FI79545B - Nya cykliska a-21978c-kaernpeptider och foerfarande foer deras framstaellning. - Google Patents

Description

Uudet sykliset A-21978C-ydinpeptidit ja menetelmä niiden valmistamiseksi 1 79545 5 Tämä keksintö koskee uusia syklisiä A-21978C-ydin- peptidejä, joilla on kaava (1') 0 NH.? ! i 10 /CH3 /\/\ ; i Y” ! I l

λ ) . V

0=/ Vvv. conh2 15 /—/· h °l ,r k ? HO Η-Νχ η3</y y Y Y .

/“0 °*\ V 8 H-{S\ \ NH C0oH · · i

Vh / 2 Χγ\/

20 O*· ''Sa.O H

/—Γ fH3 P f / 1 2 YA/Yyv·' •-ill u ’

0 H * O

25 HOjC

jossa R2 on vety tai aminon suojaryhmä, ja niiden suoloja, sekä niiden valmistusta.

Uudet kaavan (1') mukaiset yhdisteet ja niiden suo-30 lat ovat käyttökelpoisia välituotteina valmistettaessa puolisynteettisiä antibioottijohdannaisia.

On olemassa suuri tarve kehittää uusia antibiootteja, koska on hyvin mahdollista ja alituinen uhka, että kehittyy antibiootteihin nähden spesifisesti resistenttejä 35 mikro-organismien kantoja. Varsinkin gram-positiivisiin 2 79545 sukuihin Staphylococcus ja Streptococcus kuuluvat patogeenit ovat usein resistenttejä yleisesti käytetyille antibiooteille, kuten penisilliinille ja erytromysiinille [ks. esim. W.O. Foye, Principles of Medicinal Chemistry (1974), 5 ss. 684-686].

Rinnakkaisissa patenttihakemuksissa 831746, 831747 ja 831756 esitettyjen, syklisten A-21978C-peptidien uusien johdannaisten ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen on havaittu olevan tehokkaita lääkeaineita.

10 Näitä, edellä mainituissa rinnakkaisissa patentti hakemuksia s amme esitettyjä uusia peptidijohdannaisia voidaan valmistaa saattamalla uusi, kaavan (1') mukainen A-21978C-ydinpeptidi tai sen suola reagoimaan halutun asy-lointiaineen tai sen aktivoidun johdannaisen kanssa.

15 Keksinnön mukaisesti uudet sykliset A-21978C-ydin- peptidit, joilla on kaava (1'), ja niiden suolat voidaan valmistaa siten, että A-21978C-kompleksi, A-21978C:n tekijä C0 , C3 , C2 , C3 , C4 tai C5 , estetty A-21978C-kompleksi tai estetty A-21978C:n tekijä C0 , C3 , C2 , C3 , C4 tai C5 , 20 joilla on kaava (1) ! p .»Αγ“ ΜΛ .. Am k/ -AH' yv. · «M " .

- <* -cyw'i ·( Y \/ 35 ,υ HOac/ 3 79545 jossa R on 8-metyylidekanoyyli, 10-metyyliundekanoyyli, 10-metyylidodekanoyyli, A-21978C:n tekijälle C0 tunnusomainen Cx0-alkanoyyliryhmä tai A-21978C:n tekijöille C4 ja C5 tunnusomainen C:2-alkanoyyliryhmä, ja R1 ja R2 ovat 5 toisistaan riippumatta vety tai aminon suojaryhmä, deasy-loidaan entsymaattisesti vesipitoisessa väliaineessa de-asyloivalla entsyymillä, jota tuottaa Actinoplanaceae-hei-mon mikro-organismi, joka on Actinoplanes utahensis NRRL 12052, Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 10 12064, Actinoplanes missouriensis NRRL 12053, Actinoplanes sp. NRRL 12065 tai Actinoplanes sp. NRRL 8122, haluttaessa näin saadusta tuotteesta poistetaan aminon suojaryhmä R2, ja haluttaessa saatu tuote muutetaan suolakseen.

15 Kaavan (1) mukaiset yhdisteet, joissa R ja R2 ovat aminon suojaryhmiä, ovat estettyjä antibiootin A-21978C tekijöitä C0, Clf C2, C3, C4 ja C5 .

Kaavan (1') mukainen yhdiste, jossa R2 on vety, on antibioottisissa A-21978C-tekijöissä C0 , C3, C2, C3, C4 ja 20 C5 oleva yhteinen syklinen peptidi. Mukavuussyistä tätä yhdistettä kutsutaan tässä A-21978C-ytimeksi. Tämä yhdiste voidaan esittää myös kaavalla (2): L-Asp „_ 25 K ^ D-Ala Gly

i* V

L-Asp D-Ser -p i/

L-Orn 3MG

L-Kyn

Gly / (27 30 ^L~Thr ^

T

L-Asp t . L-Asn

A

L-Trp * nh2 35 4 79545 jossa 3MG tarkoittaa L-treo-3-metyyliglutamiinihappoa.

Luonnossa esiintyvillä A-21978C-tekijöillä on yhteinen peptidirunko, mutta kussakin on eri rasvahapporyh-mä. Tämän keksinnön mukainen menetelmä rasvahapporyhmien 5 poistamiseksi A-21978C-tekijöistä ja estetyistä tekijöistä käsittää antibiootin tai estetyn antibiootin altistamisen vesipitoisessa väliaineessa Actinoplanaceae-ryhmän mikro-organismin tuottamalle entsyymille, kuten deasyloituminen on olennaisesti toteutunut.

