DD238068A5 - Verfahren zur herstellung von derivaten der cyclopeptidantibiotika a-21978 c - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Derivaten von A-21978C, wie sie beispielsweise aus US-PS 4 537 717 bekannt sind, naemlich von entsprechenden C2-C14-Alkanoylderivaten, indem man einer A-21978C produzierenden Kultur die entsprechende C2-C14-Alkancarbonsaeure oder einen Ester oder ein Salz hiervon zufuehrt. Als A-21978C produzierende Kultur verwendet man vorzugsweise Streptomyces reseosporus NRRL 11379 oder NRRL 15998 oder eine Mutante, Variante oder Rekombinante hiervon.
Description
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Derivaten derCyclopeptidantibiotika A-21978C der Formel (D
worin R für eine C2-Ci4-Alkanoylgruppe steht.
Die der Familie A-21978C angehörenden Antibiotika sind ausgezeichnete antibakterielle Mittel. Eine besonders wichtige Gruppe von Derivaten von A-21978C sind die Verbindungen der Formel (I) (siehe auch Bernard J. Abbott, DavisS.Fukuda und Manuel Debono, US-PS 4537717). Die Herstellung dieser Derivate ist bisher jedoch nur nach einem Mehrstufenverfahren möglich, das zeitraubend, ausbeuteerniedrigend und teuer ist. Zur Herstellung eines Derivats der Formel (I), wie des n-Decanoylderivats von A-21978C, sind beispielsweise folgende Stufen notwendig:
1. Fermentation der A-21978C produzierenden Kultur.
a) Initiierung mit einer Ampulle aus flüssigem Stickstoff.
b) Stufe des Primärimpfguts (48 Stunden).
c) Stufe des Sekundärimpfguts (24 Stunden).
d) Stufe des Tertiärimpfguts (24 Stunden).
e) Fermentation (140 Stunden).
2. Filtration, Adsorption an ein Harz, Elution vom Harz und Einengung.
3. Herstellung des t-Boc-Komplexes (Schutz durch t-But-oxycarbonyl).
4. Einengung des geschützten Komplexes.
5. Fermentation der Deacylierungskultur unter Verwendung von beispielsweise Actinoplanes utahensis.
a) Initiierung mit einer Ampulle aus flüssigem Stickstoff.
b) Stufe des Primärimpfguts (72 Stunden).
c) Stufe des Sekundärimpfguts (48 Stunden).
d) Fermentation (67 Stunden).
6. Deacylierung des Komplexes mit der Deacylierungskultur.
7. Filtration, Adsorption an ein Harz, Elution vom Harz und Einengung.
8. Reacylierung.
9. Hydrolyse der Schutzgruppe
10. Abschließende Reinigung.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Derivaten der Cyclopeptikantibiotika A-21978C mit der oben angegebenen Formel (I), das sich gegenüber den bekannten Verfahren dadurch auszeichnet, daß (1) weniger Stufen als nach den bekannten Verfahren erforderlich sind, (2) das Produkt in höherer Ausbeute anfällt und (3) weniger Zeit erforderlich ist.
Die obige Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß nun dadurch gelöst, daß man eine C2-Ci4-Al kancarbonsäure (nämlich eine Verbindung ROH, worin R wie oben definiert ist) oder einen Ester oder ein Salz hiervon während der Produktionsstufe der Fermentation (Stufe 1 e) zu einer A-21978C produzierenden Kultur gibt, wodurch die entsprechende Verbindung der Formel (I) entsteht.
Durch dieses Verfahren werden die Stufen 3,4,5, 6,7,8 und 9 der vorherigen Verfahren überflüssig. Weiter ergibt das neue Verfahren eine wesentliche Erhöhung der Ausbeuten gegenüber den unter Anwendung des bekannten Verfahrens erzielbaren Ausbeuten.
Die Stämme NRRL 11379 (A-21978.6) und NRRL 15998 (A-21978.65), eine Mutante des Stamms NRRL 11379, von Streptomyces roseosporus eignen sich als Kulturen zu Produktion von A-21978C. Diese Kulturen sind Teil der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, V.St.A., wovon sie unter den Bezugsnummern NRRL 11379 und NRRL 15998 frei erhältlich sind. Die Kultur Streptomyces roseosporus NRRL 11379 und die Bedingungen ihrer Anwendung zur Herstellung der Antibiotika A-21978C werden von Robert
L. Hamill und Marvin M. Hoehn in US-PS 4331594 beschrieben, welche hiermit eingeführt wird.
Die beim vorliegenden Verfahren bevorzugten Mikroorganismenstämme sind zwar die Stämme mit der Bezeichnung A-21978.6 oder A-21978.65, doch läßt sich hierbei jede A-21978C produzierende Kultur verwenden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, welche Stämme für diesen Zweck brauchbar sind.
Die in US-PS 4331 594 beschriebenen und in der Natur vorkommenden Faktoren von A-21978C sind die Faktoren C0, Ci, C2, C3, C4 und C5. Bei den Faktoren C-i, C2, C3, C4 und C5 ist der Substituent R in der Formel (I) eine spezielle Ci0-Ci2-Alkanoylgruppe. Der Faktor C0 von A-21978C, von dem früher angenommen wurde, daß er eine besondere verzweigte Ci0-Alkanoylseitenkette hat, hat sich als ein Gemisch aus zwei Komponenten in einem Verhältnis von 2:1 erwiesen. Die vorherrschende Komponente hat eine verzweigte Cio-Seitenkette, wähend die untergeordnete Komponente die gerade Cio-Seitenkette aufweist.
Zur Vereinfachung der Diskussion wird im Falle der Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine solche Verbindung auch als ein Faktor von A-21978C bezeichnet. Mit Ausnahme der in der Natur vorkommenden Faktoren wird die Länge der Seitenkette zur Bezeichnung des Faktors verwendet. Wird nach diesem Verfahren daher beispielsweise die Verbindung der Formel (I) hergestellt, worin R für Octanoyl steht, dann wird diese Verbindung als Faktor A-21978C8 bezeichnet.
