DD146618A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A-21978. Ziel der Erfindung ist die Schaffung neuer Antibiotika mit guenstigeren Eigenschaften. Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz man Streptomyces roseosporus NRRL 11379 oder eine A-21978 produzierende Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen fuer Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen so lange zuechtet, bis eine betraechtliche Menge an antibiotischer Aktivitaet gebildet worden ist. Das erhaltene A-21978 Gemisch oder ein Salz hiervon wird aus dem Kulturmedium abgetrennt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A-21978.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Es gibt zwar bereits eine Reihe bekannter antibakterieller Mittel, doch besteht immer noch Bedarf an besseren Antibiotika. Die Antibiotika unterscheiden sich in ihrer Wirksamkeit gegenüber pathogenen Organismen, und es entwickeln sich ständig neue Organismenstämme, die gegenüber den gegenwärtig verwendeten Antibiotika resistent sind. Einzelne Patienten leiden darüber hinaus auch häufig an ernsten Reaktionen gegenüber speziellen Antibiotika infolge einer Hpyersensitivität und/oder toxischer Effekte. Es besteht daher ständig die Notwendigkeit für neue und bessere Antibiotika.

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Bei den Antibiotika A-21978C handelt es sich um engverwandte saure Peptidantibiotika. Zu bisher bekannten Vertretern aus dieser Klasse von Antibiotika gehören Chrystallomycin, Amphomycin, Zaomycin, Aspartocin und Glumamycin /"Antibiotics-Origin, Nature and Properties," Band I, Pergamon Press, New York, N, Y., 1976, Seiten 397 - 401 und 404 - 408/; Tsushimycin /J. Antibiotics 21, 439 - 443 (19682./; Laspartomycin /J. Antibiotics 21, 55 (19682./; Brevistin /J. Antibiotics 29, 380 389 (1976j_/; Cerexin A /J. Antibiotics 29, 1268 - 1274 (19762/ ^und. Cerexin B /J. Antibiotics 29, 1275 - 1280 (1976J_/. Von diesen Antibiotika dürften Brevistin, Cerexin A und B diejenigen bekannten Antibiotika sein, die mit den neuen Antibiotika A-21978C am engsten verwandt sind.

Ziel der Erfindung:

Infolge der oben geschilderten Nachteile der bekannten Antibiotika ist Ziel der Erfindung die Schaffung neuer Antibiotika mit günstigeren Eigenschaften.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Die Erfindung betrifft die Herstellung antibiotischer Substanzen. Sie befaßt sich insbesondere mit der Bildung antibiotischer Gemische, die mehrere Faktoren enthalten. Das Gemisch A-21978 enthält hauptsächlich den Faktor C und ferner auch die Faktoren A, B, D sowie E. A-21978 Faktor C ist ein Gemisch aus eng miteinander verwandten antibiotischen Faktoren unter Einschluß einzelner A-21978C Faktoren C_, Cj, C₂, C₃, C₄ und C₅. A-21978 Faktor C wird daher vorliegend als A-21978C-Gemisch bezeichnet.- Die Salze von A-21978 Gemisch und A-21978C Gemisch sowie von den einzelnen A-21978C Faktoren Cq, C₁, C₃, C₃, C₄ und C₅ bilden ebenfalls Teil der Erfindung. . . ,

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Unter einem Gemisch wird in der Fermentationstechnik und auch vorliegend ein Gemisch aus gleichzeitig gebildeten einzelnen antibiotischen Faktoren verstanden. Anzahl und Verhältnis der in einem antibiotischen Gemisch gebildeten Einzelfaktoren können selbstverständlich in Abhängigkeit von den jeweils angewandten Fermentationsbedingungen verschieden sein. Im Gemisch A-21978C stellen die Faktoren C../ Cj und Cj die vorwiegenden Faktoren dar, während die Faktoren C_Q, C₄ und' C₅ nur in geringerer Menge vorhanden sind.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entstandenen antibiotischen Substanzen werden hierin willkürlich als A-21978 Antibiotika bezeichnet. Bei der Diskussion der Brauchbarkeit dieser Substanzen wird der Einfachheit halber lediglich die Angabe A-21978 Antibiotikum verwendet, um hierdurch das Gemisch A-21978, das Gemisch A-21978C, die A-21978C Faktoren C_Q, C., C₃, C₃, 'C₄ und C₅ sowie die pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon zu bezeichnen.

Die Erfindung ist somit auf ein A-21978 Antibiotikagemisch gerichtet, das durch submerse aerobe Züchtung von Streptomyces roseosporus NRRL 11379 oder einer A-21978 bildenden Mutante hiervon hergestellt wird.

Weiter ist die Erfindung auch auf das A-21978C Antibiotikagemisch sowie die Faktoren C_Q, C₁, C', C₃, C₄ und C₅ gerichtet, die Komponenten hiervon darstellen. Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von A-21978-Gemisch, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces roseosporus NRRL 11379 oder eine A-21978 bildende Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermen-

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tationsbedxngungen so lange züchtet, bis eine beträchtliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet worden ist.

Nach Bildung einer beträchtlichen Menge an antibiotischer Aktivität wird das A-21978 Gemisch abgetrennt, indem man die Fermentationsbrühe filtriert, den pH-Wert des Filtrats auf etwa pH 3 erniedrigt, das Gemisch ausfallen läßt und das Gemisch dann durch Filtrieren abtrennt. Das hierdurch erhaltene Gemisch kann gegebenenfalls durch übliche Extraktionstechniken weiter gereinigt werden. Zur Isolierung der einzelnen A-21978C Gemische und Faktoren sind chromatographische Verfahren notwendig. Die erfindungsgemäß erhaltenen A-21978 Antibiotika hemmen das Wachstum pathogener Organismen, und insbesondere gram-positiver Bakterien.

Infrarotabsorptiönsspektren (KBr-Pellets) der folgenden A-21978C Antibiotika (in Form der Natriumsalze) gehen aus den beigefügten Zeichnungen hervor:

Figur 1 - A-21978C Gemisch

Figur 2 - A-21978C Faktor C₁

Figur 3 - A-21978C Faktor C₂

Figur 4 - A-21978C Faktor C₃

Figur 5 - A-21978C Faktor C_Q

Figur 6 - A-21978C Faktor C₄

Figur 7 - A-21978C Faktor C₅ ,

Die erfindungsgemäß erhältlichen A-21978C Faktoren sind eng miteinander verwandte Peptidantibiotika. Bis zu 6 antibiotische Faktoren werden aus der Fermentationsbrühe gewonnen und fallen in Form eines Gemisches an, nämlich des A-21978C Gemisches. Die einzelnen Faktoren C_Q, Cj, C₃, C₃,

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C₄ und Cr werden in der im folgenden beschriebenen Weise in Form einzelner Verbindungen isoliert.

Die A-21978C Faktoren stellen eng miteinander verwandte saure cyclische Polypeptidantibiotika dar, die an der endständigen Aminogruppe eine Fettsäureacylgruppe aufweisen. Nach entsprechender Hydrolyse erhält man aus den einzelnen Faktoren folgende Aminosäuren:

Aminosäure	Anzahl	an Molen
Asparaginsäure*	4
Glycin	2
Alanin	1
Serin	1
Threonin	1
Tryptophan	1
Ornithin	1
Kynurenin	1
3-Methylglutaminsäure** 1

* Eine Komponente hiervon könnte Asparagin sein; ** Diese Komponente könnte von 3-Methylglutamin herrühren.

Jeder der Faktoren A-21978C enthält eine Fettsäure. Aus der folgenden Tabelle I geht der Gehalt an Kohlenstoffatomen und die Art der jeweiligen Fettsäure für die jeweiligen Faktoren A-21978C hervor.

21625 A

Tabelle

Fettsäure

A-21978C- Gehalt an

Faktor Kohlenstoffatomen Art

C₁ C₁₁ 8-Methyldecansäure

C2 *~12 10-Methylundecansäure

C₃ ^C13 10-Methyldodecansäure

^C0 ^C10

^C4 ^C12

^C5 ^C13

Substraktive Edman-Abbaureaktionen zeigen,, daß Tryptophan die N-endständige Aminosäure ist und daß die dazu benachbarte Aminosäure ein Asparaginsäurerest ist.

Gaschromatographische Massenspektraluntersuchungen anhand von A-21978C Faktor C~ weisen darauf hin, daß eine der folgenden Sequenzen die Struktur dieses Faktors sein könnte (Asx bedeutet Asparaginsäure oder Asparagin, und MeGIx bedeutet 3-Methylglutaminsäure oder 3-Methylglutamin):

1). C₁₁H₂₃C-N-TrP - Asx - Asx - Thr - GIy

Orn - Asx - AIa - Asx - GIy - Ser - MeGIx - Kvn

Sk

^{2) C}ll^H23^C~^N~^TrP - ^Äsx - ^Thr - GIy -

Asx - AIa - Asx - Asx - GIy - Ser - MeGIx -Xy_n

— "7 m»

Eine enzymatische Hydrolyse von A-21978C Faktor C₂ unter Verwendung von Carboxypeptidase Y bestätigt, daß Kynurenin die C-endständige Aminosäure ist und daß die C-endständige COOH-Gruppe die Hydroxylgruppe des Threoninrest verestern kann.

Aufgrund der obigen Untersuchungen dürften die A-21978C-Antibiotika folgende Struktur haben:

	L-As ο	GIy
	" V	D-Ser
D-AIa		3MG
τ Ii-Asp
L-Orn		,-Kyn
		/ O
GIy	L
\	- ^
	L-Thr
	r
	L-As ρ
	T
	L-As ο
	T "
	L-Trp
	I
	NH
	I
	R

Hierin steht 3MG für L-threo-3-Methylglutaminsäure, während R für einen entsprechenden Fettsäurerest steht, wobei die speziellen Reste R der einzelnen Faktoren folgende Bedeutungen haben:

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A-21978C Faktor Rest R

C1	8-Methyldecanoy1
C2	1O-Methylundecanoyl
C3	1O-Methyldodecanoy1
C0	C10-Alkanoyl*
C4 '	C12-Alkanoyl*
C5	C-.-Alkanoyl*

* = noch nicht genau bestimmt.

Das A-21978C Gemisch und die einzelnen Faktoren (in Form von Natriumsalzen) lösen sich in Wasser sowie in sauren und alkalischen Lösungen, außer bei pH-Werten von unter etwa pH 3,5, in niederen Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol, sowie in Dimethylformamid,- Dimethylsulfoxid, Dioxan und Tetrahydrofuran, sie lossen sich jedoch nur gering oder sind überhaupt unlöslich in Aceton, Chloroform, Diethylether, Benzol, Ethylacetat und Kohlenwasserstofflösungsmitteln. Die Salzformen des A-21978C Gemisches und der Faktoren sind löslich in Wasser, Methanol, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, jedoch unlöslich in Lösungsmitteln, wie Ethanol, Butanol und Dioxan.

Aus der folgenden Tabelle II geht die etwaige prozentuale Elementarzusammensetzurg des Natriumsalzes eines jeden Faktors A-21978C hervor.

