DK165757B

DK165757B - Biologisk ren kultur af mikroorganismen streptomyces roseosporus nrrl 15998 samt en fremgangsmaade til fremstilling af det antibiotisk virksomme a-21978c kompleks eller en eller flere af dettes faktorer co' c1' c2' c3' c4' og c5' under anvendelse af mikroorganismen

Info

Publication number: DK165757B
Application number: DK148791A
Authority: DK
Inventors: Floyd Milton Huber; Richard Louis Pieper; Anthony Joseph Tietz; Tom Edward Eaton; Lynda Maxine Ford; Jr Otis Webster Godfrey; Mary Louise Braun Huber; Jr Milton Joseph Zmijewski
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1991-08-21
Publication date: 1993-01-11
Also published as: ES8800362A1; ATE67788T1; PL152359B1; DE3584218D1; CS276983B6; PT81265A; EP0178152A3; AU4837785A; EP0178152B1; HK24292A; CY1633A; DK165757C; KR890000800B1; DK165416C; CN85107552A; NZ213731A; DD238068A5; DK457585D0; FI853910A0; DK148791A

Description

i

DK 165757B

Opfindelsen angår en biologisk renkultur af en hidtil ukendt Streptomyces roseoporus stamme* Opfindelsen angår endvidere en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af det kendte antibiotisk virksomme cykliske peptid benævnt 5 A-21978C-kompleks eller en eller flere af dettes faktorer CQ, C1, C2, Cg, C4 og Cg som har den almene forme

i P

„ „,^Y“ ΛΛ Λ ϊ 1 v X \l/ \y \ 0=< · Y Y H /C0NH2

i# H ® H 9 1 \ J /H-R

15 /\ > K H * ΊΓ1 i / > u γχ/

0=/. \=0 · H

2° ,·—H H-/ «(λΛΑ/w* i Y j *

HOaCJ

25 j

hvor gruppen R

for C^ er 8-methyldecanoyl for C2 er 10-methylundecanoyl 30 for Cg er 10-methyldodecanoyl for Cq er C^Q-alkanoyl for C4 er C12-alkanoyl for Cg er C^g-alkanoyl. 1 A-21978C-komplekset og dettes faktorer er fremragende antibakterielle midler. Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en mikroorganisme, som ved fermentering 2

DK 165757 B

danner A-21978C-komplekset i overraskende store koncentrationer, samt en forbedret fremgangsmåde, hvormed man direkte kan fremstille A-21978C-faktorerne ved brug af mikroorganismen.

5

Kulturen NRRL 15998 (A-21978.65) er en mutantstamme af NRRL 11279 (A-21978.6) og indgår i samlingen af stamkul-turer hos the Northern Regional Research Center, US Department of Agriculture, Agricultual Research Service, 10 Peoria Illinois 61604, hvorfra den er tilgængelig for offentligheden under deponeringsnumret NRRL 15998. NRRL 15998 er deponeret den 5. september 1985 i henhold til Budapesttraktaten.

15 De naturligt forekommende A-21978C-faktorer beskrevet i US patentskrift nr. 4 331 594 er faktorerne Cq, C^, C2, C3, C^, og Cg. I faktorerne C^, C2, Cg, C^ og Cg betegner R i formel I en specifik C^Q-C12“alHanoylgruppe. A-21978C faktor Cq, som tidligere formodedes at indeholde en 20 enkelt forgrenet C^Q-alkanoyl-sidekæde, har vist sig at bestå af en blanding af to komponenter i et omtrentligt forhold på 2:1. Hovedkomponenten indeholder en forgrenet C^Q-sidekæde, mens den mindre betydende komponent indeholder en ligekædet C^Q-sidekæde.

25

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes således den hidtil ukendte mikroorganisme Streptomyces roseospo-rus NRRL 15998. Denne mikroorganisme producerer A-21978C-antibiotika i højere og mere konstante koncentrationer.

30 Opfindelsen angår også en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af det antibiotisk virksomme A-21978C-kom-pleks med formlen I eller en eller flere af dettes faktorer Cq, C2, C3, C^ og Cg, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker Streptomyces roseosporus 35 NRRL 15998 i et dyrkningsmedium, der indeholder as- similerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte, hvor dyrkningsmediet ikke indeholder en Cg-C^2 al- 3

DK 165757B

kansyre eller en ester eller et salt deraf, under submerse aerobe fermenteringsbetingelser, hvorefter man, om ønsket, fraseparerer de individuelle A-21978C-faktorer fra komplekset. Det antibiotiske A-21978C-kompleks kan 5 ekstraheres fra fermenteringsvæsken og fra myceliet ved hjælp af polære organiske opløsningsmidler. De individuelle A-21978C-faktorer kan også frasepareres og renses yderligere ved i sig selv kendte teknikker, såsom kolon-nechromatografi.

10 Sædvanligvis vil kulturen, som er isoleret fra den naturlige tilstand ("vildtypen"), producere antibiotikummet i lave udbytter. Ofte er den antibiotiske produktion uregelmæssig. Stammer med forøget styrke og stammer, som 15 producerer antibiotikummet i konstante mængder, er derfor af stor værdi.

Opfindelsen indebærer en stærkt forbedret proces til fremstilling af A-21978C-antibiotika ved dyrkning af 20 Strepmyces roseosporus NRRL 15998 i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte under submerse aerobe betingelser. Det antibiotiske A-21978C-kompleks eller de individuelle faktorer deraf kan udvindes ved anvendelse af forskellige 25 isolations- og rensningsprocedurer, som er velkendte på fagområdet.

