DD210709A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums a51568 mit den faktoren a und b - Google Patents

Verfahren zur herstellung des antibiotikums a51568 mit den faktoren a und b

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DD210709A5
DD210709A5 DD210709A5 DD 210709 A5 DD210709 A5 DD 210709A5 DD 210709 A5 DD210709 A5 DD 210709A5
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Abstract

Verfahren zur Herstellung der Faktoren A und B des Antibiotikums A51568 durch an sich bekannte Zuechtung von Nocardia orientalis NRRL 15232 oder einer A51568 bildenden Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen fuer Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivitaet. Das hierdurch erhaeltliche neue Antibiotikum zeichnet sich vor allem durch eine Wirksamkeit gegenueber grampositiven Arten von Staphylococcus und Streptococcus aus, die ansonsten gegenueber Penicillin resistent sind.

Description

Aktenzeichen: X-6119A
Vertreter; Patentanwaltsbüro Berlin
Titel der Erfindung:
Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A51568 mit den Faktoren A und B
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A51568 mit den Faktoren A und B durch Züchtung eines bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus, nämlich von Nocardia orientalis NRRL 15232 oder einer A51568 produzierenden Mutante oder Variante hiervon unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen. Nocardia orientalis NRRL 15232 bildet normalerweise ein Gemisch aus den Faktoren A und B von A51568 in einem Verhältnis von etwa 95 : 5- Diese Antibiotika hemmen das Wachstum pathogener Mikroorganismen, und zwar insbesondere solcher innerhalb der grampositiven Arten von Staphylococcus und Streptococ-
25 cus, die gegenüber Penicillin resistent sind.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Auf-
gäbe der Erfindung:'
Sehr viele Mikroorganismen sind pathogen und ursächliche Mittel von Krankheitszuständen sowohl bei Menschen als auch bei Tieren. Im Laufe der Jahre wurde eine große Anzahl an Antibiotika entwickelt, die gegenüber pathogenen Mikroorganismen wirksam sind. Es besteht allerdings immer noch die Notwendigkeit zur Auffindung von Mitteln, die gegenüber diesen pathogenen Mikroorganismen wirksam sind, damit sich die durch Mikroorganismen bei Menschen und Tieren verursachten Krankheiten erfolgreicher behandeln lassen.
<Π 0Λ ; i O
Das Antibiotikum A51568 mit den Faktoren A und B gehört der Familie der Glykopeptidantibiotika an, und diese Antibiotika sind'grampositive antimikröbielle Mittel.
zu bereits bekannten Glykopeptidantibiotika gehören unter anderem Vancomycin gemäß US-PS 3 067 099, wobei die Struktur von Vancomycin in J. Am. Chem. Soc. 103, 6580 bis 6585 (1981) angegeben ist, Actaplanin (Antibiotikum Ä-4696) gemäß US-PS 3 952 095, wobei ein Teil der Struktur von Actaplanin in US-PS 4 322 343 angeführt ist, Kistocetin gemäß GB-PS 765 886, wobei die Struktur von Ristocetin A, nämlich eines Faktors des Ristocetinkomplexes, in J. Am. Chem. Soc. 102, 897 bis 905 (1980) gezeigt ist, und Avoparcin gemäß US-PS 3 338 786, wobei die Struktur von Avoparcin in J. Am. Chem. Soc. 103, 6522 bis 6524 (1981) beschrieben ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Die Erfindung betrifft insbesondere die Schaffung eines isolierten Antibiotikums mit der Strukturformel (I)
Glucose-Vancosamin
HOOC
HOT \ / OH OH
worin η für 1 oder 2 steht, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon oder eines Antibiotikumgemisches aus einem Antibiotikum der Formel (I) oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz hiervon als vorwiegender Kompo-
nente. Das Antibiotikum der Formel (I), worin η für 1 steht, wird als A-51568 Faktor A bezeichnet. Das Antibiotikum der Formel (I), worin η für 2 steht, wird als A-51568 Faktor B bezeichnet. , '...
1^ Der Faktor A des Antibiotikums A51568 ist ein weißer amorpher Feststoff. Eine Elementaranalyse des Faktors A des Antibiotikums A51568 zeigt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff = 50,63 %, Wasserstoff = 5,07 %, Stickstoff = 8,36 %, Chlor = 8,19 % und Sauer-
1^ stoff =25,16 %· Das Antibiotikum hat ein durch Bombardierung mit schnellen Atomen massenspektrometrisch bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1435.
Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum des Faktors A des Antibiotikums A51568 ist in Dimethylsulfoxid bei 600C und 360 MHz bestimmt worden. Die verschiedenen sechsgliedrigen Ringe der Strukturformel sind durch Buchstaben des Alphabets gekennzeichnet, wie dies in der folgenden Formel angegeben ist: 25
GlucoserVancosamin
In der folgenden Tabelle 1 sind die chemischen Verschiebungen für dieses Antibiotikum in ppm angegeben.
Tabelle 1
Chemische Verschiebungen Bestimmung beim Faktor A von A51568 (600C) Chem. Verschiebung
A Chem. Verschiebung Bestimmung 6,61
Ring 6,54 Asparagin 4,32
-NH 4,19 -NH 2,56 &
-21 5,14 -(X 2,14
— 1 ' 5,86 -ß's 7,29 &
-OH 7,86 6,83
-2 7,30 -NH2
-5
-6
7,47
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Bestimmung
Ring B Chem. Verschiebung -NH 8,24
-I1 5,72
-2 5,63
-6 5,22
Ring C *
-NH 4,78
. -2 ' 5,18
-1' 5,74
-OH 7,66
-2 7,18
-3 : 7,42
-6
Ring D 8,45
-NH 4,47
-Γ 6,26
-2 6,42
-4
Ring E 8,54
-NH 4,47
-ι1 7,17
-2 6,72
-5 6,79
-6
Bestimmung
Leucin Chem. Verschiebung -NH„ *
-(X
-ß's
-r
-6's
Glucose
-1 _2
-3 -4 -5 "6
Vancosamin -1 -2
(3-CH3)
Vancosamin 4 5 (5-CH3)
3,70 1,65 & 1,49 1,76 0,93 & 0,90
5,33 3,58 3,49
3,29 *
3,70 & 3,54
5,30 1,93 & 1,77 1,37
4,67 1,09
* Nicht bestimmt
Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum des Faktors A des Antibiotikums A51568 ist dem des Vancomycins sehr ähnlich. Der durch Betrachtung feststellbare wesentliche Unterschied ist das Fehlen der Resonanz von N-CH für N-(Me-
thyl)leucin im Spektrum von A51568. Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum von Vancomycin enthält daher ein Methylsingulett bei 2,39 ppm, das im protonenmagnetischen Resonanzspektrum des Faktors A des Antibiotikums A51568 fehlt.
Auf Basis des Molekulargewichts, der Daten des protonenkernmagnetischen Resonanzspektrums und der Elementaranalysen wird dem Faktor A des Antibiotikums A51568 die empirisehe Formel C65H73C12N9°24 zu9eordnet·
Eine potentiometrische Titration des Faktors A des Antibiotikums A51568 in 66 % wäßrigem Dimethylformamid zeigt pKa-Werte von N = 6,2, 8,8, 10,3 und 12,85 (anfänglicher pH-Wert - 6,12) .
Der Faktor A des Antibiotikums A51568 hat folgende spezifische Drehwerte:
/<5/25 C _ _20f4° (c = 10 mg/mi, Wasser) ^365° = ~33'6° {c = 10 mg/ml, Wasser).