Der Alkylteil der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten C2-Ci4-Alkancarbonsäure oder des Esters oder Salzes hiervon (nämlich das Substrat), kann eine gerade oder verzweigte Kette sein. Zur Herstellung der natürlich vorkommenden Faktoren C1, C2 oder C3 von A-21978C würde man beispielsweise eine 8-Methyldecancarbonsäure, 10-Methyldodecancarbonsäureoder 10-Methylundecancarbonsäure oder einen Ester oder ein Salz hiervon verwenden. Infolge ihrer leichten Verfügbarkeit und niedrigen Kosten empfiehlt sich die Verwendung der geradkettigen C2-C14-Alkancarbonsäuren oder Ester oder Salze hiervon beim vorliegenden Verfahren. Als besonders bevorzugtes Substrat werden n-Decancarbonsäure oder die Ester oder Salze hiervon verwendet.
Bei Verwendung eines C2-Cu-Alkancarbonsäureesters sind die CrC4-AIkylester bevorzugt. In einem solchen Ester kann die CrC4-Alkylgruppe ebenfalls entweder eine gerade oder eine verzweigte Kette sein.
Zu Beispielen für geeignete Salze von C2-Ci4-Alkancarbonsäuren, die beim vorliegenden Verfahren verwendet werden können, gehören die Salze, die mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen gebildet werden, wie Natrium, Kalium, Lithium, Caesium, Rubidium, Barium, Calcium oder Magnesium. Zu geeigneten Aminsalzen gehören die Ammonium, die primären, sekundären und tertiären Ci-C4-Alkylammonium- sowie die entsprechenden Hydroxy-C^C^Alkylammoniumsalze.
Das Substrat wird der Fermentation vorzugsweise in Form einer sterilen Lösung zugeführt. Ein besonders geeignetes Lösungsmittel für diesen Zweck ist Methyloleat, obwohl sich stattdessen auch andere Lösungsmittel verwenden lassen, wie Ethanol, Ethylacetat und CrC4-Ester ungesättigter Fettsäuren. Ist das Substrat bei der Fermentationstemperatur fließfähig, was natürlich zweckmäßig ist, dann kann es direkt zugesetzt werden.
Das Substrat muß so langsam zugeführt werden, daß es zu keinem toxischen Einfluß auf die Fermentation kommt, jedoch rasch genug, daß sich die Ausbeute an der gewünschten Verbindung der Formel (I) erhöht. Zugabegeschwindigkeiten von etwa 0,05 bis etwa 0,5 ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde werden empfohlen. Bevorzugt ist eine Zugabegeschwindigkeit von etwa 0,1 bis etwa 0,2 ml/l Fermentationsbrühe und pro Stunde.
Das Substrat wird der wachsenden und A-21978C prodzierenden Kultur während der Produktionsstufe der Fermentation zugesetzt, die bei etwa 15 bis etwa 32 Stunden beginnt und sich bis zur Beendigung der Fermentation fortsetzt. Das Substrat kann nach verschiedenen Methoden zugesetzt werden, wird vorzugsweise jedoch unter Anwendung einer Methode zugeführt, die die beste Angleichung an eine Gleichgewichtsströmung ergibt.
Nach erfolgter Fermentation kann die gebildete Verbindung der Formel (I), falls dies gewünscht wird, unter Anwendung üblicher Verfahren gewonnen werden (siehe beispielsweise US-PS 4331 594).
Zur Erfindung gehört auch ein Kulturmedium zur Durchführung des obigen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es den Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine Mutante, eine Variante oder eine Rekombinante hiervon und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
Der beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendete neue Mikroorganismus NRRL 15998 wird auch als A-21978.65 bezeichnet. Dieser Stamm ist durch Stammselektion und Stammutation aus einer Kultur entwickelt worden, die als A-21978.6 (NRRL 11379) bezeichnet wird. Der Mikroorganismus NRRL 11379 kann beim erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls angewandt werden. Der Stamm A-21978.6, der von Frederick P. Mertz und Ralph E. Kastner der Lilly Research Laboratories untersucht und charakterisiert worden ist, ist wiederum aus einem Elternstamm entwickelt worden, welcher aus Erde vom Berg Ararat in der Türkei isoliert worden ist. Der Stamm A-21978.6 wird als neuer Stamm von Streptomyces roseosporus, Falcaode Moriasund Daliä Maia1961, klassifiziert. Diese Klassifizierung erfolgte nach Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen (R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams und Wiikins Company,
8. Auflage, 1974; und E. B. Shirling und D. Gottlieb, „Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces", Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 808 bis 809 [1972]).
Die Klassifizierung beruhte auf Methoden, wie sie für das Internationale Streptomyces Projekt (E. B. Shirling und D. Gottlieb,
„Methods of Characterization of Streptomyces Species", Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16,313 bis 340 (1966) empfohlen werden, zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersuchungen. Die Kohlenstoffverwertung wurde auf Grundmedium ISP Nr. 9 bestimmt, welchem Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0% zugesetzt wurden. Die Kohlenstoffquellen wurden durch Filtration sterilisiert. Das Grundmedium wurde durch Autoklavierung sterilisiert. Die Platten wurden nach 14tägiger Bebrütung bei 30°C abgelesen. Die Zellwandzucker wurden unter Anwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Lechevalier bestimmt (M. P. Lechevalier, „Chemical Methods as Criteria forthe Separation of Actinomycetes into Genera", Seminar des Unterkommitees über Actinomyceten der American Society of Microbiology unter Leitung von Dr.Thomas G. Pridham am Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971). Das Isomere der Diaminopimelinsäure wurde unter Anwendung der Methode von Becker et al. bestimmt (B. Becker, et al., „Rapid Differentation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates",Appl. Microbiol. 11,421 bis 423 [1964]). Die Aminosäureanalyse wurde anhand gewaschenerZellwandfragmente durchgeführt. Die Melanoidpigmente wurden unter Anwendung der Medien ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), ISP Nr.7 (Tyrosin-Agar), modifiziertes ISP Nr.7 (ISP Nr.7 ohne Tyrosin) und eines Tyrosinversuchs bestimmt (Yuzuru Mikami, et al., „Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces", Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 27 (3), 290 [1977]). Die Stärkehydrolyse wurde durch Testung bezüglich der Anwesenheit von Stärke mit Iod bestimmt.
