FI82075B - Foerfarande foer framstaellning av a-21978c-derivat och vid foerfarandet anvaend streptomyces roseosporus. - Google Patents

Description

1 82075

Menetelmä A-21978C-johdannaisten valmistamiseksi sekä menetelmässä käytetty Streptomyces roseosporus Tämä keksintö koskee parannettua menetelmää 5 A-21978C:n syklisen peptidiantibioottijohdannaisen valmis tamiseksi, jolla on kaava (1) I Γ Αγ“ ΛΛ A i 1 v! A · YAi h /»· 15 H Hac/ γΥ Y Y^ ·χ /es=0 6h2 I A L-Y \

< \h loJ !! I

> / Y V

γ Vo A

20 s· 7« ?H3 o H-Y

Y\V

HOsC^ 25 jossa R on C8-CI2-alkanoyyliryhmä. Menetelmälle on tunnusomaista, että syötetään vastaavaa C8-C12-alkaanihappoa, sen esteriä tai suolaa viljelmään, joka käsittää kannan Streptomyces roeosporus NRRL 11379 tai NRRL 15998, lämpötilan 30 ollessa noin 25 - 40 °C. Tämän menetelmän etuja ovat: 1) menetelmä käsittää harvempia vaiheita kuin aikaisemmat menetelmät, 2) tuotteen saanto suurenee; ja 3) tarvitaan . vähemmän aikaa.

A-21978C-heimoon kuuluvat antibiootit ovat oivalli-35 siä bakteerinvastaisia aineita. Erityisen merkittävä ryhmä 2 82075 A-21978C-johdannaisia ovat kaavan I mukaiset johdannaiset (katso myös: Berbard J. Abbott, Davis S. Fukuda ja Manuel Debono, US-patentti nro 4 537 717). Näiden johdannaisten valmistukseen tarvittiin aikaisemmin monivaiheinen mene-5 telmä, joka oli aikaavievä, saantoa pienentävä ja kallis. Esillä oleva keksintö tarjoaa käytettäväksi parannetun menetelmän näiden A-21978C-johdannaisten valmistamiseksi suoraan. Aikaisempi menetelmä kaavan I mukaisen johdannaisen, kuten A-21978C:n n-dekanoyylijohdannaisen, valmistalo miseksi vaati seuraavat vaiheet: 1. A-21978C:tä tuottavan viljelmän käyminen.

a. Käymisen saattaminen alkuun nestemäistä typpeä sisältävän ampullin avulla.

b. Primäärinen siirrosvaihe (48 tuntia).

15 c. Sekundäärinen siirrosvaihe (24 tuntia).

d. Tertiäärinen siirrosvaihe (24 tuntia).

e. Käyminen (140 tuntia).

2. Suodatus, adsorptio hartsiin ja eluointi sekä väkevöinti .

20 3. t-Boc-(t-butoksikarbonyylisuojatun) kompleksin valmis tus.

4. Suojatun kompleksin väkevöinti 5. Deasyloidun viljelmän käyminen käyttämällä esim. Actinoplanes utahensis'ta 25 a. Käymisen saattaminen alulle nestemäistä typpeä sisältävän ampullin avulla.

b. Primäärinen siirrosvaihe (72 tuntia).

c. Käyminen (67 tuntia).

6. Kompleksin deasylointi deasyloidun viljelmän avulla.

30 7. Suodatus, adsorptio hartsiin ja eluointi sekä väkevöin ti.

8. Uudelleenasylointi.

9. Suojaavan ryhmän hydrolyysi.

10. Lopullinen puhdistus.

35 Esillä oleva uusi menetelmä käsittää C8-C12-alkaa- nihapon (ROH-yhdisteen, jossa R on sama kuin edellä on 11 3 82075 määritelty) tai sen esterin tai suolan lisäämisen A-21978C:tä tuottavaan viljelmään käymisen tuotantovaiheen (vaihe le) aikana vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen saamiseksi. Tämän menetelmän avulla voidaan eliminoida 5 aikaisemman menetelmän vaiheet 3, 4, 5, 6, 7, 8 ja 9. Uusi menetelmä suurentaa sitäpaitsi saannot huomattavasti suuremmiksi kuin ne saannot, jotka on saatu käyttämällä aikaisempaa menetelmää.

Streptomyces roseosporus-kannat NRRL 11379 10 (A-21978,6) ja NRRL 15998 (A-21978,65), eräs NRRL 11379:n mutanttikanta, ovat käyttökelpoisia A-2l978C:tä tuottavia viljelmiä. Nämä viljemät ovat osa perusviljelmäkokoelmaa, jota ylläpitää Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 15 Peoria, Illinois 61604, josta ne ovat yleisön saatavissa vastaanottonumeroilla NRRL 11379 ja NRRL 15998. S. roseos-porus NRRL 11379-viljelmää sekä olosuhteita sen käyttämiseksi A-21978C-antibioottien tuotannossa ovat selostaneet Robert L. Hamil ja Marvin M. Hoehn US-patentissa 20 4 331 594, joka on sisällytetty tähän viittauksena.

Luonnossa esiintyviä, US-patentissa 4 331 594 selostettuja A-21978C-teki jöitä ovat tekijät C0, Cx, C2, C3, C4 ja C5. Tekijöissä ja C5 on R kaavassa I erityinen C10-C12-alkanoyyliryhmä. A-21978C-tekijän C0, jonka aikai-25 semmin arveltiin omaavan erityisen haarautuneen C10-alka-noyylisivuketjun, on todettu olevan kahden komponentin seos likimain suhteessa 2:1. Pääkomponentissa on haarautunut -C10-sivuketju ja vähäisemmässä komponentissa on suorako- sivuketju.

30 Valmistettaessa kaavan I mukaista yhdistettä tämän keksinnön mukaisella menetelmällä kutsutaan sitä mukavuussyistä myös A-21978C-tekijäksi. Lukuunottamatta luonnossa • - esiintyviä tekijöitä käytetään sivuketjun pituutta tar koittamaan tekijää. Niinpä esimerkiksi kaavan I mukaista 35 yhdistettä, jossa R = oktanoyyli, kutsutaan siinä tapauk- 4 82075 sessa, että se on valmistettu tämän menetelmän avulla, A-21978Ce-tekij äksi.

Tämän keksinön mukaisessa menetelmässä käytetyn C8-C12-alkaanihapon, esterin tai suolan (substraatin) alkyy-5 liosa voi olla suora tai haarautunut ketju. Luonnossa esiintyvän A-21978C-tekijoiden C1, C2 tai C3 valmistamiseksi voitaisiin käyttää esimerkiksi 8-metyylidekaani-, 10-me-tyylidodekaani- tai 10-metyyliundekaanihappoa, -esteriä tai -suolaa. C8-C12-suoraketjuisia happoja, -estereitä ja 10 -suoloja suositellaan käytettäväksi menetelmässä niiden saatavuuden ja halpuuden vuoksi. Erityisen edullinen substraatti on n-dekaanihappo, sen esterit tai suolat.

Käytettäessä C8-C12-alkaanihappoesteriä pidetään C^-C^-alkyyliestereitä edullisina. Tällaisessa esterissä 15 voi C1-C4-alkyyliryhmä olla myös suora tai haarautunut ketju.

Tyypillisiä sopivia C8-C12-alkaanihappojen suoloja, joita voidaan käyttää menetelmässä, ovat sellaiset, jotka on muodostettu käyttämällä alkalimetalleja ja maa-alkali-20 metalleja, kuten natriumia, kaliumia, litiumia, sesiumia, ribidiumia, bariumia, kalsiumia tai magnesiumia. Sopivia amiinisuoloja ovat ammonium-, primääriset, sekundääriset ja tertiääriset C^C^-alkyyli-ammonium- ja hydroksi-C2-C4-alkyyli-arnmoniumsuolat.

25 Substraatti lisätään käymisalustaan edullisesti steriilin liuoksen muodossa. Erityisen käyttökelpoinen liuotin tähän tarkoitukseen on metyylioleaatti, vaikkakin muitakin liuottimia voidaan käyttää, kuten etanolia, etyyliasetaattia ja tyydyttymättornien rasvahappojen C1-C4-este-30 reitä. Mikäli substraatti on sopivasti nestemäinen käymis-lämpötilassa, voidaan se lisätä suoraan.

Substraatin lisäysnopeuden tulee olla kyllin alhainen sen seikan välttämiseksi, että muodostuu käymistä myrkyttävä vaikutus, mutta kyllin korkea toivotun, kaavan I 35 mukaisen yhdisteen saannon suurentamiseksi. Lisäysnopeuk-

II

5 82075 siksi suositellaan noin 0,05 - noin 0,5 ml litraa kohti käymislientä tunnissa. Lisäysnopeutena noin 0, 1 - noin 1,2 ml litraa kohti käymislientä tunnissa on edullinen.