Mikroorganismen er blevet betegnet A-21978.65. Denne stamme blev udviklet ved stammeudvælgelse og mutation fra 30 en kultur betegnet A-21978.6 (NRRL 11379). Stammen A- 21978.6, som er blevet studeret og karakteriseret af Frederick P. Mertz og Ralph E. Kastner hos the Lilly Research Laboratories, er atter udviklet fra en forældre-stamme, som blev isoleret fra en jordprøve fra Mount 35 Ararat i Tyrkiet. Stammen A-21978.6 blev klassificeret som en hidtil ukendt stamme af Streptomyces roseosporus,

Falcao de Morias og Dali’a Mia 1961. Denne klassifikation 4

DK 165757 B

blev foretaget efter sammenligning med publiserede beskrivelser (R.E. Buchanan og N. E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams and Wilkins Company, 8th Ed., 1974; og E. B. Shirling og D.

5 Gottlieb, "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces", Intern. Journal, of Systematic Bacteriol., 808 - 809 (1972)).

Klassifikationerne blev baseret på metoder, som anbefa-10 ledes til det internationale Streptomyces-projekt (E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces Species", Intern. Journal of Systematic ’ Bacteriol. 16, 313 - 340 (1966)) sammen med visse supplerende forsøg. Udnyttelsen af carbon blev bestemt på et 15 ISP nr. 9 basal-medium, hvortil der var sat carbon-kilder til en endelig koncentration på 1,0%. Disse carbon-kilder blev steriliseret ved filtrering, mens basal-mediet blev steriliseret ved autoklavering. Pladerne blev aflæst efter 14 dages inkubation ved 30 °C. Cellevæggenes indhold 20 af sukkerarter blev bestemt ved anvendelse af en modifikation af proceduren beskrevet af Lechevalier (M.P. Lechevalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera" seminar støttet af the Subcommittee on Actinomycetes of the American Society 25 of Microbiology, Dr. Thomas G. Pridham, Convenor, afholdt på the Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971). Isomeren af diaminopimelinsyre blev bestemt ved anvendelse af metoden beskrevet af Becker et 30 al., (Becker et al., "Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 11, 421 - 423 (1964)). Aminosyreanalysen blev foretaget med vaskede cellevæg-fragmenter. Melanoid-pigmenterne blev bestemt 35 ved anvendelse af ISP nr. 1 (trypton-gærekstraktvæske), ISP nr. 7 (tyrosin-agar), ISP nr. nr. 7 modificeret (ISP nr. 7 uden tyrosin) og en tyrosinprøve (Yuzuru Mikami et 5

DK 165757B

al., "Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces", Intern. Journal of Systemic Bacteriol.

27(3), 290 (1977)). Stivelseshydrolysen blev foretaget ved at teste for tilstedeværelsen af stivelse ved hjælp 5 af lod.

Temperaturområdet, NaCl-tolerancen, pH-området og den antibiotiske følsomhed blev bestemt ved hjælp af et ISP nr.

2 agar-medium. Rækkefølgen af temperaturer var 25, 28, 10 30, 34, 37, 40, 45, 50 og 55 °C. NaCl-tolerancen blev i målt ved at sætte NaCl til agaren til koncentrationer på 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 og 12%. Disse medier blev inkuberet ved 30 °C. Man målte pH-området ved at justere agaren fra pH 3,0 til pH 11,0 med stigninger på 1,0 pH-15 enheder umiddelbart inden udhældningen. Den antibiotiske følsomhed blev bestemt ved anvendelse af sensitivitets-plader anbragt på podede agarplader.

Der tildeltes farvenavne i overensstemmelse med iscc-nbs-20 metoden (K.L. Kelly og D.B. Judd, "The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", US Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C., 1955). 1 2 3 4 5 6

Tallene i parenteser refererer til Tresner og Backus 2 farverækker (H.D. Tresner og E.J. Backus, "System of 3

Color Wheels for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol.

4 11, 335 - 338 (1956)). Farvemærkningerne er understreget.

5

Farveblokkene ifølge Maerz og Paul er anført i bløde pa- 6 renteser (A. Maerz og M. R. Paul, "Dictionary of Color",

McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N.Y., 1950).

Morphologi 35 Morphologien af kulturen A-21978.6 består af sporophorer, som hører til Rectus-Flexibilis (RF) klassifikationen. Sporekædeme indeholder mere end 10 sporer pr. kæde.

6

DK 165757 B

Sporeoverfladen er glat.

Kulturen A-21978.6 er karakteriseret ved produktion af en overvejende rød luftig sporemassefarve, som har en rød-5 brun bagsidefarve. Et lysebrunt vandopløseligt pigment er ligeledes til stede. Disse karakteristika viser sig på 3 ud af 14 agar-udsåningsmedier (ISP nr. 2, ISP nr. 7 og TPO). Disse 3 medier er de eneste, som understøtter en rigelig luftig og vegetativ vækst.

10 2 agar-udsåningsmedier, nærmere bestemt ISP nr. 4 og glucose-asparagin-agar, frembragte en hvid til grå luftig sporemassefarve med en gul bagsidefarve. Der observeredes ikke noget vandopløseligt pigment. Disse 2 medier under-15 støttede en god, om end ikke rigelig, luftig og vegetativ vækst.

Der benyttedes 9 andre agar-udsåningsmedier, men disse gav en ringe eller slet ingen vækst og sporedannelse. Når 20 der var en farve til stede i luftmyceliet, om end kun i ringe grad, var der tale om en hvid til grå farverække.

Der er ikke melanoid-pigmenter til stede. De væsentligste bestanddele af cellevæggen er LL-DAP, glycin, glucose og 25 ribose. Dette indikerer en cellevæg af type I og et sukkermønster af type C (R. E. Buchanan og N. E. Gibbons,

Eds., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology",

The Williams & Wilkins Company, 8th Edition, 1974, p.

658).

30

De følgende 5 kulturer blev i laboratorieforsøg sammenlignet med A-21978.6:

Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 35 Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891 Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443 Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958

DK 165757B

7 '

Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497

Disse kulturer hører til den hvide og røde farverække, de har en sporophorer-morphologi af RF-typen og en glat 5 sporeoverflade-ornamentik, og ifølge ISP-beskrivelseme er de melanin-negative og indeholder ikke nogen skelnelig bagsidefarve eller vandopløselige pigmenter. Sammen med carbon-udnyttelsesmønsteret og andre sekundære træk passer disse karakteristika med. egenskaberne af kulturen A-10 21978.6.