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Faktors A des Antibiotikums A51568 in einem KBr-Pellet geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Darin sind folgende unterscheidbare Absorptionsmaxima zu beobachten: 3400 (breit, stark), 3380 (breit, stark), 1657 (breit, stark), 1587 (mittelstark), 1505 (mittelstark), 1424 (mittel), 1396 (mittel), 1328 (breit, schwach), 1310 (breit, schwach), 1231 (mittelstark), 1174 (schwach), 1156 (schwach), 1128 (mittel), 1062 (mittelstark), 1028 (schwach), 1015 (schwach), 990 (schwach), 882 (schwach), 881 (schwach) cm ,
Die Ultraviolettabsorptionsmaxima des Faktors A des Antibiotikums A51568 in Wasser unter sauren, neutralen und basischen Bedingungen sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt.
Tabelle 2
U\/-Spektrophotoinetrie des Faktors A von Antibiotikum A51568
5 Sauer oder neutral max'nm (£) .
278 (5500)
234 (Schulter) ("25000)
Basisch max nm (£)
302 (6000)
264 (Schulter) (10000)
Der Faktor B des Antibiotikums A51568 (Formel I, worin η für 2 steht) ist ein weißer amorpher Feststoff, A51568 Faktor B hat ein durch Bombardierung mit schnellen Atomen massenspektrometrisch bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1437.
Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum des Faktors B des Antibiotikums A51568 ist in Dimethylsulfoxid bei 600C und 360 MHz bestimmt worden. Die verschiedenen sechsgliedrigen Ringe der Strukturformel sind durch Buchstaben des Alphabets gekennzeichnet, wie dies in der folgenden Formel angegeben ist:
Glucose-Vancosamin
-δι In der folgenden Tabelle 3 sind die chemischen Verschiebungen für dieses Antibiotikum in ppm angegeben.
Tabelle
Chemische Verschiebungen beim Faktor B von A51568 (600C)
Bestimmung Ring A Chem.VerschiebungGlutamin
-NH 6.54
-2' 4.19
-1' 5.13
-OH 5.85
-2 7.84
-5 7.29
-6 7.47
Ring B
-NH 7.63
-I1 5.67
-2 5.60
-6 5.23
Ring C
-NH
-2' 4.81
—1' 5.13
-OH 5.83
—? 7.84
-3 7.16
-6 7.13
Ring D
-NH 8.42
-! 4.48
-2 6.29
-4 6.42
Bestimmung
Glutamin Chem. Verschiebung
-NH 6.83
-Of 4.06
-ß 1.67 &
Y 1.87
-NH2 6.83 &
6.41
Leucin -NH2-α -ß's
-Y -6's
Glucose
-1 -2 4.05 1.63 1.68 1.67 0.92 0.91
-1 5.33
-2 5.52
-3 3.48
-4 3.29
-5 3.16
-6 3.70 &
3.52
Vancosamin
(3-CH3)5.30 1.92 & 1.76 1.37
— ΟΙ Tabelle 3 (Fortsetzung)
Bestimmung Bestimmung
Ring E Chem. Verschiebung Vancosamin Chem.Verschiebung
-NH 8,48 4 3,16
-I1 4,48 5 4,67
-2 7,18 (5-CH3) 1,09
-5 6,72
-6 6,79
* Nicht bestimmt
Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum des Faktors B des Antibiotikums A51568 ist sehr ähnlich zu dem von Vancomycin und dem des Faktors A von A51568. Die durch Betrachtung feststellbaren hauptsächlichen Unterschiede sind ein Fehlen der Resonanz von N-CH- für N-(Methyl)leucin im Spektrum von Vancomycin und ein Fehlen der Resonanzen von Asparagin in den Spektren von Vancomycin und des Faktors A von A51568. Die im Vancomycin und im Faktor A von A51568 feststellbaren Resonanzen von Asparagin sind im Faktor B von A51568 durch Resonanzen von Glutamin ersetzt.
Auf Basis der Massenspektraldaten, der Daten des protonenkernmagnetischen Resonanzspektrums und eines Vergleichs dieser Daten mit den entsprechenden Daten für den Faktor A von A51568 wird dem Faktor B des Antibiotikums A51568 die empirische Formel C65H 73C12N9O24 zu9eordnet·
Das Antibiotikumgemisch von A51568, das die Faktoren A und B enthält, wird gebildet durch Züchtung eines bisher nicht beschriebenen Stammes vpn Nocardia oriental is NRRL 15232.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf den bisher nicht beschriebenen Stamm von Nocardia orientalis NRRL 15232 und auf biologisch reine Kulturen hiervon. Der Einfachheit halber ist die biologisch reine Kultur von Nocardia orientalis NRRL 15232 im Labor der Anmelderin als Kultur A51568.1
-ιοί bezeichnet worden.
Die Kultur A51568.1 ist ein durch natürliche Selektion von der Kultur A51568 abgeleiteter Variantenstamm, wobei die letztgenannte Kultur ursprünglich aus einer in Yucatan, Mexico, gesammelten Bodenprobe isoliert wurde.
Die Kultur A51568.1 ist klassifikationsmäßig ein Stamm von Nocardia orientalis, und zwar auf Basis gleichzeitiger Laborvergleiche und eines Vergleichs mit den veröffentlichten Beschreibungen von Nocardia durch D. Berd "Laboratory Identification of Clinically Important Aerobic Actinomycetes", Appl. Microbiol. 25(4), 665 bis 681 (1973), durch Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, herausgegeben von R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (The Williams and Wilkins Co., Baltimore, V.St.A.), durch R.E. Gordon et al. "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophia and the Nocardirt Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54 bis 63 (1974), durch R.E. Gordon et al., "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol. 27(3), 176 bis 178 (1977), durch S.A. Waksman, The Actinomycetes, Band II (The Williams and Wilkins Co., Baltimore, V.St.A. (1961)), und mit den veröffentlichten Beschreibungen dieser Spezies durch R.E.
Gordon et al. "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109 „ 69 bis 78 (1978), durch S.J. Mishra et al. "Identification of No-
oQ cardiae and Streptomycetes of Medical Importance", J. Clin, Microbiol. 11(6), 728 bis 736 (1980), und durch Pittenger et al. "Streptomyces orientalis", n.sp., the Source of Vancomycin", Antibiot. and Chemoth. VI(Il), 642 bis 647 (1956) .
Diese Klassifikation beruht auf Methoden und Medien, wie sie für das International Streptomyces Project (ISP) zur Charakterisierung von Arten von Streptomyces empfohlen
und von Shirling und Gottlieb ("Methods of Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16(3), 313 bis 340 (1966)) veröffentlicht worden sind und ferner auch auf Methoden, wie sie zur Charakterisierung von Arten von Nocardia empfohlen und von Gordon et al. "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophia und the Nocardin«Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54 bis 63 (1974) beschrieben worden sind.
10 Charakterisierung der Kultur A51568.1
Morphologie
Die Kultur A51568.1 bildet ein extensives Substrat und Luftmyzel. Unter dem Lichtmikroskop betrachtet sehen die Lufthyphen spinnengewebeartig aus. Läßt man die Kultur submers unter Schütteln wachsen, dann brechen die Hyphen zu kurzen Myzelbruchstücken.
Es lassen sich keine Conidien beobachten, wenn man die Lufthyphen mit einem Lichtmikroskop betrachtet. Bei Untersuchung mit einem Elektronenabtastmikroskop sind jedoch Conidien zu sehen. Diese Merkmale lassen sich beobachten, wenn man die Kultur A51568.1 auf Agar aus ISP-Medium Nr. und Leitungswasser wachsen läßt. Die Ornamentierung der Sporenoberfläche ist glatt (Sm). Die Sporenform ist kugelig bis zylindrisch, und die Sporen werden schwach und irregulär gebildet. Diese Morphologie gehört klassifikationsmäßig zum Abschnitt der Nichtstreptomyceten, wie dies im oben erwähnten Bergey's Manual beschrieben ist.