Der Temperaturbereich, die NaCI-Verträglichkeit, der pH-Bereich und die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurden unter Verwendung des Agar-Mediums ISP N r. 2 ermittelt. Hierbei ergab sich folgender Temperaturbereich: 25,28,30,34,37,40,45,50 und 550C. Zur Messung der NaCI-Verträglichkeit wurde der Agar mit folgenden Mengen an NaCI versetzt: 0,1,2,3,4,5,6,8,10 und 12%. Es erfolgte eine Bebrütung bei 30°C. Zur Messung des pH-Bereichs wurde der Agar unmittelbar vor dem Gießen in Anteilen von jeweils 1,0 pH-Einheiten von pH 3,0 auf pH 11,0 eingestellt. Die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde unter Verwendung von Empfindlichkeitsschreiben bestimmt, die auf angeimpfte Agar-Platten geklotzt waren. Die Zuordnung der Farbnamen erfolgte nach der Methode ISCC-NBS (K. L Kelly und D. B. Judd, „The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D. C, 1955). Die eingeschobenen Zahlen beziehen sich auf die Farbreihe von Tresner und Backus (H. D.Tresner und E. J. Backus, „System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol. 11,335 bis 338 [1956]). Die Bezeichnungen der Farbtafeln sind unterstrichen. Die Farbblöcke von Maerzund Paul sind in Klammern angegeben (A. Maerzund M.R.Paul, „Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N. Y., 1950).
Die Morphologie der Kultur A-21978.6 besteht aus Sporophoren, die der Klassifikation Rectus-Flexibilis (RF) angehören. Die Sporenketten haben mehr als 10 Sporen pro Kette. Die Sporenoberfläche ist glatt.
Die Kultur A-21978.6 ist gekennzeichnet durch die Produktion einer vorwiegend rot gefärbten Luftsporenmasse mit einer rötlichbraun gefärbten Unterseite. Ferner ist auch ein hellbraunes wasserlösliches Pigment vorhanden. Diese Eigenschaften zeigen sich auf drei der vierzehn Agar-Beschichtungsmedien (nämlich auf ISP Nr.2, ISP Nr.7 und TPO). Diese drei sind die einzigen Medien, die ein reichliches aeriales und vegetatives Wachstum unterstützen.
Zwei Agar-Beschichtungsmedien, nämlich ISP Nr.4und Glucose-Asparagin-Agar, bilden eine weiß bis grau gefärbte Luftsporenmasse mit einer gelb gefärbten Unterseite. Es läßt sich kein wasserlösliches Pigment beobachten. Diese beiden Medien unterstützen ein gutes, jedoch nicht übermäßiges, aeriales und vegetatives Wachstum.
Es werden auch neun andere Agar-Beschichtungsmedien verwendet, wobei hier Wachstum und Sporulation jedoch nur schwach oder überhaupt nicht gegeben sind. Falls überhaupt eine Luftsporenmasse vorhanden ist, dann ist diese nur spärlich zugegen und weiß bis grau gefärbt.
Melanoidpigmente fehlen. Die vorwiegenden Bestandteile derZellwand sind LL-DAP, Glycin, Glucose und Ribose. Dies bedeutet eine Zellwand vom Typ I und ein Zuckermuster vom Typ C (Herausgeber R.E.Buchanan und N.E.Gibbons, „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams & Wilkins Company, 8. Auflage, 1974, Seite 658). Diefolgenden fünf Kulturen werden in Laborversuchen mit A-21978.6 verglichen:
Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833
Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891
Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443
Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958
Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497
Diese Kulturen gehören den Farbreihen weiß und rot an, haben eine Sporophorenmorphologie vom Typ RF, weisen eine glatte Sporenoberflächenornamentation auf und sind nach ISP-Beschreibungen malanin-negativ und haben keine unterscheidungsfähige Unterseitenfarbe und wasserlösliche Pigmente. Diese Eigenschaften passen, zusammen mit dem Kohlenstoffverwertungsmuster und anderen Sekundärmerkmalen, zu denen der Kultur A-21978.6. Vergleicht man diese Kulturen unter Laborbedingungen mit A-21978.6, dann scheiden hierbei vier Kulturen aus. Streptomyces candidus und Streptomyces setonii weisen auf vielen Medien eine gelbe Luftsporenmasse auf, wodurch sie sich von der Kultur A-21978.6 unterscheiden. Streptomyces albovinaceous und Streptomyces moderatus sind an ihrer Unterseite unterscheidungskräftig dunkel gefärbt, ergeben wasserlösliche Pigmente und bilden Melanoidpigmente, wodurch sie sich insgesamt von der Kultur A-21978.6 unterscheiden. Streptomyces moderatus ergibt nach der Beschreibung ISP eine rötlichbraun oder stark braun gefärbte Unterseite, während Streptomyces albovinaceous dieses Merkmal nicht aufweist. Keine dieser Kulturen ist melanin-positiv.
Die Kultur A-21978.6 wird klassifiziert als ein Stamm von Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias und Daliä Maia 1961. Diese Klassifizierung beruht auf einem Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen und direkten Laborvergleichen. Die folgenden Kulturcharakteristiken stellen eine Zusammenfassung der direkten Vergleichsstudien dar.
Kulturcharakteristiken
Morphologie
A-21978.6
Die Sporophoren sind gerade bis gewunden (RF), wobei sich weder Haken, noch Schlaufen, noch Spiralen beobachten lassen.