Tabelle II ; A-21978C Faktor .

Element ^Co ^Cl ^C2 ^C4 ^C3 ^C5

berech- gefun- berech- gefun- berech- gefun- gefun- berech- gefun- gefun-

net den net den net den den net den den

Kohlenstoff	52,61	52,07	52,89	52,47	53,17	51,87	52,73	53,44	54	,18	52,76 .	I
Wasserstoff	6,07	5,95	6,14	5,93	6,21	6,05	5,99	6,28	6	,35	6,71	U I
Stickstoff	13,63	12,73	13,52	13,38	13,41	13,66	14,07	13,29	13	,34	13,97
Sauerstoff	26,28	25,84	26,06	26,19	25,84	25,85	25,81	25,63	25	,06	25,60
Natrium*	1,40	3,41	1,39	2,03	1,38	2,56	1,40	1,36	1	,07	0,96

* durch Differenzbildung

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Die Infrarotabsorptxonsspektren für. das A-21978C Gemisch und die Faktoren (in Form der Natriumsalze) in KBr-Pellets gehen aus den Figuren 1 bis 7 der beigefügten Zeichnung hervor. In Tabelle III sind die wichtigsten Äbsorptionsmaxima für alle diese Substanzen zusammengefaßt.

Tabelle

III

IR-Maxima (cm ) des Gemisches und der Faktoren von A-21978C

Gemisch

3300	3300	3310	3310	3320	33OO
3050	3040	3050	3040	3050	3045
2910	2910	2910	2910	2920	291O
2840	2840	2840	2835	2850	2840
1650	1650	1665	1650	1655	i65O
1540	1535	1535	1535	1525	1525
1445	1450	145O	1450	1455	1445
1395	* 1395	1400	1395 .	1395	1390
1215	1220	1225.	1225	1220	1215
1155	1160	1160	1160	1160	1155
1060 . ;	1065	1065	1060	1065	1055
745	745	745 .	745	740	735

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Die etwaigen Molekulargewichte und Molekularformeln der drei wesentlichen Faktoren von A-21978C gehen aus folgender Tabelle IV hervor.

Tabelle IV A-21978 Faktor Molekulargewicht Formel

^{: C}0 . ^{1622 C}72^H1OO^N16°27

^C1 * ^{1636 C}73^H1O2^N16°27

C₂ 1650 ^C74^H1O4^N16°27

C₃ 1664

C₄ 1650

^C5^{1664 C}75^H1O6^N16°27

In Tabelle V sind die Absoprtionsmaxima der Ultraviolettabsorptionsspektren der drei wesentlichen Faktoren von A-21978C (in Form ihrer Natriumsalze) in neutralem Ethanol zusammengefaßt.

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Tabelle V

UV-Maxima	E	C1	(Ethanol-neutral)	C2	C3
	307	1% 1cm	303	300
nm	62		62	63
223	39		41	42
260	35		36	38
280	33		33	32
290
360

Aus Tabelle VI geht eine Zusammenfassung der elektrometrischen Titrationswerte, und zwar bestimmt in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid, für die drei wesentlichen Faktoren von A-21978C sowie für das Gemisch A-21978C (in Natriumsalzform) hervor.

T a b e 1	1 e	VI
Titration	(66 5	I DMF)
pK -Werte* a

A-21978C

Faktor C₁** 5,7, 5,9; 7,2, 7,6

Faktor C₂** 5,8, 5,93; 7,6, 7,63

Faktor C₃** 5,73, 5,75; 7,54, 7,58

Gemisch 5,62; 7,16

Überall befinden sich schwächere Gruppen bei 11,5 bis 12; Zwei Bestimmungen durchgeführt.

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Die optischen Drehwerte der A-21978C Faktoren (Natrium-

25 salze), nämlich die /alpha/_n —Werte, b

gehen aus folgender Tabelle VII hervor

25 salze), nämlich die /alpha/_n —Werte, bestimmt in Wasser,

Tabelle VII Optische Drehwerte

A-21978C

Faktor Drehwerte

+11,9° (c 0,7, H₂O)

+16,9° (c 0,7, H₂O)

+18,6° (c 0,9, H₂O)

+20,9° (c 0,4, H₂O)

+14,8° (c 0,7, H₂O)

+17,9° (c 0,7, H₂O)

Die A-21978C Faktoren lassen sich durch Hochgeschwindigkeitsflüssxgchromatographie unter folgenden Bedingungen auftrennen:

Säule: Glas, 1 χ 21 cm

Packung: Silicagel/C.g (Quantum LP-i) Lösungsmittel: Wasser:Methanol:Acetonitril

(95:30:75) mit einem Gehalt an 0,2 % Essigsäure und 0,2 % Pyridin

Detektor: UV bei 285 nm

Druck: 7 bar

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Die bei einer derartigen Auftrennung ermittelten Retentionszeiten für die A-21978C Faktoren (Natriumsalze) sind in folgender Tabelle VIII zuammengefaßt:

Tabelle VIII Retentionszeiten in der Hochdruckflüssigchromatographie

Bioversuch (Micrococcus luteus) (Einheiten/mg)

A-21978C Faktor	Zeit (Minuten)
co	6
C1	8
C4	9
C2	13
C5	14
C3	19

966 1663 1420 1390 1246 803

Das A-21978C Gemisch läßt sich von A-21978 Faktoren A, B, D und E durch Einsatz einer Silicageldünnschichtchromatographie auftrennen und unterscheiden. Als bevorzugtes Lösungsmittel system wird hierzu ein 3:1 Gemisch aus Acetonitril und Wasser verwendet. Die bevorzugte Detektionsmethode stellt eine Bioautographie mit Micrococcus luteus dar. Die ungefähren R_-Werte dieser A-21978 Faktoren (in Form ihrer Natriumsalze) gehen aus der folgenden Tabelle IX hervor. .

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Tabelle IX

A-21978 Faktor R_f-Werte

A 0,66

B 0,57

C Gemisch 0,31

D 0,51

E. 0,48

Die Faktoren des Gemisches A-21978C lassen sich am besten durch Umkehrphasensilicagelchromatographie (C₁₈) auftrennen und voneinander unterscheiden. Das hierzu angewandte Lösungsmittelsystem ist vorzugsweise ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (45:15:40), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % Essigsäure enthält. Zur Detektion kann man langwelliges Ultraviolettlicht (365 nm) verwenden. Die ungefähren R_f-Werte für die A-21978C Faktoren (in Natriumsalzform) in diesem System gehen aus folgender Tabelle X hervor.

Tabelle X

A-21978C Faktor R_f-Werte

C₀0,71

C₁0,64

C₂0,56

C₃0,47

C₄0,63

C_ 0,53

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Die A-21978C Faktoren und das A-21978C Gemisch sind in Lösungen mit pH-Werten von 2 bis 9 bei 5 °C und 25 ⁰C wenigstens 7 Tage stabil. Sie sind bei einem pH-Wert von 11-nach 4 Tagen sowohl bei 5 ⁰C als auch bei 25 ⁰C instabil (totale Inaktivierung).

Das Gemisch A-21978, das Gemisch A-21978C und die einzelnen A-21978C Faktoren C_Q, C₁, C₂, C₃, C₄ und C₅ können Salze bilden. Diese Salze sind ebenfalls Teil der Erfindung. Solche Salze eignen sich beispielsweise zur Auftrennung und Reinigung der Gemische und der einzelnen Faktoren. Darüberhinaus sind pharmazeutisch unbedenkliche Salze besonders wertvoll. Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden dabei diejenigen Salze verstanden, durch die sich die Toxizität der jeweiligen Verbindung als Ganzes gegenüber Warmblütern in bezug auf die Nichtsalzform nicht erhöht.

Die A-21978 Antibiotika verfügen über bis zu fünf freie Carboxylgruppen, die Salze bilden können. Zur Erfindung gehören daher Teilsalze, Mischsalze und vollständige Salze. Eine Herstellung dieser Salze bei pH-Werten von über sollte vermieden werden, da die Antibiotika bei diesen Bedingungen instabil sind.

Die A-21978 Antibiotika verfügen weiter auch noch über zwei freie Aminogruppen, so daß sie Mono- oder Disäureadditionssalze bilden können.

Pharmazeutisch unbedenkliche Alkali-, Erdalkali- und Aminsalze sowie Säureadditionssalze sind besonders interessant. Zu Beispielen für geeignete Alkali- und Erdalkalisalze der A-21978 Antibiotika gehören die Natrium-, Kalium-, Lithium-,

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Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium·^ und Magnesiumsalze. Als Aminsalze der A-21978 Antibiotika kommen unter anderem die entsprechenden Ammoniumsalze sowie die primären, sekundären und tertiären C.-C.-Alkylammoniumsalze und Hydroxy-C^-C₂~alky!ammoniumsalze in Frage. Beispiele für geeignete Aminsalze sind diejenigen, die durch Reaktion eines A-21978 Antibiotikums mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sec-Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Diisopropylamin, Ethanolamin, Triethylamin oder 3-Amino-i-propanol entstehen.

Die Alkalisalze sowie die Erdalkalisalze der A-21978 Antibiotika werden nach zur Herstellung kationischer Salze üblichen Methoden gebildet. Zu diesem Zweck löst man beispielsweise die freie Salzform von A-21978C Faktor C₁ in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmem Methanol oder Ethanol, und versetzt die so erhaltene Lösung dann mit einer Lösung, die eine stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wäßrigem Methanol enthält. Das hierdurch entstehende Salz läßt sich in üblicher Weise isolieren, beispielsweise durch Filtrieren oder Verdampfen des Lösungsmittels.

In ähnlicher Weise lassen sich auch entsprechende Salze mit organischen Aminen herstellen. Zu diesem Zweck gibt man beispielsweise das jeweilige gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung von A-21978C Faktor C₁ in einem geeigneten Lösungsmittel,, wie Aceton, und entfernt im Anschluß daran das Lösungsmittel sowie das überschüssige Amin durch Verdampfen.

Beispiele für geeignete Säureadditionssalze der A-21978 Antibiotika sind unter anderem diejenigen Salze, die durch übliche Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren gebildet werden, wie mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure,

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Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Kampfersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäuren Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.

Wie aus der Veterinärmedizin bekannt ist, kommt der jeweiligen Form eines bestimmten Antibiotikums gewöhnlich keine große Bedeutung zu, wenn man mit diesem Antibiotikum ein entsprechendes Tier behandelt. In den meisten Fällen wird der Wirkstoff unter den im Tier herrschenden Bedingungen in eine Form verändert, die sich von der Form der Verabreichung unterscheidet. Die Salzform, in der der jeweilige Wirkstoff verabreicht wird, ist daher nicht von besonderer Bedeutung. Die Salzform kann jedoch aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, Einfachheit und Toxizität gebildet werden.

Beschreibung des Mikroorganismus

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wurde von Frederick P. Mertz und Ralph E. Kastner aus den Lilly Research Laboratories untersucht und charakterisiert.