ZüchtungsCharakteristiken
Die Kultur A51568.1 wächst gut auf Hefe-Dextrose-Agar und auch auf vielen anderen Agarmedien, wobei das Wachstum oft runzelig und flockig ist. Es werden reichlich Luftmyzelien gebildet, die eine Sporenmasse mit einer Farbe in der grauen (GY) und gelegentlich weißen (W) Farbreihe haben. Der am nächsten kommende Farbstreifen für die graue
Farbreihe im System von Tresner und Backus (siehe Tresner und Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", Appl. Microbiol. 11, 335 bis 338 (1956)) ist d
hellgrau bis 2dc gelblichgrau. 5
Das Luftwachstum ist weder so dicht noch so lang wie dies für Streptomyces typisch ist. Das Luftwachstum wird auf Agar aus anorganischen Salzen und Stärke (ISP Nr. 4), Agar aus Glycerin und Asparagin (ISP Nr. 5) und Agar aus Glyce-1^ rin und Glycin gebildet, und es läßt sich am besten bei einem Wachsenlassen auf Agar aus Hefe und Malzextrakt (ISP Nr. 2) beobachten.
Auf der Unterseite läßt sich in den folgenden Agarmedien eine dunkelbraune unterscheidbare Farbe beobachten: ISP Nr. 2, ISP Nr. 5, Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7) und Glycerin-Glycin-Agar. Diese Farbe wird vom pH-Wert nicht beeinflußt. In den oben bezeichneten Medien entwickelt sich auch ein hell- bis rötlich-braunes lösliches Pigment, und Gleiches gilt auch in Czapek-Lösung-Agar und in Glucose-Asparagin-Agar. Die Farbe der Unterseite der Kultur A51568.1 in anderen Medien ist gelbbraun.
Bei Beschichtung zur Variabilität zeigt die Kultur A51568.1
kein Gemisch aus Koloniearten, und die Kultur A51568.1
wird daher als ein stabiles Isolat angesehen.
Die Züchtungschar'akteristiken der Kultur A51568.1 auf verschiedenen Medien sind im Vergleich zu den Züchtungscharak- 3® teristiken von Nocardia orientalis ATCC 19795 in der folgenden Tabelle 4 angegeben.
Die Zuordnung der Farbnamen erfolgte hierbei nach den ISCC-NBS Centroid Color Charts, Probe Nr. 2106 (National 3^ Bureau of Standards, U.S. Department of Commerce, 1958) und dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago,
- 13 Illinois, V.St.Α., 1958).
Tabelle
5 Wachstumscharakteristiken von A51568.1 und ATCC 19795 auf
verschiedenen Medien
Medium
A51568.1 ATCC 19795
ISP 2 G: reichlich, runzelige Oberfläche
R: 59.d.Br (keine pH-Änderung)
Am: reichlich: d grau (GY)
Sp: rötlich-braun
ISP 3 G: reichlich
R: 89.p.Y.
Am: gut: d l.grau (GY)
Sp: keines
reichlich, runzelige Oberfläche
72.d.OY
reichlich: 2ba fahlgelb (Y)
keines
reichlich 89.p.Y.
Gut: d l.grau (GY) keines
ISP 4 G: reichlich R: 72.d.OY
Am: reichlich: b Auster weiß (W)
Sp: keines reichlich 70.1.OY
reichlich: b Auster weiß (W)
keines
ISP 5 G: reichlich reichlich
R: 59.d.Br (keine pH-Änderung) 70.1.OY
Am: reichlich: b Auster reichlich: b Auster
weiß (W) weiß (W)
Sp: hellbraun keines
ISP 7 G: reichlich
R: 65.br.schwarz (keine pH-Änderung )
Am: reichlich: 2ba p. gelb (Y)
Sp: dunkel rötlich-braun reichlich 71.rn.OY
reichlich: 2ba p. gelb (Y)
keines
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Medium
A51568.1
ATCC 1 9795 runzelig,
Gut
70.1.OY
gut: b Auster weiß (W)
keines
reichlich, schuppig
Czapek-Lösung
G: R:
Gut 74.s.yBR
Am: gut: b Auster weiß (W)
Sp: hellbraun
Emerson- Agar G: reichlich, runze schuppig
R: 74.s.yBr
Am: gut: d.i.GYT 2ba p.Y (GY)
Sp: keines
Gluco- G: reichlich
se- Aspa- ragin R: Am: 75.tief ^Br reichlich: 2dc y grau (GY)
Sp: olivbraun
Glyce- G: rin-Glyein R"
Am:
Sp:
reichlich
78.d.yB (keine pH-Änderung )
reichlich: 2dc y grau (GY)
olivbraun 74.s.yBr
gut: 2ba p. gelb (Y)
keines
reichlich
67. brillant OY
reichlich: 2ba p. gelb (Y)
keines
reichlich 71.m.0Y
reichlich: 2ba p. gelb (Y)
keines
Nahr- Agar G: R: gut 70.1.OY
Am: gut: b Auster weiß (W)
Sp: keines
Lei tungs wasser G: R: ausreichend 93. T. grau
Am: schlecht Sp: keines gut 70.1.OY
gut: b Auster we i ß (W)
keines
ausreichend 93. T grau schlecht keines
- 15 Tabelle 4 (Fortsetzung)
Medium G: A51568.1 ATCC 19795
Hefe- Dextrose R: reichlich-runzelig, schuppig reichlich runzelig , etwas
Am: 68.s.OY 68.s.OY
Sd: reichlich: d hell grau (GY) reichlich weiß (W) : b Auster
keines keines
G= Wachstum, R = Unterseite, Am = Luftmyzel, Sp = lösliches Pigment
ZeIlwandstudien
Unter Verwendung hydrolysierter Gesamtzellen einer Kultur von A51568.1 wird die Anwesenheit bestimmter diagnostischer Zucker durch die in J. Lab. Clin. Med. 71, 931 bis 944 (1968) beschriebene chromatographische Methode bestimmt.
Hydrolysierte Gesamtzellen werden zur Bestimmung der Isomeren von Diaminopimelinsäure nach der in Appl. Microbiol. 11, 421 bis 423 (1964) beschriebenen Methode verwendet.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen gehen aus folgender Aufstellung hervor.
Versuch
Beobachtetes Ergebnis
Diagnostische Zucker Isomere von 2,6-Diaminopimelin-
Galactose, Arabinose meso-Isomeres von Ribose
saure
Diese Ergebnisse entsprechen einem Zuckermuster von Gesamtzellen vom Typ A und einer Zellwand vom Typ IV, und diese Kombination aus vorwiegenden Zellwandbestandteilen ist ein Zeichen für den Genus Nocardia, wozu auf die oben erwähnte Literaturstelle J. Lab. Clin. Med. 71, 931 bis 944 (1968) hingewiesen wird.
Bei einer dünnschichtchromatographischen Untersuchung von Methanolysaten aus Gesamtzellen nach dem in J. Gen. Microbiol. 88, 200 bis 204 (1975) beschriebenen Verfahren lassen sich keine Mycolsäuremethylester beobachten.