10 Edullisessa tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään rasvahapposivuketjun lohkaisuun entsyymiä, jota tuottaa mikro-organismi Actinoplanes utahensis NRRL 12052. Deasylointi toteutetaan tavallisesti lisäämällä sopiva antibiootti tai estetty antibiootti A. utahensis- viljel-15 mään ja inkuboimalla viljelmää, kunnes deasyloituminen on tapahtunut. Tällöin muodostunut syklinen A-21978C-peptidi tai estetty peptidi erotetaan fermentointielatusaineesta tunnetuilla menetelmillä.

Kaavan (1') mukaiset sykliset A-21978C-peptidit 20 ovat käyttökelpoisia sikäli, että ne voidaan asyloida uudelleen uusien antibioottien aikaansaamiseksi.

Oheen liitetyt infrapuna-absorptiospektrit, jotka on määritetty KBr:ssa, ovat seuraavat:

Kuvio 1 - A-21978C-ydin (kaava 1', R2 = H) 25 Kuvio 2 - A-21978C-N0rn-t-BOC-ydin (kaava 1, R * H, R2 = tert-butyylioksikarbonyyli) Tässä määritellyssä käytetään seuraavia lyhenteitä: Ala: alaniini Asp: asparagiinihappo 30 Gly: glysiini

Kyn: kynureniini Orn: ornitiini Ser: seriini Thr: treoniini 35 Trp: tryptofaani s 79545 t-BOC: tert-butyylioksikarbonyyli Cbz: bentsyylioksikarbonyyli DMF: dimetyyliformamidi THF: tetrahydrofuraani 5 HPLC: suuren suorituskyvyn nestekromatografia TLC: ohutkerroskromatografia UV: ultraviolettl A-21978C-antibiootit ovat läheistä rakennetta olevia, happamia peptidiantibiootteja ja ne on kuvattu US-10 patenttijulkaisussa 4 208 403. Kuten US-patenttijulkaisussa 4 208 403 on kuvattu, sisältää A-21978C-antibiootti-kompleksi pääaineosan, tekijän C, joka puolestaan on rakenteeltaan läheisten tekijöiden muodostama kompleksi. A-21978C:n tekijä C, jota kutsutaan A-21978C-kompleksiksi, 15 sisältää yksittäiset tekijät C0, C2 , C2 , C3 , C4 ja C5 . Tekijät Cx , C2 ja C3 ovat päätekijöitä ja tekijät C0, C4 ja C5 ovat vähäisempiä tekijöitä. A-21978C-tekijöiden rakenne on esitetty kaavassa (3): 20 , L~*sp \

Mia G'y A * f D-Ser L-Asp

25 t 3MG

L-0rn ^ \ L-Kyn G,y 0/ \ / (3) L—Thr 30 f L-Asp t L-Asn f L—Trp

35 r,H

RN

6 79545 jossa 3MG tarkoittaa L-treo-metyyliglutamiinihappoa ja R" tarkoittaa rasvahapporyhmää. Tekijöille ominaiset ^-ryhmät ovat seuraavat: A-21978C-tekijä R"-ryhmä 5 C3 8-metyylidekanoyyli C2 10-metyyliundekanoyyli C3 10-metyylidodekanoyyli C0 C2 0-alkanoyyli* C4 C:2-alkanoyyli* 10 C5 2-alkanoyyli* *Ei vielä identifioitu

Kun ongelmana on peptidiantibiootin deasylointi, on erittäin vaikeata tietää, onko olemassa entsyymiä, jota voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Tällaisen entsyymin 15 löytäminen on vieläkin vaikeampaa silloin, kun substraat-tiantibiootti sisältää syklisen peptidirakenteen. Koska entsyymit ovat suuressa määrin spesifisiä, vaikuttavat substraatin peptidirungossa ja sivuketjussa olevat erot deasylointiyrityksen onnistumiseen. Lisäksi monet mikro-20 organismit tuottavat suuren joukon peptidaaseja, jotka vaikuttavat peptidirakenteen eri osiin. Tämä johtaa usein vaikeasti käsiteltäviin tuoteseoksiin.

Jokaisessa A-21978C:n antibiootissa (kaava 3) ras-vahapposivuketju (R" ) on liittynyt tryptofääniryhmän a-25 aminoryhmään. Me olemme keksineet, että keksinnön mukaisella menetelmällä rasvahapposivuketju voidaan lohkaista entsyymin avulla vaikuttamatta muun A-21978C-peptidin kemialliseen rakenteeseen.

Ilmaisu "aminon suojaryhmä" tarkoittaa tunnettua 30 aminon suojaryhmää, joka sopii yhteen muiden A-21978C-mo-lekyylissä olevien funktionaalisten ryhmien kanssa. Edullisesti aminon suojaryhmät ovat sellaisia, jotka voidaan myöhemmin helposti poistaa. Esimerkkejä sopivista suoja-ryhmistä voidaan löytää julkaisusta Theodora W. Greene, 35 Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and 7 79545

Sons, New York, 1981, luku 7. Erityisen edullisia aminon suojaryhmiä ovat tert-butyylioksikarbonyyli- ja bentsyyli-oksikarbonyyliryhmät.