Der zur Herstellung der A-21978C Antibiotika geeignete neue Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die am Berg Ararat in der Türkei gesammelt wurde. Der Organismus läßt sich als neuer Stamm von Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias und Daliä Maia 1961, klassifizieren. Diese Klassifikation beruht auf einem Vergleich mit entsprechenden veröffentlichten Beschreibungen /R. E. Buchanan und N. E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology," The Williams and Wilkins Company, 8. Auflage, 1974, sowie E.B. Shirling and D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces, "Intern. Journal of Systematic Bacteriol.", 808-809 (1972)/.

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Die obige Klassifizierung beruht auf Methoden, wie sie vom International Streptomyces Projekt /E. B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods of Charakterization of Streptomyces Species," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16, 313 - 340 (1966j_/ empfohlen werden, wobei auch noch bestimmte ergänzende Untersuchungen durchgeführt wurden. Die Kohlenstoffverwertung wurde anhand des Grundmediums ISB Nr.9 untersucht, dem man bis zu einer Endkonzentration von 1,0 % Kohlenstoffquellen zugesetzt hatte. Die Kohlenstoffquellen wurden durch Filtrieren sterilisiert. Das Grundmedium wurde durch Behandeln in einem Autoklav sterilisiert. Die entsprechenden Platten wurden nach einer Inkubationszeit von 14 Tagen bei 30 ⁰C ausgewertet. Die Zellwandzucker wurden unter Anwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Lechevalier ermittelt (M. P. Lechevalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera," Referat vor dem Subcomittee über Actinomyceten der American Society of Microbiology von Dr. Thomas G. Pridham am Institut of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jeresy, 1971). Das Isomer von Diaminopimelinsäure wurde nach der Methode von Becker bestimmt /B. Becker et al., "Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates," Appl. Microbiol. 11, 421 - 423 (19642/. Die Aminosäureanalysen wurden anhand gewaschener Zellwandfragmente durchgeführt. Die Melanoidpigmente wurden unter Einsatz von ISP Nr. 1 (Trypton-Hefe-Extrakt-Brühe), ISP Nr. 6 (Pepton-Hefe-Extrakt-Eisenagar), ISP Nr. 7 (Tyrosinagar), modifiziertes ISP Nr. 7 (ISP Nr. 7 ohne Tyrosin) und eines Tyrosinversuchs ermittelt (Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 27 (3), 290 (1977J>_/, Die Stärkehydrolyse wurde durch Untersuchen bezüglich der Gegenwart von Stärke mit Iod ermittelt.

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Zur Bestimmung des Temperaturbereichs, der Natriumchloridtoleranz, des pH-Bereichs und der antibiotischen Empfindlichkeit wurde Argarmedium ISP Nr. 2 verwendet. Es ergab sich folgender Temperaturbereich: 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 und 55 ⁰C. Zur Ermittlung der Natriumchloridtoleranz wurde der Agar mit Natriumchlorid bis auf Werte von 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 und 12 % versetzt. Die Inkubation wurde bei 30 ⁰C durchgeführt. Zur Messung des pH-Bereichs wurde der Agar unmittelbar vor seinem Ausgießen jeweils um 1,0 pH-Einheiten von pH 3,0 auf pH 11,0 eingestellt. Zur Bestimmung der antibiotischen Empfindlichkeit wurden Empfindlichkeitsplättchen verwendet, die sich auf angeimpften Agarplatten befanden. .

Die Farbnamen wurden nach der ISCC-NBS-Methode ermittelt (K. L. Kelly and D. B. Judd, "The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names, " U. S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D. C. 1955). Die in Parenthesen befindlichen Zahlen beziehen sich auf die Farbreihen von Tresner und Backus. /H. D. Tresner, and E. J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy," Appl. Microbiol. 11, 335 - 338 (1956Ji_/. Die Bezeichnungen der Farbplatten sind dabei unterstrichen. In Klammern sind die Farbblöcke- nach Maerz and Paul angegeben (A. Maerz und M. R. Paul, "Dictionary of Color, "McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N. Y., 1950).

Charakterisierung des A-32978 produzierenden Mikroorganismus Morphologie

Die Morphologie einer Kultur A-21978.6, nämlich der Kultur, die die A-21978 Antibiotika produziert, besteht aus Sporophoren, die der Klassifikation Rectus-Flexibilis (RF) angehören. Die Sporenketten weisen über 10 Sporen pro Kette auf. Die Sporenoberfläche ist glatt.

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Die Kultur A-21978.6 zeichnet sich dadurch aus, daß sie eine vorwiegend rotgefärbte Luftsporenmasse bildet, deren Unterseite rötlichbraun gefärbt ist. Ferner ist auch ein hellbraunes wasserlösliches Pigment vorhanden. Diese Eigenschaften zeigen sich an 3 von 14 Agarmedien (ISP Nr. 2, ISP Nr. 7, TPO). Diese drei Medien sind die einzigen, auf denen es zu einem reichlichen aerialen und vegetativen Wachstum kommt.

Zwei Agarmedien, nämlich ISP Nr. 4 und Glucose-Asparagin-Agar, bilden eine weiß bis grau gefärbte Luftsporenmasse mit gelbgefärbter Unterseite. Es läßt sich kein wasserlösliches Pigment beobachten. Diese beiden Medien ergeben ein gutes, jedoch nicht übermäßiges, aeriales und vegetatives Wachstum.

Neun weitere als Agarmedien eingesetzte Medien ergeben ein schwaches oder überhaupt kein Wachstum oder eine schwache oder überhaupt keine Sporulation. Die Luftsporenmasse ist, falls eine solche überhaupt vorhanden ist, weiß bis grau gefärbt.

Melanoidpigmente fehlen völlig. Die vorwiegenden Bestandteile der Zellwand sind LL-DAP, Glycin, Glucose und Ribose. Dies spricht für eine Zellwand vom Typ I und ein Zuckermuster vom Typ C (R. Buchanan und N. E. Gibbons, Eds., "Berey's Manual of Determinative Bacteriology," The Williams & Wilkins Company, 8. Auflage, 1974, S. 658).

Die folgenden fünf Kulturen wurden in Laboruntersuchungen mit A-21978.6 verglichen:

Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891 Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443

Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497

Diese Kulturen gehören der Farbreihe weiß und rot an, haben eine Sporophorenmorphologxe vom Typ RF, verfügen über eine glatte Sporenoberflächenornamentatxon, sind nach dem ISP-Beschreibungen melaninnegativ, sind an ihrer Unterseite nicht unterscheidungsfähig gefärbt und verfügen über keine wasserlöslichen Pigmente. Diese Eigenschaften entsprechen zusammen mit dem Kohlenstoffverwertungsmuster sowie anderen Sekundärmerkmalen der Kultur A-21978.6.

Vergleicht man die obigen Kulturen mit der Kultur A-21978.6 unter Laborbedingungen, dann scheiden hierbei vier aus. S. candidus und S. setonii ergeben auf einer Reihe von Medien eine gelbgefärbte Luftsporenmasse, so daß sich diese Kulturen von der Kultur A-21978.6 unterscheiden-Die Kulturen S. albovinaceous und S. moderatus sind an ihrer Unterseite unterscheidungsfähig dunkel gefärbt, ergeben wasserlösliche Pigmente und bilden Melanoidpigmente, wodurch sie sich insgesamt von der Kultur A-21978.6 unterscheiden. Die ISP-Beschreibung von S. moderatus bezieht sich auf eine rötlichbraun oder stark braun gefärbte Unterseite, ergibt das Gleiche jedoch nicht für S. albovinaceous. Keine dieser Kulturen gilt als melaninpositiv.

Die Kultur A-21978.6 wird daher als Stamm von Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias und Daliä, 1961, klassifiziert. Diese Klassifikation beruht auf einem Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen und direkten Laborvergleichen. Die im folgenden angegebenen Kulturcharakteristiken stellen eine Zusammenfassung der direkten vergleichenden Untersuchungen dar.

KuIturcharakteri stiken

Morphologie

A21978.6

S. roseosporus

Die Sporen sind gerade bis gewunden (RF), wobei sich keine Haaken, Schlaufen oder Spiralen beobachten lassen. Die Ketten bestehen aus über 10 Sporen. Die Sporenoberfläche ist aufgrund einer Differentialelektronenmikroskopie glatt.

Sporen: länglich bis oval Mittelwert: 0,85 χ 1,78 JJm Bereich: 0,65 - 0,97 χ 0,97 -2,6 μπι

länglich bis zylindrisch 1,01 bis 2,47 μΐη 0,97 - 1,3 χ 1,63 - 3,25 μπι

-JZ* -

Kulturcharakteristiken (Fortsetzung)

A21978.6

Wachstum

Farbe

S. roseosporus Wachstum

Farbe

Karottenpfropfen

Aerial: gut grau c pink

Vegetativ: reichlich braun

kein lösliches Pigment

keines keine

gut gelbbraun

kein lösliches Pigment

Kartoffelpfropfen

Aerial: gut grau c pink

Vegetativ: reichlich braun dunkelbraunes lösliches Pigment

keines keine

leidlich orangebraun

kein lösliches Pigment

ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt-Agar)

Aerial: leidlich (W) a_ weiß Vegetativ: gut /lOAjL/fahlgelbgrün

kein lösliches Pigment schlecht schlecht

Aerial: reichlich Vegetativ: reichlich

' kein lösliches Pigment

ISP Nr. 2 (Hefe-Malzextrakt-Agar)

reichlich

(W) a weiß

/10B2/fahlgelbgrün

(R) 5cb gräulich gelbpink

hellrotbraun hellbraunes lösliches Pigment

(R) 3ca fahlorangegelb reichlich /12L2/hellolivbraun

hellbraunes lösliches Pigment

- 2Sr -

KuI tür chareikter i st iken (Portsetzung)

A21978.6 c· S. roseosporus

Wachstum Farbe Wachstum Farbe

ISP Nr. 3 (Hafermehl-Agar)

Aerial: leidlich (W)a weiß schlecht (W) a weiß

Vegetativ: leidlich /lOÄ2)fahlgelbpink leidlich . fahlgrünlichgrau

hellbraunes lösliches Pigment kein lösliches Pigment

ISP Nr. 4 (anorganische Salze-Stärke-Agar)

Aerial: gut (W)b weiß gut (R) 3c2 fahlorangegelb

Vegetativ: gut . /lOBl/fahlgelbgrün reichlich . /1115/ gräulichgelb

hellbraunes lösliches Pigment . kein lösliches Pigment

ISP Nr. 5 (Glycerin-Asparagin-Aqar)

Aerial: leidlich (W) 13ba purpurweiß , leidlich (W) b weiß

Vegetativ: gut /_3B7/gräulichgelbpink . gut L^iocl/ gräulichgelb

gräulichpinkes lösliches Pigment hellbraunes lösliches Pigment

Kulturcharakteristlken (Fortsetzung)

A21978.6

S. roseosporus

Wachstum

Farbe Wachstum

Farbe

ISP Nr. 7 (Tyrosin-Agar)

Aerial: reichlich (R) 5cb graugelbpink Vegetativ: reichlich /7L12/mittelrotbraun dunkelbraunes lösliches Pigment