Substraattia lisätään kasvavaan, A-21978C:tä tuot-5 tavaan viljelmään käymisen tuotantovaiheen aikana noin 15. - noin 32. tunnista alkaen ja jatkaen siihen asti kunnes käyminen on päättynyt. Substraatti voidaan lisätä eri menetelmillä, mutta on edullista lisätä se sellaisella menetelmällä, jolla parhaiten saavutetaan tasainen virtaus.

10 Käymisen jälkeen voidaan muodostunut kaavan I mu kainen yhdiste ottaa haluttaessa talteen käyttämällä tällä alalla tunnettuja menetelmiä (katso esim. US-patenttia 4 331 594.

Tämän keksinnön kohteena on myös aikaisemmin mai-15 nittu uusi mikro-organismi, Streptomyces roseosporus NRRL 15998 ja sen jälkeläiset. Tämä mikro-organismi tuottaa myös A-21978C-antibiootteja.

Luonnontilasta eristetty viljelmä ("villi laji") tuottaa antibioottia vähäisen saannon. Antibiootin muodos-20 tuminen on usein oikullista. Sellaiset kannat, joilla on parantunut teho, ja sellaiset kannat, jotka tuottavat jatkuvasti antibioottia, ovat tämän vuoksi erittäin arvokkaita.

Keksinnön tämän osuuden mikro-organismista on käy-25 tetty merkintää A-21978.65. Tätä kantaa kehitettiin kantaa valikoimalla ja mutatoimalla viljelmästä, josta käytetään merkintää A-21978.6 (NRRL 11379). A-21978.6-kanta, jota tutkivat ja luonnehtivat Frederick P. Mertz ja Ralph E. Kastner (Lilly Research Laboratories), kehitettiin vuoros-30 taan alkuperäiskannasta, joka oli saatu Turkista Ararat-vuoren maaperästä. A-21978.6-kanta luokitellaan uudeksi kannaksi, jonka nimitys on Streptomyces roseosporus, Falä-co de Morias and Daliä Maia 1961. Tämä luokitus suoritettiin sen jälkeen kun oli vertailtu julkaistuja selostuksia 35 [R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Deter- 6 82075 minative Bacteriology, "The Williams and Wilkins Company, 9. painos, 1974; ja E.B. Shirling ja D. Cottlieb, "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces," Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 808-809 (1972)].

5 Luokitus perustui menetelmiin, joita on suositeltu

International Streptomyces Project-ohjelmaa varten [E.B. Shirling ja D. Cottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces Species, "Intern. Journal of Systematic Bec-teriol. 16, 313-340 (1966)] yhdessä määrättyjen täydennys-10 kokeiden kanssa. Hiilen hyväksikäyttö määritettiin ISP nro 9 perusalustassa, johon hiilen lähteitä lisättiin niin paljon, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 1,0 %. Hiilen lähteet steriloitiin suodattamalla; perusalusta steriloitiin kuumentamalla autoklaavissa. Levyt tutkittiin 15 sen jälkeen kun niitä oli inkuboitu 14 päivää 30 °C:ssa. Soluseinämien sokerit määritettiin käyttämällä Lecheva-lier'in menetelmää, (M.P. Lechevalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera", American Society of Microbiology-nimisen yhdistyksen 20 Actinomycetes-luokkaa käsittelevän alakomitean tukema se minaari, puheenjohtajana tri. Thomas G. Pridham, joka seminaari pidettiin Institute of Microbiology-nimisessä laitoksessa (Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971). Diaminopimelii-25 nihapon isomeeri määritettiin käyttämällä Becker'in ja muiden menetelmää [B. Becker, et ai., "Rapid Differentiation Between Norcardia ja Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates," Appi. Microbiol. 11, 421-423)]. Aminohappoanalyysi suoritettiin pesemällä solu-30 seinämien fragmentit. Melanoidi-pigmentit määritettiin käyttämällä ISP nro 1-koetta (tryptoni-hiivauuteliemi), ISP nro 6-koetta (peptoni-hiivaute rauta agar), ISP nro 7-koetta (tyrosiini agar), ISP nro 7-koetta muunnettuna (ISP nro 7 ilman tyrosiinia) ja tyrosiini-koetta [Yuzuru Mika-35 mi, et.ai., "Modified Arai ja Mikani Melanin Formation li 7 82075

Test of Streptomyces", Intern. Journal of Systematic Bac-teriol. 27(3), 290 (1977)]. Tärkkelyksen hydrolyysi suoritettiin testaamalla läsnä oleva tärkkelys jodilla.

Lämpötila-alue, NaCl:n sietokyky, pH-alue ja anti-5 biootin herkkyys tutkittiin käyttämällä ISP nro 2:n agar-alustaa. Lämpötilojen vaihtelualue oli seuraava; 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 ja 55°C. NaClrn sietokyky mitattiin lisäämällä NaCl agariin niin paljon että väkevyyksiksi tuli; 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ja 12 %. Näitä inkuboi-10 tiin 30 C°:ssa. pH-alue mitattiin säätämällä agar'in pH-ar-vosta 3,0 arvoon 11,0 l,0:n suuruisin pH-arvoyksikköjen lisäyksin juuri ennen valamista. Antibioottien herkkyys määritettiin käyttämällä herkkyyskiekkoja, jotka oli levitetty siirrostetuille agar-levyille.

15 Värien nimet merkittiin ISCC-NBS-menetelmän mukaan (K.L. Kelly ja D.B. Judd, "The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S. Department of Commerce Cire. 553 Washington, D.C., 1955).

Suluissa olevat numerot tarkoittavat Tresner'in ja 20 Backus'in värisarjaa [H.D. Tresner ja E.J. Backus, "System of Color heels for Streptomycete Taxonomy", Appi. Microbiol. 11, 335-338 (1956)]. Värisuikalemerkinnät on alle-viitattu. Merz'in ja Paul’in värilaattamerkinnät on suljettu hakasulkuihin (A. Maerz ja M.R. Paul, "Dictionary of 25 Color", McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N.Y. 1950).

Morfologia

Viljelmän A-21978.6 morfologia koostuu sporoforeis-ta, jotka ovat Rectus-Flexibilis (RF)-luokitusta. Itiöket-30 juissa on >10 itiötä ketjua kohti. Itiön pinta on sileä.

Viljelmää A-21978.6 luonnehditaan siten, että se tuottaa pääasiallisesti punaisen väristä ilmaitiömassaa kääntöpuolen värin ollessa punaisenruskeata. Vaaleanruskeata vesiliukoista pigmenttiä on myös läsnä. Nämä tunnus-35 omaiset piirteet esiintyvät kolmella neljästätoista agar-levyviljelyalustasta (ISP nro 2, ISP nro 7, TPO). Nämä 8 82075 kolme alustaa ovat ainoat sellaiset, jotka kannattavat runsasta ilma- ja vegetatiivista kasvua.

Kaksi agar-levyviljelyalustaa, ISP nro 4 ja glukoo-si-asparagiini-agar, tuottivat väriltään valkoisen ja har-5 maan välillä olevaa ilmaitiömassaa kääntöpuolen värin ollessa keltainen. Mitään vesiliukoista pigmenttiä ei havaittu. Nämä kaksi alustaa kannattivat hyvää, joskaan ei runsasta ilma- ja vegetatiivista kasvua.

Yhdeksää muuta agar-levyviljelyalustaa käytettiin, 10 mutta nämä tuottivat heikon tai olemattoman kasvun ja itiöiden muodostuksen. Ilmamassan väri, mikäli tällaista massaa oli läsnä vaikkakin heikosti, kuului värisarjassa valkoisen ja harmaan välille.

Melanoidi-pigmentit puuttuvat. Soluseinämän pää-15 asialliset aineosat ovat: LL-DAP, glysiini, glukoosi ja riboosi. Tämä osoittaa tyyppiä I olevaa soluseinämää ja tyyppiä C olevaa sokerirakennetta. (R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, Eds., "Bergeys's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams & Wilkins Company, 8. painos, 1974, 20 s. 685).