A-21978C-ytimellä, so. kaavan 1 mukaisella yhdis-5 teellä, jossa R2 on vety, jota on vaihtoehtoisesti kuvattu myös kaavalla 2, on seuraavat ominaisuudet:

Muoto: valkea amorfinen kiinteä aine, joka fluoresoi lyhytaaltoisessa UV:ssa

Empiirinen kaava: C62H83N17 02 5 10 Molekyylipaino: 1465

Liukoisuus: vesiliukoinen

Infrapuna-absorptiospektri (KBr): esitetty oheen liitettyjen piirrosten kuviossa 1; absorptiomaksimit havaitaan seuraavilla frekvensseillä (cm-1): 15 3300 (leveä), 3042 (heikko), 2909 (heikko), 1655 (voimakas), 1530 (voimakas), 1451 (heikko), 1399 (keskivahva), 1222 (keskivahva), 1165 (heikko), 1063 (heikko) ja 758 (keskivahvasta heikkoon).

Ultraviolettiabsorptiospektri (metanoli): UV-mak- 20 simit 223 nm (6 41 482) ja 260 nm (6-8 687).

Potentiometrinen titraus (66-prosenttinen dimetyy-liformamidin vesiliuos) osoittaa neljä titrautuvaa ryhmää, joiden pKa-arvot ovat noin 5,2, 6,7, 8,5 ja 11,1 (alkuperäinen pH 6,12).

25 Erityisen käyttökelpoinen kaavan 1' mukainen sykli nen peptidi on yhdiste, jossa R2 on tert-butyylioksikarbonyyli. Tätä yhdistettä nimitetään seuraavassa mukavuussyistä "t-BOC-ytimeksi". A-21978C-tBOC -ytimellä on seuraavat ominaisuudet: 30 Muoto: valkea amorfinen kiinteä aine, joka fluore soi lyhytaaltoisessa UV:ssa

Empiirinen kaava: C6 7 H, 3 Nx 7 02 7 Molekyylipaino: 1565

Liukoisuus: vesiliukoinen 35 Infrapuna-absorptiospektri (KBr): esitetty oheen- 8 79545 liitettyjen piirrosten kuviossa 2; absorptiomaksimit havaitaan seuraavilla frekvensseillä (cm*1): 3345 (leveä), 3065 (heikko), 2975 (heikko), 2936 (heikko), 1710 (olake), 1660 (voimakas), 1530 (voima-5 kas), 1452 (heikko), 1395 (keskivahva), 1368 (heikko), 1341 (heikko), 1250 (keskivahva), 1228 (keskivahva), 1166 (keskivahvasta heikkoon) ja 1063 (heikko).

UItraviolettiabsorptiospektri (90-%:nen etanoli): UV-maksimit 220 nm ( 42 000) ja 260 nm ( 10 600) 10 Suuren suorituskyvyn nestekromatografia: viipymis- aika = 6 min 4,6- x 300-mm:n silikageeli-Cj8-kolonnissa käytettäessä liuottimena H2 0/CH3 CN/CH3 OH (80:15:5), joka sisältää 0,2 % NH4 OAc virtausnopeudella 2 ml/min ja UV-il-maisinta.

15 Tämän keksinnön mukaisia estettyjä A-21978C -teki jöitä ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa R2 on ami-non suojaryhmä ja R on 8-metyylidekanoyyli, 10-metyyliun-dekanoyyli, 10-metyylidodekanoyyli, A-21978C:n tekijälle C0 ominainen C30-alkanoyyliryhmä tai jokin A-21978C:n te-20 kijöille C4 ja C5 ominaisista C32-alkanoyyliryhmistä.

Tämän keksinnön mukaiset A-21978C:n estetyt tekijät ja sykliset peptidit voivat muodostaa suoloja, jotka myös ovat tämän keksinnön osa. Tällaiset suolat ovat käyttökelpoisia esimerkiksi yhdisteiden erottamisessa ja puhdista-25 misessa. Farmaseuttisesti hyväksyttävät alkalimetallisuo-lat, maa-alkalimetallisuolat, amiinisuolat ja happoaddi-tiosuolat ovat erityisen käyttökelpoisia. "Farmaseuttisesti hyväksyttäviä" suoloja ovat suolat, joita voidaan käyttää lämminveristen eläinten kemoterapiaan.

30 Esimerkiksi kaavan 1' mukaisissa syklisissä A-21978C-peptideissä on neljä vapaata karboksyyliryhmää, jotka voivat muodostaa suoloja. Näiden karboksyyliryhmien osittais- ja seossuolat sekä täydelliset suolat otetaan sen vuoksi huomioon osana tätä keksintöä. Valmistettaessa 35 9 79545 näitä suoloja tulisi välttää suurempia pH-arvoja kuin 10, koska yhdisteet ovat tällaisissa pH-arvoissa epästabiileja.