Modifizierter Bennett-Agar

Aerial: Vegetativ:

Aerial: Vegetativ:

keines

schlecht fahlgelbbraun kein lösliches Pigment

CaIciummalat-Agar

keines

leidlich /yLl^/mittelrotbraun hellbraunes lösliches Pigment reichlich (R) 5cb graugelbpink reichlich /11E5/ gelbbraun hellbraunes lösliches Pigment

reichlich (R) 5cb graugelbpink reichlich Z^llDi/ gräulichgelb hellbraunes lösliches Pigment

schlecht (W) a weiß schlecht fahlgelbgrün.

fahlgelbgrünes lösliches Pigment

Kulturcharakterlstlken (Portsetzung)

A21978.6

Wachstum

Farbe

Czapek-Lösung-Agar

Aerial: schlecht (W)a weiß Vegetativ: schlecht . weißlich . kein lösliches Pigment

Aerial: schlecht

Vegetativ: reichlich Z§/

kein lösliches Pigment

Emerson-Agar Glucose-Asparagin-Agar

Aerial: gut (W)b weiß

Vegetativ: gut /jL2B2/graugelb

kein lösliches Pigment

S. roseosporus Wachstum Farbe

keines

keines

reichlich (R) 5cb graugelbpink reichlich /1115/graugelb hellbraunes lösliches Pigment

leidlich (W)b weiß gut /12B2/ fahlgelbgrün

kein lösliches Pigment

Kulturcharakterlstlken (Fortsetzung)

A21978.6

Wachstum

Farbe

Glycerln-Glycln-Agar

Aerial: vegetativ:

Aerial: Vegetativ:

Aerial: Vegetativ:

schlecht

reichlich. /8Ll£/dunkelgraubraun braunes lösliches Pigment

Nähragar

keines -—-schlecht fahlgelbgrau kein lösliches Pigment

S. roseosporus

Wachstum

Farbe

reichlich (W)b weiß

reichlich hoG2/ hellgelb

hellbraunes lösliches Pigment

leidlich (W) b weiß

gut fahlgelbgrau

kein lösliches Pigment

reichlich (R) 5cb graugelbpink reichlich /8Ll2/ dunkelgraubraun braunes lösliches Pigment

Tomaten-paste-flafermehl-Agar

reichlich (R) 5cb graugelbpink

reichlich D-²¹Qj gelbbraun

braunes lösliches Pigment

Kohlenstoffverwertung

Substrat Ά21978.7

L-Arabinose +

D-Fructose +

D-Galactose + D-Glucose . · +

i-lnoslt -

D-Mannit +

D-Raffinose > -

L-Rhamnose +

Salicin . · +'

Sacharose -

D-Xylose +

Bedeutungen: + = Positive Verwertung - = Negative Verwertung

S. roseosporus

Verhalten

A21978.6

S. roseosporus Melanoidpigment ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt)

ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt - Eisen) ISP Nr. 7 (Tyrosin-Agar)

ISP Nr. 7 modifiziert (ISP Nr. 7 minus Tyrosin)

Tyrosin-Versuch Gelatineverflüssigung Wirkung auf entrahmte Milch Stärkehydrolyse

pH-Bereich

Temperaturbereich Nitratreduktion

NaCl-Verträglichkeit; Wachstum bis zu

schwache Hydrolyse

5-11 25 - 40 ⁰C

10 %

schwache Hydrolyse

-. 11 - 45 ⁰C +

6 %

Antibiotische Empfindlichkeit

Antibiotikum	Konzentration pro Scheibe	Class	A21978.6	S. roseosporus
Erythromycin	15 Mg	Macrolid	+	+
Cephalothin	30 Mg	ß-Lactam	+	+
Lincomycin	2 Mg	Glycosid		-
Nystatin	100 Einheiten	Polyen	-	-
Polymyxin B	300 Einheiten	Peptid ·		-
Streptomycin	10 Mg	Aminoglycosid	+	+
Tetracyclin	30 Mg	Tetracyclin	+	+
Vancomycin	30 Mg	Glycopeptid	+	+

+ =» empfindlich (Hemmzonen)

- = resistent (keine Hemmzonen)

216 254

Bestimmte charakteristische Eigenschaften des A-21978 produzierenden Stammes S. roseosporus NRRL 11379 unterscheiden sich von den für S. roseosporus veröffentlichten Eigenschaften. Die Kultur A-21978.6 unterscheidet sich vom veröffentlichten Stamm*in ihrer Sporengröße, ihrem Wachstum auf Karottenpfropfen, ihrem Wachstum auf Kartoffelpfropfen, ihrer Natriumchloridtoleranz sowie ihrer Nitratreduktion.

Eine Kultur des A-21978 Antibiotika produzierenden Mikroorganismus Streptomyces roseosporus ist in der ständigen Sammlung des Northern Regional Research Center, U. S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 hinterlegt worden und von dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11379 frei beziehbar.

Wie bei anderen Organismen, unterliegen die Eigenschaften der die Antibiotika A-21978 produzierenden Kultur, nämlich von Streptomyces roseosporus NRRL 11379, einer Variation. Beispielsweise kann man durch Behandlung mit verschiedenen bekannten mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radiaktiver Strahlung oder Chemikalien, künstliche Varianten oder Mutanten des Stammes NRRL 11379 bilden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten sowie Mutanten von Streptomyces roseosporus NRRL 11379, die die A-21978 Antiniotika produzieren, können erfindungsgemäß verwendet werden. ,

Zur Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 11379 kann man irgendeines der vielen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute und einer leichten Isolierbarkeit des Produkts werden jedoch gewisse Kulturmedien bevorzugt.

216254

So ist beispielsweise die für die Fermentation in großem Maßstab vorzugsweise angewandte Kohlenhydratquelle Tapiocadextrin, obgleich man statt dessen Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Mannose, Baumwollsaatöl, Methyloleat, Glycerin oder gereinigtes Sojabohnenöl verwenden kann. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist enzymhydrolysiertes Casein, man kann jedoch auch mit löslichem Fleischpepton, Sojabohnenöl, Sojabohnenhydrolysat, Sojabohnengrütze, Hefe oder Aminosäuren, wie L-Asparagin oder DL-Leucin, arbeiten. Als anorganische Nährsalze können den Kulturmedien übliche lösliche Salze zugegeben werden, die Kalium-, Ammonium-, Chlorid-, Sulfat-, Nitrat- oder ähnliche Ionen liefern. Von diesen Salzen ist Kaliumsulfat für die Bildung der Antibiotika besonders geeignet. Ferner eignen sich zu diesem Zweck auch Melasseasche, Aschedialysate und synthetische Mineralgemische.

Für die Produktion der Antibiotika A-21978 sollte im Fermentationsmedium vorzugsweise destilliertes oder deionisiertes Wasser verwendet werden. Einige in Leitungswasser enthaltene Mineralien, wie beispielsweise Calcium oder Carbonat, scheinen sich ungünstig auf die Produktion der Antibiotika auszuwirken.

Im Kulturmedium sollten ferner auch die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlichen Spurenelemente vorhanden sein. Diese Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen der anderen Bestandteile "des Medium in solchen Mengen auf, wie sie zum Wachsen des Mikroorganismus erforderlich sind.

Hat man es bei der großtechnischen Fermentation mit dem Problem eines Schäumens der Fermentationsmedien zu tun, dann muß man diese mit geringen Mengen (beispielsweise 0,2 ml pro Liter) eines Antischaummittel, wie Polypropylenglykol, versetzen.

216254

Für die Bildung wesentlicher Mengen der Antibiotika A-21978 wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks oder Behältern bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotika A-21978 lassen sich auch durch Schüttelflaschenkultur herstellen. Wegen der Zeitverzögerung, die bei der Antxbxotikabxldung auftritt, wenn man große Tanks oder Behälter mit den Sporen des Mikroorganismus animpft, wird vorzugsweise mit einem vegetativen Inokulum gearbeitet. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem man ein kleines Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Mikroorganismus animpft, wodurch man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Die vegetative Impfkultür überträgt man dann in einen größeren Behälter.

Der die Antibiotika A-21978 produzierende Mikroorganismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 37 ⁰C gezüchtet werden. Eine optimale Bildung der Antibiotika A-21978C scheint bei Temperaturen von etwa 30 bis 32 ⁰C zu erfolgen.

Bei einer Tankfermentation sollte der pH-Wert des Fermentationsmediums vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und 7,0 liegen. Dies läßt sich durch Zusatz geeigneter Mengen von beispielsweise Natriumhydroxid (in den frühen Stufen) und von Chlorwasserstoffsäure (in den späteren Stufen) erreichen.

Die Bildung der Antibiotika A-2T978 läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man entsprechende Proben der KuItürbrühe oder von Extrakten der Mycelfeststoffe bezüglich ihrer antibiotischen Wirksamkeit gegenüber Mikroorganismen untersucht, deren Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bekannt ist. Ein für die vorliegenden Antibiotika besonders -geeigneter Nachweisorganismus ist Micrococcus luteus. Dieser Bioversuch wird vorzugsweise auf Papierscheiben oder Argarplatten durchgeführt.

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Die unter entsprechenden submersen aeroben Fermentationsbedingungen hergestellten Antibiotika A-21978 lassen sich nach ihrer Bildung aus dem Fermentationsmedium durch in der Fermentationstechnik übliche Methoden gewinnen. Die während der Fermentation des A-21978 produzierenden Mikroorganismus entstandene antibiotische Aktivität tritt im allgemeinen in der filtrierten Kulturbrühe auf. Eine maximale Gewinnung der Antibiotika A-21978 ergibt sich daher, wenn man von der Kulturbrühe zuerst die Mycelmasse abfiltriert. Die auf diese Weise erhaltene filtrierte Kulturbrühe läßt sich dann nach irgendeiner Technik reinigen, wodurch man das antibiotisch wirksame Gemisch A-21978 erhält. Eine hierzu bevorzugte Methode besteht in einer Extraktion und Ausfällung unter Bildung des Gemisches A-21978.

Die weitere Reinigung und Auftrennung des A-21978 Gemisches sowie der einzelnen A-21978C Faktoren besteht in zusätzlichen Adsorptions- und Extraktionsverfahren. Zur Reinigung des A-21978C Gemisches und der einzelnen Faktoren lassen sich beispielsweise folgende adsorptive Materialien verwenden: 1) Anionenaustauscherharze - a) stark basische: Polystyrol, BioRad AG 1 & 2, Bio-Rex, Dowex 1 und 2, Amberlit IRA 400, 401, 410, b) mittelmäßig basische: Epoxypolyamin Bio-Rex 5 und Duolit A30B, c) schwachbasische: Polystyrol oder phenolisches Polyamin Bio-Rad AG3, Duolit A-6, A-7,Amberlit IRA 68, IR-45, IR-4B, 2) Silicagel, 3) Magnesiumaluminiumsilicatgel (Florisil), 4) polymere Adsorbentien (XAD-2 und 4), 5) hochporöse Polymere (Diaion HP-20), 6) Sephadex G-10, G-25 und G-50, Bio-Gel P-2 und P-10, 7) Umkehrphasenharze, Silicagel/Cj₈

und Silicagel Cg, 8) Aktivkohle, 9) DEAE-Cellulose, DEA-Sephadex, 10) Polyamid, 11) Aluminiumoxid und 12) Mikrocellulose. Bezugsquellen für derartige Materialien sind folgende: Bio-Rad-Harze und Biol-Gel-Harze - Bio Rad Laboratories,

216254

Richmond, CaI.; Amberlit- und XAD-Harze - Rohm und Haas Co, Philadelphia, Pa.; Duolit-Harze - Diamond Shamrock Chemical Co, Redwood City, CaI.; Sephadex-Harze - Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden; Dowex-Harze - Dow Chemical Co., Midland, Mich.; Diaion - Mitsubishi Chemical Industies Ltd., Tokyo, Japan; XAD-Harze; Silicagel/C-g und Silicagel/Cg - E. Merk, Darmstadt, Deutschland.