DieSporenketten haben mehr als 10 Sporen. Durch Abtastelektronenmikroskopie ergibt sich, daß die Sporenoberfläche glatt ist. Sporen: Länglich bis oval Länglich bis zylindrisch
Mittlere Größe: 0,85 x 1,78 μπη 1,01 x 2,47 ^m
Größenbereich: 0,65-0,97 x 0,97-2,6μίτι 0,97-1,3 x 1,63-3,25μνη
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Kulturcharakteristiken (Fortsetzung)
| A-21978.6 | Farbe | Kartoffelstöpsel | |
| Wachstum | Karottenstöpsel | graucpink | |
| graucpink | braun | ||
| Aerial: | gut | braun | |
| Vegetativ: | reichlich | kein lösliches Pigment | |
| gut | |||
| Aerial: | reichlich | ||
| Vegetativ: |
dunkelbraunes lösliches Pigment
ausreichend gut
Trypton-Hefeextrakt-Agar) (W)aweiß [10A1] schwach gelbgrün
kein lösliches Pigment
reichlich
(Hefe-Malzextrakt-Agar) (R) 5cb grau gelb
reichlich [5D10] hell rotbraun
hellbraunes lösliches Pigment
A-21978.6
(Hafermehl-Agar) ausreichend (W)aweiß
ausreichend [10A2] schwach gelbpink
hellbraunes lösliches Pigment
gut
(Anorganische Salze-Stärke-Agar) (W)bweiß
gut [lOBUschwachgelbgrün
hellbraunes lösliches Pigment
(Glycerin-Asparagin-Agar) ausreichend (W) 13ba purpurweiß
gut [3B7]graugelbpink
graupinkes lösliches Pigment
Medium ISP Nr. 7
(Tyrosin-Agar)
reichlich (R)5cbgraugelbpink
reichlich [7L12] mittelrotbraun
dunkelbraunes lösliches Pigment Streptomyces roseosporus Wachstum Farbe
keines keine
gut gelbbraun
kein lösliches Pigment
keines keine
ausreichend orangebraun
kein lösliches Pigment
schwach (W)aweiß
schwach [10B2] schwach
gelbgrün kein lösliches Pigment
reichlich (R) 3ca schwach
orangegelb
reichlich [12L7] hell olivebraun
hellbraunes lösliches Pigment
Streptomyces roseosporus Wachstum Farbe
schwach (W)aweiß
ausreichend schwachgrüngrau
kein lösliches Pigment
gut (R) 3c2 schwach
orangegelb
reichlich [1115] gräulichgelb
kein lösliches Pigment
ausreichend (W) b weiß
gut [10C2] gräulichgelb
hellbraunes lösliches Pigment
reichlich (R)5cbgraugelbpink
reichlich [11E5] gelbbraun
hellbraunes lösliches Pigment
A-21978.6 Wachstum
Kulturcharakteristiken (Fortsetzung)
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Aerial: Vegetativ:
Farbe Modifizierter Bennet-Agar
keines —
schwach fahlgelbbraun
kein lösliches Pigment
keines —
ausreichend [7L12] mittelrotbraun
hellbraunes lösliches Pigment
schwach (W)aweiß
schwach weißlich
kein lösliches Pigment
schwach —
reichlich [13L6]
kein lösliches Pigment
A-21978.6 Wachstum
gut gut
Farbe
(W)bweiß [12B2] graugelb
kein lösliches Pigment
schwach —
reichlich [8L12] dunkelgraubraun
braunes lösliches Pigment
Nähr-Agar
keines —
schwach hellgelbgrau
kein lösliches Pigment
reichlich (R)5cbgraugelbpink
reichlich [8L12] dunkelgraubraun
braunes lösliches Pigment Streptomyces roseosporus Wachstum Farbe
reichlich (R)5cbgraugelbpink
reichlich [11D4] gräulichgelb
hellbraunes lösliches Pigment
schwach (W)aweiß
schwach schwach gelbgrün
schwach gelbgrünes lösliches Pigment
keines keines
reichlich (R)5cbgraugelbpink
reichlich [1115] graugelb
hellbraunes lösliches Pigment
Streptomyces roseosporus Wachstum Farbe
ausreichend (W)bweiß
gut [12B2] schwach
gelbgrün kein lösliches Pigment
reichlich (W)bweiß
reichlich [10G3] hellgelb
hellbraunes lösliches Pigment
ausreichend (W)bweiß
gut hellgelbgrau
kein lösliches Pigment
reichlich (R)5cbgraugelbpink
reichlich [12L7] gelbbraun
braunes lösliches Pigment
Substrat A-21978.6
L-Arabinose +
D-Fructose +
D-Galactose +
D-Glucose +
Isoinosit -
D-Mannit +
D-Raffinose -
L-Rhamnose +
Salicin +
Saccharose —
D-XyI öse +
Schlüssel:+ = Positive Verwertung
— = Negative Verwertung
- / — £.00 UUO
Melanoid Pigmente ISPNr. 1 (Trypton-Hefeextrakt)
ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen) ISPNr.7(Tyrosin-Agar)
ISP Nr. 7 modifiziert (ISPNr. 7 minus Tyrosin)
Ty rosin-Versuch Gelatineverflüssigung Magermilch-Einwirkung Stärke-Hydrolyse pH-Bereich Temperatur-Bereich Nitrat-Reduktion NaCI-Verträglichkeit; Wachstum bis zu
A-21978.6
Streptomyces roseosporus
schwache Hydrolyse +
5-11 25-4O0C
schwache Hydrolyse +
5-11 25-450C
+ 6%
| Antibiotikum | Konzentration/ | Klasse | A-21978.6 | Streptomyces |
| Scheibe | roseosporus | |||
| Erythromycin | 15/Ag | Makrolid | + | + |
| Cephalotin | 30/Ag | (8-Lactam | + | + |
| Lincomycin | 1 μ9 | Glycosid | - | - |
| Nystatin | 100 Einheiten | Polyen | - | - |
| Polymyxin B | 300 Einheiten | Peptid | + | - |
| Streptomycin | 10/Ag | Aminoglycosid | + | + |
| Tetracyclin | 30/Ag | Tetracyclin | + | + |
| Vancomycin | 30/Ag | Glycopeptid | + | + |
+ = Empfindlich (Hemmzonen) - = Resistent (Keine Hemmzonen)
Bestimmte Charakteristiken des Stammes A-21978.6 unterscheiden sich von den für Streptomyces roseosporus veröffentlichten Charakteristiken. Die Kultur A-21978.6 unterscheidet sich vom veröffentlichten Stamm in der Sporengröße, dem Wachstum auf Karotten- und Kartoffelstöpseln, der NaCI-Verträglichkeit und der Nitrat-Reduktion.