Zusätzlich zu den obigen Bestimmungen wird die Kultur A51568.1 auch untersucht und verglichen mit veröffentlichten Daten über 21 Bezugsstämme von Nocardia orientalis sowie durch gleichzeitige Vergleiche mit NRRL 2451, NRRL 2452 und ATCC 19795. Die dabei erhaltenen Vergleichsdaten über die züchtungstechnischen, morphologischen und physiologischen Eigenschaften sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5
Vergleich physiologischer Eigenschaften von A51568.1 und Bezugsstämmen von Nocardia
orientalis
Eigenschaften
NRRL NRRL ATCC Nocardia A51568.1 2451 2452 19795 orientalis
Säureschnelligkeit Lufthyphen Katalase
Zellwandart Conidien
Zersetzung von Adenin
Casein
DNA
Hypoxanthin Tyrosin Harnstoff Xanthin
Fragmentierung Gelatineverflüssigung gram-Anfärbung Hydrolyse von Aesculin Hippurat Magermilch Stärke
IV
IV
IV
IV
IV
NU
NU NU
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Eigenschaften
NRRL NRRL ATCC Nocardia A51568.1 2451 2452 19795 orientalis
Melanoidpigmentxerung Morphologie - spinnwebenartig NaCl-Verträglichkeit in % Nitrit aus Nitrat Phosphatase Resistenz gegenüber Bacitracin
Lysozym
Novobiocin
Penicillin G
Rifampin Sporenfarbe
Sporenform kugelig bis zylindrisch
Sporenoberfläche, glatt Überleben bei 500C und 8 h Temperaturbereich, 0C Zuckermuster vom Typ A Ureasebildung
Verwertungsmuster von Kohlenstoffverbindungen Verwertungsmuster von organischen Säuren
Vegetatives Wachstumsoptimum im gleichen Medium
10-40
+ 8
'W-Y
15-40
+
W-Y
15-40
10
W-Y
10-40
NU NU NU NU
NU NU
W-Y
10-40
NU
NU = nicht untersucht
Weiter wird auch die Säurebildung aus Kohlenhydraten durch die Kulturen A51568.1, NRRL 2451, NRRL 2452 und ATCC 19795 mit den veröffentlichten Ergebnissen von 21 Bezugsstämmen von Nocardia Orientalis verglichen. Diese Daten sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.
Tabelle 6
Säurebildung aus Kohlenhydraten durch Kulturen von A51568..1, NRRL 2451, NRRL 2452 ATCC 19795 und Bezugsstärnmen von Nocardia orientalis
A51568.1 NRRL NRRL ATCC Nocardia I
Eigenschaften 2451 2452 19795 orientalis NJ
Adonit + + + + + O
1(+) Arabinose + + + + I
Cellobiose + + +
Cellulose _ _ NU
Dulcit + _ NU
i-Erythrit + + + + +
Fructose + + + f NU
d(+) Galactose + + + + NU
Glucose + + + + +
Glycerin + + + + +
i-Incsit + + + + +
Inulin + + + + NU
d(+) Lactose + + + + +
d(+) Maltose + + + +
d(-) Mannit + + + +
d(+) Mannose + + + +
d(+) Melezitose + + -
d(+) Melibiose - - — -
a-Me-D-Glucosid d(+) Raffinose 1(+) Rhamnose
Tabelle 6 (Fortsetzung)
NRRL NRRL ATCC Nocardia Eigenschaften A51568.1 2451 2452 19795 orientalis
Salicin . + ' . + + + NU
d(-) Sorbit · - . - - -
Saccharose + + + + NU ι
d( + ) Trehalose + + + + + nj
d( + ) Xylose + + + + + ·"*
Kpntrolle - - - _ - ι
NU = nicht untersucht
Unter Heranziehung der für A51568.1 bestimmten züchtungstechnischen, morphologischen und physiologischen Eigenschaften wird ein Vergleich mit den veröffentlichten Beschreibungen von 14 Stämmen von Nocardia durchgeführt, wie sie in J. Gen. Microbiol. 109, 69 bis 78 (1978) und J. Clin. Microbiol. 11(6), 728 bis 736 (1980) veröffentlicht sind. Zusätzlich werden auch gleichzeitige Laborvergleiche zwischen der Kultur A51568.1 und den Kulturen NRRL 24 51, NRRL 2452 und ATCC 197 95 durchgeführt. 10
Nach folgender Gleichung werden dann Ahnlichkeitskoeffizienten berechnet:
S = [Ns+ + Ns~]/[ns+ + Ns" + Nd] χ 100 15
Darin bedeuten
Ns = Anzahl positiver Ähnlichkeiten Ns = Anzahl negativer Ähnlichkeiten Nd = Anzahl von Unähnlichkeiten (Unterschieden). 20
!Siehe W.A. Kurylowicz et al, Numerical Taxonomy of Streptomycetes, Polish Medical Publishers, Warschau j (1975). ί
Für die Berechnung der Ähnlichkeitskoeffizienten werden als Eigenschaften hauptsächlich physiologische Charakteristiken herangezogen. Durch Messung aller anderen Stämme gegenüber der Kultur A51568.1 werden Vergleiche durchgeführt. Der Kultur A51568.1 wird daher im Vergleich mit ihr selbst die Bewertungszahl 100 zugeordnet. Die bei diesen Untersuchungen erhaltenen Vergleiche sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengefaßt.
- 23 Tabelle 7
Ähnlichkeitskoeffizienten zwischen der Kultur A51568.1 und mehreren Bezugsstämmen von Nocardia
Kultur Koeffizient
A51568.1 100
NRRL 2451 95
NRRL 2452 95
ATCC 19795 86
Nocardia orientalis (Verbund aus 21 Stämmen) 89
Nocardia aerocolonxgenes 76
Nocardia hirsuta 68
Nocardia autotrophia 65
Nocardia dassonvillei 63
Nocardia madurea 63
Nocardia brasiliensis 61
Nocardia caviae 61
Nocardia transvalensis 57
Nocardia amarae 53
Nocardia vaccinii 50
Nocardia asteroides 47
Nocardia carnea 47
Nocardia pelletieri 39
Ein Vergleich der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen der Kultur A51568.1 und Nocardia orientalis ATCC 19795
geht aus folgender Tabelle 8 hervor.
- 24 Tabelle
Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen der Kultur A51568.1 und der Kultur ATCC 19795 .
Ähnlichkeiten Unterschiede
Säure aus Kohlenhydraten Züchtungscharakteristiken
Lufthyphen auf gleichen Medien: Katalasebildung Farbe des Luftmyzels
Zellwandart Typ IV Farbe der Unterseite
10 Anwesenheit von Conidien Lösliches Pigment
Züchtungscharakteristiken Zersetzung von Xanthin
Zersetzung von: NaCl-Verträglichkeit
Casein Nitratreduktion
DNA Resistenz gegenüber Novo
biocin Hypoxanthin
Tyrosin '
Fragmentierung von Myzel Gelatineverflüssigung Hydrolyse von: Aesculin Hippurat Magermilch Stärke
Unvermögen zur Zersetzung von Adenin Fehlen von Melanoidpigmenten Morphologie Phosphatasebildung Resistenz gegenüber:
Lysozym Penicillin Rifampin
Empfindlichkeit gegenüber Bacitracin Sporenform Ornamentierung der Sporenoberfläche Anfärbreaktion
Zuckermuster von Gesamtzellenhydrolysaten vom Typ A
- 25 Tabelle 8 (Fortsetzung)
Ähnlichkeiten Unterschiede
5 Überleben bei 500C während 8h Temperaturbereich (10 bis 4O0C) Ureasebildung
Verwertung organischer Verbindungen Vegetatives Wachstum in CSM-Medium
Die Kultur A51568.1 ist beim Northern Regional Research Center, U.S. Department, of Agriculture, Agricultural Research. Service, Peoria, Illinois 61604, V.St.A., hinterlegt und bildet Teil der dortigen Kulturensammlung, wovon sie unter der Nummer NRRL 15232 frei bezogen werden kann.
Teil der Erfindung sind ferner auch die pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Salze der Faktoren A und B des Antibiotikums A51568. Pharmazeutisch unbedenkliche Salze sind Salze, bei denen die Toxizität der Verbindung als Gesamtes gegenüber warmblütigen Tieren im Verhältnis zur Nichtsalzform nicht erhöht ist. Zu typischen und geeigneten Salzen der Faktoren A und B des Antibiotikums A51568 gehören die Säureadditionssalze, die durch übliche Umsetzung mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise mit Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure und Fumarsäure, und auch die Salze, die von der Carboxyl- ,.
gruppe mit starken Basen gebildet werden, wie mit Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Ammoniumhydroxid, Diethanolamin und ähnlichen Basen.