Seuraavia viittä viljelmää verrattiin laboratoriokokeissa A-21978.6:en:

Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891 25 Streptomyces moderatus ISP 5529, ATCC 23443

Streptomyces roseosporus ISP 5122, ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497 Nämä viljelmät kuuluvat valkoiseen ja punaiseen vä-risarjaan, niillä on RF-tyyppiä oleva sporofori-morfolo-30 gia, sileä itiön pintakoristelu ja ISP-kuvausten mukaan ne ovat melaniini-negatiivisia eikä niissä ole tunnusmerkillistä kääntöpuolen väriä tai vesiliukoisia pigmenttejä. Nämä tunnusomaiset piirteet yhdessä hiilen hyväksikäyttö-mallin ja muiden sekundääristen piirteiden kanssa sopivat 35 yhteen viljelmän A-21978.6 ominaisuuksien kanssa.

li g 82075

Kun näitä viljelmiä verrattiin A-21978.6:n kanssa laboratorio-olosuhteissa, hylättiin niistä neljä S. candi-dus ja S. setonii tuottivat keltaista ilmaitiömassaa monilla alustoilla erottuen siten viljelmästä A-21978.6.

5 S. albivinaceuos ja S. moderatus osoittivat tummaa selvästi erottuvaa kääntöpuolen väriä, vesiliukoisia pigmenttejä sekä tuottivat melanoidi-pigmenttejä, mitkä kaikki osoittivat erilaisuutta viljelmään A-21978.6 näiden S. modera-tus-viljemän ISP-kuvaus osoittaa punaisenruskeata tai voi-10 makkaan ruskeata kääntöpuolen väriä, mutta ei osoita tällaista piirrettä S. albovinaceous-viljelmälle. Kumpaakaan viljelmää ei luokitella melaniini-positiiviseksi.

Viljelmä A-21978.6 luokiteltiin tämän vuoksi kannaksi, joka oli nimitykseltään Streptomyces roseosporus, 15 Falcäo de Morias and Dalia Maia 1961. Tämä luokitus pohjautui vertailuun julkaistujen kuvausten ja välittömien laboratoriovertailujen kanssa. Seuraavat viljelyä koskevat tyyppitiedot esittävät pääkohdittain suorat vertailututkimukset.

20 Viljelmän ominaispiirteet

Morfologia A21978.6 S.roseosporus

Sporoforit suoria tai mutkittelevia (RF), niissä ei havaittu koukkuja, silmukoita tai kierukoita. Itiöiden ket-25 juja >10. Itiön pintasileä määritettynä pyyhkäisyelektronimikroskopian avulla.

Itiöt: pitkulaisia - pitkulaisia - lieriömäisiä soikeita

Keskikoko: 0,85 x 1,78 pm 1,01 x 2,47 pm 30 Vaihtelualue: 0,65-0,97 x 0,97-2,6 pm 0,97-1,3 x 1,63-3,25 pm 10 , 82075

C I I

ai οι oi oi c 3

•A (0 A

id A C

-P Ο -A :(0

(O H C > -A

0) (0 0) (0 -A 44

AS 0) C AS 01 -A -P

UI AS (1)C Ή c f-t c 3 oi C <0 :(0 (0 a) O 0)

A 3 -A 0) 0) (0 C · E

A O H A > -A H CP

CC C AS (0 43 (0 (0 -A

:(0 CD :(0 C H (0 -A 44 (0 (0 a

-A :(0 tn :(0 -H (0 > > (0 .-I > (D

A -μ-H 4->(fi > I''-- U 0) Γ'-» AS (0

:(0 43 (0 :(0 43 tfi (Ml :(0 m m ΓΜ -P

> >1 4-> -A >1 C :(0 (01 W -H d 01

rH 4-1 (0 -A Ο -P —r (N -A

01 -A (D 4-1 ·γ4 A 4J IS IH 44 OS IH O

3 0) AS C Q) 0 4-) ~~ \l C '—’ \l a; A (D C <D 3 ο ε ai ε -a o. cp ε σι r-ι 01 -r4 Cp -r4 _

S a u Ä a S

01 (0 (0 !-l (0 <D

O 4-1 4-1 (0 -P — Ai — P 01 U) t? 01 A O) (0 -A -A (0 -H (0 3

0 O O O Cp A

AS UI | AS CAS01 AS <0 C

4-i 3 0) 3 O 3) 3 (0 3 C -H c a -H 4-> -H 01 01

n > :<0 i—I :(0 -A H 3 i—l O i—I

^ 01 MO :(0(03 4-1 01 3 (0 4-1 -H 4-1 .—I Ή (0 -A 3 01 (0 (0 4-i as x ai es (oai>oo a)3(0 oi >

01 >1 :(0 >,4-1 -A CC 0101C

01 > AS-AOO (0C3

4-1 *A >, -A O 40 3 3 H 3 A

A 01 43 0) AS I 40 40 HA

A -A (0 •a c ε a. o i 01 4-1 (0 •A Q, ϊ>

(0 4-1 > -A

C (0 A -A

-Aa 4-> 4-1 43 I

ε rH (0 — '— 3 0 3a 3 (0 44 iH :(0 >H (N A 0) :(0

C (0 3 -A C AS -A

:(0 C 4J 4JOQ1 OCOl-P

ε (0 (0 4JA01 AO) 3 44

rH AS C CC -A C01AC

01 AS 3 01(0 -A CO) •n AC AC ε 0< -P Λ(00ΐε rH O 01 0)0) CP CO rH CO 44 01 tp

•A Λ C CU C -AH 01 M iH -A -A

> -a -h acAS oiC(oa

(0 (0 0) C AS 01 C

C C (dC(0 · C 3 <0

3 Md 3 -A -A 01 MO MO ε -A a -P

a -a a oi orHoi-H Α(0·ω

C 44 C -A AS (0 A 4J (OC-H-A

3 44 3 o A (0 43 4J 433(0 O

01 C 01 AS (0 > -A C afOAS

3 01 3 3 > l\ > 0) Λ C > 3

3 ε 3 -a hi ε U 3 -A

•A A tP A H (OI < CP m 01 OI H

A -A r-- O -A H ^

mo 10 ma κι (0(0 s h a — q 4J

> 01 01 44 — \l OS un (0 (0 AS (0 (0 AS (0 (Ο-^-ΉΟΙ

(0 01 4J (0 OI 01 C 44 AS

8 3 «1 g 3 Q) 01 OI

A A -A A A 01 C -A 3

(0 O W 3 -A O A

to 43 AS 43 A (0 AS C

• 013 01 C H 3 0101(0 00 (0 -A (0(0(0 -A (0 Ifl 0)

Γ- MO 01 H :(0ϋΐέ 4J:(0H 01 01 H

σι >C > C g A3 > CC<0 H >1 3 -A >,33 ΟίΑ-Α 33(0 (N 43 A 01 43 A 44 AS 43 01 A A > < 3 3 3 3 .. I > ·· I > ·· I > ·· I > 3 -a 01 3 -A 01 3 -A 01 3 -A 01 3 > -A (0 > -A (0 > -A (0 > -A (0

> 01 44 AS 01 44 3*S 01 -P AS 01 44AS

01(0(0 (0(0 (0(0 (0(0

(0 AS 44 c AS 44 C AS 44 C AS 44 C

SS (00101 (00)01 (0(001 Ό 0101 ε cp c ε trc ε tp c ε tpc

H 01 *A H 0) -A 1—I 01 *A H 01 -A

H > > H>> H > > H >> n 82075

I I

c tn 3 I C 0) -H 3

h a; C a P

G O G -H G

G λ; ·η to rO :ra G

g G G 4-> 4-> > -P

P :G -H -P :G h in :G G in

G -H ΙΛ i—I -H a) -H 4-1 O -H

X 4-> in o 4-> X O P X O

C 4-> G X 4J x o c in x :G G G CG G 3 H O 3 3 in > o P go g -h h c p -h

3 G :G g 0 > B G > i—I Ο -H G H

p o 4-> tn g g tn o g x g o

O G P -H (0 4-1 ·Η G -P Π) GGG

a -h o a o x a -η x 4-> · g -h 4-> O -H ΟΧ λ (H G O G G g a g g op x ·η g ρ g e m χ g o p c -p o

O :G H>4->GGGP4-> H P X G 3 H X

g > g c g tn t> o (0 g G G m .Gin o in :rxj O > m -H G G X -H > X G X G -h

P O O <N -H |\ O 1^ P X) Ι'ή p 4J

föI ,—i ^ n U id Lni χ ΛΙ ni G :aJ o mi G 44 • — (0 p ^ n+J m 3 — U G -H in W G c CO s (0 -H H .—. i—I -H Gl -— O <U -M .— Ή <D qj — > i—I CL) GG |i—I i—I G IS IH HP « l<—I He — X — \l t? w \l Id G - \l G tr,