Wahlweise kann man die KuItürfeststoffe unter Einschluß der Bestandteile des Mediums und des Mycels auch ohne Extraktion oder Abtrennung, jedoch vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Quelle für die Antibiotika A-21978 verwenden. So kann man das Kulturmedium nach Bildung der Antibiotika A-21978 beispielsweise durch Lyophilisieren trocknen und das dabei erhaltene Material dann direkt in ein Futtervorgemisch einarbeiten.

Bei den vorliegend beschriebenen-Untersuchungen setzt man das A-21978C Gemisch und die einzelnen A-21978C Faktoren immer in Natriumsalzform ein.

Die Gemische A-21978 und A-21978C und die einzelnen A-21978C Antibiotikafaktoren C , C₁, C₂, C-, C. und C₅. hemmen das Wachstum bestimmter pathogener Mikroorganismen, insbesondere gram-positiver Bakterien. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte), bei denen die A-21978C Faktoren und das A-21978C Gemisch ausgewählte Bakterien hemmen, werden durch übliche Agar-Verdünnungsversuche ermittelt, und die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XI hervor.

Tabelle

XI

Organismen (aerob)

Staphylococcus aureus 3055 Gruppe D Streptococcus 282 Streptococcus pyogenes C2O3 Streptococcus pneumoniae Park I Viridans Streptococcus 9943 Neisseria gonorrhoeae 111076-4

*NU = nicht untersucht

	co	Cl	. MIC-Werte	0,06	C4	C5	I «=«0 I
Gemisch	1,0	0,5	C2	0,13	0,25	0,13
0,13	2,0	1,0	0,13	0,25	1,0	0,13
0,25	0,25	0,13	0,25	0,13	0,13	0,06
0,13	0,5	0,13	0,13	0,5	0,5	0,06
0,13	1,0	0,5	0,25	4,0	1,0	0,13
0,5	NU*	16.0	1,0		NU	• NU
8,0			4,0

216254

Die minimalen Hemmkonzentrationen, bei denen das A-21978C Gemisch und die vorwiegenden A-21978C Faktoren ausgewählte Bakterien hemmen, und zwar bestimmt durch übliche Brühe-Verdünnungsversuehe, gehen aus der folgenden Tabelle XII hervor.

Tabelle XII

Organismus (aerob)

Staphylococcus aureus 3055 Gruppe D Streptococcus 282 Streptococcus pyogenes C2O3 Streptococcus pneuraoniae Park I Viridans Streptococcus 9943

	MIC ^g/ml)	^2	0,13	I
Gemisch		0,5	0,13 ·	I
0,25	ι·,ο	1,0	0,13	O
0,25	2,0	0,25	0,5
0,13	0,5	IfO	32,0
0,5	2,0	16,0
8,0	32,0

216254

Besonders interesant und wichtig ist die Tatsache, daß die A-21978C Antibiotika das Wachstum von Mikroorganismen hemmen, die gegenüber anderen Antibiotika resistent sind. Aus der folgenden Tabelle XIII gehen die für die Faktoren Cq, C-, C₂, C-, C. und C₅ von A-21978C beim Agar-Verdünnungsversuch gegenüber typischen derartigen Organismen unter Anwendung der ICS-Agar-Verdünnungstechnik erhaltenen minimalen Hemmkonzentration hervor.

Tabelle

XIII

Wirksamkeit von A-21978C Faktoren gegenüber Klinikisolaten Minimale Hemmkonzentration

A21978C	A21978CJ	A21978C2	I
1,0/10/	0,5/l0/	0,12-0,25/10/
1-2 Z1I/	0,13-0,2/9/ ·	0,13-0,25/9/, 0,5
0,25-5/5/, 32, >32	0,12/5/, 8, 16	0,06-0,12/5/, 4, 8
2-4/8/,>32	1-2/8/,>16	Ο,25-Ο,5/§_/, 8
0,13-1,0/7/, 4	0,12-1/7/, 8	0,12/5/, 0,5, 4/2/
1-4/2/	0,5, 8	0,5, 4
NU***	16-> 128/li/	4-> 128/1V

Testorganismen*

Staphylococcus aureus (10) Staphylococcus epidermidis (12) Streptococcus pyogenes (7) Gruppe D Streptococcus (9) Streptococcus pneumoniae (8) Viridans Streptococcus (2) Neisseria gonorrhoeae (11)

*In runden Klammern ist jeweils die Anzahl der untersuchten Isolate angegeben.

**In eckigen Klammern ist jeweils die Anzahl der untersuchten Isolate angegeben, die die jeweiligen MIC-Werte oder MIC-Bereiche ergibt, wobei dann, falls keine Klammer vorhanden ist, nur ein einziges Isolat den genannten MIC-Wert hat.

***NU = nicht untersucht.

-JZ-

Tabelle

XIII

Wirksamkeit von A-21978C Faktoren gegenüber Klinikisolaten Minimale Hemmkonzentration

Testorganismen*

Staphylococcus aureus (10) Staphylococcus epidermidis (12) Streptococcus pyogenes (7) Gruppe D Streptococcus (9) Streptococcus pneumoniae (8) Viridans Streptococcus (2) Neisseria gonorrhoeae (11)

A21978C₃

O,06-0,12/10/ 0,06-0,25/Ij₁/, 1 0,06-0,25/6/, 8 0,12-0,5/8/, 4 0,06-0,25UJ, 4 0,5 /2/ 4->128/9/

A21978C₄

0,25-0,5/10/

0,25-1,0/12/ O,13/5_/, 16, 32 0,5-1,0/8/, 32 0,5/7/, 2

1-2/2/

NU***

A21978C₅

0,06-0,25/10/ 0,13-0,5/12/ 0,06/5/, 4, 16 0,13-0,25/8/,>32 O,06/7/, 2 ' 0,13-0,25/2/ J NU '

*In runden Klammern ist jeweils die Anzahl der untersuchten Isolate angegeben.

**In eckigen Klammern ist jeweils die Anzahl der untersuchten Isolate angegeben, die die jeweiligen MIC-Werte oder IIC-Bereiche ergibt, wobei dann, falls keine Klammer vorhanden ist, nur ein einziges Isolat den genannten MIC-Wert hat.

***NU = nicht untersucht.

216254

Die A-21978C Antibiotika hemmen weiter auch das Wachstum bestimmter anaerober Bakterien. Aus der folgenden Tabelle XIV geht die Wirksamkeit des A-21978C Gemisches sowie der A-21978C Faktoren C₁, C, und C₃ gegenüber verschiedenen anaeroben Bakterien hervor, wie sie unter Anwendung des üblichen Agar-Verdünnungsversuchs ermittelt wurde.

Tabelle XIV MIC-Werte (mcg/ml)

Testorganismen

Actinomyces israelii Clostridium perfringens Clostridium septicum Eubacterium aerofaciens Peptococcus asaccharolyticus Peptocuccus prevoti Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus intermedius Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum

2	4	1,0	1,0	1,0	0,5
2	16	8	8	1,0	0,5
4	4	1,0	1,0	1,0	0,5
4	16	8	4	2	0,5
4	4	2	1,0	I/O	0,5
4	2	1,0	<0,5	2	0,5
0,25	2	1,0	1,0	0,25	0,25
2	4	1,0	<0,5	1,0	0,25
1	.8	2	1,0	0,5	0,25
>128	> 128	>128	> 128	> 128	M28
4	>128	>128	16	4	2
2	64	64	32	4	O,5

Gemisch

1,0 8

1,0 8

1,0 <0,5 1,0 1,0 2 > 128

128

21625

Die A-21978C Faktoren haben sich in vivo auch gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen als antimikrobiell wirksam erwiesen. Für diese Untersuchungen verabreicht man entsprechend infizierten Mäusen subkutan zwei Dosen des jeweiligen Faktors von A-21978C und bestimmt die hierdurch hervorgerufene Wirksamkeit durch Messen der sogenannten ED₅_-Werte /wirksame Dosis in mg pro kg zum Schutz von 50 % der untersuchten Tiere, J. Bacterial. 81, 233 - 235 (1961_)_/. Die dabei für das A-21978C Gemisch und die A-21978C Faktoren C₁, C₃, C₃, C_Q, C. und C₅ erhaltenen ED_5Q-Werte gehen aus der folgenden Tabelle XV hervor.

Tabelle

XV

	Vergleich zwischen	ED5O2	in vitro Aktivität	-5O2	und in vivo Aktivität
	Staphylococcus aureus	0,22	. Streptococcus	0,064	pyogenes
Antibiotikum	MIC1	0,16	MIC	0,032	-so3
A21978C,	0,5	0,08	0,13	0,032	93
A21978C2	0,13		0,13	0,16	59
A21978C3	0,06		0,06	0,10	66
A21978CO			0,25	0,053
A21978C4		0,18	0,13	0,043
A21978C		0,5	0,06	0,64
A2178C Mischung	0,13	<0,03
Erythromycin	0,13	0,13

Streptococcus pneumonlae

MIC

ED

50

0,13	0,3	I .*·
0,13	0,14	-U 1
0,03	0,09	ι
0,5	. 0,88
0,5	0,36
0,06	0,17
0,13	Ο,Ι
0,5	7,3

MIC = Minimale Hemmkonzentration {μς/ηύ.) Agarverdünnung 2 Subcutane Verabfolgung

Orale Verabfolgung

Nd

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Die erfindungsgeraäßen A-21978C Faktoren und das A-21978C Gemisch zeichnen sich auch durch ihre Wirksamkeit bei der Behandlung von Pyelonephritis aus. So ergeben die A-21978C Faktoren beispielsweise bei einer experimentell hervorgerufenen abnehmenden Pyelonephritisinfektion bei Ratten einen Schutz, der dem mit Vanomycin erreichbaren Schutz überlegen ist. Als Bakterienkultur wird für diese Untersuchungen Streptococcus faecalis (Guze) verwendet. Zu diesem Zweck läßt man die Kultur auf Trypticase-Sojabohnen-Agar (BBL) wachsen, der in einer Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BBL) aufgeschlämmt ist, unterteilt das Ganze in 0,2 ml große Anteile und gefriert diese in flüssigem Stickstoff ein. Die zur Beimpfung der Ratten benötigten Bakteriensuspensionen werden täglich hergestellt, indem man in einem 50 ml fassenden Kolben Trypticase-Sojabohnen-Brühe (BBL) mit einer gefrorenen Ampulle animpft und die Kultur dann über Nacht auf einer Schüttelapparatur bei 27 ⁰C wachsen läßt. Sodann verdünnt

8 man die Kultur von S. faecalis auf 5 χ 10 koloniebildende Einheiten pro ml. Die jeweils zu untersuchenden Verbindungen werden den Versuchstieren subkutan einmal täglich über eine Zeitdauer von 7 Tagen gespritzt. Alle Verbindungen sind zu diesem Zweck in 0,125-prozentiger Carboxymethylcellulose suspendiert.