Der erfindungsgemäß bevorzugte neue Stamm A-21978.65 (NRRL 15998) hat die identifizierenden Eigenschaften des ebenfalls verwendbaren jedoch bekannten Stammes A-21978.6 (NRRL 11379), unterscheidet sich davon jedoch in der Menge an gebildeten Antibiotika A-21978C. Der frühere Stamm produzierte im besten Fall nicht mehr als 100/xg der Antibiotika A-21978C pro ml Fermentationsmedium. Der verbesserte erfindungsgemäße Stamm A-21978.65 produziert wenigstens das 2,5fache dieser Menge bei Tankfermentationen und bei einer Schüttelkolbenfermentation bereits bis zum 18fachen dieser Menge. Durch dieses verbesserte Produktionsverhalten von A-21978C ermöglicht dieser neue Stamm daher auch ein stark verbessertes Verfahren bei der erfindungsgemäßen Herstellung von Derivaten der Cyclopeptidantibiotika A-21978C der allgemeinen Formel (I), nämlich der gewünschten C2-C14-Alkanoylderivate.
Wie andere Organismen, so sind auch die Eigenschaften der neuen A-21978C produzierenden Kultur, nämlich von Streptomyces roseosporus NRRL 15998, einer Variation zugänglich. Rekombinanten, Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 15998 lassen sich durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen erhalten, wie durch Einwirkung von Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien. Natürlich und induzierte Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces roseosporus NRRL15998, welche die Eigenschaft der Bildung der Antibiotika A-21978C in hoher Ausbeute beibehalten, können erfindungsgemäß ebenfalls angewandt werden.
Das zum Wachsenlassen der Kultur Streptomyces roseosporus NRRL15998 angewandte Kulturmedium kann irgendeines aus einer Reihe von Medien sein. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Eine für eine großtechnische Fermentation bevorzugte Kohlenstoffquelle ist beispielsweise Tapioca-Dextrin, obwohl sich stattdessen auch Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Mannose, Baumwollsaatöl, Methyloleat, Glycerin, gereinigtes Sojabohnenöl und dergleichen verwenden lassen. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist enzymhydrolysiertes Casein, obwohl sich stattdessen auch lösliches Fleischpepton, Sojabohnenmehl, Sojabohnenhydrolysat, Sojabohnenschrot, Hefe, Aminosäuren, wie L-Asparagin und DL-Leucin, und dergleichen eignen. Anorganische Nährsalze, die dem Kulturmedium beigegeben werden können, sind die löslichen Salze, welche Kalium-, Ammonium-, Chlorid-, Sulfat-, Nitrat- und ähnliche Ionen ergeben. Von diesen Salzen ist K2SO4ZUr Bildung des Antibiotikums besonders brauchbar. Ferner eignen sich auch Melasseasche, Aschedialysat und Synthesemineralmischungen. Zur Produktion der Antibiotika A-21978C wird im Fermentationsmedium vorzugsweise destilliertes oder deionisiertes Wasser verwendet. Einige im Leitungswasser vorhandene Mineralien, wie beispielsweise Calcium und Carbonat, scheinen die Bildung des Antibiotikums zu stören.
Im Kulturmedium sollen auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus ebenfalls notwendig sind. Solche Spurenelemente kommen in anderen Bestandteilen des Mediums gewöhnlich als Verunreinigungen in Mengen vor, die den Wachstumserfordernissen des Organismus genügen.
Wird die Schaumbildung zu einem Problem, dann kann der Zusatz geringer Mengen (beispielsweise Mengen von 0,2 ml/l) eines Antischaummittels, wie Polypropylenglycol, zu großtechnischen Fermentationsmedien notwendig sein.
Mengen der Antibiotika A-21978C lassen sich jedoch auch durch Schüttelkolbenkultur erhalten. Infolge der zeitlich verzögerten Bildung des Antibiotikums, zu der es gewöhnlich bei einer Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus kommt, wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Das vegetative Impfgut wird hergestellt, indem man ein kleines Volumen an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus beimpft und so zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das vegetative Impfgut wird dann in einen größeren Tank übertragen.
Man kann den neuen A-21978C produzierenden Organismus bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 40°C wachsen lassen.
Zu einer optimalen Produktion an A-21978C scheint es bei Temperaturen von etwa 30 bis 32°C zu kommen.
Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch beim vorliegenden Verfahren sterile Luft in das Kulturmedium eingeblasen. Für eine wirksame Produktion der Antibiotika A-21978C soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion oberhalb 20%, und vorzugsweise oberhalb 30% (bei 300C und einer Atmosphäre Druck) liegen.
Bei einerTankproduktion hält man den pH-Wert des Fermentationsmediums vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 7,0. Dies läßt sich erreichen, indem man geeignete Mengen an beispielsweise Natriumhydroxid (in den frühen Stufen) und Chlorwasserstoffsäure (in den späteren Stufen) zugibt.
Die Produktion der Antibiotika A-21978C läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Kulturbrühe oder von Extrakten der Mycelfeststoffe bezüglich ihrer antibiotischen Wirksamkeit gegenüber Organismen prüft, von denen man weiß, daß sie antibiotikaempfindlich sind. Ein zur Prüfung dieser Antibiotika geeigneter Versuchsorganismus ist Micrococcus luteus. Der Bioversuch wird vorzugsweise als Papierscheibenversuch auf Agarplatten durchgeführt.
Wahlweise kann man die Kulturfeststoffe unter Einschluß der Bestandteile des Mediums und des Mycels auch ohne Extraktion oder Abtrennung, jedoch vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Quelle für die Antibiotika A-21978C verwenden. Nach Produktion der antibiotischen Aktivität an A-21978C läßt sich das Kulturmedium beispielsweise durch Lyophilisierung trocknen und direkt in ein Futtervorgemisch einmischen.