Da disse kulturer blev sammenlignet med A-21978.6 under laboratoriebetingelser, måtte 4 af dem kasseres. S. can-didus og S. setonii udviste en gul luftig sporemasse på 15 mange medier, hvorved de adskilte sig fra kulturen A- 21978.6. S. albovinaceous og S. moderatus udviste en mørk karakteristisk bagsidefarve samt vandopløselige pigmenter, og de producerede melanoid-pigmenter. Alle disse karakteristika er forskellige fra kulturen A-21978.6. ISP-20 beskrivelsen af S. moderatus refererer til en rødbrun eller kraftigt brun bagsidefarve, men en sådan egenskab nævnes for S. albovinaceous. Ingen af disse kulturer er angivet som melanin-positive. 1 2 3 4 5 6 35

Kulturen A21978.6 blev derfor klassificeret som en stamme 2 af Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias og Dali'a 3

Maia 1961. Denne klassifikation blev baseret på en sam 4 menligning med publicerede beskrivelser og på direkte la- 5 boratorie-sammenligninger. De følgende karakteristika for 6 kulturen er en opsummering af direkte sammenligninger:

DK 165757 B

8 & g

O a P

X 0) C

co x in o) o co cm g • P h *. o

p x p co c H

ω -η -o 3 a h s q i <p c p (0 C H > <D Λ +> P O H 00 P Dl H Dl

HP >i E vO O C 3 H

Qj P O Λ ·. fa -Η - D) H

(0 (0 tt H Q)

3 Μ H C·» CO

P P Η H Ti X -ø.

O <D O) P s H

a H CM CO Dj

CO H Q) d) O

O 0) Ό Dl X H

<D C C I P ΰ P

CO PCD <0 r-f t-. 10 Q) Q)

O 0) P H O O' X 01 Ό P

P •Hi) 't! v " « C O C

ΛΌ < H O > H Dl H

CO HD

X «. CO

(0 φ X Dl *D p H Od) 0) P P > Λ m x x •Η +3 >|

PH (Dg P

Q) D Od) CQ

+JO 0) P CO

X H P CO >d DO Q)Q) o U JC > λ p DOP 0)

X P 0) g H

, o CO o 3

PS Λ CO CD

3 O

+> P

H C D C

3 0) Η H

tt *D O) Dj 3 P Ό ^ 0) 0) tt d) g K c > c w 0) P *D 3 , *0 _ D p p 0) D g tt Dl Λ Ό H a

0) <P

Ό P vo H 0) * +i

,0 > CM C

Η O I 0) 0) g !N g H p d) a oi Dl

Η O H * H

+> Di D 00 O Dj CQ > Cv 0) O v X p Ό · H Dl '

d) O H IS Dl H

VOflHHXcn HH

•HAP - p H Q) co h in o co o cd tv +>d) 0)001 X OD)·©·

CJ1 0) Ό Ol-tn S OHH

η p fe com > di P a CM X D o

< P H ·· O

0) · H P .. p P P rtj H ·· > 0)

O Qi C Η HP

Δ ·· CO D P Ct

a P P g > D H

O 0) 0) Q) P .. P

P P P D O) P 0) O O O C P H Dl a a a o) c 3 o) CQ CQ CQ CD H d >

DK 165757 B

9 μ c c

3 <D

μ s Λ Dl

I -H

a) a a) CD) > ω c μ μ cn co οι co c c μ ή 3 [* Ή O Η

μ S

o “ a ·©· co μ o a S o 0 μ c μ

01 co <D C <D

Jd di > μ . w c as c

co > T-) T-) -H

μ «3 co μ o u «(-4 Q)

W X

X

(O >4 x μ

H CO

μ h

(O <D

•η μ

μ *H

Φ o μ μ

Jd h

(0 (O

μ « .¾ co c μ S ti 5 *0 § η o) ε 3 O) S ^ Dl 6 > C μ μ *cO 3 a co μ μ c* di λ μ D) μ

rH

0) η «· γΗ a ο μ c ΙΟ 3 . οι μ οο μ ώ θ'. μ Η Ο)

φ C0 Ο) X

γη α: τι σι μ ν « ο μ f < > Di μ ε «· > μ μ (Ο .. +> μ 0) μ Ο 3 0) J >

DK 165757 B

10 c 0. μ il c O) O) H s g, ti O) O C *r| _ g g> 04 o> ε to

_ ® O) > 01 C +J

<0 > μ W μ >i 3 a μ ffl O4 3 H Ρ μ

> KJ O) Λ H

O d) r-l C Φ 0) n a Φ oo a t" Φ w w > (0 CO μ > C J > © 3 5-1 r* O μ p ^ m n ή h O Cd S <H φ (d fc Ρ μ μ Q4 O fe w i—i CO (l< —' O 1—'00 o ·©.

w Η -P

o 04 o G> O O) Gi 3 M *H *rl 5-1 O μφφμ^μμμ,Ο ^ O W a a Φ 5-4 CO Φ φ φ ti «ρΑίΟΟ-ΡΦΑίΟΐΟω ® · P ffi Ή Ή C , O ffi Η μ >h Φ ω(0>ΡΡμφ>ρΡΗ

+> Ol I

0 CO -μ

,0 I X

<w -P <0

~ Λ P

co μ

<0P (O

λ; μ ^ •ri a φ •μ λ; μ co Φ Η μ ρ φ & « ε χ α> a ιο μ ι ρ μ c x S » Ο4 3 <0 Ο C Ο) I ρ ρ μ ®· η S3 <0 Οι Ρ 3 Ό X >ι Ο) Ν Ο) © 1 Ρ Η ρ ρ μ 3 · · 3 W Ο) Ρ >η W μ ti . Ο Ο) >ι £ Η r-l Ο) Η Φ 3 _ <0 Ο, Λ g « · ό > μ cn Ογ-,ο) ρ. η « β η φ ιη ο μ C > Φ > Η 04

Δ r-ι g Ρ Λ Q

CU Φ μ a (0 05 ιη μ C0 > (0| < μ pc^ —' «—i en Η Ρ ^ Ο 04 μ (0 S μ μ h w ι-j μ 0)

Ο) W

μ ·©.

