1590

Empirische Formal: C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub8;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl&sub2;

FAB-MS (Thioglycerin) : (M+1) gefunden: 1591,5315;

berechnet: C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub9;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Cl&sub2; = 1591,5327 (siehe Figur 5);

UV (H&sub2;O) λmax: 280 nm (&epsi;5,192), verschiebt sich auf 300 nm im Alkalischen;

IR (KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023 und 1018 cm&supmin;¹ (siehe Figur 2);

NMR [(CD&sub3;)&sub2;SO]: siehe Figur 8

pKa (H&sub2;O) : 4,65; 9,5

Eigenschaften von A82846C

Molekulargewicht: 1522

Empirische Formel: C&sub7;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;

FAB-MS (Thioglycerin): (M+Na) gefunden: 1545,5998;

berechnet: C&sub7;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub2;&sub6;Na = 1545,5925 (siehe Figur 6);

UV (H&sub2;O) λmax: 280 nm (&epsi;5,198), verschiebt sich auf 300 nm im Alkalischen;

IR (KBr) : 3600T3004 (breit), 2999, 2991, 2950, 1687T1650 (breit), 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 und 1014 cm&supmin;¹ (siehe Figur 3);

NMR [(CD&sub3;)&sub2;SO]: siehe Figur 9

pKa (H&sub2;O) : 4,6; 9,4;

2. Antibiotikum A82846, wie vorher beschrieben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

3. Antibiotikum A82846A, wie vorher beschrieben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

4. Antibiotikum A82846B, wie vorher beschrieben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

5. Antibiotikum A82846C, wie vorher beschrieben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

6. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A82846, A82846A, A82846B oder A82846C, umfassend, daß man Nocardia orientalis NRRL 18098, NRRL 18099 oder NRRL 18100 oder einen A82846-produzierenden Nachkömmling davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält unter Submersfermentationsbedingungen züchtet und gegebenenfalls anschließend das Antibiotikum von dem Fermentationsmedium abtrennt und/oder das Antibiotikum in Salzform überführt, wenn es nicht in Salzform ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung des Antibiotikums A82846.

8. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung des Antibiotikums A82846A.

9. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung des Antibiotikums A82846B.

10. Biologisch gereinigte Kultur, ausgewählt aus den Nocardia orientalis Stämmen NRRL 18098, NRRL 18099 und NRRL 18100 oder einem A82846-produzierenden Nachkömmling davon.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als aktiven Inhaltsstoff in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern.

12. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in der Therapie bakterieller Infektionen.

13. Tierfuttervormischung, umfassend als aktiven Inhaltsstoff eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit einem oder mehreren landwirtschaftlich annehmbaren Trägern.