Edustaviin esimerkkeihin ja sopiviin kaavan 1' mu-5 kaisten syklisten A-21978C-peptidien alkalimetalli- ja maa-alkalimetallisuoloihin kuuluvat natrium-, kalium-, litium-, kesium-, rubidium-, barium-, kalsium- ja magne-siumsuolat. Syklisten A-21978C-peptidien sopiviin amiini-suoloihin kuuluvat ammoniumsuolat ja primaariset, sekun-10 daariset ja tertiaariset Cx.4-alkyyliammonium- ja hydrok-si-Cj_4-alkyyliammoniumsuolat. Esimerkkejä amiinisuoloista ovat muiden muassa suolat, jotka saadaan syklisen A-21978C-peptidin reagoidessa ammoniumhydroksidin, metyy-liamiinin, sek-butyyliamiinin, isopropyyliamiinin, dietyy-15 liamiinin, di-isopropyyliamiinin, etanoliamiinin, trietyy-liamiini ja 3-amino-l-propanolin kanssa.

Kaavan 1' mukaisten syklisten A-21978C-peptidien alkalimetalli- ja maa-alkalimetallisuolat valmistetaan menetelmillä, joita tavallisesti käytetään valmistettaessa 20 kationisuoloja. Syklisen A-21978C-peptidin vapaa happomuo-to liuotetaan esimerkiksi sopivaan liuottimeen kuten lämpimään metanoliin tai etanoliin, sitten lisätään liuos, joka sisältää stoikiometrisen määrän haluttua epäorgaanista emästä vesipitoisessa metanolissa. Näin muodostunut 25 suola voidaan eristää tavallisilla menetelmillä kuten suodattamalla tai haihduttamalla liuotin.

Orgaanisten amiinien kanssa muodostuvat suolat voidaan valmistaa samalla tavalla. Voidaan esimerkiksi lisätä kaasumainen tai nestemäinen amiini sykliseen A-21978C-30 peptidiin, joka on liuotettu sopivaan liuottimeen kuten asetoniin; liuotin ja amiiniylimäärä voidaan poistaa haihduttamalla.

Tämän keksinnön mukaisissa syklisissä A-21978C-pep-tideissä on myös vapaita aminoryhmiä ja ne voivat siten 35 muodostaa happoadditiosuoloja, jotka myös ovat osa tätä 10 79545 keksintöä. Edustaviin esimerkkeihin ja sopiviin syklisten A-21978C -peptidien happoadditiosuoloihin kuuluvat muiden muassa suolat, jotka on muodostettu vakioreaktioilla orgaanisten ja epäorgaanisten happojen kanssa kuten esimer-5 kiksi kloorivety-, rikki-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmltiini-, kooli-, pamoiini-, lima-, D-glutamiini-, d-kamferi-, glu-taari-, glykoli-, ftaali-, viini-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbii-10 ni-, pikriini-, bentsoe- ja kanelihappojen kanssa.

Syklisten A-21978C -peptidien valmistus

Kaavan 1' mukaisia syklisiä A-21978C -peptidejä, saadaan deasyloimalla peptidiantibiootti, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat A-21978C:n tekijät C0, C: , C2 , 15 C3 , C4 ja C5 ja estetyt A-21978C:n tekijät C0 , Cx , C2 , C3 , C4 ja C5 .

I. Substraattien valmistus A-21978C:n tekijät C0 , Ct, C2, C3, C4 ja C5 valmistetaan kuten on kuvattu US-patentissa 4 208 403. Nämä te-20 kijät ovat aineosina A-21978C-kompleksissa, joka on osa A-21978-kompleksia.

A-21978-kompleksia voidaan tuottaa viljelemällä Streptomyces roseosporus NRRL 11379:ää (talletettu 29. elokuuta 1978) aerobisissa uppoviljelmäolosuhteissa, kun-25 nes on muodostunut huomattava antibiootin aktiivisuustaso. A-21978-kompleksi erotetaan suodattamalla viljelyliemi, alentamalla suodoksen pH noin arvoon 3, antaen kompleksin saostua ja erottamalla kompleksi suodattamalla. Erotettu kompleksi voidaan puhdistaa edelleen uuttotekniikkojen 30 avulla. Erillisen A-21978-kompleksin ja tekijöiden eristämiseen tarvitaan kromatografisia erotusmenetelmiä.

Tämän keksinnön mukaisia estettyä A-21978C-komplek-sia ja estettyjä A-21978C:n tekijöitä C0 , C3 , C2 , C3 , C4 ja C5 (kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa R on valittu 35 ryhmästä, jonka muodostavat 8-metyylidekanoyyli, 10-metyy- n 79545 llundekanoyyli, 10-metyyl±dodekanoyyli ja tekijöiden C0 , C4 ja C5 C10- ja Cx2-alkanoyyliryhmät) valmistetaan käyttäen peptidien aminoryhmlen suojaamiseen käytettyjä menetelmiä. Suojaryhmät valitaan erilaisista tunnetuista aml-5 non suojaryhmistä, jolta ovat esimerkiksi bentsyylioksi-karbonyyli, tert-butyylioksikarbonyyli, tert-amyylioksi-karbonyyli, lsobomyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikar-bonyyli, o-nitrofenyylitio, difenyylifosfinotioyyli, kloori- tai nitrobentsyylioksikarbonyyli.