μ μ S Οι W ο Θ· η μ

ιο 04 C

• Ο Ο) Ο) 3 C0 μ μ ρ «ν μ μ μ μ μ λ σ> in c φ ω φ φ φ Η .* > ό μ *i a a ιο OJ »ffioc ffi μ μ ;* < > ·η a μ >ΡΡμ ·· ·· > > μ μ μ μ (0 cd ·· Ρ ·« Ρ μ φ +ί Q) μ a μ a 3 0 3 Φ J > δ >

DK 165757 B

11 Η

4J 3 P

CG 01 O) G

©•(1) «0 <D

Ό P E H 'j ^ I

HOB 3 O) O)

> ·<0 iH 0*5 O) *H

H u ft U 0) f"1 O) (D B) 0) CO O) m

> <d| P Ρ» C H -P

P Λ III O P CFd? 05 10 S >h H id Gi P η h

3 [n wHH ^ fe w O *—1 H

< Q) 0) id o (0P to Q ^ h ^ o cu 01 a o) o 51 o m Q) Ή

O .μ ffl p Λί P HP

S B DlC® Μ g ®®

X G > P Η Λ Ό 0) P

• « HSG C » O HG

^(/3 f> U t-> *H (0> Di HT!

M O

w 2 p -p 3 P p 0 £ é H Dl 6 w (0 , 1 £

(0 H JO

v φ o ni ® jj ni (0 W S 0)

H > W

Li (D H

« £ ·§ S e £ ϋ -5 e c co a p p

tø I (0 O

G · H v-' H

v tø 3 3 1 G O) ^ 0> c. O)

3 Gu (OP· (OP

P (0 Ό >i G P ΊΟ K· S

Η Η Η H O) C H Hg

3 >6 > E

m ,Cr-iO>fe Æi—iCO

Φ (SI H CO d) Λ( Η H

> «i < οι η > ΛΙ cøa tø Ο Ρ c ο

G SHP (0 3: HP

£ w i—i D) fe o*’ i-jO)

Η H

φ d)

to CO

S «

Η H

a a o o p p *D c c • 3 3

00 P . P

IS p ,Q P XI

O' to g G d) S „ C S

rH a:>>w as 13 > to <n ffiSKN ffi O ffi

< > ό T-) Η ί> O) Ή H

·· ·· > £

Η H

P -P

G id <· +» ·· p

+j G P G

«Η O) H O) 3d) 3 Φ J > GJ >

DK 165757 B

12

Jd

C

•H

p a -μ c i c 0) H C fl) HE 33ε 3 0) Oh© © *H «<0 JQ -ri Ό Ί0 Di h M a H h © 3 > © p © -μ Δ © Δ O) , i—i Ή 0 '—i ·Η 0) ί| « H <D ID ID Η > οα) > ω o h λ o in u ^ r-i m tO (0 & r-t &. (0 « Η Ό

3 ti 1—· i—i H ti w i—i H

P Λ CU

0 0 0

Qi ω p p Q C 3 0) 3 © © 3 55 h -Η H h O-'P Δ -ΡΗΗΛ h h 01 C <D W 0) 0) a) (0 X > *0 rø X © © 0) • © B B O >i B Η Η i»i

Λ CO to > η © H > h h H

P I

to c ^ W H h P © (0 h (0 ©

Oh <0 «Η (0 i ~ α c

(il -H

(0 <0 Ό M

X Ή O

*H i > h P Δ >i 01 H 1 P c Η O Ό >— 3 H U O· h <J) <J) h is X Δ

P O © β -O

id >1 *H X · *H ·©.

« H H C h O. h

h © KO *H C I

<0 w Η © HP

X Λ I Οι 3 <0 I in H 10 © h

h 01 3 H KO 0) P

3 · ►» © P h Ό C

P h H KO C ©Od)

H C h fl) g E

3 to © E Λ © & ti Λ © O r-ι η to 0) CO r-ι t) O) lOdOi

Η > Η N ft > H

h rv PQ μ r J JJ

to s n p to «is©

ti w i—i © ti >_» i—i H

*ri H

H Q) Q) 01

W -S

O· H

h a α ο ο £ c Ό c 3 i • *rj © © h ® a η η λ i is P I P Η H <D i © tOCP tO Q) fl) ϋ Η Δί >«κο δ; © © h cj B 8 o h 8 η H &

< >T1©© > h h E

·· ·« j > > I; Η ·Η

P P

<0 (0

.. +J ·· P

P <D P fl) «Η © ih © 3 0) 3 fl) J > ti > i

DK 165757 B

13

P

X c c g η ε a +} D) I c -η H O) Q.