Die Wirksamkeit des Faktors A des Antibiotikums A51568 gegenüber einer Reihe von Bakterien, und zwar bestimmt durch die Agar-Verdünnungsmethode, geht aus der folgenden Tabelle 9 hervor, worin die Werte für die minimale Hemmkonzentration (MHK-Werte) angegeben sind.
. - 26 Tabelle 9
Wirksamkeit des Faktors A von A51568 gegenüber einer Reihe
von Bakterien
.
Bakterien / MHK-Werte fμg/ml)
Staphylococcus aureus
3055* 0,5
X400 1
V138 · 1
V140 1
V102 1
Staphylococcus epidermidis
222 1
270 2
285 2
219 1
269 2
Streptococcus pyogenes
C203 0,5
ATCC 10389 0,5
Streptococcus sp_. Gruppe B 25
5 4
14 0,5
Streptococcus sp. Gruppe D
X66 1
9960 4
2041 2
8043 1
9901 2
- 27 |i_9 (Fortsetzung)
Bakterien __, MHK-Werte (pg/ml)
Streptococcus sp. Gruppe D
12253F 1
Mxl61 1
2058 4
Streptococcus pneumoniae
Park I 0,125
' . ' · ;; . Bl-438 . \' ' ' " ',;' \ ';'. '.. '. ,.; 0/5 < : . \ , ;.;';.
Haemophilus parainfluenzae
7901 64
9796 64
Haemophilus influenzae
CL. 32
Mx366 32
Mx371 .64
76 64
Bond 64
16836 128 -
4842 32
312 128
. - ' . ; . ,
*Name und Zahl, die unter jedem Organismus auftauchen, kennzeichnen den Stamm des für den Versuch verwendeten Organismus.
30 Die in vitro-Wirksamkeiten der Faktoren· A und B des Antibiotikums A51568 gegenüber einer Anzahl aerober Bakterien sind unter Anwendung eines üblichen Agar-Verdünnungsversuchs bestimmt worden. Die durch Ablesung des Endpunkts nach 24 Stunden bestimmten Ergebnisse gehen aus der folgen-
den Tabelle 10 hervor.
- 28 Tabelle 10
Wirksamkeit der Faktoren A und B von A51568 gegenüber aeroben Bakterien
Versuchsorganismus MHK-Werte (pg/ral)
JL B Staphylococcus aureus 3055 (Xl.1) 1 2
Staphylococcus aureus V41 1 2
Staphylococcus aureus X400 2 2
Staphylococcus aureus S13E 1 2
Staphylococcus epidermidis EPIl 2 2 Staphylococcus epidermidis EPI2 1
Staphylococcus epidermidis 222 - 2
Streptococcus pyogenes C203 1 0,5
Streptococcus pneumoniae Park I 0,5 0,6 Streptococcus sp. Gruppe D X66 1 1 Streptococcus sp. Gruppe D 9960 4 -
Streptococcus sp. Gruppe D 2041 2
Haemophilus influenzae (sensitiv) Holt 64 -
Haemophilus influenzae
(resistent) R252 128
Haemophilus influenzae
(sensitiv) CL. - 128
25 Haemophius influenzae (resistent) 76
Escherichia coli NlO Escherichia coli EC14
Escherichia coli TEM 30 Klebsieila pneumoniae X26 Klebsiella pneumoniae KAE Klebsiella pneumoniae X6B
- 64
>128 >128
>128 >128
128 >128
>128 >128
>128 >128
>128
1 Die Faktoren A und B des Antibiotikums A51568 haben sich auch bei einer Untersuchung gegenüber einer Anzahl anaerober Bakterien als wirksam erwiesen, wie aus der folgenden Tabelle 11 hervorgeht, und die darin angeführten MHK-Werte
5 sind durch die Agar-Verdünnungsmethode bestimmt worden.
Tabelle
Wirksamkeit der Faktoren A und B von A51568 gegenüber an-10 aeroben Bakterien "' '
Versuchsorganismus MHK-Werte (μς/τη!)
Clostridium difficile 2994 Clostridium perfringens 81 Clostridium septicum 1128 Eubacterium aerofaciens 1235 Peptococcus asaccharolyticus 1302 Peptococcus prevoti 1281 Peptostreptococcus anaerobius 1428 Peptostreptococcus intermedius 1264 Propionibacterium acnes 79 Bacteroides fragilis 111 Bacteroides fragilis 1877 Bacteroides fragilis 1936B Bacteroides thetaiotaomicron 1438 Bacteroides melaninogenicus 1856/28 Bacteroides melaninogenicus 2736 Bacteroides vulgatis 1211 Bacteroides corrodens 1874 Fusobacterium symbiosum 1470 Fusobacterium necrophorum 6054A
A B 1
2 1
1 1
1 1
2 1
16 4
32 2
1 1
1 2
1 32
32 16
32 32
32 32
32 >128
>128 >128
16 4
32 32
32 32
2 128
2
1 Der Faktor A des Antibiotikums A51568 ist auch gegenüber einer Anzahl von Stämmen von Clostridium difficile wirksam, wie eine Bestimmung durch die Agar-Verdünnungsmethode ergeben hat. Die Ergebnisse dieser Versuche gehen aus
der folgenden Tabelle 12 hervor.
Tabelle 12
Wirksamkeit des Faktors A des Antibiotikums A51568 gegen-Iο über Stämmen von Clostridium difficile
Clostridium difficile MHK-Werte (pg/ml)
• 8484 2
6890 2
2634 2
78 2
A-194 2
A-195 2
A-196 2
A-279 2
A-280 2
A-281 2
WAL-2112 2
WAL-3657 2
WAL-4268 2
107B 2
HlF 2
1153 2
3424-5B 2
3816 2
3950D 2
1 ,79 ' . 2' 5
3 ,03 7 , 94
2 ,71 2, 5
Die Faktoren A und B des Antibiotikums A51568 haben auch in vivo eine antimikrobielIe Wirksamkeit gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen gezeigt. Verabreicht man zwei Dosen der zu untersuchenden Verbindung subkutan an Mäuse mit den jeweiligen Infektionen, dann wird die dabei beobachtete Wirksamkeit in Form der ED50-Werte gemessen (wirksame Dosis in mg/kg, zum Schutz von 50 % der Versuchstiere, J. Bacteriol. 81 (1961) 233 bis 235). Hierbei ergeben sich für die Faktoren A und B des Antibiotikums A51568 folgende ED^-Werte (in Einheiten an mg/kg χ 2) :
' A B
Staphylococcus aureus 3055 15 Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumoniae Park I
Einer der Gesichtspunkte der Erfindung besteht auch in der Schaffung eines Verfahrens zur Behandlung von Infektionen bei Mensch und Tier, das darin besteht, daß man einem Menschen oder Tier eine nichttoxische antibiotisch wirksame Dosis zwischen etwa 25 mg und etwa 2000 mg entweder des Faktors A des Antibiotikums A51568 oder des Faktors B von A51568 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hier-
25 von verabreicht.
Bei der Behandlung von Infektionen beim Menschen wird das Antibiotikum auf parenteralem Weg verabreicht, beispielsweise durch intramuskuläre Injektion oder intravenöse Infusion. Zur Injektion wird das Antibiotikum oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon in einem physiologisch unbedenklichen Verdünnungsmittel mit der gewünschten Konzentration gelöst und. verabreicht. Zu geeigneten-Lösungsmitteln gehören beispielweise Wasser zur Injektion, 0,9 %-ige Kochsalzlösung, 5 %-ige Dextroselösung, Ringer-Lösung oder sonstige herkömmlich verwendete Verdünnungsmittel. Zur Verabreichung durch intravenöse Infusion kann man das Antibiotikum oder SaIz^
hiervon in einer physiologischen Flüssigkeit oder einer verdünnten Nährlösung mit einer geeigneten Konzentration zubereiten, beispielsweise mit einer Konzentration zwischen etwa 5 % und etwa 10 %, und langsam mit der Flüssigkeit infundieren. Wahlweise läßt sich das Antibiotikum auch durch die sogenannte Huckepack-Methode verabreichen.