G .L -H X -H G G O <0 -H

o 03 a) p o > B > a X h :G in -h i G in tn

4-> G O <0 4-1 (0 G G O G G

G > G 4-) :G g -h 4-> G :iu in in

•n m O G C 4-) > C ·Η £·Η > G G

— G 3 0 0 G Pn G tn O <0 >i G G

4-> x x x c h x p g x h x p p

O OP

Q)—i G G

4-> p en a

p G tn P

H tn 4-> G G

-H G <1) G tn

a in i G G

in o h > •H Xl G -H G -Hl

G G G H 41 CG

G G G O X I :G -H G

•H -n tn p G G -H -H G

g G G P O > G 4-) tn G

O P O O G in -h tn 4-> o G G

G G G :G O >!> GCPP G

G G -H O :G a dl :G H 3 O Po G >

:G X G G -H O -H -H tn G P g 4-> O G :G

g -* 4-> -H 4-> ^ rö 4-1 — 4J G tn—in 4-) -H

iH H G 4-> 4-)4-) i—I G O Ή -H P 4-> O ro OGC^r h cm G o g ar^G O 4->

•ro G X 3 O O O P G -H 4J CC

H O O GagOG X gOG-H G G O Ή G G O

•h pc g e tn p <d G tnpao χ x ρ o o a g > G H O G -H C C G :G -H G aX H G G G G · tn

O I-Hina Ή ooa p i—I OOH · -H λ: -H

a x gg a o Hp aGG x e o a g g GGa

CO H G 3 G CO X G X G CO a P> · -H X CO P G -HO

H G >V44JHH G-H4-)h g G 3 H G 3 X X G

>1-^. in G >>tn g pc -h x a inin4-> 041 -H > Ι-'-.-Η X) <0 G H OGin

•H Gl < O HIO ro X a XI P -H

P — O X XJl ¢0 X H l\ G O l\0

:G S IH G — oG l 4J m in i X

> — \I H IS IH -H — CQ in H G

H ^ '-J H IS |Π -H — Xl H

" \i <0 oi ir- h

G G G —' '-J

4-) 4-> G G

g g a 4->

e G O O G G G

O O X X O G O

G G in WC G X

-H -H G G -H G G

G G P P G G G

h h G ch pininp

GGG GG GGG

4-) 4-) O :G :G O 4-> :G · G in G

X X H > > H X > g g G j§ O O G >i >i G O Ph P G Gg χ i x g x ι x g x i x g p ip g

to -H > -H > -H X -H X

• ·· ^ «· Il ^ ·· ·· ^ «I ·» ^ ··

OO G -H G G -H G G -H G G -H G

I'"' > -H > > -H > > -H > > -H > m in x ο inxt/i tnxin inxo

H GGG GGG GGG GGG

in g x xi x Λίχχ

<C>GO GO GO GO

G gtnc g tn G gtnc gtnc

G HOO HOO HOO HOO

X H>G H > G H G H > G

i2 82075 tr

I -3 I

3 a 3

Cij :rö p :<ΰ c -h m c -3 3 4-1 4-> 3 4-1 3 44 3 tO 4->

3 C C -3 3 C

3 Q) 0) O 3 0)

3 C E :3 Λί ME

C -3 tn Q) 3 C tn

0) 3 -3 (-( -3 <L) C -H

3 4-> P X r-i 3 tl) P

W ·Η rH -Η -3 C

3 (0 0)05 > :3 3 ·Η 3 >4 4-> ,¾ 4-> I 4*4 4-)34-) Ο -3 C 3 C .’3 Η 4) Μ Ρ 33-3 33 II 3 —I ·Η to A! > O G C 3 X 3 3 0 O C (0 0) -3 χ; · <D Ai Χί 3 3 C 4->3 C 3 -3 EC *3 tn 3 3 -C -3 -3 4-) > (4 -3 E -3

O EC 3 >-H O i-4 (0 (0 3 M

(4-3 (4-3 E -V 3 C X C 3

• 3o5(0305 ma:Q) X) (O

U5:3 X! C 34-) 3 C 3 Λ 1^- 4-> > ΧΙ3>3·3 ϋΐΛΙ3 X) l\ O) 33 lT) M3 U ΌΊ Ai 31 (-4 4-) ^ .3 Ai 3 in Q 3 ^ (0 M PS 1-3 3 O M 3 5 03 3 CC “ \l 3

Ai PS 13 M — > Ai :3 :3 3

4-) — \l C C :3 :3 :3 C

3 3 3-3 4-)4-· 3 3 3 -n 3 3 0) 4-) -C -C 333 '— 3 ι-H i—H 4-) >1 >i 3 3 r—t eri 3 3 e C e 3 4-> 33 33 3d) -3 -3 3 3 Λ 3 3 3 3 > O O > E G) O) 3 3>

3 > 3 3 3 CC

4-> 3 4-) C C 300 3 3 3-3 3 3 333 (0 -3 t*i O 3 3 tr -C x: tr -3-3 3 3 P 04 to -3 -3 3 3 •3 Ό 3 0 3 3 0 3 :3 3 tr C E 3 -3-3 3

•3 3 3 i—I

EC r3 3 C

0-3 3 CC -3 E QJ -3

C 3 E E C

:3 3 3 tr Ai O

Ed) -3 -3 0) 3 i~4 C 3 P a 3 3 C <3 3 3

•n 3 3 3 N E

^ CQ Ai 3 U W

-3 :3 3 :3 > 1-3 -3 -3 C 3 O 3 :3 3 3 X 3 -3 3 C · 3 3 C C 3» •3 3 X 3 -3 3 0) 4-»

3 E C Ai M C E C

3 tr -3 3 -3 3 tr 3

.-4-3 X 3 3 O > -3 E

3 0) P 3 3-3 X (OP tr M Ai 3 C 3 r-4 3 -1-1

:3 IC(0 l Ai 0) 0) 3 -G OS I^P

> 333 3 Ai >33 I 131 3 3 3 (NI-3 3 S3 (3 3 ΗΛί -3 ,3 (0 3 31 3-3 Γ03 330 i3 C (4 —* 3 0 1.3 3

333J lr- 3 G "S- X X \IO

>33 \IP3 — 3 3 •3 3 -3 -3 .3 1—I r4 *3 3 0-3 3 -3 -3 C 3 > 003 33 O C C 0 3 3 O O C 3

X 3 3 O C

vo I I X! I X 3 13 • -3 -3 e -3 X -3 (4 co ·· I> ·· ·* ^ ·· (1) ·* i> ·· ·· £> ·* t 3 C -3 3 3 C -3 3 C 3-3 3 3 -3 3 tr > :3 -3 > > :3 -3 > -3 > -3 > > -3 > r4 3 :(0 4-> 3 3 :oJ -P 3 (0 3 -P 3 3 4J3 (N <tj4-)t0(0 n) 4) n) ui 3 njranJ nl aJ (ti <C3 a: -3 4-> a; Ai x: -p a: ίο x xx a: -pa: > oJ E 0) (O >4 0) -Ρ Π3 ω mo

3 EtrC E tn C -C Etre EtrC

rö .3-3 0) tl) .3-3(1)0)0 .30)0) .3 0)0)

X MO) > C M <L> > G Ai M > C H > C

i3 82075 :g

•H

-μ :ta -Ρ

<D C I

μ α> 3^ λ e £ ·«

•H O'1 G ‘H

> -H G -P

G GO. G tn G -P

ni G G 13 1) G

tn G nJ E 3 A 0)

tn -h :G -h -P P :G P tn S

3 ta -h tOtO G *H C G O'

G +J4J 4-> -H AS -P G P -H

O rH -p -HO G-Ptn ΟιX Q) G G A G G G G

tn c A g G A 3 G tn G -h c o ta

O d) G E G G -H a) -h E to O G -P

<d c ta tr- G ta h c to cp -p g -h tn

tn -H d) ·Η -H (U -H -P -H -H -H (O -H

o o ή o. o ή to ο-ho. ajto-p o g a g a g -p a g a g -h a -h ta to -h ta o -h *a ta o 3 . g > -p g > a tac-p λα -h c/5 > tn > i\ tn >ratn οι\ ή (ni -h roi G a) -h in r-i •H Λ CQ O ΛΙ O P ΛΙ -H O pi to

G — fN^^OC -— <TJ -^CN -P

:tO S irH G 12 ΙΉ fO S G G OS ΙΉ G

> —· \| -h \l O ~ > H “ "-l G

r~\ -H ι-H G A!