10 Estetty A-21978C -kompleksi on erityisen edullinen substraattina. Se valmistetaan A-21978C -kompleksista, jolloin vältetään erillisten A-21978C-tekijöiden erottamiseen tarvittavat vaiheet, mutta kun se deasyloidaan, se antaa yhden ainoan tuotteen, so. sopivasti estetyn ytimen. 15 II. Deasylointlmenetelmä A. Entsyymin valmistus 1. Mikro-organismit A-21978C:n tekijöiden C0 , Ct , C2 , C3 , C4 ja C5 ja estettyjen tekijöiden C0 , Cx , C2 , C3 , C4 ja C5 deasyloin-20 nissa käyttökelpoisia entsyymejä voidaan valmistaa tiettyjen suvun Actinoplanaceae mikro-organismien avulla edullisesti mikro-organismilla Actlnoplanes utahensis NRRL 12502 (tallennettu 9. lokakuuta 1979). Vaikkakin esimerkissä 1 on kuvattu A. utahensis NRRL 12052:n viljelyn muo-25 dostama edullinen menetelmä tämän entsyymin valmistamiseksi, on alan ammattimiehelle ilmeistä, että muitakin menetelmiä voidaan käyttää.

Actinoplanaceae on mikro-organismiryhmän Actinomy-cetales heimo. Tämä heimo todettiin 1955, sen kuvasi en-30 slmmäiseksi tri John N. Couch [Elisha Mitchell Sei. Soc. 71, 148-155 (1955)]. Heimon ja useiden yksittäisten sukujen tunnusmerkit on esitetty julkaisussa "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. painos, toim. R. E. Buchanan ja N. E. Gibbons, The Williams ja Wilkins Co., 35 Baltimore, Md., 1974, sivut 706-723. Täten on erotettu i2 79545 kymmenen sukua: I. Actinoplanes (tyyppisuku ja siis ylivoimaisesti yleisin suku); II. Spirillospora; III. Strep-tosporangium; IV. Amorphosporangium; V. Ampullariella; VI. Pilimelia; VII. Planomonospora; Vili. Planobispora; IX.

5 Dactylosporangium; ja X. Kitasatoa.

Eräitä tähän mennessä eristettyjä ja karakterisoituja lajeja ja muunnoksia ovat: Actinoplanes philippinen- sis, Actinoplanes armeniacus, Actinoplanes utahensis ja Actinoplanes missouriensis; Spirillospora albida; Strep-10 tosporiangium roseum, Streptosporangium vulgare, Strepto-sporangium roseum var. hollandensis, Streptosporangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampullariella regularis, Ampullariella cam-panulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, 15 Pilimelia terevara, Pilimelia anulata, Planomonospora pa-rontospora, Planomonospora venezuelensls, Planobispora longispora, Planobispora rosea, Dactylosporangium auran-tiacum ja Dactylosporangium thailandense.

Actinoplanes -suku on edullinen tässä keksinnössä 20 käyttökelpoisen entsyymin lähde. Actinoplanes -suvussa on laji Actinoplanes utahensis erityisen edullinen tämän entsyymin lähde.

Muita tyypillisesti käyttökelpoisten lajien viljelmiä on yleisön saatavissa laitoksesta Northern Regional 25 Research Center, Agricultural Research Culture Collection (NRRL), U.S. Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, Illinois 61604, U.S.A., seuraavin tal-letusnumeroin:

Actinoplanes utahensis NRRL 12052 30 (talletettu 9.lokakuuta 1979)

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 (talletettu 9.lokakuuta 1979) Actinoplanes sp. NRRL 8122 (talletettu 17. lokakuuta 1975) 35 i3 79545

Actinoplanes sp. NRRL 12065 (talletettu 5. marraskuuta 1979) Streptosporangium roseum var. hollandesls NRRL 12064 5 (talletettu 5. marraskuuta 1979) A. utahensls NRRL 12052 kehitettiin emäviljelmästä, joka myös talletettiin laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 (A. utahensls ATCC 14539). Myös A. utahensls ATCC 10 14539-viljelmää voidaan käyttää entsyymilähteenä.

A. missouriensis NRRL 12053 kehitettiin viljelmästä, joka myös talletettiin ATCC:hen (A. missouriensis ATCC 14538) ja joka on myös entsyymilähde.

Minkä tahansa tietyn Actinoplanaceae -ryhmään kuu-15 luva mikro-organismikannan tehokkuus tämän keksinnön mukaisessa deasyloinnissa määritetään seuraavalla menetelmällä. Sopiva ravintoalusta ympätään mikro-organismilla. Viljelmää inkuboidaan noin 30°C:ssa kaksi tai kolme vuorokautta kiertoravistimessa. Sitten lisätään yhtä subst-20 raattiantibioottia viljelmään samalla kun fermentointiväliaineen pH pidetään noin arvossa 7,0. Viljelmän aktiivisuutta seurataan käyttäen Micrococcus luteus -koetta. Tämä menettely on kuvattu kohdassa D. Antibiootin tehon pieneneminen on osoitus siitä, että mikro-organismi tuot-25 taa deasylointiin tarvittavaa entsyymiä. Tämä voidaan kuitenkin varmistaa jollakin seuraavista menetelmistä: 1) HPLC-analyysillä, jolla todetaan muuttumattoman ytimen läsnäolo tai 2) uudelleenasyloimalla sopivan sivuketjun avulla (esim. lauroyylillä, n-dekanoyylillä tai n-dode-30 kanoyylillä) aktiivisuuden palauttamiseksi. Deasyloitaessa estettyä A-21978C-ainesta on antibiootin aktiivisuuden pieneneminen vaikeata todeta, koska estoryhmän lisääminen aiheuttaa antibiootin aktiivisuuden pienenemisen 80-90 %:lla.