Die Verbindungen der Formel (I) sind ausgezeichnete antibakterielle Mittel.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen weiter erläutert, die nicht als beschränkend anzusehen sind.
In der Gasphase von flüssigem Stickstoff wird eine Stammkultur hergestellt und gehalten. Mit der ursprünglich in der Gasphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrten Kultur Streptomyces roseosporus NRRL 15998 beimpft man 50ml vegetatives Medium, das folgende Zusammensetzung hat:
Bestandteile Menge (%)
Trypticase Sojabrühe* 3,0
Dextrin 2,5
Wasser (deionisiert) 94,5
* Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD, V.St.A.
Das beimpfte Medium bebrütet man in einem 200 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 48 Stunden bei 300C auf einem Schüttler, der unter einem Bogen von etwa 5cm bei 250 Upm rotiert. Die reife vegetative Kultur wird in eine Reihe von Behältnissen (0,5 ml pro Behältnis) gegeben und in der Gasphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Zur Bildung eines größeren gleichförmigen Vorrats an aufbewahrtem Material beimpft man 80ml des oben beschriebenen vegetativen Mediums mit 1 ml der in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Kultur. Das beimpfte vegetative Medium bebrütet man in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 48 Stunden bei 300C auf einem Schüttler, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von etwa 5cm bei 250 Upm rotiert.
Unter Verwendung von 10 ml einer solchen Kultur beimpft man dann 450 ml eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben beschriebene primäre vegetative Medium hat. Das Medium der zweiten Stufe bebrütet man in einem 21 fassenden Erlenmeyer-Kolben 24 Stunden bei 300C auf einem Schüttler, der unter einem Bogen von etwa 5cm bei 250Upm rotiert.
Mit 1 Liter der vegetativen Kultur der zweiten Stufe beimpft man hierauf 39 Liter eines sterilen Entwicklungsmediums für das dritte Impfgut, das folgende Zusammensetzung hat:
| Bestandteile | Menge(%) |
| Sojabohnenmehl | 0,5 |
| Hefeextrakt3 | 0,5 |
| Calciumgluconat | 1,0 |
| KCIb | 0,02 |
| MgSO4 -7H2Ob | 0,02 |
| FeSO4 -7H2O13 | 0,0004 |
| Sag 471 (Antischaummittel)0 | 0,03 |
| Wasser | 97,9296 |
a Difco Laboratories, Detroit Ml, V. St. A.
b Die Spurenmineralien werden wie folgt hergestellt:
Man löst FeSO4 7H2O (7,6g) in konzentrierter HCI (76 ml). Hierauf gibt man MgSO4 · 7H2O (380g), KCI (380 g) und deionisiertes Wasser in einer Menge zu, daß sich ein Gesamtvolumen von 3800 ml ergibt. Durch Anwendung von 80ml dieser Lösung auf 39 Liter Entwicklungsmedium für das Inokutum der dritten Stufe ergeben sich die angeführten Mengen an Mineralien.
c Union Carbide, Danbury CT, V. St. A.
Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei 300C in einem Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl bebrütet. Das Reaktionsgefäß wird mit steriler Luft in einer Menge von 0,85 Volumina pro Volumen Medium und pro Minute belüftet und mit herkömmlichen Rührern unter einer Geschwindigkeit von 350 bis 450 Upm gerührt. Der Druck im Reaktionsgefäß wird auf 0,35 bar über dem Atmosphärendruck gehalten.
Mit 1 Liter des bebrüteten Impfgutes der dritten Stufe beimpft man dann 119 Liter eines sterilen Produktionsmediums, das folgende Zusammensetzung aufweist:
| Bestandteile | Menge(%) |
| Sojabohnenmehl | 2,2 |
| Fe(NH4J2SO4- 6H2O | 0,066 |
| Dextrose | 0,825 |
| Sag 471 | 0,022 |
| Kartoffelstärke | 3,3 |
| Melasse (Portwein) | 0,275 |
| Leitungswasser | 93,312 |
Der pH-Wert wird nach Zugabe der ersten beiden Bestandteile und dann wieder nach Zusatz aller restlichen Bestandteile unmittelbar vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt.
Das beimpfte Produktionsmedium bebrütet man 6Tage in einem Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl bei 30°C unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 0,5 Volumina pro Volumen Medium und pro Minute. Das Medium wird mit herkömmlichen Rührern zuerst 0 bis 15 Stunden bei 250 Upm und nach 15 Stunden bei 350 Upm gerührt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von Ammoniumhydroxidlösung auf oder über 6,5 gehalten. Die Ausbeute an Komplex A-21978C beträgt am Ende der Fermentation 0,282g pro Liter Brühe. Die Verteilung der einzelnen Faktoren geht aus Tabelle 1 hervor.
Die ersten, zweiten und dritten Wachstumsstufen werden,wie im Beispiel 1 beschrieben,durchgeführt. Die Produktionsstufe wird, wie im Beispiel 1,gestartet, wobei man abweichend davon jedoch bei 28 Stunden mit der Zufuhr einer sterilen Lösung, die aus 50Vol.-% Caprylsäure (Octancarbonsäure) und 50Vol.-% Methyloleat besteht, zur Fermentation in einer Menge von 0,13ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde beginnt und diese Zufuhrgeschwindigkeit bis zur Beendigung der Fermentation nach 144Stunden aufrechterhält. Hierdurch ergibt sich der Komplex A-21978C in einer Ausbeute von 1,255g pro Liter Brühe, was einer Ausbeuteerhöhung von 445°Cgegenüberder Ausbeute von Beispiel 1 entspricht. Der Faktor A-21978C8 (nämlich die Verbindung der Formel (I), worin R für Octanoyl steht) macht 9% der Gesamtmenge des nach diesem Verfahren hergestellten Komplexes A-21978C aus, während sich bei dem nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Komplex A-21978C überhaupt kein Faktor A-21978C8feststellen läßt.