_ G G G

G G -H G G -H CP 3

O 0(1) > O (DG P

A PC G

+J G -H -HO

G CP G P G AS

•rt G-H G G G -H G G G

G G tjiGG G GGG

> -h -P :G G G G +J :G -n G G

-P tn G AS > CG AS > GGG

O G -H O >i -H G G 0>i P G G

<1) A -H A AS GPP Αί X! GPP

•G CP -H t0 P G Ή Ai

•HP G

-H G >· a o -h g

G G Cp G

•H G P -G

G I G G

β| D3 -P G

•H Ή G I I tl)

g -H rH -H G G A

O G CO O -P Q) 0) G

o Q)P -p -P G G G

G O Gtl) G G -H -H P

:G A -H G · -Hl 2 ^ t° J ^

E G G > G >C E-PGE-tO

rH rH +) H p:GG G O-HGP -H

tl) O rH O G -H Oi G E-< 0) O- G A

•n tu as -p -h AGxi-p

rH GA G G A G · 2 · G

•H (1)· G O G -P E G E G

> GE 1 A 0) -H P G g E

-H p :G EGE d):G GGG (ΤΟ G -H G G St A Ή XJP-P -H

A AS -G -PP-H G-P 1^ O.

•H rH l\ -p l\ O. G G A Λ (NI

PGcnIG <N I G G G O Ή G

:G > as G I rH G l -H g G m-G -P

> — (N E G-P G P E — l°o g

s IH a- 100 G G G CP OS "G -H

— \| -H 'G-H > AS Ή ' O

O. O o. A

A 3

GGG -H

G -H G G Ή

tn rH :G G

H :G -H G

O GGG OG G G

a: ogg as o a g gg :G:GG GGG SP G G G Gd)

> > -H o Cd) C-H G GA

>1 SP rH GGA -H G -H G 3 tn

AG I AG AS I P G G I AS P |PG

VO -H -H -H G -H -H -H P

• ·· £> · φ ·· ^ ·· P ·· ^ ·· G *· r> **

oo G H G G -H G G H G G -H G

I" > H > > -H > > H > > -H > av tn-pG ιη-PG tn-PG g+jg

rH GGG GGG GGG GGG

(NG A-PA A-PA A -PA A -PA

< > G G GG GG GG

G ECPC ECPG E CC E CP G

G -H G G -H G G -H G G rH a) G

i*S H > G H > G H > G H>C

i4 82075

Hiilen hyväksikäyttö

Substraatti A21978.6 S. roseosporus L-arabinoosi + + 5 D-fruktoosi + D-galaktoosi + + D-glukoosi + + i-inositoli D-mannitoli + 10 D-raffinoosi L-ramnoosi + + salisiini + + sakkaroosi D-ksyloosi + + 15

Selitykset: + = positiivinen hyväksikäyttö -= negatiivinen hyväksikäyttö is 82075

H

tn tn >1 G >i

P HO

O 0 0

P p H LO ÖP

U) Ό H ^

O III ll+^+ll+VO

dj d m m

tn (M

o P > o • Ή

CO H

•H

tn u CD >1 o

• >i HO ckO

CO H H *1·

H O | I I O

<y\ lii ι i p + m m h

h Ό fN

<N >1

< -G

:<Ö > d)

♦H

f—i tn 3 c

•PE G

d <u

(0 Γ» G

λ H

Q) O E

4-> Q) >-l >1

d P G -O

d d — tn

(0 G M Λ H

> rö (0 co G Ό H > td h O 0)

•H H (¾ O

x: H H G

I Jd H (0 —. H H Cd H H I fi G -H to tn o > Λί G H H dc E >1 c «

X O G H p H tn >1 H (TJ

M -P O tn P H >. G H E

ο p a p o o tn -Pdo >i E-H >, Q, P P O >t 3 P p ·* o-PMtu^dPtucu-PTi tn tn -pgpo.pg>iOPp>i -mx

CdiwwwEtJjii ιη·Ηί ω>ί>ι dE H d) P 3 H Λ<

tntdHCOHH G G O G H d) O

H H d d) (d Oi -p

O. O O O O -H G Λ! M I O

H p p p P 0) H X <0 G H

OGGCC OGtn>i H H tn H pH d H <D ·Η -P

O Λ Pj Λ CU >i H-Pd)3P<tJC G 1Ä 10 to M -P -P 3 Λ H fl <0 ·· tOHHHH Π3ΛίΛ!<0Ο<ΡΗ

H H H P I E -p U

d) d) (β oO BJ :<o H dl

E td > P CU H G Z

ie 82075 tn

O

M

O

a tn + + i i i + + + o tu tn

O

G

toi <o 00 + + i i + + + + CTi rH CN <

•H

T3 -H •H G Ή tn -h -a — •H O Ή *H Ht3 (tj -H g -H X r-l 4-> 4-1

Ό ίο Ό -H >o 4* Oi -H

tn x -h ra -h e -h .h >1 0) a; >- θΉ4-»ιηα>Γοεριηα, x

> G0440<D-H0<Ö0 X

X i_4G(t54<i>i4JGG4i: >1

X X i—\ >i «H Oi -H 4-> >ι X

3- 1 rtJ I r-l O Φ 6 O ·-< ·Ό a) 601^0404(04-10^ >1 43 > C tn -H *Η 44 ^-:(0

0 0 4-> X

ΟΧ :π3 :π3 (1) Λ -rH X :0 :0 0) Ο 43 0) XX 4* •Η Ή Λί 4^ Αί -Η 4- > X ·Η ·Η >ι (1) G NtotJitJiin tn

<ζ tnGGG444*:GGG: O

>1 \ \ \ >Ί >1 \ \ \ >i G

>, m o cn o o o > φ

> *Η ro o O I—I ro ro >1 G

0) o o tn -h X rH ro -H >1

:n3 :rö X

> Λί >i

.G

dj tn

— G

44 :rtJ tn

4* G

Λ! 4-1 G tn ai (ö g >

Il II

CQ -H +1

•H G -H

G -H -H -H G -H

•H -H -H G G -H -H G

4-1 *H G Ή Ή Ή tn *H -H

4-> tn -H -H G Ή >i rH -H

0>i-Htn-HtngAitn 0g+J>1-Hr*0>1>1 •HOOg4->>i44tng 43GiHO(dgQ4(t30 •H 44 (04^4-1 >i <D G 4*3 44>iM-lCtnrHG4JC GG(U-r4>i04JQ)te <! Q)4^i—I G O4W44

II

i7 82075 A-21978.6-kannan määrätyt ominaisuudet eroavat S. roseosporus-kannan julkaistuista ominaisuuksista. Viljelmä A-21978.6 eroaa julkaistusta kannasta itiökoon, porkkana-ja peruna-tulppakasvun, NaCl:n sietokyvyn ja nitraatin 5 pelkistymisen osalta Tämän keksinnön mukaisella A-21978.65-kannalla on A-21978.6-kannan identifiointiominaisuudet, mutta se eroaa siitä tuotettujen A-21978C-antibioottien määrässä. Aikaisempi kanta ei tuottanut parhaassa tapauksessa enempää 10 kuin 100 pg A-21978C-antibiootteja ml kohti käymisalustaa. Tämän keksinnön mukainen parannettu A-21978.65-kanta tuottaa ainakin 2 1/2 kertaa tämän määrän säiliökäymisissä ja se on tuottanut niinkin paljon kuin 18 kertaa tämän määrän suoritettaessa käyminen ravistuspullossa. Tällä parantu-15 neella A-21978C:n tuotto-ominaisuudella uusi kanta tarjoaa suuresti parantuneen menetelmän näiden antibioottien saamiseksi .

Samoin kuin kysymyksen ollessa muista organismeista ovat tämän keksinnön mukaisen uuden A-21978C:tä tuottavan 20 viljelmän, Streptomyces roseosporus NRRL 15998, ominaisuudet alttiita vaihtelulle. Streptomyces roseosporus NRRL 15998:n jälkeläiset voidaan myös käyttää tässä keksinnössä.

Streptomyces roseosporus NRRL 15998-viljelmän kas-25 vatukseen käytetty viljelyalusta voi olla jokin lukuisista alustoista. Tuotannon taloudellisuuden, optimaalisen saannon ja tuotteen eristämisen helppouden vuoksi ovat eräät viljelyalustat suositeltavia. Niinpä esimerkiksi eräs edullinen hiilen lähde suuressa mittakaavassa suoritetussa 30 käymisessä on tapioka-dekstriini, vaikkakin voidaan käyttää myös glukoosia, fruktoosia, galaktoosia, maltoosia, mannoosia, puuvillansiemenöljyä, metyylioleaattia, glyserolia, puhdistettua soijapapuöljyä ja niiden kaltaisia. Eräs edullinen typen lähde on entsyymillä hydrolysoitu 35 kaseiini, vaikkakin käyttökelpoisia ovat myös liukoinen ib 82075 lihapeptoni, soijapapujauho, soijapapuhydrolysaatti, soi-japapusuurimot, hiiva, aminohapot, kuten L-asparagiini ja DL-leusiini ja niiden kaltaiset. Ravintoaineeksi soveltuvia epäorgaanisia suoloja, joita voidaan sisällyttää vil- 5 jelyalustoihin, ovat liukoiset suolat, jotka kykenevät tuottamaan kalium-, ammonium-, kloridi-, sulfaatti-, nit raatti-ioneja ja tämän kaltaisia ioneja. Näiden joukossa K2S04 on erityisen käyttökelpoinen antibiootin valmistukselle. Melassin tuhka, tuhkan dialysaatti ja synteettinen 10 mineraaliseos ovat myös käyttökelpoisia.