Die Versuchstiere werden in folgender Weise experimentell infiziert. Man anästhesiert weibliche willkürlich ausge-" wählte Albino-Ratten (Cox-Wistar) mit einem Gewicht von 190 bis 210 g durch intraperitoneale Injektion von 12 mg Natriummethohexital, wobei man dieses erforderlichenfalls auch noch nachspritzt. Das Modell einer experimentellen Pyelonephritis beruht auf Untersuchungen von Guze und Beeson.

216254

Zu diesem Zweck unterbindet man den linken Harnleiter 20 Minuten und spritzt in die Femoralvene dann 0,5 ml des Testorganismus ein. 4 bis 5 Stunden nach erfolgter Infektion beginnt man mit der antimxkrobiellen Therapie. 4 Stunden nach der letzten Behandl.ung tötet man die Ratten, entfernt ihre linke Niere und homogenisiert sie in einem Homogenisator, der 9 ml physiologische Kochsalzlösung enthält. Dies entspricht einer 10 Verdünnung des Nierengewebes. Aufgrund der im Gewebehomogenisat geschätzten Menge an vorhandenen Bakterienzellen macht man hiervon weiter auch noch 10-fache Verdünnungen. Sodann bereitet man aus mehreren dieser Verdünnungen jeweils doppelte Agarplatten und bebrütet die erhaltenen Platten über Nacht bei 37 ⁰C. Die entsprechenden therapeutischen Ergebnisse werden auf zwei verschiedenen Wegen zum Ausdruck gebracht: (1) Durch die prozentuale Menge der Ratten, deren Nierenauswertung weniger

als 10 pro g Nierengewebe ergxbt, und diese Ratten werden als geheilt angesehen, sowie (2)'durch die prozentuale Menge der Ratten, bei denen sich eine 4-1Og₁--Reduktion des bakteriellen Titers ergibt, und zwar jeweils im Vergleich mit infizierten Kontrollnieren. Entsprechende Kontrollratten werden lediglich mit 0,125-prozentiger Carboxymethylcellulose behandelt. Die Lebendzellwerte des Nierengewebes von Kontrollratten unter Verwendung von S. faecalis reichen Gewebe.

Q '8

reichen von 1,2 χ 10 bis 4,6 χ 10⁹ pro g homogenisiertem

Die bei den obigen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XVI hervor.

Tabelle XVI Abnehmender Pyelonephritistest mit Streptococcus faecalis bei Ratten Antibiotikum

Vancomycin A21978C, A21978C₂ A21978C₃ A21978C-Komplex

MIC . . (μς/πιΐ)	Dosis mg/kg χ 7
1,0	12,0
1,0	1,0
0,25	1,0
0,13	1,0
0,25	' 1,0

Prozent Ratten

mit einer 4-log

Titerabnahme

55 50 100 78 89

Prozent geheilte Ratten

33 50 89 78 89

Ul O

In vitro Empfindlichkeit des Stammes S. faecalis Guze

Subcutane Verabfolgung

- StT-

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Anhand der vorliegenden Antibiotika wurden auch entsprechende Toxizitätsuntersuchungen angestellt. Für die vorwiegenden A-21978C Faktoren und das A-21978C Gemisch ergaben sich die aus der folgenden Tabelle XVII hervorgehenden Toxizitätswerte.

Tabelle XVII Toxizität von A-21978C

^LD50

Maus Ratte

A-21978C	I.V.	S.C.	I.V.	32
Faktor C1	>25O	>365	479 -	17
Faktor C,	150 - 250	175	204 -
Faktor C3	<50	70 - 75	<160	10
Gemisch	150	175 - 190	169 -

Verwendet man das Gemisch A-21978C oder einen Faktor von A-219.78C als antibakterielles Mittel, dann kann man sich hierzu einer oralen oder parenteralen Verabreichung bedienen. Eine derartige Verabreichung des Gemisches A-21978C oder eines entsprechenden Faktors hiervon wird dabei gewöhnlich selbstverständlich zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel durchgeführt. Die hierbei jeweils anzuwendende Dosis des A-21978C Gemisches oder eines Faktors hiervon ist abhängig von einer Reihe von Überlegungen, wie beispielsweise der Art und Stärke der jeweils zu behandelnden Infektion. Die für eine entsprechende Verabreichung jeweils geeigneten Dosierungsbereiche und/oder Dosierungseinheiten lassen

'- 52 -

21625

sich anhand der angeführten Werte für die minimale Hemmkonzentration, der ED₅ -Werte sowie der Toxizitätswerte unter Berücksichtigung anderer Faktoren, wie der Art des jeweiligen Patienten oder Wirts und dem infizierenden Mikroorganismus, vom Fachmann ohne weiteres ermitteln.

Die A-21978 Antibiotika sind auch als wachsturnsfördernde Mittel bei Tieren geeignet. So ergibt sich beispielsweise bei Hühnchen unter Verwendung des A-21978C Gemisches eine Verbesserung der Gewichtszunahme sowie der Futterverwertung. Die bei zwei derartigen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse über eine solche Wirksamkeit gehen aus der folgenden Tabelle XVIII hervor. Bei diesen Untersuchungen verfüttert man das A-21978C Gemisch den jeweiligen Tieren in einer Konzentration von 25 g pro Tonne Futter. Die diesbezüglichen Untersuchungen werden mit Tierbatterien "von jeweils 4 Gruppen aus jeweils 8 Tieren unter jeweiliger Wiederholung der einzelnen Versuche durchgeführt. Es werden zu diesem Zweck also 64 Tiere verwendet. Die Untersuchungsdauer beträgt 21 Tage, und zwar vom 7. bis 28. Lebenstag der Tiere. Die entsprechenden Wachstumswerte (Gewichtszunahme, Futterverbrauch und Futterverwertung) werden mit 40 entsprechenden Versuchen einer gleichzeitig laufenden Kontrollbehandlung verglichen.

Tabelle XVIII

Ver- Behänd- Konzentration Gewichtszu- Prozentuale . Konzentration Futtermenge/ Prozentuale such lung (g/Tonne) nähme (g) Verbesserung— !.Futter (g) Gewicht Verbesserung

1 Kontrolle

A21978C 25

Kontrolle

A21978C 25

414	4,10	734	1,773
431	„	750	1,741
423	2,12	704	1,665
432	683	1,582

1,80

4,99

. . Behandlungsmittelwert „ ,

1/ ——-— . — χ lOO s» prozentuale Verbesserung

— Kontrollmxttelwert *

_₅₄_ 216254

Die A-21978 Antibiotika wirken insbesondere dann bei Geflügel wachsturnsfördernd, wenn man sie zusammen mit dem Tierfutter in Mengen von etwa 1 bis 100 g Antibiotikum A-21978 pro Tonne Tierfutter verabreicht.

Aüsführungsbeispiele

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

A. Schüttelkolbenfermentation von A-2T978C

Man löst ein lyophilisiertes Plätzchen von Streptomyces roseosporus NRRL 11379 in 1 bis 2 mm sterilem Wasser. Mit dieser Lösung beimpft man dann einen Schrägagar folgender Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge (%)
Glucose	0,5
Hefeextrakt	0,2
CaCO3	0,3
Agar	2,0
Pflanzensaft*	20,0
Deionisiertes Wasser
ohne Einstellung pH 6,1;	nach Behandlung im Auto klav pH 5,9

* V/8 Juice, Campbell Soup Co.

Die beimpfte Schräge wird etwa 7 bis 10 Tage bei 30 ⁰C bebrütet. Die reife Schrägagarkultur wird mit sterilem destilliertem Wasser (10 ml) überdeckt und zur Lockerung der Sporen mit einer sterilen Pipette abgeschabt. Mit einem Teil (1 ml) der hierbei erhaltenen Sporensuspension beimpft man

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50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Trypticase-Soja-Brühe* 3,0

Dextrin 2,5 Wasser (deionisiert)

* Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md.

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben etwa 48 Stunden bei 30 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung mit einer Rotation durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser von 250 Umdrehungen pro Minute bebrütet.

Mit dem auf diese Weise bebrüteten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 50 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Glucose 7,5

Tapioca-Dextrin* 30,0

Enzymatisches Hydrolysat von

Casein** 5,0

Enzymhydrolysiertes Casein*** 5,0

K₂SO₄ ' 17,4

L-Asparagin, wasserfrei 1,32

Deionisiertes Wasser q.s. 1 Liter

Stadex 11, A. E. Staley, Co., Decatur, 111.

..NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

...Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

_.„._ 21625

Das in dieser Weise beimpfte Produktionsmedium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 6 bis 7 Tage bei 30 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung mit einer Rotation durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser von 250 Umdrehungen pro Minute bebrütet.

B. Tankfermentation von A-21978C

Zur Erzielung eines größeren Volumens an Inoculum werden 10- ml des oben beschriebenen bebrüteten vegetativen Mediums zum Beimpfen von 400 ml eines Mediums, für ein vegetatives Wachstum in einer zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung wie beim vegetativen Medium verwendet. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben 48 Stunden bei 25 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung mit einer Rotation durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser von 250 Umdrehungen pro Minute bebrütet.

Das in obiger Weise hergestellte vegetative Medium der zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zur Beimpfung von 100 ml sterilem Produktionsmedium mit der oben unter A beschriebenen Zusammensetzung. Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 165 1 fassenden Fermentationstank bei einer Temperatur von 30 ⁰C etwa 6 bis 8 Tage der Fermentation überlassen. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft unter einem Druck von etwa 1 bar (1 Atmosphäre) derart belüftet, daß sich eine LufSättigung von über 30 % ergibt, wobei man das Ganze unter Einsatz herkömmlicher Rührer mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 300 Umdrehungen pro Minute rührt.