3 H g O) 3 tn . +1 •<0 D) *H _ C O)

U «0 D. Ό «· -H

tn d tj £ί h O) +J > O) 0) JQ tn x; H w O 1—i Ή , 3 « <D n 'f h Q) (01 tn h > Q a) > Di U ^ rH ω k CP° to (O Bi H S (0 S !*

3 bj w LJ ri fo w 1 1 P

Li a c o o g S *> 5> o c d <d t n o p 2.

to Ή -H t-( D> n +JHHX3 P 0) 0)

S W <D 0) 0) g D) D) -P

Λί Di D) CO Λ C G “ . (δ -Η Ή >i ffl f d i?

tO > h D H >VlWH

ί g m , 2, P ^ ® H <0 <p OS1 i h (d p s- « <D H fi C Ό 2 2 x © i ^ Ή (Ί g 2 x) o p V.

m o Ti u ri Ή O ^

Li Uj H

0 -H « +»

<0 O jO

« i β <8 „ 5 “ λ i §

1 +> Η E

Li +J 3 P r-ι O)

3 0) CD D C N-H

jj c > o > »η a

Zj c h i w E h i j

3 <S S I N CD ® 1 > P

OfolH-H foil—<D) O« Ή

H

p 0) o ra H 5 H d <D Di

tD O

& Η £

vo Di C

• O ?

m H

S p C <D P P C Λ cn w <d tn Q) cn Φ C 0) H J* D> G P * £> > « CM tBC-Hfi « C « >« rt; > H f-ι Η >·η·πη «· *· > > •ri -ri

P P

<0 Λ

.. p ·· P

p φ PC) HD) HD) 3 0) 3d) J J >

DK 165757 B

14 44

C

•H

α c I O) Η H 6 3 3 Dl

Dl Dl -H KO TO (¾ μ μ Dl Dl -μ Dl Λ i—i Ή Φ φ o in η > > in η φ „ Β 1 1 μ ~ η ω S3 *σ ι ι ro κ η s

3 fa I I fa ·>—< i—< H

μ a o o a

to 4J

o c ® οι a 3 S . . *h *h μ p +> β β -μ η η λ μ (οφφ φφφφ 44 Dl gi x Dl a w • ffi C β S}iK*r|^i £ ω > -h -H > μ μ h (0 to μ μ 0 Oil «μ c — ·μ - c

(0 CO

44 -Θ-

•Η H

μα μ w o id •H Dl μ cn φ Φ μ 44 to 44 Φ « a c μ «o o ion co 44 u μ 1 ·μ Φ μ <h ό e 3 (o -π ω μ ό > d μ -η χ: 3 (0 > S4 οι Λ C -μ ί-. +i <1 Φ , Φ β φ «5 β > (01 +> Φ > 31 φ μ c to ε μ ι co ε (0 3 ffi Dl (0 I Η Dl

fa —' C ·Η fa I *—J H

a a •μ -μ

Dl Dl •ri τ) Η Η φ φ to to ©· ©· Η Η νο α a • ο οι ο CO μ

c·« -μφφ-μ +> φ η +J

c* to οι οι φ to σίΦΦ Η 44 C β ·μ 44 fi Dl μ <Ν «·μ·μβ 8·Ητ|β < >μμ·μ >μμ·π ·· «« > > •Η ·Η μ μ» (0 (0

·· -μ .« +J

•μ Φ -μ φ Ή 01 Ή Dl 3 Φ β φ 31 > 31 >

DK 165757B

15 S p O) Φ H £ 3 P O)

O) C H -H

(1) 3 Qi p g O)

D> D> Φ P

to Ή CO O) Ό > Οι Ό Ή

•H CO Ή Η H

> P >0)

XJ r-ι O) JC r-i CO

<D (N -H <D , P) θ

CO > Λ « Η > ΛΙ O H

3 μ ^ N ¢1 μ ^ O Qi

μ (0 5 Η CO <0 S H O

O &l, w i—i ©. w i—i α h p

ffl ft C

φ O D) D> 3 *-s| (0 Ή t) h

+>0 P P PHH»Q

too; coca) co <u <υ cd

CO .SC > Ό P .¾ 0> D> CO

p · (Bffloa ffi p t1 ^ μ co >nO)P > μμπ 0 ««μ , · w to μ G) g, to to Dl X t ®

•H C I

Ρ ·Η c co di -η

H <0 O

μ μ „ 0) <o η g p ft DI Ρ X CD £ (0 CO I λ μι Η ·Φ (0 Φ ρ u X CO d ^ °» 1 ο 3 Φ μ ο D) ϋ α; 3 3 «0 >Ί Μ Ρ Η Ό μ Η ·§· η ο -η ο> ο ε 3 > ν χ; r-i ρ r-1 ρ ® C3 C Φ Ν β > XI 03 Φ > «Η φ μ ^ η i μ ι j g to 3: r-i ΰ) (0 ι oo en UJ τ| fri I ^ *Η CU Οι Ρ ρ D) D) •Η Ή γΗ i“t 0) Φ

CD CD

•Θ· ©· Η Η VO Οι _ Οι . ο Ο) Ο ” Ρ Ρ Ρ Φ Η Ρ σ> co Φ co Ο) Φ Ο Η Λ Ό Ό Ρ Λ! 00)3 Μ ffiOOC « -η τ' < > οι ο> ρ >μρχϊ ·· ·· > > Ρ Ρ Ρ ρ (0 φ .. +J ·· ρ ρ α) ρ φ «Η Ο) Ρ Ο) 3 Φ 3 Φ (J > J >

DK 165757B

16 ϋ d •ri a η d 3 3 ho μ οι μ -μ ϋ £ ho λ d Ο) 0) MHO) -g η ε ο> 3 ε Η 3 CJ) D) Ο) £ Ο) *Η £3 Η . Λ ft ϋ i-» ft 0) , μ 0) ιη > ΛΙ σι μ > J μ Μ '-'(ΟΟ) Μ «-> Ν Ο) 03 C0 3 > Η (0 Κ η ri 3 (iiwtOH fit i—i Η Μ 0) 0) Ο 0) Μ ft «· φ 0) Η Η Ο ft ft 0) Ο Ο) Ο) Ο 03 Η Η ο -μ -μ -μ η η μ Μ 03 d 0) 03 Q) α) d > ό μ λ; D)D)3 • 83 83 Ο d 83 Η -Η Μ £ Ο) > η Ο Η > Μ Μ X) <0 Μ 03 β •μ Ο) Μ (0