Das Antibiotikum oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon kann in Einheitsdosierungsformulierungen in herme-
1^ tisch verschlossenen Ampullen, sterilen und mit Kautschukstopfen verschlossenen Fläschchen oder in Kunststoffbeuteln zubereitet sein. Solche Einheitsdosierungsformen können Hilfsstoffe enthalten, wie Antioxidationsmittel, SoIubilisierungsmittel, Dispergiermittel, Puffer und dergleichen. Eine solche Einheitsdosierungsformulierung enthält 100 mg Faktor A oder B von A51568 oder ein pharmazeutisch annehmbares nichttoxisches Salz hiervon in einem mit einem Kautschukstopfen (Butylkautschuk) verschlossenen Fläschchen. Eine andere Einheitsdosierungsformulierung enthält 250 mg Faktor A oder B des Antibiotikums A51568 oder eines Salzes hiervon in einer sterilen verschlossenen Ampulle.. Eine zur intravenösen Infusion geeignete erfindungsgemäße Einheitsdosierungsformulierung enthält 5 g Faktor A oder B des Antibiotikums A51568 oder eines pharmazeutisch annehm-
25 baren Salzes hiervon in einem Kunststoffbeutel.
Verwendet man den Faktor A oder B des Antibiotikums A51568 als antibakterielles Mittel, dann kann die Verabreichung entweder oral oder parenteral erfolgen. Der Faktor A oder B des Antibiotikums A51568 wird natürlich gewöhnlich zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Die Dosis an Faktor A oder B des Antibiotikums A51568 ist abhängig von einer Reihe von Betrachtungen, wie beispielsweise der Art und Stärke der jeweils zu behandelnden Infektion. Für eine Verabreichung geeignete Dosierungsbereiche und/oder Dosierungseinheiten lassen sich vom Fachmann unter Berücksichtigung
der hierin angegebenen MHK-Werte und ED,-n-Werte zusammen mit Faktoren, wie dem Patienten oder Wirt und dem infizierenden Organismus, bestimmen.
Die Faktoren A und B des Antibiotikums A51568 eignen sich unter anderem zur Unterdrückung des Wachstums von Organismen von Staphylococcus, Streptococcus und Propionibacterium acnes, so daß sich dieses Antibiotikum beispielsweise zur Behandlung von Akne verwenden läßt. Für eine Behandlung der
1^ Haut können die Faktoren A und B von A51568 in gereinigtem Zustand in pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln formuliert sein, wie Isopropylalkohol. Solche Lösungen können Antibiotikumkonzentrationen von etwa 1 bis etwa 15 Gew.-% pro Volumen aufweisen. Wahlweise kann das Antibiotikum zur Behandlung der Haut auch zu Cremes oder Lotionen formuliert sein.
Die Faktoren A und B von A51568 eignen sich auch zur Unterdrückung des Wachstums von Organismen von Clostridium difficile, die im Intestinum pseudomembranöse Colitis verursachen. Die Faktoren A und B von A51568 können daher auch zur Behandlung pseudomembranöser Colitis durch orale Verabreichung einer wirksamen Dosis des Antibiotikums oder eines pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Salzes hiervon in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform zubereitet verwendet werden. Hierzu kann man den Faktor A oder B von A51568 in Gelatinekapseln oder in flüssiger Suspension verabreichen.
Die Faktoren A und B von A51568 werden durch Züchtung des bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus Nocardia orientalis NRRL 15232 oder einer A51568 bildenden Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität hergestellt. Der Großteil der antibiotischen Ak-
tivität findet sich in der Brühe, während geringere Mengen an antibiotischer Aktivität auch im Myzel vorhanden sind. Das Antibiotikum läßt sich vom Fermentationsgemisch am leichtesten durch Entfernung des Myzels, nämlich der Bio-
° masse, durch Filtration abtrennen. Das Antibiotikum wird dann aus der filtrierten Fermentationsbrühe isoliert, und zwar vorzugsweise durch Säulenchromatographie über ein geeignetes Adsorbens unter Verwendung eines entsprechenden Elutionsmittels.
Zu geeigneten Adsorbentien gehören Kohle, Anionen- und Kationenaustauscherharze, Polyamide, Carboxymethylcellulosen, hochporöse Copolymerisate aus Styrol und Divinylbenzol, wie Diaion HP-20, die Amberlit-XAD-Harze und die Duoli.t-Harze,wie' die durch Vernetzung von Dextran hergestellten hydrophilen unlöslichen Molekularsiebe zur.Chromatographie und auch die TSK-GeIe. Bei den Diaion-Harzen handelt es sich um ein Produkt von Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokyo, Japan. Die Amberlit-XAD-Harze werden von Rohm und Haas, Philadelphia, Pennsylvania, V.St.A. hergestellt. Die Duolit-Harze sind Produkte von Diamond Shamrock, Redwood City, California, V.St.A. Die Sephadex-Harze werden von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden hergestellt. Die TSK-GeIe sind erhältlich von E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, und von Bio-Rad, 2200 Wright Ave., Richmond, California 94804, V.St.A.
Für die Bildung der Faktoren A und B von A51568 durch Nocardia orientalis NRRL 15232 läßt sich eine Anzahl verschiedener Medien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Produkts sind jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Diese Medien sollen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthalten.
Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Kartoffelstärke, Rohrzuckermelasse, Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose und Stärke. Optimale Mengen an Kohlenstoffquellen liegen
- 35 1 zwischen etwa 2 und etwa 5 Gew.-%.
Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Natriumglutamat, Fleischpepton, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Sojabohnenschrot und Hefe.
Essentielle Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus notwendig sind, können als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen der Medien in Me η - gen vorkommen, die für den Wachstums- und Biosynthesebedarf des Organismus ausreichen. Es kann jedoch günstig sein, den Kulturmedien weitere lösliche anorganische Nährsalze einzuverleiben, die für Ionen von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Phosphat, Sulfat,
15 Nitrat und ähnlichem sorgen.
Wird die Schaumbildung zu einem Problem, dann kann der Zusatz geringer Mengen (nämlich Mengen von 0,2 ml/1) eines Antischaummittel, wie Propylenglykol, zu großtechnischen Fermentationsmedien notwendig sein.
Geringe Mengen an Faktoren A und B von A51568 lassen sich zwar bereits durch Schüttelkolbenkultur erhalten, doch ist eine submerse aerobe Fermentation in Tanks zur Bildung wesentlicher Mengen an Antibiotikumgemisch bevorzugt. Bei einer Tankfermentation wird vorzugsweise von einem vegetativen Impfgut Gebrauch gemacht. Das vegetative Impfgut wird hergestellt durch Beimpfung eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Myzel- bruchstücken, wodurch man eine frische und aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Impfgut wird dann in einen größeren Tank übertragen, in dem nach einer geeigneten Inkubationszeit das Antibiotikumgemisch A51568 in optimaler Ausbeute gebildet wird.
Eine andere Methode zur Bildung eines Impfguts für das vegetative Medium besteht in einem Ersatz der wäßrigen Spo-
rensuspension durch ein lyophilisiertes Pellet. Lyophilisierte Pellets werden in bekannter Weise hergestellt. Die Herstellung der Sporensuspension zur Lyophilisierung ist ähnlich wie die Herstellung der wäßrigen Sporensuspension, mit Ausnahme der Verwendung eines sterilen Kälberserums anstelle von sterilem destilliertem Wasser.