Die ersten, zweiten und dritten Entwicklungsstufen des Impfgutes werden wie im Beispiel 1 beschrieben.durchgeführt. Die Produktionsstufe wird wie im Beispiel 1 gestartet, wobei man abweichend davon jedoch bei 28 Stunden mit der Zufuhr einer sterilen Lösung, die aus 25VoI.-% Nonancarbonsäure und 75VoI.-% Methyloleat besteht, zur Fermentation in einer Menge von 0,13 ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde beginnt und diese Zufuhrgeschwindigkeit bis zur Beendigung der Fermentation nach 144 Stunden aufrechterhält. Hierdurch ergibt sich der Komplex A-21978C in einer Ausbeute von 0,821 g pro Liter Brühe, was einer Ausbeuteerhöhung von 293% gegenüber der Ausbeute von Beispiel 1 entspricht. Der Faktor A-21978C9 (Formel [I], worin R für Nonanoyl steht) macht 10% der Gesamtmenge des nach diesem Verfahren hergestellten Komplexes A-21978C aus, während sich bei dem nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Komplex A-21978C überhaupt kein Faktor A-21978C9 feststellen läßt.
Die ersten und zweiten vegetativen Wachstumsstufen werden wie im Beispiel 1 beschrieben gezüchtet. Bei der dritten Stufe verwendet man 800 ml der zweiten Impfgutkultur zur Beimpfung von 950 Liter sterilem Entwicklungsmedium für das dritte Impfgut, das folgende Zusammensetzung aufweist:
| Bestandteile | Menge(% |
| Dextrose | 2,0 |
| Calciumcarbonat | 0,2 |
| Sojabohnenmehl | 2,0 |
| Hefeextrakt | 0,1 |
| KCP | 0,02 |
| MgSO4 -7H2O3 | 0,02 |
| FeSO4-7H2O3 | 0,0004 |
| Sag 471 (Antischaummittel) | 0,02 |
| Wasser | 95,6396 |
a Lösung an Spurenmineralen, die.wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestel It worden ist.
Das beimpfte Medium wird 24 Stunden in einem Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl bei 30°C bebrütet. Das Reaktionsgefäß wird mit steriler Luft in einer Menge von 0,8 Volumina pro Volumen Medium und pro Minute belüftet und mit herkömmlichen Rührern gerührt. Unter Verwendung von 1 Liter dieses Impfguts der dritten Stufe beimpft man dann 119 Liter Medium der Produktionsstufe, das die im Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung hat. Die Produktionsstufe wird genauso wie im Beispiel 1 beschrieben gestartet, wobei man abweichend davon jedoch bei 28 Stunden mit der Zufuhr einer sterilen Lösung, die aus 50Vol.-% Caprinsäure (Decancarbonsäure) und 50Vol.-% Methyloleat besteht, zur Fermentation in einer Menge von 0,26ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde beginnt und diese Zufuhrgeschwindigkeit bis zur Beendigung der Fermentation nach 283 Stunden aufrechterhält. Hierdurch ergibt sich der Komplex A-21978C in einer Ausbeute von 1,94g pro Liter Brühe, was einer Ausbeuteerhöhung von 687% gegenüber der Ausbeute von Beispiel 1 entspricht. Die Konzentration des Faktors A-21978Ci0 (Formel (I)], worin R für n-Decanoyl steht) beträgt 1,63 g pro Liter oder 84% des gesamten Komplexes A-21978C. Dies ist um 13583% mehr als die unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1 gebildete Menge an A-21978C10.
Die ersten, zweiten und dritten Entwicklungsstufen des Impfgutes werden4wie im Beispiel 1 beschrieben^durchgeführt. Die Produktionsstufe wird wie im Beispiel 1 gestartet, wobei man abweichend davon jedoch bei 28 Stunden mit der Zufuhr einer sterilen Lösung, die aus 25VoI.-% Caprinsäureethylester (Ethylcaprylat) und 75VoI.-% Methyloleat besteht, zur Fermentation in einer Menge von 0,13 ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde beginnt und diese Zufuhrgeschwindigkeit bis zur Beendigung der Fermentation nach 144 Stunden aufrechterhält. Hierdurch ergibt sich der Komplex A-21978C in einer Ausbeute von 1,022 g pro Liter Brühe, was einer Ausbeuteerhöhung von 362% gegenüber der Ausbeute von Beispiel 1 entspricht. Die Konzentration des Faktors A-21978C10 beträgt 0,202 g pro Liter oder 20% des gesamten Komplexes A-21978C. Dies ist um 1683% mehr als die unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1 gebildete Menge an A-21978Ci0.
Die ersten und zweiten vegetativen Wachstumsstufen werden,wie im Beispiel 1 beschrieben,gezüchtet. Das Impfgut der dritten Stufe wird,wie im Beispiel 4 beschriebentgezüchtet, wobei abweichend davon das Volumen des Mediums jedoch 1 900 Liter beträgt und diese Stufe auf eine Dauer von 48 Stunden verlängert ist. Die Belüftung erfolgt in einer Menge von 0,3 Volumina Luft pro Volumen Medium und pro Minute von 0 bis 24 Stunden, in einer Menge von 0,45 Volumina Luft pro Volumen Medium und pro Minute von 24 bis 40 Stunden und in einer Menge von 0,90 Volumina Luft pro Volumen Medium und pro Minute von 40 bis 48 Stunden. Die Produktionsstufe wird wie im Beispiel 1 beschrieben gestartet. Nach 23 Stunden führt man der Fermentation auf einmal eine sterile Aufschlämmung von 0,004% Hefeextrakt zu. Beginnend bei 36 Stunden wird eine Lösung aus Glycerin und Ammoniumdecanoat in einer Menge von 0,84ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde zugesetzt. Diese Lösung enthält Glycerin (3600g), deionisiertes Wasser (9000 ml), Caprinsäure (1 Liter) und eine konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung (620 ml). Die Zugabe wird bei dieser Geschwindigkeit solange aufrechterhalten, bis die Fermentation nach 143 Stunden beendet ist. Die Ausbeute an Komplex A-21978C beträgt 1,772 g/l, was einer Ausbeuteerhöhung von 628% gegenüber der nach Beispiel 1 erhaltenen Ausbeute entspricht. Die Konzentration des Faktors A-21978Ci0 beträgt 0,739 g/l oder 42% des gesamten Komplexes A-21978C. Dies ist um 6158% mehr als die unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1 gebildete Menge an A-21978Ci0.