Ο I

«Μ Η w Μ 0) to ε to Ο) (1) * (0 Μ Η > μ ο) to

03 Ό A

Η d I

Μ 0) (0 α) μ μ d •μ « to λ; 3 Λ 2 (0 d Μ « ft -Η Λ μ μ a ho S jo i μ χ ε η ο I 0 3 b ε* ο χ 3 Ηθ ΗΟ Μ μ Μ Μ -Θ- η ο) οι ε ,Ρ Η « 3 μ Λ Π μ α) σ> c ο) ϋ μ d . > ο) > t n η α) μ ι to ε μ "ν j ε (0 I S Ο) to βί CO 03 I Η Η h ' ι—ι -Η ft ft μ μ Ο) Ο) Η Η Η Η α) α) to to θ· ·& Η Η Ό ft ft • Ο Ο) ο> ο 00 Η Ή ts μ c α) μ μ η η μ σ> to α) ο α) to <D<Dd Η ΑίΟ)θμ Λ0)033 Ν 83 C Ή C «Η-ΗΜ < > Η Μ τ) > Μ Μ Λ ·♦ ·· > > Η *Η μ μ (0 (0 .. 4-» ·· μ μ α) μ α) ή ο» m Ο) 3 0) 3 0) •3 > tJ >

DK 165757 B

17

Carbon-udnyttelse

Substrat_A21978.6_S. roseosporus 5 L-Arabinose + + D-fructose + D-galactose + + D-glucose + + i-Inositol 10 D-mannitol + D-raffinose LRhamnose + +

Salicin + +

Saccharose 15 D-xylose + + + « udnyttelse - = Ingen udnyttelse 20 25 1 35

DK 165757B

18 a ? ® μ 01 Ο >Η α η ο C0 ο Ο ο μ Q) Ό ιη W >ι Η ^ Ο Λ Η

μ I

μ ι • Φ . ΙΩ dp CQ III I I + Η + Β Ν + (Ο φ (0 η Ο 0 Ο VO u ' *0 ο C0 >1 ^ ^ •s X! τΗ σ\ ι Ή μ ι dp es; Φ in ο < II I I ι + Η + in Μ ι Η c

U

φ η οι μ ι 3 χ μ c Λ Αί Ή Η μ φ η -η μ μ μ W μ Ο· Α! 0) «""» 0« φ α; μ · ο μ φ λ μ φ « μ Ο) C Μ μ 01 ίβ to Η Ο 0) ι ο> ι & οι c Αί μ c ι c cq c -η » Φ Ο C μ η β β φ > μ μ ο οι w Φ α: οι φ β c a μ ρ ό μ >t ό ο * φ >ι a μ · φ φ -η η ·<α·μφ ε μ φ * ό w Αί > ο μμο ο> μ a μ ο ί^οκμ ε Αί β -Hwwws HajAits ο o <υ μ a « > η >ι μ «ο μ Φ I Η ΙΟ t> IN ΟΙΙΒ,ΟΦΟΦΦ •Q ο ^ΦΦεΦΌμμΗ <ο ·Η····βββμιο·<ΰ(θΐο

Ji ομμμμμμ^αίΗμμμμ ω βββββίοιομεΦεΦΦΐ 5 5 . Λ ο .ο (0 g > ο ft ^ Η 6 ΦίΟΜίΟΟΙ^ΝΟΙϋμΚΐϋτΐιΐΙ Η 2ΗΗΗΗμΒϋ010)&^2;^:

DK 165757 B

19

CO

3 u o

G

CO

O

©

CO

O

u + + I I I + + +

CO

vo •

Ό CO

Φ O

JC O« g h

O CM

CO < ++II+ + + + ri

«Η TJ

3 i 1 S 2

•H μ ϋ H -P

μ Ό O Ό >i O G

O ri (D Ή H >i fl) '

Η © HJCOCODiOG

A CO O I O Q) -H O <0 O

•h co ^(oon-pc^o μ <o op>ihoi-h^>i C Η (ΟΦΗΟΦΕΦΗ

< & SlOOftftOO

U

©

G

O

N

CO

C O O C C

O IDOCMOOOOO Η Ή X H CO H CO H CO CO u

© G

Λ © H Di

JG G

G -H

•H >1 x <H d>iH-H H CO

DK 165757 B

Visse karakteristika for A21978.6-stammen afviger fra de karakteristika, som er publiceret for S. roseosporus. Kulturen A21978.6 afviger fra den publicerede stamme med hensyn til sporestørrelse, vækst på gulerods- og kartof-5 felstykker, NaCl-tolerance og nitrat-reduktion.

A-21978.65-stammen ifølge opfindelsen har de samme identificerende karakteristika som A-21978.6-stammen, men afviger fra denne med hensyn til den mængde A-21978C-anti-10 biotika, som produceres. Den tidlige stamme producerede i bedste fald højest 100 ug A-21978C-antibiotika pr. ml fermenteringsmedium. Den forbedrede A-21978.65-stamme ifølge opfindelsen producerer mindst 2,5 gange denne mængde ved tankfermentering, og den har produceret helt 15 op til 18 gange denne mængde ved rystef laskefermentering.

Med denne forbedrede evne til at producere A-21978C-anti-biotika frembyder denne hidtil ukendte stamme en stærkt forbedret metode til opnåelse af disse antibiotika.

20 Som det også er tilfældet med andre mikroorganismer, kan de karakteristika, der kendetegner den nye A-21978C-pro-ducerende kultur ifølge opfindelsen, Streptomyces roseosporus NRRL 15998, undergå variationer. Rekombinanter, varianter og mutanter af stammen NRRL 15998 kan opnås ved 25 behandling med forskellige kendte mutagener, såsom ultra-violette stråler, røntgenstråler, højfrekvensbølger, radioaktive stråler og kemikalier.