35 i4 79545 2. Olosuhteet entsyymiä tuotettaessa

Entsyymin muodostuminen tapahtuu olosuhteissa, jotka ovat sopivat Actinoplanaceae'n kasvulle, so. lämpötila-välillä noin 25eC:sta noin 30°C:seen ja pH-alueella noin 5 5,0 - noin 8,0 sekoittaen ja ilmastaen. Viljelyalustan tulisi sisältää a) assimiloituva hiililähde, kuten ruokosokeri, glukoosi, glyseroli tai muu sellainen, b) typpi-lähde, kuten peptoni, urea, ammoniumsulfaatti tai muu sellainen, c) fosfaattilähde kuten liukoinen fosfaattisuola 10 ja d) epäorgaanisia suoloja, joiden on yleensä havaittu edistävän mikro-organismien kasvua. Tehokas entsyymimäärä saadaan yleensä noin 40 - noin 60 tunnin kuluttua kasvuvaiheen aloittamisesta ja se säilyy yleensä jonkin aikaa sen jälkeen kun tehokas kasvu on saavutettu. Muodostuneen 15 entsyymin määrä vaihtelee mikro-organismilajeittain ja kasvuolosuhteista riippuen.

Kuten on ilmeistä alalla työskenteleville, ovat entsyymiä tuottavat mikro-organismit kuten esimerkiksi Actinoplanes utahensis NRRL 12052 alttiita muuntumiselle. 20 Keinotekoisia muunnoksia ja mutantteja näistä kannoista saadaan esimerkiksi erilaisilla tunnetuilla mutageeneilla kuten ultraviolettisäteillä, röntgensäteillä, suurtaajuus-aalloilla, radioaktiivisellä säteilyllä ja kemikaaleilla. Kaikkia luonnossa esiintyviä ja keinotekoisia muunnoksia 25 ja mutantteja, joita saadaan ryhmästä Actinoplanaceae ja jotka tuottavat entsyymiä, voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti.

B. Deasylointiolosuhteet Lähtöaineena käytetty substraatti lisätään edulli-30 sesti Actinoplanaceae -viljelmään sen jälkeen, kun viljelmää on inkuboitu noin 48 tuntia. Substraatin pitoisuutta reaktioväliaineessa voidaan suuresti vaihdella. Entsyymin käyttämiseksi mahdollisimman tehokkaasti ja käytännöllisesti katsoen täydellisen deasyloitumisen aikaansaamiseksi 35 kolmen tunnin kuluessa käytetään kuitenkin tavallisesti aluetta noin yhdestä noin kolmeen mg/ml. Voidaan käyttää is 79545 alempia pitoisuuksia, mutta niissä ei saada entsyymistä maksimihyötyä; voidaan myös käyttää suurempia pitoisuuksia, mutta substraatti ei deasyloidu täydellisesti mikäli fermentointiaikaa ei pidennetä.

5 Substraattiantibiootin muuttaminen A-21978C-ytimek- si tämän keksinnön mukaisesti tapahtuu parhaiten, kun fer-mentointiväliaineen pH pidetään alueella noin 7,0 - noin 7,2. pH-arvon 7 alapuolella deasyloituminen tapahtuu hitaasti; kun pH-arvot nousevat yli arvon 7,2, on muodostu-10 nut ydin lisääntyvästi alttiina alkaliselle hydrolyysille. Sekoitettavissa fermenttoreissa pH:ta voidaan säätää tun-tosäätimin. Silloin kun tämä .on mahdotonta kuten pullofer-menttoreissa, voidaan pH-arvoa kontrolloida lisäämällä O,1-molaarista fosfaattipuskuria väliaineeseen ennen 15 substraatin lisäämistä.

Kun substraatti on lisätty, tulisi viljelmän inku-bointia jatkaa vielä 3-6 tuntia. Substraatin puhtaus vaikuttaa deasyloitumisnopeuteen. Esimerkiksi substraatti, jonka puhtaus on yli 50 %, deasyloituu noin nopeudella 2,5 20 mg antibioottia/ml 3 tunnissa. Kun käytetään epäpuhtaampia substraatteja, tapahtuu deasyloituminen jonkin verran hitaammin.

Substraattia voidaan lisätä useina erinä. Voidaan esimerkiksi lisätä 0,75 mg antibioottia/ml 24 tunnin vä-25 lein ainakin viitenä tai useampana lisäyksenä.

Deasylointi voidaan suorittaa laajalla lämpötila-alueella, esim. noin 20 - noin 45°C:ssa. On kuitenkin suositeltavaa suorittaa deasylointi noin 30°C:n lämpötilassa optimideasyloitumisen ja substraatin ja ytimen optimista-30 biilisuuden vuoksi.