A-21978C-antibioottien valmistukseen on edullista käyttää tislattua tai deionisoitua vettä käymisen alustassa. Eräät vesijohtovedessä olevat mineraalit, kuten esimerkiksi kalsium ja karbonaatti näyttävät olevan haitaksi 15 antibiootin tuottamiselle.

Organismin kasvulle ja kehitykselle myös välttämättömiä oleellisia hivenalkuaineita tulee sisällyttää vilje-lyalustaan. Tällaisia hivenalkuaineita esiintyy yleensä alustan muissa aineksissa riittävässä määrässä täyttämään 20 organismin kasvuvaatimukset.

Pienien määrien (esim. 0,2 ml/litra) vaahdonesto-ainetta, kuten polypropyleeniglykolia, lisääminen suuressa mittakaavassa tapahtuvan käymisen alustoihin voi olla välttämätöntä mikäli vaahtoaminen muodostaa ongelman.

25 Huomattavien A-21978C-antibioottimäärien valmista miseksi on edullista suorittaa aerobinen, upoksissa tapahtuva käyminen säiliöissä. A-21978C-antibioottien pieniä määriä voidaan kuitenkin saada ravistuspulloviljelmän avulla. Antibioottien tuotannossa tavallisesti tapahtuvan 30 hidastuksen vuoksi, mikä yleensä liittyy organismin itiö- muodolla suoritettuun siirrostukseen suurissa säiliöissä, on edullista käyttää vegetatiivista siirrosta. Vegetatii-vinen siirros valmistetaan siirrostamalla pieni tilavuus viljelyalustaa organismin itiömuodolla tai huovastofrag-35 menteilla organismin tuoreen, aktiivisesti kasvavan vil-

II

i9 82075 jelmän saamiseksi. Vegetatiivinen siirros siirretään sen jälkeen suurempaan säiliöön.

Uutta A-21978C:tä tuottavaa organismia voidaan kasvattaa lämpötiloissa välillä noin 20 - noin 40 °C. Optimaa-5 linen A-21978C:n tuotanto näyttää tapahtuvan lämpötiloissa välillä noin 30 - 32 °C.

Kuten tavanomaisissa aerobisissa uppoviljelymene-telmissä dispergoidaan steriiliä ilmaa viljelyalustan läpi. A-21978C-antibioottien tehokasta tuotantoa varten tu-10 lee ilmakyllästyksen prosentuaalisen määrän olla säiliö-tuotantoa varten yli 20 %, edullisesti yli 30 % (30 °C:ssa ja yhden ilmakehänpaineessa).

Säiliössä suoritettavaa käymistä varten on edullista pysyttää käymisalustan pH-arvo välillä noin 6,5-7,0. 15 Tämä voidaan suorittaa lisäämällä sopivat määrät esimerkiksi natriumhydroksidia (varhaisissa vaiheissa) ja kloo-rivetyhappoa (myöhemmissä vaiheissa).

A-21978C-antibioottien valmistusta voidaan seurata käymisen aikana testaamalla liemestä tai huovaston kiin-20 teiden aineiden uutoksista otettuja näytteitä tutkimalla niiden antibioottista aktiviteettia organismeja vastaan, joiden tiedetään olevan herkkiä antibiooteille. Eräs koe-organismi, joka on käyttökelpoinen näiden antibioottien testauksessa on Micrococcus luteus. Biokoe suoritetaan 25 edullisesti paperikiekkomäärityksellä agar-maljoilla.

Vaihtoehtoisesti voidaan viljelmän kiinteitä aineita, mukaanluettuna alustan ainekset ja huovasto, käyttää uuttamatta tai erottamatta, mutta edullisesti veden poistamisen jälkeen, A-21978C-antibioottien lähteenä. Esimer-30 kiksi A-21978C-antibioottiaktiviteetin tuottamisen jälkeen voidaan viljelyalustan kuivata lyofilisoimalla ja sekoittaa suoraan syötettävään esiseokseen.

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat oivallisia anti-bakteriaalisia aineita.

35 Tämän keksinnön käytäntöön saattamisen valaisemi seksi täydellisemmin esitetään seuraavat esimerkit.

20 8 2 0 7 5

Esimerkki 1 A-21978C-kompleksin tuottaminen

Kantaviljelmä valmistetaan ja pidetään nestemäisen typen höyryfaasissa. Edeltäpäin nestemäisen typen höyry-5 faasissa varastoitua Streptomyces roseosporus NRRL 15998 käytettiin koostumukseltaan seuraavanlaisen 50 ml:n suuruisen kasvualustan siirrostamiseen:

Aineosa Määrä (%)

Trypticase Soy Broth* 3,0 10 dekstriiniä 2,5 vettä (deionisoitua ) 94,5 ♦Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD.

Siirrostettua alustaa inkuboitiin 250 ml:n vetoi-15 sessa Erlenmeyer-pullossa 30 °C:ssa 48 tuntia ravistuslait-teessa, joka pyöri 5,08 cm:n kaarta pitkin nopeudella 250 kierrosta minuutissa. Valmis kasvuviljelmä siirrettiin useaaan säiliöön (0,5 ml/säiliö) ja varastoitiin nestemäisen typen höyryfaasissa.

20 Varastoidun materiaalin suuremman yhdenmukaisen erän saamiseksi käytettiin 1 ml nestemäisessä typessä varastoitua viljelmää 80 ml:n suuruisen erän edellä kuvattua kasvualustaa siirrostamiseen. Siirrostettua kasvualustaa inkuboitiin 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa 30 °C:ssa 48 tun-25 tia ravistuslaitteessa, joka pyöri halkaisijaltaan 5,08 cm:n kaarta pitkin nopeudella 250 kierrosta minuutissa.

10 ml tällaista viljelmää käytettiin 450 ml:n suuruisen toisen vaiheen vegetatiivisen kasvualustan siirrostamiseen, jolla alustalla oli sama koostumus kuin edellä 30 kuvatulla primäärisellä vegetatiivisella alustalla. Toisen vaiheen alusta inkuboitiin 2 litran Erlenmeyer-pullossa 24 tuntia 30 °C:ssa ravistuslaitteessa, joka pyöri halkaisijaltaan 5,08 cm:n kaarta pitkin nopeudella 250 kierrosta minuutissa.

35 1 litra toisen vaiheen vegetatiivista viljelmää käytettiin koostumukseltaan seuraavanlaisen 39 litran suu-

II

2i 82075 ruisen steriilin tertiäärisen siirroksen kehitysalustan siirrostamiseen:

Aineosa Määrä (%) soijapapujauhoa 0,5 5 hiivauutetta* 0,5 kalsiumglukonaattia 1,0 KClb 0,02

MgS04 · 7H2Ob 0,02

FeS04 · 7H2Ob 0,0004 10 Sag 471 (vaahdonestoaine)c 0,03 vettä 97,9296

aDifco Laboratories, Detroit MI

bHivenmineraalit valmistettiin seuraavalla tavalla: 15 FeS04*7H20 (7,8 g) liuotettiin väkevään HCl:ään (76 ml).

MgS04*7H20 (380 g), KC1 (380 g) ja deionisoitua vettä lisättiin niin paljon, että kokonaistilavuudeksi tuli 3800 ml. Spesifioitujen mineraalien saamiseksi käytetään 80 ml liuosta 39 litraa kohti tertiääristä siirroksenkehitysvai-20 hetta.

cUnion Carbide, Danbuty CT.

Siirrostettua alustaa inkuboitiin 24 tuntia ruostumattomassa teräsastiassa 30 °C:ssa. Astiaa ilmastettiin steriilillä ilmalla määrän ollessa 0,85 til./til./min ja 25 hämmennettiin tavanomaisilla hämmennyslaitteilla nopeudella 350-450 kierrosta minuutissa. Astiassa vallitseva paine pysytettiin arvossa 0,35 kg/cm2 ylipainetta (5 PSIG).