Dyrkningsmediet, som benyttes til dyrkning af kulturen 30 Streptomyces roseosporus NRRL 15998, kan være valgt blandt en række forskellige medier. Af hensyn til en økonomisk produktion, et optimalt udbytte og en bekvem isolation af produktet foretrækker man imidlertid' bestemte dyrkningsmedier. En foretrukken carbon-kilde til fermen-35 tering i stor målestok er således tapioca-dextrin, selv om man også kan anvende glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, bomuldsfrøolie, methyloleat, glycerol,

DK 165757 B

21 raffineret sojabønneolie og lignende. En foretrukken nitrogen-kilde er enzym-hydrolyseret casein, selv om man også kan anvende opløseligt kød-pepton, sojabønnemel, sojabønnehydrolysat, grovmalede sojabønner, gær, amino-5 syrer, såsom L-asparagin og DL-leucin, og lignende. Nærende uorganiske salte, som kan inkorporeres i dyrkningsmediet, er opløselige salte, som kan tilvejebringe kaliumioner, ammoniumioner, chloridioner, sulfationer, nitrationer og lignende. Blandt disse salte er K2S04 sær-10 ligt nyttigt til antibiotisk produktion. Melasse-aske, aske-dialysater og syntetiske mineralblandinger er ligeledes nyttige.

Til produktion af A-21978C-antibiotika foretrækker man at 15 anvende destilleret eller demineraliseret vand i fermenteringsmediet. Visse af de mineraler, som findes i almindeligt ledningsvand, såsom calcium og carbonat, synes at påvirke den antibiotiske produktion i uheldig retning. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Væsentlige sporstoffer, som er nødvendige for organismens 2 vækst og udvikling, bør også forefindes i dyrkningsmedi 3 et. Sådanne sporstoffer optræder sædvanligvis som urenhe 4 der i de øvrige bestanddele af mediet i mængder, som er 5 tilstrækkelige til at imødekomme organismens vækstkrav.

6 7

Det kan være nødvendigt at tilsætte små mængder (eksem 8 pelvis 0,2 ml/liter) af et anti-skummiddel, såsom poly- 9 propylenglycol, ved fermentering i stor målestok, hvis 10 skumning bliver et problem.

11 12

For at opnå tilpas store mængder A-21978C-antibiotika 13 foretrækker man submers aerob fermentering i tanke. Imid 14 lertid kan man også opnå små mængder A-21978C-antibiotika 15 ved rysteflaskedyrkning. På grund af den tidsforsinkelse, 16 i den antibiotiske produktion, som sædvanligvis er forbundet med podning af store tanke med en sporeform af organismen, foretrækkes det at anvende et vegetativt pode- 22

DK 165757 B

stof. Dette vegetative podestof fremstilles ved at pode et lille volumen af dyrkningsmediet med sporeformen eller med myceliske fragmenter af organismen med henblik på at opnå en frisk, aktivt voksende kultur af organismen. Det 5 vegetative podestof overføres derefter til en større tank.

Den omhandlede A-21978C-producerende organisme kan dyrkes ved temperaturer på mellem ca. 20 og ca. 40 °C. Den opti-10 male A-21978C-produktion synes at optræde ved temperaturer på omkring 30 - 32 °C.

Som det er sædvane ved aerobe submerse dyrkningsprocesser, dispergerer man steril luft i dyrkningsmediet. For 15 at opnå en effektiv produktion af A-21978C-antibiotikum-met bør den procentvise luftmætning ved tankproduktion være over 20%, fortrinsvis over 30% (ved 30 °C og et tryk på 1 atmosfære).

20 Ved tankfermentering foretrækkes det at holde fermenteringsmediets pH-niveau i et område fra omkring 6,5 til omkring 7,0. Dette kan gøres ved tilsætte passende mængder af eksempelvis natriumhydroxid (i de tidlige trin) og saltsyre (i de senere trin).

25

Produktionen af A-2l978C-antibiotikummet kan følges under fermenteringen ved at teste prøver af væsken eller af ekstrakter af myceliets faste bestanddele for antibiotisk aktivitet over for organismer, som vides at være sensiti-30 ve over for disse antibiotika. En sådan prøveorganisme, som er nyttig til at teste disse antibiotika, er Micrococcus luteus. Prøven gennemføres fortrinsvis som en pa-pirskive-prøve på agarplader. 1

Alternativt kan de faste bestanddele fra dyrkningen, herunder bestanddele af mediet og myceliet, benyttes uden ekstraktion eller separation, men fortrinsvis efter fjer-

DK 165757 B

23 nelse af vand, som en kilde for A-21978C-antibiotika. Efter produktion af den antibiotiske A-21978C-aktivitet kan man f. eks. tørre dyrkningsmediet ved lyofilisering og blande det direkte med en foderblanding.

5

De ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede forbindelser med formel 1 er fremragende antibakterielle midler.

10 Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 15 Fremstilling af A-21978C-komplekset

Man fremstillede en stamkultur, blev holdt i dampfasen af flydende nitrogen. Streptomyces roseosporus NRRL 20 15998, som indtil anvendelsen var blevet opbevaret i dampfasen af flydende nitrogen, benyttedes til at pode 50 ml af et vegetativt medium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde (%) 25

Trypticase-soj avæske| 3,0

Dextrin 2,5

Vand (demineraliseret) 94,5 30 IBaltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD.

Det podede medium blev inkuberet i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe ved 30 °C i 48 timer på et rysteapparat, der roterede i en bue med diameter 5 cm og med en omdrej nings-35 hastighed på 250 omdr./min. Den modne vegetative kultur blev fordelt i et antal beholdere (0,5 ml/beholder) og opbevaret i dampfasen af flydende nitrogen.

DK 165757B

24

Med henblik på at opnå en større ensartet forsyning af opbevaret materiale benyttede man 1 ml af kulturen, som opbevaredes i flydende nitrogen, til at pode 80 ml af det ovenfor beskrevne vegetative medium. Det podede vegeta-5 tive medium blev inkuberet i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe ved 30 °C i 48 timer på et rysteapparat, der roterede i en bue med en diameter på 5 cm og en omdrejningshastighed på 250 omdr./min.