C. Substraatti

On edullista mutta ei välttämätöntä käyttää substraattina puhdistettua antibioottia. Koska puhdistettu substraatti liukenee veteen tai puskuriin, sitä voidaan 35 käsitellä helpommin. Lisäksi puhdistettua substraattia ie 79545 käytettäessä deasyloituminen tapahtuu nopeammin. Osittain puhdistettuja substraatteja, jotka sisältävät lähtöainean-tibioottia jopa vain 15 %, on deasyloitu menestyksellisesti.

5 Substraattiantibiooteilla on antibakteerinen teho.

Siitä johtuu, että vaikkakin substraattiainekset (varsinkin ne, joiden puhtausaste on alhainen) voivat toimia kantajina bakteerisoluille tai -itiöille, jotka oletettavasti voisivat kasvaa deasylointiväliaineessa ja vaikuttaa de-10 asylolntireaktioon tai lähtöaineantibiootin tai tuoteyti-men rakenteeseen, ei tällaista kuitenkaan ole havaittu. Sen vuoksi ei ole tarpeen, että substraatit olisivat steriilejä, varsinkin lyhyiden deasylointivaiheiden ollessa kysymyksessä.

15 D. Deasyloinnin seuranta A-21978C:n tekijät C0 , Cx , C2 , C3 , C4 ja C5 ovat bakteerien vastaisia aineita, jotka ovat erityisen tehokkaita lajia Micrococcus luteus vastaan. Tästä syystä on substraattimäärien määrityksessä suositeltava mikä tahansa 20 koe, jossa käytetään lajia M.luteus. Muodostunut A-21978C-ydin on vesiliukoinen mutta biologisesti tehoton. Biologisen aktiivisuuden väheneminen on sen vuoksi nopea, summittainen koe deasyloitumisesta.

Muodostuneen ytimen määrä voidaan määrittää kvan-25 titatiivisesti jäljempänä kuvatun järjestelmän mukaisesti HPLC-analyysillä.

E. Solujen lepomuotojen käyttö

Vaihtoehtoiseen deasylointimenetelmään sisältyy Actinoplanaceae -solujen poistaminen viljelyväliaineesta, 30 solujen suspendointi puskuriliuokseen ja deasyloinnin suorittaminen kohdassa B kuvatulla tavalla. Käytettäessä tätä menetelmää voidaan entsymaattisesti aktiivista huovastoa käyttää uudelleen. Esimerkiksi A. utahensis NRRL 12052-huovasto säilyttää deasylointiaktiivisuutensa varastoi-35 taessa sitä kuukauden ajan tai pitempään jäähdyttäen i7 79545 (4-8°C) tai jäädytettynä (-20°C). Edullinen puskuriliuos on 0,1-molaarinen fosfaattipuskuri.

F. Immobilisoidut entsyymit

Vielä eräs tapa deasyloinnin suorittamiseksi on 5 entsyymin immobilisointi alalta tunnetuilla menetelmillä (katso esimerkiksi "Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins", toim. Thomas Ming Swi Chang, Plenum Press, New York, 1977; Vol. 1). Immobilisoitua entsyymiä voidaan sitten käyttää kolonnissa (tai muussa sopivan 10 tyyppisessä reaktorissa) deasyloitumisen aikaansaamiseen.

Lisäksi voidaan itse mikro-organismi immobilisoida ja käyttää katalysoimaan deasylointireaktiota.

Syklisten A-21978C-peptidien käyttökelpoisuus Sykliset A-21978C-peptidit ja niiden suolat ovat 15 käyttökelpoisia välituotteita valmistettaessa puolisynteettisiä bakteerien vastaisia yhdisteitä.

Kemoterapeuttisesti käyttökelpoisilla yhdisteillä, joita kuvataan samanaikaisesti vireillä olevassa patenttihakemuksessamme 831 756, on yleinen kaava (1), 20 jossa R on C7-C36-alkanoyyli, Cx3-Cx7-alkenoyyli tai ami-noryhmää suojaava ryhmä;

Rj on vety tai Cx-Cx 0-alkanoyyli; ja R2 on vety, Cx-Cx3-alkanoyyli, sukkinyyli tai aminoryhmää suojaava ryhmä; 25 sillä edellytyksellä, että 1) vähintään yksi ryhmistä R, Rl , R2 on jokin muu kuin vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, 2) vähintään toinen ryhmistä R1 ja R2 on vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, 30 3) R, R1 ja R2 sisältävät yhteensä vähintään neljä hiili- atomia ja 4) sekä R1 :n että R2:n ollessa joko vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, R ei ole 8-metyylidekanoyyli, 10-metyyli-undekanoyyli, A-21978C-tekijän C0 spesifinen 0-alkanoyy-35 liryhmä tai A-21978C-tekijöiden C4 ja C5 spesifinen C3 2 - 79545 18 alkanoyyliryhmä.

Ilmaisut "C7-Cx 6-alkanoyyli" ja "Cj 3-Cx 7-alkenoyy-li" tarkoittavat asyyliryhmiä, jotka ovat peräisin 7-16 ja vastaavasti 11-17 hiiliatomia sisältävistä karboksyyliha-5 poista.

Kun ryhmä R on alkanoyyli, on alkyyliosa yksiarvoinen tyydyttynyt haarautumaton tai haarautunut hiilivety-ryhmä. Kun R on alkenoyyli, on alkenyyliosan yksiarvoinen tyydyttymätön haarautumaton tai haarautunut hiilivetyryh-10 mä, jossa ei ole useampia kuin kolme kaksoissidosta. Tyy-dyttymättömän hiilivetyketjun kaksoissidososa(t) voi(vat) olla joko cis- tai trans-konfiguraatiossa.