1 litra inkuboitua tertiääristä siirrosvaihetta käytettiin 119 litran suuruisen, koostumukseltaan seuraa-30 vanlaisen steriilin tuotantoalustan siirrostamiseen: Aineosa Määrä (%) soijapapujauhoa 2,2

Fe(NH4 )2S04 · 6H20 0,066 dekstroosia 0,825 35 Sag 471 0,022 perunadekstriiniä 3,3 melassia (sokeriruokomelassia) 0,275 vesijohtovettä 93,312 22 82075 pH säädettiin arvoon 7,0 ensimmäisten kahden aineosan lisäämisen jälkeen ja uudelleen sen jälkeen kun kaikki aineosat oli lisätty ja välittömästi ennen sterilointia.

Siirrostettua tuotantoväliainetta inkuboitiin 6 5 päivää ruostumattomassa teräsastiassa 30 °C:ssa ja ilmastettiin steriilillä ilmalla nopeudella 0,5 til./til./min. Alustaa hämmennettiin tavanomaisilla hämmennyslaitteilla nopeudella 250 kierrosta minuutissa ensimmäiset 15 tuntia ja nopeudella 350 kierrosta minuutissa näiden 15 tunnin 10 jälkeen. pH pysytettiin arvossa 6,5 tai sen yläpuolella lisäämällä ammoniumhydroksidiliuosta. A-21978C-kompleksin saanto oli 0,282 g litraa kohti lientä käymisen päätyttyä. Tekijöiden jakautuminen on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 2 15 A-21978CH:n kohotettu tuotanto

Primäärinen, sekundäärinen ja tertiäärinen kasvatusvaihe suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tuotantovaihe aloitettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla lukuunottamatta sitä, että 28 tunnilta alkaen syötettiin 20 käymisastiaan steriiliä liuosta, joka sisälsi 50 % til./-til. kapryylihappoa (oktaanihappoa) ja metyylioleaattia, nopeudella 0,13 ml litraa kohti käymislientä tunnissa ja tämä nopeus pidettiin käymisen lopettamiseen asti 144 tuntina. A-21978C-kompleksin saanto oli 1,255 g litraa kohti 25 lientä, mikä merkitsee 445 %:n suurenemista saannossa verrattuna esimerkin 1 saantoon. Tekijää A-21978Ce (kaavan I yhdistettä, jossa R = oktanoyyli) edusti 9 % tällä menetelmällä valmistetusta kaikesta A-21978C-kompleksista; yhtään A-21978Ca ei todettu esimerkin 1 mukaisella menetel-30 mällä valmistetussa A-21978C-kompleksissa.

Esimerkki 3 A-21978Co:n kohotettu tuotanto

Primäärinen, sekundäärinen ja tertiäärinen siirroksen kehitysvaihe suoritettiin samalla tavalla kuin esimer-35 kissä 1 on esitetty. Tuotantovaihe aloitettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla lukuunottamatta sitä, että 28 tunnilta

II

23 82075 alkaen lisättiin käymisastiaan steriiliä liuosta, joka sisälsi 25 % til./til. nonaanihappoa ja 75 % metyyli-oleaattia, nopeudella 0,13 ml litraa kohti käymislientä tunnissa ja tämä lisäysnopeus pidettiin käymisen päättämi-5 seen asti 144 tuntina. A-21978C-kompleksin saanto oli 0,821 g litraa kohti lientä, mikä merkitsee 293 %:n suurenemista esimerkissä 1 saatuun nähden. Tekijää A-21978C9 (kaava I: R = nonanyyli) edusti 10 % tällä menetelmällä valmistetusta kaikesta A-21978C-kompleksista; yhtään 10 A-21978C9 ei todettu esimerkin 1 menetelmän avulla valmis tetusta A-21978C-kompleksissa.

Esimerkki 4 A-21978Cin-tekijän kohotettu tuotanto (kaava I: R = n-dekanoyyli 15 Primäärisen ja sekundäärisen vaiheen vegetatiiviset kasvuvaiheet viljeltiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tertiäärisessä vaiheessa käytettiin 800 ml sekundääristä siirrosviljelmää 950 litran suuruisen steriilin tertiääri-sen siirroksen, kokoomukseltaan seuraavanlaisen kehitys-20 alustan siirrostamiseen:

Aineosa Määrä (%) dekstroosia 2,0 kalsiumkarbonaattia 0,2 soijapapujauhoa 2,0 25 hiivauutetta 0,1 KC1“ 0,02

MgS04 · 7H2Oa 0,02

FeS04-7H20a 0,0004

Sag 471 (vaahtoamisen estoaine) 0,02 30 vettä 95,6396 “Hivenmineraaliliuos valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Siirrostettua alustaa inkuboitiin 24 tuntia ruostu-35 mattomassa teräsastiassa 30 °C:ssa. Astiaa ilmastettiin steriilillä ilmalla nopeudella 0,8 til./til./min ja häm- 24 82075 mennettiin tavanomaisten hämmennyslaitteiden avulla. Yksi litra tätä tertiäärisen vaiheen siirrosta käytettiin 119 litran suuruisen, koostumukseltaan esimerkissä 1 kuvatun tuotantovaiheen alustan siirrostamiseen. Tuotantovaihe 5 aloitettiin myös samalla tavalla kuin esimerkissä 1 lukuunottamatta sitä, että 28 tunnilta alkaen syötettiin käymisalustaan steriiliä liuosta, joka sisälsi 50 % til./ til. kapriinihappoa (dekaanihappoa) ja 50 % metyylioleaat-tia, nopeudella 0,26 ml litraa kohti käymislientä tunnissa 10 ja tätä lisäysnopeutta ylläpidettiin käymisen päättymiseen asti 223 tuntina. A-21978C-kompleksin saanto oli 1,94 g litraa kohti lientä, mikä merkitsee 687 %:n suurenemista esimerkissä 1 saavutettuun verrattuna. A-21978C10-tekijän konsentraatio (kaava I: R = n-dekanoyyli) oli 1,63 g lit-15 raa kohti eli 84 % kaikesta A-21978C-kompleksista. Tämä oli 13583 % suurempi kuin esimerkin 1 menetelmää käyttäen tuotettu A-21978C10:n määrä.

Esimerkki 5 A-21978Cin:n kohotetun tuotannon vaihtoehtoinen me- 20 netelmä

Primäärinen, sekundäärinen ja tertiäärinen siirroksen kehitysvaihe suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tuotantovaihe aloitettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla lukuunottamatta sitä, että 28 tunnista alkaen li-25 sättiin käymistilaan steriiliä liuosta, joka sisälsi 25 % til./til. kapriinihapon etyyliesteriä (etyylikaptaattia) ja 75 % metyylioleaattia, nopeudella 0,13 ml litraa kohti käymislientä tunnissa ja tämä lisäysnopeus pysytettiin käymisen päättymiseen asti 144 tuntina. A-21978C-komplek-30 sin saanto oli 1,022 g litraa kohti, mikä merkitsee 362 %:n suurenemista esimerkissä 1 saatuun verrattuna. Tekijän A-21978C10 väkevyys oli 0,202 g litraa kohti eli 20 % kaikesta A-21978C-kompleksista. Tämä oli 1683 % suurempi kuin esimerkin 1 menetelmää käyttäen saavutettu A-21978C10:n 35 konsentraatio.

Il 25 82075

Esimerkki 6 A-21978C,n:n kohotetun tuotannon vaihtoehtoinen menetelmä

Primäärisen ja sekundäärisen vaiheen vegetatiivisen 5 kasvun vaiheet viljeltiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tertiäärisen vaiheen siirrosta viljeltiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla lukuunottamatta sitä, että alustan tilavuus oli 1900 litraa ja vaiheen kesto oli pidennetty 48 tuntiin. Ilmastusnopeus oli 0,3 til./til./min tunteina 10 0,24, 0,45 til./til./min tunteina 24-40 ja 0,90 til./til./ min tunteina 40-48. Tuotantovaihe aloitettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. 23 tuntina lisättiin 0,004 % hiiva-uutetta steriilinä lietteenä yhtenä eränä käymisastiaan. 36 tunnista alkaen lisättiin glyserolin ja ammoniumdekano-15 aatin liuosta nopeudella 0,84 ml litraa kohti käymislientä tunnissa. Syötetty liuos sisälsi glyserolia (3600 g), de-ionisoitua vettä (9000 ml), kapriinihappoa (1 litra) ja väkevää ammoniumhydroksidiliuosta (620 ml). Syöttö pysytettiin tässä nopeudessa siksi kunnes käyminen lopetettiin 20 43 tuntina. A-21978C-kompleksin saanto oli 1,772 g litraa kohti, mikä merkitsee 628 %:n suurenemista esimerkissä 1 saavutettuun verrattuna. Tekijän A-21978C10 konsentraatio määritettiin 0,739 g:ksi litraa kohti eli 42 %:ksi kaikesta A-21978C-kompleksista. Tämä oli 6158 % suurempi kuin 25 esimerkin 1 menetelmällä tuotetun A-21978C10:n konsentraatio.