Man kann NRRL 15232 über einen breiten Temperaturbereich von etwa 25 bis etwa 37°C wachsen lassen. Zu einer optimä-1^ len Bildung des Antibiotikumgemisches Ά515.6,8 scheint es bei einer Temperatur von etwa 32 bis 34°C zu kommen.
Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird durch das Kulturmedium sterile Luft verteilt. Für ein wirksaines Wachstum des Organismus liegt das bei einer Tankproduktion angewandte Luftvolumen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,25 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute (V/V/min) bei einer Durchmischung unter etwa 100 bis etwa 300 UpM. Ein optimales Ausmaß an Belüftung bei einem 165 1-Fermenter, der 100 1 Fermentationsmedium enthält, liegt bei etwa 0,15 V/V/min unter Durchmischung mit einem unter einer Geschwindigkeit von etwa 200 UpM rotierenden Flügelrührer. . "
Die antibiotische Aktivität ist im allgemeinen nach etwa 24 Stunden vorhanden und bleibt wenigstens 168 Stunden während der Fermentationsdauer erhalten. Zu einer maximalen Produktion an Antibiotikum kommt es nach einer Ferraentatiönsdauer von etwa 90 bis etwa 114 Stunden.
Zur Erhöhung der Produktion an Antibiotikumgemisch kann man das Medium in einer Menge von 5x10 Mol mit p-Hydroxyphenylglycin versetzen. Bei einem Versuch hat ein solcher Zusatz eine Erhöhung der Produktivität um 64 % er-
35 geben.
Die Produktivität wird auch durch den Phosphatspiegel be-
— 4 '
einflußt. Eine Phosphatanreicherung um nur 3 χ 10 Mol (0,05 mg/ml) hat bei einem Versuch eine Ausbeuteerniedrigung um 20 % ergeben.
° Die antibiotische Aktivität ist im Überstand vorhanden.
Zur Probenentnahme zentrifugiert man eine Probe der Gesamtbrühe etwa 15 Minuten bei 1000 g und entfernt das Konzentrat für die Untersuchung. Die Untersuchung wird mikrobiologisch mit einem Agarplattentest unter Verwendung von Mi-1^ crococcus luteus ATCC 9341 durchgeführt.
Die Produktion an Antibiotikumgemisch A51568 kann während der Fermentation entweder durch Agardiffusion unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 oder durch Turbi- !5 dimetrie unter Einsatz von Staphylococcus aureus ATCC 9114 überwacht werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums der oben angegebenen Formel (I), das darin besteht, daß man Nocardia Orientalis NRRL 15232 oder eine A51568 bildende Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität züchtet.
Ausführungsbeispiele;
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.
Beispiel --"'I 35 Herstellung eines Impfquts der ersten Stufe
Zur Verwendung bei einer Schrägagarkultur von Nocardia
- 38 orientalis NRRL 15232 wird das folgende Medium hergestellt.
Bestandteile Menge (g/l)
Vorgekochtes Hafermehl 60,0
Hefe . ' ;.. . · '\ . .; ;-" ':. 2,5
K2HPO4 1,0
Czapek-Mineralgrundmischung 5,0 ml/1
Agar ./.'.. V , ." -. ::".\"' ' "· ; ; · , 25,0
Deipnisiertes Wasser qs auf 1,0 1
•ίο ; . . .; ; . . , ·. ·.. . , .. . ;. - . . ·. . . ·' ·
Die Czapek-Mineralgrundmischung wird aus folgenden Bestandteile hergestellt.
Bestandteile Menge (g/100 ml)
' —:—", ". - '' "— : ' -——— — ________
KCl 10,0
MgSO4.7H2O 10,0
FeSO4.7H2O 0,2
Deionisiertes Wasser qs auf 100 ml
' ' ' ' "- ' " ' ·.'. · ' ' ...·. . Vorsterilisation bei pH 6,2. Einstellung auf pH 7,3 mit wäßriger Natriumhydroxidlösung^ Nachsterilisation bei pH
'. ' 6,7.'.. . ' ' ' . ': :: *-:'\' ' ' . Γ - ..i.V." '. ' ; .'. : :.; ' '
Man beimpft aus den oben angegebenen Bestandteilen herge-
ο π . .· . . · ./.'....' ' .· .·.
stellten Schrägagar mit Sporen von Npcardia orientalis NRRL 15232 und bebrütet den so beimpften Schrägagar dann 7 Tage bei etwa 3O0C. Die reife Schrägagarkuitur wird dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und mit einem sterilen Werkzeug unter Ablösen der Sporen und des Myzels abgekratzt. 1 ml der erhaltenen Sporensuspension wird zur Beimpfung von 50 ml vegetativem Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet.
Bestandteile Menge (g/l)
'— —— — — . .
Kartoffeldextrin 30,0
Rohrzückermelasse 20,0
Bactopepton (Difco Laboratories) 7,0
1 Bestandteile Menge (g/l)
L-Tyrosin 1,0
Deionisiertes Wasser qs auf 1,0 1
Das Gemisch hat einen pH von 5,5, der vor Sterilisation mit wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt wird. Nach Sterilisation beträgt der pH 6,1.
Das vegetative Impfgut wird in einem 250 ml-Erlenmeyer-1^ Weithalskolben bei etwa 300C etwa 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler bebrütet, der sich in einer Kreisbahn von etwa 5 cm mit 250 UpM bewegt. Dieses bebrütete Medium verwendet man entweder zur Beimpf ung kleiner Fermenter (wobei das Impfgut 0,8 Prozent pro Volumen des Mediums beträgt) oder zur Beimpf ung von Kolben der zweiten Stufe zur Herstellung eines größeren Volumens an Impfgut.
Fermentation von A51568.1
Man beimpft 100 1 eines Produktionsmediums mit 0,8 % (800 ml) des obigen bebrüteten vegetativen Mediums. Das Produktionsmedium hat folgende Zusammensetzung.
Bestandteile Menge (g/l)
25 Polypropylenglykol (2000) 0,2
Kartoffeldextrin 30,0
Rohrzuckermelasse 20,0
Bactopepton (Difco Laboratories) 7,0
L-Tyrosin 1,0
30 Deionisiertes Wasser qs auf 100 1
Das Medium hat einen pH von 5,2, der mit 5n Natriumhydroxid auf 7,1 eingestellt wird. Das Medium wird bei 121°C und 1,2 bis 1,3 bar während 45 Minuten sterilisiert. Nach Sterilisation hat das Medium einen pH von 6,2.
Das beimpfte Produktionsmedium läßt man in einem 165 1-Fermentationstank etwa 114 Stunden bei einer Temperatur von
300C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einer Menge von 0/15 V/V/min belüftet und mit herkömmlichen Rührern bei etwa 200 UpM gerührt,
Die antibiotische Aktivität ist im Überstand des Fermentationsgemisches vorhanden. Das Vorliegen der antibiotischen Aktivität wird geprüft durch Zentrifugierung einer Probe der Gesamtbrühe bei 1000 g und Dekantierung des Zentrifugats zur Untersuchung. Die Probe wird mit einem Phosphatpuffer von pH 6,0 verdünnt und mikrobiologisch in einem Agarplattentest unter Verwendung von Micrococcus luteus ATCC 9341 als Versuchsorganismus untersucht.