Beispiel 2

" Abtrennung des' Ά-21978C Antibiötikümgemisches

D'ie gemäß Beispiel 1 erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (6050 1) wird in einer Filterpresse unter Verwendung von

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3 % Filterhilfe (Celite 545, Johns-Manvilie Products Corp.) filtriert. Der angefallene Filterkuchen wird mit soviel Wasser gewaschen, daß man insgesamt 4100 1 Filtrat erhält, und dieses Filtrat enthält 230 Einheiten pro ml. Der pH-Wert des Filtrats wird mit Chlorwasserstoffsäure auf 3,5 eingestellt, und das angesäuerte Filtrat läßt man dann 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen, damit die wirksamen Faktoren ausfallen können. Die hierbei anfallende Suspension wird mit Filterhilfe (0,75, %, Celite 545) versetzt, worauf man den Niederschlag durch Filtrieren abtrennt. Der Filterkuchen wird zweimal mit 410 1 Methanol extrahiert, wobei man vor dem Filtrieren jeweils 1 Stunde rührt. Die vereinigten Methanolextrakte (720 1) werden mit 0,1 Volumen Wasser (72 1) versetzt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Natriumhydroxid auf 6,5 bis 7,0 eingestellt. Sodann engt man die erhaltene Lösung zur Entfernung des Methanols unter Vakuum auf etwa 1/20 ihres Volumens (30 1) ein, wobei man während des Einengens bedarfsweise destilliertes Wasser zusetzt. Das erhaltene Konzentrat wird dann mit n-Butanol (0,75 Volumteilen oder 22 1) unter Rühren versetzt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird dann mit Chlorwasserstoffsäure auf 3,0 eingestellt. Nach entsprechender Schichtentrennung wird die aktivitätshaltige n-Butanolschicht abgetrennt und unter Vakuum zu einem Rückstand konzentriert. Der Rückstand wird in einer minimalen Menge Methanol gelöst und die Methanollösung zur Ausfällung des Großteils des A-21978C Gemisches mit 30 Volumteilen Aceton versetzt. Der hierdurch anfallende Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch man zu 247 g rohem A-21978C Gemisch (780 Einheiten pro mg) gelangt. '.

Das Methanol-Aceton-Filtrat, das den verbleibenden Anteil des A-21978 Gemisches (Faktoren A und B) enthält, wird zu einem Rückstand konzentriert. Der Rückstand wird in einem

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5:1 Gemisch aus t-Butanol und Wasser gelöst und die Lösung gefriergetrocknet, wodurch man 169 g A-21978 Gemisch erhält.

Beispiel 3

A. Reinigung des A-21978C Gemisches

Rohes A-21978C Gemisch (734 g), hergestellt gemäß Beispiel 2, wird in Wasser (25 1) suspendiert, und der pH-Wert dieser Suspension wird zur vollständigen Auflösung des Materials mit 5n Natriumhydroxid auf 6,5 eingestellt. Die Lösung wird dann auf eine Säule aufgegeben, die 27 1 Ionenaustauscherharz (Acetatform) enthält (IRA68, Rohm & Haas Co.)· Die Säule wird zuerst mit 4 Säulenvolumina Wasser (108 1) und dann mit 5 Säulenvolumina 0,1n Essigsäure (135 1) gewaschen. Das aktive Material wird mit 0,5n Essigsäure eluiert, wobei man etwa 120 1 umfassende Fraktionen sammelt und jede Fraktion bezüglich ihrer biologischen Aktivität untersucht.

Die hochaktiven Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 278 g gelbgefärbtem A-21978C Gemisch (1100 Einheiten pro mg) gelangt. Die Fraktionen mit niedriger Aktivität werden ebenfalls vereinigt, und aus ihnen erhält man 238 g braunes A-21978C Gemisch (880 Einheiten pro mg).

B. Weitere Reinigung von A^21978C Gemisch

Eine Teilmenge des bei der obigen Reinigung aus der mit IRA-68 gefüllten Säule erhaltenen aktiven A-21978C Gemisches (150 g) suspendiert man in Wasser (600 ml). Sodann stellt man den pH-Wert der erhaltenen Suspension zur vollständigen Auflösung des darin enthaltenen Materials

216 2 54

auf 6,5 ein und versetzt das Ganze anschließend mit einer zur Absorption der wäßrigen Lösung ausreichenden Menge trockenem Silicagel (Grace, Sorte 62). Diese feuchte SiIicagelzubereitung gibt man dann auf eine mit 30 1 Silicagel (Grace 62) bepackte Säule (10 χ 375 cm) in Acetonitril, wobei man das Silicagel vorher zur Entfernung feiner Teilchen mit Wasser wäscht, die Säule dann mit dem in Wasser suspendierten Silicagel füllt und die mit Silicagel gefüllte Säule hierauf mit 30 1 Acetonitril wäscht. Nach entsprechendem Füllen wird die Säule mit Acetonitril (15 1) gewaschen und dann mit einem 4:1 Gemisch aus Acetonitril und Wasser entwickelt, wobei man etwa 4 1 ausmachende Fraktionen sammelt. Die Elution der Säule wird durch einen Bioversuch sowie durch ein Silicageldünnschichtchromatogramm /CH₃CNrH₂O (3:12/ überwacht. Diejenigen Fraktionen, die lediglich A-21978C Gemisch (Fraktionen 43 bis 60) enthalten, werden, vereinigt, unter Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 86,2 g gelbem bis "lohfarbenem gereinigtem A-21978C Komplex (1160 Einheiten pro mg) gelangt. Die Fraktionen 21 bis 29, welche die Faktoren D und C enthalten, werden ebenfalls vereinigt und gefriergetrocknet, und aus ihnen erhält man 13g eines gelben Pulvers mit geringer biologischer Aktivität.

Das in obiger Weise erhaltene gereinigte A-21978C Gemisch (30 g) wird weiter entfärbt, indem man 30 g dieses Gemisches in einer minimalen Menge Wasser suspendiert und die Suspension dann mit einer zur Absorption der Lösung ausreichenden Menge Silicagel'(Typ LP-1, 10-20 Mikron, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N. J. 07006) vermischt. Das feuchte Silicagelgemisch wird in einem 4:1 Gemisch aus Acetonitril und Methanol suspendiert und in eine 4 χ 30 cm

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(Außendurchmesser) messende Glasführungssäule gegeben, die sich auf einer 6,5 χ 32 cm (Außendurchmesser) großen Glashauptsäule befindet, welche 2,8 1 Silicagel (Quantum LP-1) in einem 4:1 Gemisch aus Acetonitril und Methanol enthält. (Das Silicagel wird vorher mit Wasser und dann mit einem 4:1 Gemisch aus Acetonitril und Methanol gewaschen, worauf man die Säule mit diesem Silicagel in einem 4:1 Gemisch aus Acetonitril und Methanol unter einem Druck von etwa 2 bis 4 bar füllt). Sodann wäscht man die Glasführungssäule und die Hauptsäule unter einem Druck von etwa 2,5 bar mit 3 1 eines 4:1 Gemisches aus Acetonitril und Methanol. Im Anschluß daran eluiert man das aktive Material mit einem Gemisch aus Acetonitril, Methanol und Wasser (55:20:25), wobei man 300 ml große Fraktionen auffängt. Die Elution wird durch einen Bioversuch (Micrococcus luteus) überwacht. Die Fraktionen 14 bis 25 verfügen über die höchste Aktivität. Sie werden vereinigt, konzentriert und gefriergetrocknet, wodurch man zu 24 g hellgelbem reinem A-21978C Gemisch in Form des Natriumsalzes (1250 Einheiten pro mg) gelangt. Die Fraktionen 26 bis 32 sind weniger aktiv. Sie werden ebenfalls vereinigt, konzentriert und gefriergetrocknet, wodurch man 1,6g weniger reines A-21978C Gemisch (780 Einheiten/mg) erhält.

Beispiel 4 Auftrennung der A-21978C Faktoren

Man löst gereinigtes A-21978C Gemisch (2g), erhalten gemäß Beispiel 3, in Wasser (40 ml) und gibt die erhaltene Lösung dann mittels einer Pumpe (FMI LAB Pump, Fluid Metering, Inc. 48 Summit St., Oyster Bay, NY 11771) unter einem Druck von etwa 3,5 bar auf eine 4,1 χ 60 cm messende Säule auf,

- 6T-

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die mit einem Umkehrphasensilxcagel (Quantum LP-1 Silicagel/C,o) in einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Aceton (100:15:85) gefüllt ist, welches 0,15 % Essigsäure und 0,15 % Pyridin enthält. Die Säule wird dann mit dem gleichen Lösungsmittel unter einem Druck von etwa 4,5 bar entwickelt, wobei man 25 ml umfassende Fraktionen auffängt. Die Elution der Faktoren wird durch Ultraviolettlicht von 280 nm und durch einen Bioversuch überwacht. Die einzelnen Fraktionen werden bezüglich ihres Reinheitsgrades auf einer analytischen Säule untersucht. Hierbei ergeben sich folgende Auftrennungen: Die Fraktionen 33 bis 37 enthalten den Faktor C , die Fraktionen 45 bis 53 enthalten den Faktor C₁, die Fraktionen 75 bis 92 enthalten den Faktor C₂, die Fraktionen 112 bis 134 enthalten den Faktor C₃, die Fraktionen 54 bis 74 enthalten die Faktoren C₁, C« und C₄, und die Fraktionen 93 bis 111 enthalten die Faktoren C₂/ C₃ und Cr. Diejenigen Fraktionen, welche mehrere Faktoren enthalten, werden erneut "auf die Säule aufgegeben, wodurch man zu weiteren Ausbeuten an den Faktoren C₁, C₇ und C₃, sowie an den Faktoren C. und C₅ gelangt. Die Fraktionen, die lediglich einen einzigen Faktor enthalten, werden vereinigt, unter Vakuum konzentriert und gefriergetrocknet, wodurch man zu hellgelben Pulvern eines jeden Faktors (in Form des Natriumsalzes) gelangt. Ausgehend von 60 g Gemisch gelangt man zu folgenden Ausbeuten: Faktor C₁ = 5,55 g, Faktor C» = 10 g und Faktor C₃ = 6,61 g. Die Fraktionen, welche mehrere Faktoren enthalten, werden erneut in die mit Umkehrphasenharz gefüllte Säule gegeben, wodurch man zu folgenden weiteren Materialien gelangt: Faktor C_Q = 550 mg, Faktor C₁ =1,29 g, Faktor C₃ = 1,99 g, Faktor C₃ = 443 mg, Faktor C₄ = 512 mg und Faktor C₅ = 384 mg. -.