Esimerkki 7 A-2l978C11:n kohotettu tuotanto

Primäärinen, sekundäärinen ja tertiäärinen siirros-30 vaihe suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tuotantovaihe aloitettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla lukuunottamatta sitä, että 28 tunnista alkaen lisättiin käymisastiaan steriiliä liuosta, joka sisälsi 25 % til./ til. undekaanihappoa ja 75 % metyylioleaattia, nopeudella 35 0,13 ml litraa kohti käymislientä tunnissa siksi kunnes 26 82075 käyminen lopetettiin 144 tuntina. A-21978C-kompleksin saanto oli 1,62 g litraa kohti, mikä merkitsee 574 %:n suurenemista verrattuna esimerkissä 1 saatuun. Tekijän A-21978Cn (kaava I: R = undekanoyyli) konsentraatio määri-5 tettiin 0,70 g:ksi litraa kohti eli 43 %:ksi kaikesta A-21978C-kompleksista. Tekijää A-21978C11 ei voitu todeta esimerkin 1 menetelmällä valmistetussa A-21978C-komplek-sissa.

Esimerkki 8 10 A-21978Cti:n kohotettu tuotanto

Primäärinen, sekundäärinen ja tertiäärinen siirros-vaihe suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tuotantovaihe aloitettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla lukuunottamatta sitä, että 28 tunnista alkaen lisättiin 15 käymisastiaan steriiliä liuosta, joka sisälsi 25 % til./ til. lauriinihappoa ja 75 % metyylioleaattia, nopeudella 0,13 ml litraa kohti käymislientä tunnissa siksi kunnes käyminen lopetettiin 144 tuntina. A-21978C-kompleksin saanto oli 1,12 g litraa kohti, mikä merkitsee 400 %:n 20 suurenemista esimerkissä 1 saavutettuun verrattuna. Tekijän A-21978C5 (kaava I: R = dodekanoyyli) konsentraatio määritettiin 0,372 g:ksi litraa kohti eli 33 %:ksi kaikesta A-21978C-kompleksista. Tämä oli 5314 % suurempi kuin esimerkin 1 menetelmällä valmistetussa A-21978C-komplek-25 sissa todettu A-21978C5:n konsentraatio.

Il 27 82075 :3 6 il >ι --1 Ρ I -—I ·Η ω u -π c -Ρ >i O -H C Π3 >-i ο p O h-i 3 -p 3 r-H <0

C 3 (0 o I

(0 in > I—I r—I

4_) - I I I I I I O I -H U rH

o -IIIIIIOIC+J u 3 o ή 4-1 * -p _ -H Q) σι <0 Λ . ,, _ _ 4-J I—I Ο -n c J· υ n v v -ho

φ 3dlNOOOCN<riaOmO-H * I

•r-ι '~‘H-Hr'CnmororHf^-H> ooo

.p rH Ul Ή CO IN Γ'· rH rH > (0 U<H

+> ε γη h ^ u

C J; 3 -P

m CTdllnillll rH :ro

c — UI I I 00 I I I l I :3 3 -PI

o r in -H cn

a -2., in C :0 U

P 4J J I f-l I I I ( I I d) -H -( 1 0 ti H I rH I I I I I I e -H -H -

λ: S ul H <u -p I

1 Si -p a> oo

6 Q . rH QJ -P U

00 & I t^iriCNi^rHooncM -ο i [-«. s “ι ι^σΓ'ίησι^Γ'ΐΰο u -h σ 8 01 ή rH cm cn cn tn -p oo -p cn y . 3 σι 3 1 CO I CN^LDCOv-DCOCOrH -Ρ*Γ. rH>

f£ r^d t^rHCH-J'LncNLOrt' <u CN 3 -H

συ| INrH rH<Mr-(>—i -P?, | 3 rH

in Γί ιβ 2 < -P >1 p ™ , -a 5 w >1

7j I niNC^OiOrH^O^OoO :3 3 O

p <drHrHrs'in3't>-om 3&1 -p > C

_ y UI -h n rH in cn cn cn <n κ *> rd 3 " Λ 8 S Ir^coc^-Lncoinn^-H-H c Pi ts 72 -jr^r-nccniocnoo-pp -p i

3 £ ^1 CNrHrHrHfOrHCN^d) -P 3 C

. (U 3 in in

3 -H P ·* (LI tn -H

3 -P -P 3 ·Η -P

p_( 4-1 G -—i 3 0 in 3 G-) —13 *i I G) 3 3 3 3«

.--- 3-1 C > O *· -H

4J -r-l O 3 C 13 rH

3 P >; C -P -H

n (1) C 0 -P O

3 4-1 3 3 3 <L> CD

3 3 a) -H rH 4J rH

-H Q) -p l*H 3 O

-0 -P 4-1 3 II -H

-p -p rH -P -P P Ό C

a. -H >, -p ccni3x:3 -P irt >i +> Q)Oa>i> rH 3} -P 3 G -P 3

ΰ <1)3 0 3· 3 3 O rH

-p +3 O O 04 E 3 -r-ι -P U O

p a oogcooeo-h w -a 0.00.0 3 0 0 0 PH ro-p:3 3

S 0.0.0404 Λ! 3 Ο 3 O 3 -r-ι -P

-p 3033 CD -C 3 IQ)> Λί·Ρ4->

Ό C ,G 3 .G £ Ό ·Ρ .G -P-P3 * 3 AC <D

•P :3 -Η Λ ·Ρ ·Ρ § G -Ρ -Ρ 3 cn Ε Ο Ό

0· :3 rH -ρ G G 3 3 G -Ρ <D G U -PO

3 -Ρ >h C -Ρ -Ρ -P 3 -P O G Ο Η -P

43 >1 3 -Ρ -P G A! -Ρ 0 -P G

>1 p 3 ρ p oop -p c -p rpcoc

0300. £ TJ 3 X)0)OU3CO

•P 3033 E C 3 -P3P > G

Q) .¾ C A! -X 3 3 H 4J-P0 * 3 O G

e C03033·· •P < X! .O CJ A! rH «

i! h rg n <f m icr^oo3 3 ,0 OO

W

ζβ 82075

Esimerkki 9 A-21978C-kompleksin vaitoehtoinen tuotanto A-21978C-kompleksia tuotetaan käyttämällä esimerkin 1 menetelmää mutta käytetään Streptomyces roseosporus NRRL 5 11379-viljelmää.

Esimerkki 10

Vaihtoehtoinen menetelmä A-2l978C10:n tuotannon kohottamiseksi

A-21978C10:tä tuotetaan käyttämällä esimerkin 6 me-10 netelmää, mutta käytetään Streptomyces roseosporus NRRL

11379-viljelmää.

Esimerkki 11 A-21978C-kompleksin tuottaminen ravistuspullossa Käytetään esimerkissä 1 esitettyä yleistä menetel-15 mää, mutta ravistuspullo-olosuhteita sekä seuraavaa käy- misalustaa:

Aineosa Määrä (g/litra) glukoosia 7,5 dekstriiniä® 30 20 entsyymillä hydrolysoitua kaseiiniab 5 peptoniac 5 melassia 2,5 deionisoitua vettä q.s. yhteen litraan asti “Statex 11, A.E. Staley Co., Decatur IL 25 bNZ Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst NJ cBiosa-te, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD A-21978C-kompleksin saanto tästä käymisetä oli 1800 pg ml kohti lientä.

Il

Claims (6)

29 82075

1. Menetelmä A-21978C-johdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava (I): 5 | P /\/CHä /v\ < i „ I I „ V °=\ *//Νγ/ΧΧ5/Ϊ H /C0NHz /*“7* H ® H 9 1 \ 9 /NH-R “K ·A·^ ! f Y / " > > L Y-; ~ “AaaA'^" - ϊ i M HOzC jossa R on Ce-C12-alkanoyyliryhmä, tunnettu siitä, 25 että syötetään vastaavaa C8-C12-alkaanihappoa, sen esteriä tai suolaa viljelmään, joka käsittää kannan Streptomyces roseosporus NRRL 11379 tai NRRL 15998, lämpötilan ollessa noin 25-40 °C.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että käytetään C8-C12-alkaanihap-poa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään C10-alkaanihapon etyyliesteriä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 82075 tunnettu siitä, että käytetään C10-alkaanihapon ammoniumsuolaa.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kapriinihap- 5 poa, sen etyyliesteriä tai sen ammoniumsuolaa.

6. Streptomyces roseosporus NRRL 15998 ja sen jälkeläiset. Il 31 82075