Die ersten, zweiten und dritten Entwicklungsstufen des Impfguts werden,wie im Beispiel 1 beschriebe^durchgeführt. Die Produktionsstufe wird wie im Beispiel 1 gestartet, wobei man abweichend davon jedoch bei 28 Stunden mit der Zufuhr einer sterilen Lösung, die aus 25 Vol.-% Undecancarbonsäure und 75 Vol.-% Methyloleat besteht, zur Fermentation in einer Menge von 0,13ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde beginnt und diese Zufuhrgeschwindigkeit bis zur Beendigung der Fermentation nach 144 Stunden aufrechterhält. Hierdurch ergibt sich der Komplex A-21978C in einer Ausbeute von 1,62g pro Liter Brühe, was einer Ausbeuteerhöhung von 574% gegenüber der Ausbeute von Beispiel 1 entspricht. Die Konzentration des Faktors A-21978Cn (Formel [I], worin RfürUndecanoyl steht), beträgt 0,70g pro Liter oder 43% des gesamten Komplexes A-21978C. Der Faktor A-21978Cn konnte in dem nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Komplex A-21978C nicht festgestellt werden.
Die ersten, zweiten und dritten Entwicklungsstufen des Impfguts werdenfwie im Beispiel 1 beschrieben,durchgeführt. Die Produktionsstufe wird wie im Beispiel 1 gestartet, wobei man abweichend davon jedoch bei 28 Stunden mit der Zufuhr einer sterilen Lösung, die aus 25Vol.-% Laurinsäure und 75Vol.-% Methyloleat besteht, zur Fermentation in einer Menge von 0,13 ml pro Liter Fermentationsbrühe und pro Stunde beginnt und diese Zufuhrgeschwindigkeit bis zur Beendigung der Fermentation nach 144 Stunden auf rechterhält. Hierdurch ergibt sich der Komplex A-21978C in einer Ausbeute von 1,12 g pro Liter Brühe, was einerAusbeuteerhöhung von 400% gegenüber der Ausbeute von Beispiel 1 entspricht. Die Konzentration des Faktors A-21978C5 (Formel [I], worin R für Dodecanyl steht), beträgt 0,372 g pro Liter oder 33% des gesamten Komplexes A-21978C. Dies ist um 5314% mehrals die Konzentration an A-21978C, die in dem nachdem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Komplex A-21978C zu finden ist.
Komponente von A-21978C ^g/ml)
·b
| Beispiel | Lipidsubstrate | C1 | C2 | C3 | C5 | 7 |
| 1 | keines | 77 | 113 | 72 | 175 | |
| 2 | Caprylsäure | 276 | 312 | 214 | 192 | |
| 3 | Nonancarbonsäure | 147 | 177 | 125 | 77 | |
| 4 | Caprinsäure | 135 | 50 | 48 | 251 | |
| 5 | Caprinsäureethylester | 168 | 246 | 156 | 98 | |
| 6 | Ammoniumdecanoat | 335 | 371 | 228 | 273 | |
| 7 | Undecancarbonsäure | 163 | 206 | 158 | 372 | |
| 8 | Laurinsäure | 204 | 236 | 141 |
113 — 170 —
— 83 90 —
— — 1630d —
— — 202d —
— — 739d —
— — 118 700
— — 173 —
a Die Konzentration derantibiotischen Komponenten in der filtrierten Brühe wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ermittelt. Die verschiedenen Komponenten werden durch Absorption von Ultraviolettlicht detektiert.
b C0, Ci, C2, C3 und C5 = in der Natur vorkommende Faktoren von A-21978C.
C8, C9, Cio und Cn = Verbindungen der Formel (I), worin R für C8-, C9-, Ci0- und Cn-Acylgruppen steht.
c In der Natur vokommender Faktor C0.
d Praktisch nur Komponente, worin R für n-Decanoyl steht.
Der Faktor A-21978Cl0 wird nach dem Verfahren von Beispiel 6 hergestellt, wobei man jedoch die Kultur Streptomyces reseosporus NRRL 11379 verwendet.
a Stadex11,A.E.StaleyCo., DecaturlL,V.St.A.
b NZ Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst NJ, V. St. A.
c Biosate, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD, V.St.A.
Die Ausbeute an Komplex A-21978C bei dieser Fermentation beträgt 1800/ng pro ml Brühe.
Claims (9)
- Erfindungsanpruch:1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Cyclopeptidantibiotika A-21978C der Formel (I)HC2worin R für eine C2-C14-AII<anoylgruppe steht, dadurch gekennzeichnet, daß man einer A-21978C produzierenden Kultur die entsprechende C2-Ci4-Alkancarbonsäure oder einen Ester oder ein Salz hiervon zuführt,
- 2. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine C2-Ci4-Alkancarbonsäure verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen CrC4-AlkylesterderC2-Ci4-Alkancarbonsäure verwendet.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Salz der C2-Ci4-Alkancarbonsäure verwendet.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Caprinsäure oder einen Ester oder ein Salz hiervon verwendet.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als C^Cu-AlkancarbonsäureCaprylsäure, Nonancarbonsäure, Undecancarbonsäure, Laurinsäure oder einen Ester oder ein Salz hiervon verwendet.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als A-21978C produzierende Kultur Streptomyces roseosporus NRRL 11379 oder eine Mutante, eine Variante oder eine Rekombinante hiervon verwendet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mann als Kultur Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine A-21978C produzierende Mutante, Variante oder Rekombinante hiervon verwendet.
- 9. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es den Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine Mutante, eine Variante oder eine Rekombinante hiervon und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
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