10 10 ml af en sådan kultur blev benyttet til at pode 450 ml af et vegetativt vækstmedium i andet trin, hvilket medium havde samme sammensætning som det primære vegetative medium beskrevet ovenfor. Dette medium i andet trin blev inkuberet i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe i 24 timer ved 30 15 0C på et rysteapparat, der roterede i en cirkelbue med en diameter på 5 cm og med en omdrejningshastighed på 250 omdr./min.

1 liter af den vegetative kultur i andet trin blev be-20 nyttet til at pode 39 liter af et sterilt tertiært udviklingsmedium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde (%) 25 Sojabønnemel 0,5 Gærekstrakt 0,5

Calciumgluconat 1,0 KClb 0,02

MgS04.7H20b 0,02 30 FeS04.7H20b 0,0004

Sag 471 (antiskummiddel)0 0,03

Vand 97,9296 a

Difco Laboratories, Detroit MI 35

Spormineralerne fremstilledes som følger: FeS04.7H20 (7,6 g) blev opløst i koncentreret HC1 (76 ml).

DK 165757 B

25

MgS0^.7H20 (380 g), KC1 (380 g) og demineraliseret vand tilsattes til opnåelse af et totalt volumen på 3800 ml.

Til opnåelse af de specificerede mineraler benyttes 80 ml af opløsningen pr. 39 liter tertiært podningsmedium.

5 c Union Carbide, Danbury CT.

Det podede medium blev inkuberet i 24 timer i en rustfri stålbeholder ved 30 °C. Beholderen blev beluftet med ste-10 ril luft i en mængde på 0,85 v/v/min. og omrørt med konventionelle omrøringsorganer, der roterede med 350 - 450 omdr./min. Trykket i beholderen blev holdt på 0,35 kg/cm2.

15 1 liter af det inkuberde tertiære podningstrin blev be nyttet til at pode 119 liter af et sterilt produktionsmedium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde (%) 20

Sojabønnemel 2,2

Fe(NH4)2S04.6H20 0,066

Dextrose 0,825

Sag 471 0,022 25 Kartoffeldextrin 3,3

Melasse (mørk sirup) 0,275

Ledningsvand 93,312

Efter tilsætning af de første 2 ingredienser blev pH ind-30 stillet til 7,0, og denne indstilling blev gentaget, efter at alle ingredienser var blevet tilsat umiddelbart før sterilisation.

Det podede produktionsmedium blev inkuberet i 6 dage i en 35 rustfri stålbeholder ved 30 °C og beluftet med steril luft i en mængde på 0,5 v/v/min. Mediet blev omrørt ved hjælp af konventionelle omrøringsorganer, der roterede 26

DK 165757B

med en omdrejningshastighed på 250 omdr./min. i de første 15 timer og derefter med 350 omdr./min. Blandingens pH-værdi blev holdt på eller over 6,5 ved tilsætning af en ammoniumhydroxidopløsning. Udbyttet af A-21978C-komplek-5 set var 0,282 g pr. liter fermenteringsvæske ved afslutningen af fermenteringen. Fordelingen af faktorer fremgår af den efterfølgende tabel 1.

Tabel 1 10

Fordelingen af faktorer

a K

Eksempel nr. A-21978C-komponent (ug/ml) ' 15 C1 C2 C3 C5 C0 1 77 113 72 7 12 20 3 Koncentrationen af de antibiotiske komponenter i den filtrerede væske blev bestemt påvist ved ultraviolet absorption.

Cq, C^, C2, og Cg = naturligt forekommende A-21978C-25 faktorer. 1 35

DK 165757 B

27 EKSEMPEL 2

Rysteflaske-produktion af A-21978C-komplekset 5

Man benytter den generelle procedure beskrevet i eksempel 1, idet man dog anvender rystef laske-betingelser med følgende fermenteringsmedium: 10 Ingrediens Mængde (g/1)

Glucose 7,5

Dextrina 30

Enzym-hydrolyseret casein0 5 15 Pepton 5

Melasse 2,5

Demineraliseret vand op til 1 liter

aStadex 11, A.E. Staley Co., Decatur IL

20

^NZ Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst NJ

cBiosate, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD.

25

Udbyttet af A-21978C-kompleks ved denne fermentering er 1800 ug pr. ml fermenteringsvæske.

30 35

Claims

28 DK 165757 B Patentkrav :

1. Biologisk ren kultur af Streptomyces roseosporus NRRL 5 15998.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af det antibiotisk virksomme A-21978C-kompleks med formlen I i 10. tjlHa /\ Λ / V*x· HCKC H t I li λ i · v 15 0=/ V H JMNH* \. π δ H t I *\ 8 /H-R \=o °=\ p I " i I 20 ·( > U VV </V\A/vV 25. i Y i ϊ - HOsC . i. 1 2 3 4 5 6 hvor gruppen R 2 for er 8-methyldecanoyl 3 for C2 er 10-methylundecanoyl 4 for Cg er 10-methyldodecanoyl 5 for Cq er C^Q-alkanoyl 6 for er C^g-alkanoyl for Cg er C^g-alkanoyl DK 165757 B 29 eller en eller flere af dettes faktorer, nemlig CQ, C^, C2' ^3' C4 C5' kendetegnet ved, at man dyrker Streptomyces roseosporus NRRL 15998 i et dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare kilder for carbon, ni-5 trogen og uorganiske salte, hvor dyrkningsmediet ikke indeholder en alkansyre eller en ester eller et salt deraf, under submerse aerobe fermenteringsbetingelser, hvorefter man, om ønsket, fraseparerer det dannede A-21978C-kompleks, og om ønsket, separerer de individuel-10 le A-21978C-faktorer fra komplekset.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man separerer A-2l978C-komplekset fra dyrkningsmediet . 15

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3 til fremstilling af en eller flere af de individuelle antibiotiske A-21978C-faktorer, CQ, C^, C2, C3, C4 og Cg, kendetegnet ved, at man separerer de individuelle fakto- 20 rer fra det antibiotisk virksomme A-21978C-kompleks. 25 1 35