_„_ 216254

Beispiel 5

Großtechnische Auftrennung und Reinigung der Faktoren von A-21978C

Die Faktoren des vorliegenden Antibiotikums werden auch in größerem Maßstab durch ümkehrphasensäulenchromatographie aufgetrennt. Zu diesem Zweck löst man gemäß Beispiel 3 erhaltenes reines A-21978C Gemisch (6 g) in Wasser (80 ml). Sodann stellt man den pH-Wert dieser Lösung mit Essigsäure auf 4,4 ein und versetzt das Ganze mit Tetrahydrofuran (20 ml). Die erhaltene Lösung wird dann unter niedrigem Druck (Lapp Pumpe) auf eine Stahlsäule (4,8 χ 100 cm) gepumpt, die 1,77 1 Silicagel/C^ /Quantum LP-1, 10 - 20 Mikron, silyliert mit Octadecyltrichlorsilan/ enthält, welches in ein 4:1 Gemisch aus Wasser und Tetrahydrofuran gepackt ist. Die Säule wird unter Druck (etwa 7 bar) mit 150 ml eines 4:1 Gemisches aus Wasser und Tetrahydrofuran gewaschen. Die Entwicklung der Säule wird unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (47,5:15:37,5), welches 0,2 % Pyridin und 0,2 % Essigsäure enthält, bei einem Druck von etwa 7 bar unter einer niedrigen Strömungsgeschwindigkeit von 35 ml pro Minute entwickelt, wobei man 175 ml umfassende Fraktionen auffängt. Die Elution wird kontinuierlich auf einem entsprechenden Überwachungsgerät mit einem Ultraviolettdetektor bei 280 nm überwacht. Diejenigen Fraktionen, die aufgrund der Maxima in der graphischen Überwachung einzelne Faktoren enthalten, werden weiter auch auf einer analytischen Umkehrphasenharzsäule überwacht. Die Fraktionen, die einen einzelnen Faktor enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet. Bei einem derartigen Vorgehen erhält man beispielsweise folgende Ergebnisse: Die Fraktionen 12 bis enthalten den Faktor C₀, die Fraktionen 20 bis 26 enthalten den Faktor C₁, die Fraktionen 38 bis 50 enthalten den FaktorC₂, die Fraktionen 63 bis 78 enthalten den Faktor C₃.

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Die Fraktionen 27 bis 37, welche die Faktoren C₁ und C. enthalten, sowie die Fraktionen 51 bis 62, welche die Faktoren C₂ und C₅ enthalten, werden erneut durch die Säule geschickt, wodurch man zu reinen Faktoren C. und C₁- gelangt. Die Säulenbeladung liegt zwischen 6 und 12 g. Aus insgesamt 84 g A-21978C Gemisch erhält man folgende Ausbeuten: 1,9 g Faktor Cq, 3,27 g Faktor C₁, 4,97 g Faktor C₂ und 1,94 g Faktor C-. Zu höheren Ausbeuten der einzelnen Faktoren gelangt man dann, wenn man die Fraktionen, die mehrere Faktoren enthalten, unter Einsatz geeigneter Lösungsmittelsysteme für eine Hochdruckflüssigchromatographie rückführt. Hierzu können verschiedene Systeme ausgewählt werden, und zwar je nach dem jeweiligen Ansatz, dem verwendeten Umkehrphasenharz und der Art der Säule.

Aus der folgenden Aufstellung gehen verschiedene Systeme hervor, die sich zur Auftrennung der A-21978C Faktoren eignen: * ·

A. Analytische Systeme

Ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (50:25:35), das 0,2 % Essigsäure (HOAc) enthält und mit Pyridin auf pH 5,5 eingestellt ist,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (50:15:35), das 0,2 % Essigsäure und 0,2 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (50:15:35), das 0,75 % Ammoniumformiat enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (95:30:75), das 0,2 % Essigsäure und 0,2 % Pyridin enthält,

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ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (105:15:80), das 0,2 % Essigsäure und 0,2 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Tetrahydrofuran (59:15:25), das 0,5 % Essigsäure und 0,5 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Tetrahydrofuran (60:15:25), das 0,5 % Amraoniumformiat enthält.

B. Präparative Systeme ,

Ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (95:20:85), das 0,15 % Essigsäure und 0,15 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (100:15:85), das 0,15 % Essigsäure und 0,15 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (50:10:40), das 0,1 % Essigsäure und 0,1 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (50:15:35), das 0,75 % Ammoniumformiat enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (55:10:35), das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Tetrahyrofuran, (52,5:15:32,5), das 0,6 % Ammoniumformiat enthält,

ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Tetrahydrofuran, (50:15:35), das 0,6 % Ammoniumformiat enthält.

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Der Vorteil der Verwendung von Essigsäure-Pyridin gegenüber dem Einsatz von Ammoniumformiat besteht darin, daß sich ersteres während der ..Gefriertrocknung entfernen läßt, während das Ammoniumformiat durch Säulenchromatographie (Sephadex G-25) entfernt werden muß.

Beispiel 6 Anderes Verfahren zur Isolierung von A-21978C Gemisch

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (97 1) wird mittels einer Filterhilfe (4 % Hyflo Super-Cel) filtriert und das erhaltene Filtrat (80 1) mit 2 1 eines nichtionischen makroporösen Copolymers aus einem mit Divinylbenzol vernetzten Styrol (Diaion HP-20 Harz, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) 2 Stunden verrührt. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit dekantiert, das Harz mit Wasser (8 1) gewaschen und das Wasser dekantiert. Hierauf verrührt man das Harz 15 Minuten mit 8 1 eines 15:85-Gemisches aus Acetonitril und Wasser und entfernt das Lösungsmittel dann durch Filtrieren. Dieser Vorgang wird wiederholt, um so das gesamte A-21978C Gemisch zu entfernen. Die beiden dabei erhaltenen Filtrate werden vereinigt und unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Das öl wird in einem minimalen Volumen Wasser gelöst, worauf man die Lösung unter Erwärmen zuerst mit 2 Volumina Methanol und anschließend zur Ausfällung des A-21978C Gemisches mit 30 Volumina Aceton versetzt. Der angefallene Niederschlag wird abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 13,6 g rohem A-21978C Gemisch (570 Einheiten pro mg) gelangt.

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Das rohe A-21978C Gemisch wird durch Silicagelsäulenchromatographie gereinigt. Zu diesem Zweck löst man das Gemisch (1 g) in einem minimalen Volumen Wasser, versetzt die Lösung dann mit einer zur Absorption des Wassers ausreichenden Menge Silicagel (Grace 62) und schlämmt das Absorbens in Acetonitril auf. Sodann gibt man die erhaltene Aufschlämmung auf eine 1,5 χ 40 cm messende Säule, die mit in Acetonitril gepacktem Silicagel (Grace Sorte 62) gefüllt ist. Die Säule wird hierauf mit Acetonitril gewaschen. Sodann eluiert man die Aktivität unter Verwendung eines 4:1-Gemisches aus Acetonitril und Wasser, wobei man 25 ml umfassende Fraktionen auffängt. Die Fraktionen werden wie in Beispiel 3 beschrieben überwacht. Die Fraktionen 21 bis 46, die den Großteil des A-21978C Gemisches enthalten, werden vereinigt, unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und dann gefriergetrocknet, wodurch man zu 605 mg gereinigtem A-21978C Gemisch (Natriumsalz) (900 Einheiten pro mg) gelangt.

Beispiel 7 Herstellung der Säureform von A-21978C

Das gemäß Beispiel 1 in Natriumsalζform hergestellte A-21978C Gemisch (7g) wird in Wasser (150 ml) gelöst und die Lösung mit n-Butanol (150 ml) versetzt. Unter anschließendem 1-stündigem Rühren stellt man den pH-Wert der erhaltenen Lösung dann mit 2n Chlorwasserstoffsäure auf pH 3,4 ein. Im Anschluß daran wird die n-Butanolschicht abgetrennt und unter. Vakuum zu einem Rückstand konzentriert. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und die Lösung gefriergetrocknet, wodurch man zu 6 g A-21978C Gemisch in .Säureform gelangt. Nach der gleichen Methode werden auch die Salze der einzelnen Faktoren A-21978C in die entsprechenden Säureformen, überführt.

216 2 54

Beispiele

Herstellung des Natriumsalzes von A-21978C Gemisch aus der Säureform von A 21978C Gemisch .

Das gemäß Beispiel 7 hergestellte A-21978C Gemisch in der Säureform (50 mg) löst man in warmem absolutem Ethanol (5 ml), worauf man die Lösung tropfenweise mit 1n Natriumhydroxid versetzt, bis sie einen pH-Wert von 9,4 hat, und die erhaltene Lösung wird dann über Nacht bei Raumtemperatur aufgehoben. Der hierdurch entstandene Niederschlag wird abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 32 mg A-21978C Gemisch in Form des Natriumsalzes gelangt. Das Natriumsalz enthält einer Untersuchung durch Atomabsorption zufolge 8 % Natrium.

Beispiel 9

Unter Anwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrens bildet man das entsprechende Calciumsalz des Gemisches A-21978C, indem man eine ethanolische Lösung der Säureform des Gemisches A-21978C mit Calciumchlorid in Ethanol versetzt.

Beispiel 10

Mikrobiologische Ermittlung der Aktivität von A-21978 in

Fermentationsbrühen sowie in isolierten Proben hiervon

Zur mengenmäßigen Beurteilung der Aktivität von A-21978 in Fermentationsbrühen und in isolierten Proben hiervon bedient man sich eines Agardiffusionssystems unter Verwendung von Papierscheiben und unter Einsatz von Micrococcus luteus.

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Zur Herstellung beimpfter Agardiffusionsscheiben beimpft man ein Nähragarmedium mit einer entsprechenden Konzentration der zu untersuchenden Kultur und gießt 8 ml Agar dann jeweils in 20 χ 100 mm große Petrischalen aus Kunststoff.

Als Bezugsstandard für diese Untersuchungen dient eine Präparation aus A-21978C Gemisch. Diese Präparation wird als Einheitsbasis verwendet. Hochgereinigtes A-21978C Gemisch enthält etwa 1250 Einheiten pro mg. Die als Standard dienende Dosis-Wirkungs-Kurve wird so ausgelegt, daß sie 150-75-40-20-10-Einheiten pro ml enthält. Als Verdünnungsmittel für den Standard und für die Proben wird 0,1 molarer Phosphatpuffer vom pH 6,O verwendet.

Die Probenlösungen und die Standardlösungen werden unter Verwendung einer automatischen Pipette auf 12,7 mm große Papierscheiben gegeben. Die Inkubation wird 16 bis 18 Stunden bei 30 ⁰C durchgeführt. Die jeweiligen Inkubationszonen werden unter Verwendung eines abgewandelten Antibiotikazonenlesgerätes von Fischer und Lilly ausgewertet.

Claims (9)

1. Erfindungsansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum A-21978 Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces roseosporus NRKL 11379 oder eine A-21978 produzierende Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen so lange züchtet, bis eine beträchtliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet worden ist.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das erhaltene A-21978 Gemisch oder ein Salz hiervon aus dem Kulturmedium abtrennt.
3. 3. . Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß man das A-21978C Gemisch oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978 Gemisch isoliert.
4. 4. . Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man A-21978C Faktor C_Q oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978C Gemisch isoliert.
5. 5. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man A-21978C Faktor C. oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978C Gemisch isoliert.

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6. 6. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man A-21978C Faktor C- oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978C Gemisch isoliert.
7. 7. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet / daß man A-21978C Paktor C₃ oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978C Gemisch isoliert.
8. 8. Verfahren nach Punkt 3, dadurch ge

   kennzeichnet , daß man A-21978C Faktor C₄ oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978C Gemisch isoliert.
9. 9. Verfahren nach Punkt 3, dadurch ge

   kennzeichnet , daß man A-21978C Faktor C₅ oder ein Salz hiervon aus dem abgetrennten A-21978C Gemisch isoliert.

   Hierzu .J^.„ Seiten Tabellen