B e i s ρ i e 1 2
" ' . . ' . -. - ' '; ' '., ' ' ' . . · .-. -' . ... Isolierung des Antibiotikumgemisches A51568
3 1 gesamte Fermentationsbrühe des Antibiotikums A51568, die die Faktoren A und B in einem Verhältnis von etwa 95 : 5 enthält, versetzt man mit einer Diatomeenerde als Filterhilfe (Hyflo Supercel von Johns-Manville Corp.) und filtriert das Gemisch dann. Das FiItrat, das ein Volumen von 2,7 1 und einen pH von 7,8 hat, wird auf eine mit Diaion HP-20-Harz (ein hochporöses Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat in Perlenform von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan) gegeben, das sich in einer 3 χ 25 cm Chromatographiersäule befindet. Der Säulenabstrom wird verworfen, und die Säule wird mit 1 Liter Wasser und 500 ml 25 %-igem Methanol in Wasser gewaschen. Das
QQ Antibiotikumgemisch A51568 wird von der Säule mit zweimal je 500 ml an 50 %-igem Methanol in Wasser eluiert. Die Faktoren A und B werden in der gleichen Weise an HP-^20 adsorbiert und davon unter den gleichen Bedingungen eluiert. Bei dieser Stufe erfolgt daher keine Aüftrennung der Fak-
^c toren. Die Eluatfraktionen werden bezüglich ihrer antibiotischen Aktivität unter Verwendung von Bacillus subtilis geprüft. Die stärker aktiven Fraktionen werden auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert. Man gelangt
xu einem rohen Antibiotikumgemisch von A51568, das 905 mg wiegt und die Faktoren A und B in einem Verhältnis von etwa 95 : 5 enthält.
5 Beispiel 3
Reinigung des Antibiotikumgemisches von A51568
Das rohe Antibiotikumgemisch von A51568 aus obigem Beispiel 2 (905 mg) wird in 50 ml Wasser gelöst und auf Sephadex CM-25 (NH. -Form) (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gegeben, das in einer 1,7 χ 44 cm Chromatographiersäule enthalten ist. Der Abstrom wird verworfen, und die Säule wird mit 250 ml Wasser gewaschen. Die Säule wird dann mit einem konvexen Gradienten an Ammoniumbicarbonat (H3O ·* Im NH4HCO3, 100 ml Mischkammer) eluiert. Es werden 50 Fraktionen mit jeweils 25 ml gesammelt und bezüglich ihrer antibiotischen Aktivität unter Anwendung des Versuchs mit Bacillus subtilis geprüft. · ·
Die aktiven Fraktionen, nämlich die mit einer antibiotischen Aktivität, werden zusammengefaßt. Die Faktoren A und B werden bei Verwendung von Sephadex CM-25 unterschiedlich adsorbiert und eluiert, und die am Faktor A reichen Fraktionen sind daher nicht die gleichen Fraktionen wie die am Faktor B reichen Fraktionen. Im Gemisch ist die Menge an vorhandenem Faktor B klein im Vergleich zur Menge an Faktor A, so daß die am Faktor B reichen Fraktionen eine verhältnismäßig niedrige antibiotische Aktivität im Vergleich zu den am Faktor A reichen Fraktionen aufweisen. Die zusammengefaßten Fraktionen enthalten verhältnismäßig wenig Faktor B. Zur Entsalzung des Produkts werden die zusammengefaßten Fraktionen auf eine 1,7 χ 10 cm messende Chromatographiersäule aus Diaion-HP-20-Harz gegeben, die man vorher in Wasser äquilibriert hat, und die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen und mit 100 ml 50 %-igem Methanol in Wasser eluiert. Das Methanoleluat wird zur
Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und die Lösung mit 0,ln wäßriger Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Das angesäuerte Gemisch wird dann lyophilisiert. Man erhält 25 mg gereinigten Faktor A
5 des Antibiotikums A51568.
Die Isolierung des Faktors B erfolgt unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 3 und Untersuchung durch Hochleistungsflussigkeitschromatographie anstelle einer Untersuchung unter Verwendung von Bacillus subtilis. Dies ist notwendig, weil die letztgenannte Untersuchung nicht zwischen den Faktoren A und B unterscheidet. Durch Hochleistungsflussigkeitschromatographie lassen sich die an den Faktoren A und B reichen Fraktionen dagegen getrennt identifizieren und getrennt zusammenfassen. Die getrennten Sammlungen werden wie in der letzten Stufe von Beispiel 3 entsalzt, so daß sich ein an Faktor A reiches Produkt und ein zweites an Faktor B reiches Produkt ergibt.
20 B e i s ρ i e 1 4
Isolierung, Reinigung und Auftrennung der Faktoren A und B yon A51568 .
2° Zur Abtrennung des Gemisches der Faktoren A und B von
A51568 aus der Gesamtbrühe von A51568 wird die Gesamtbrühe durch eine Diatomeenerde als Filterhilfe (Hyflo Supercel) filtriert· Nach Einstellung des pH-Werts des Fiitrats auf 6,0 bis 6,5 mit 5n HCl gibt man Ionac X-236-Harz (H+) zu (4i Harz auf 100 1 Filtrat) und rührt das Gemisch zur Adsorption der Aktivität. Der Überstand wird verworfen, und das Harz wird mit Wasser (10-faches Volumen des Harzes) gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen und das X-236-Harz in eine Säule gefüllt, die mit 0,ln Ammoniumhydrochlorid (5 Säulen Volumina) eluiert wird. Die 4 1-Fraktionen werden unmittelbar mit 5n HCl neutralisiert. Die antibiotische Aktivität wird durch Staphylococcus aureus und
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht. Die die Faktoren A und B von A51568 enthaltenden Fraktionen werden zusammengefaßt und zur Entsalzung des Gemisches auf eine mit Diaion HP-20-Harz gefüllte Säule gegeben. Der Abstrom wird verworfen. Das Harz wird dann mit 5 %-igem Isopropyl-* alkohol eluiert, der 0,1 % H3PO4 enthält. Es werden Fraktionen von jeweils 500 ml gesammelt und bezüglich ihrer antibiotischen Aktivität überwacht.. Die aktiven Fraktionen werden zusammengefaßt, konzentriert und lyophilisiert. Das erhaltene unreine Material enthält etwa 95 % des Faktors A von A51568 und 5 % des Faktors B von A51568.
Zur weiteren Reinigung des Produkts und zur gleichzeitigen Auftrennung der Faktoren A und B wird das unreine Gemisch
1^ der Faktoren A und B in Wasser gelöst und auf eine mit CM-Sephadex-C-25 gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten aus Wasser bis zu 0,25n NH4HCO., eluiert. Die Fraktionen werden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht, und die den Faktor α enthaltenden Fraktionen werden getrennt von den den Faktor B enthaltenden Fraktionen zusammengefaßt.
Zur Entfernung des in der vorherigen Stufe zugesetzten Salzes gibt man jede Sammlung auf eine mit Diaion-HP-20-Harz gefüllte Säule, die man mit 5 %-igem Isopropylalkohol eluiert, der 0,1 % H3PO4 enthält. Die geeigneten Fraktionen aus jeder Säule werden auf Basis der Untersuchung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zusammengefaßt. Die beiden Sammlungen werden konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu praktisch reinem Faktor A von A51568 und zu praktisch reinem Faktor B von A51568 gelangt.

Claims (4)

1 Erfindungsansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums der
Formel (I)
Glucose-Vancosamin
worin η für 1 oder 2 steht, dadurch gekenn ze ichnet , daß man Nocardia orientalis NRRL 15232
oder eine A51568 bildende Mutante oder Variante hiervon
in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität züchtet.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer weiteren Stufe
den Faktor A des Antibiotikums A51568 aus dem Kulturmedium isoliert.
-45-
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer weiteren Stufe den Faktor B des Antibiotikums A51568 aus dem KuI-turmedium isoliert.
4. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1,2 oder 3, d a d u r c h ge k en η ze i ohne t / daß es den Mikroorganismus Nocardia orientalis NRRL 15232 und assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat/ Stickstoff und anorganische Salze enthält.
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