Ilmaisu "aminon suojaryhmä" tarkoittaa tunnettua aminon suojaryhmää kuten yllä on määritelty.

15 Seuraavat ovat edullisia sovellutusmuotoja patent tihakemuksessa 831756 esitetyistä kaavan (1) mukaisista yhdisteistä: 0 a) Yhdisteet, joissa R on kaavan CH3(CH2 )n-^-mukainen alkanoyyli ja n on kokonaisuluku 5-14; CH, 0

I 3 II

20 b) yhdisteet, joissa R on kaava CH3 (CH2 )n CH(CH2 )m-C- mukainen alkanoyyli ja n ja m merkitsevät toisistaan riippumatta kokonaislukua 0-12, sillä edellytyksellä, että n + m on vähintään 3 ja korkeintaan 12 ja että n:n ollessa 0, m ei ole 8 ja n:n ollessa 1, m ei ole 6 eikä 8; 0

II

25 c) Yhdisteet, joisas R on kaavan CH3 (CH2 )nCH«CH(CH2 )n -C-mukainen cis- tai trans-alkenoyyli ja n ja m merkitsevät toisistaan riippumatta kokonaislukua 1-13 sillä edellytyksellä, että n + m on vähintään 7 ja korkeintaan 13; 0 30 d) Yhdisteet, joissa R on kaavan CH2 «CH(CH2 )n-&- mukainen cis- tai trans-alkenoyyli ja n on kokonaisluku 8-14; e) Yhdisteet, joissa R on: 0 ch3 (ch2 )5 -Ϊ-35 i9 79545 o ch3 (CH2 )6-fc-o

ch3 (CH2 )7 -c-5 O

CH3 (CH2 )e-C- o ch3 (CH2 )9 -C-0 10 CH3(CH2 )10-c- o CH2 =CH-(CH2 )8-C-0 CH3 (CH2 )n -C- 15 o CH3 (CH2 )i 2 -Ä- o ch3 -(CH2 )3 -CH=CH- (CH2 )7 -i- .V 0 20 CH3 (CH2 )13-<ϋ- 0 ch3 ch2 CH( ch3 ) - ( ch2 ) 6 -Ϊ-

Kemoterapeuttisilla yhdisteillä, joita kuvataan 25 samanaikaisesti vireillä olleissa patenttihakemuksissamme 831 746 ja 831 747, on yleinen kaava (1), jossa R1 on vety.

Patenttihakemuksessa 831 747 kuvatut kaavan (1) mukaiset johdannaiset ovat sellaisia, joissa R on vety, 30 8-metyylidekanoyyli, 10-metyylidekanoyyli, 10-metyyliun-dekanoyyli, A-21978C0:lie ominainen C20-alkanoyyliryhmä tai jokin A-21978C:n tekijöille C4 ja C5 ominaisista C12-alkanoyyliryhmistä, aminon suojaryhmä, aminoasyyliryhmä,

O

35 jolla on kaava -C-Q-NH2, jossa Q on C7.76-alkyleeni, tai 20 79545 o N-alkanoyyliaminoasyyliryhmä, jolla on kaava -W- li-R2 jossa W on kakslvalensslnen aminoasyyliryhmä, jolla on kaava

5 Q

a) -ϋ-Α-ΝΗ- jossa A on C3_ 10-alkyleenl tai C5.6-sykloalkyleeni; 10 0 R3

il I

b) -C-CH-NH- jossa R3 on hydroksimetyyli, hydroksietyyli, merkaptome-tyyli, merkaptoetyyli, metyylitioetyyli, 2-tienyyli, 3-15 indolimetyyli, fenyyli, bentsyyli tai substituoitu fenyyli tai substituoitu bentsyyli, joiden bentseenirengas on substituoitu kloorilla, bromilla, jodilla, nitrolla, Cj.j-alkyylillä, hydroksilla, C3_3-alkoksilla, Cx_3-alkyyli-tiolla, karbamyylillä tai Cx_3-alkyylikarbamyylillä; 20

X X

; 25 jossa X on vety, kloori, bromi, jodi, amino, nitro, C3.3-alkyyli, hydroksi, C3_3-alkoksi, merkapto, C3_3-alkyyli-tio, karbamyyli tai C3_3-alkyylikarbamyyli; 30 1 X1 -CT il NH_ . ~c~r | tai kx><L-NH- ^X1 X X1

35 X

2i 79545 joissa X1 on kloori, bromi, jodi, amino, hydroksi, Cj.j-alkyyli tai C2_3-alkoksi;

—tjJH

5 (e) L/\ Jy\ .

i I! tai 7 il tai -^V v# 10 (f) s /* \ . . jossa B on kaksivalenssinen radikaali, jolla on kaava -(CH2)n- ja n on kokonaisluku yhdestä kolmeen; 15 -CH=CH-; -CH=CH-CH2- tai ? -CH2 NHC-; R2 ' on C2 . x 7 -alkyyli tai C2_27-alkenyyli ja R2 on vety, 20 aminon suojaryhmä, aminoasyyliryhmä, jolla on edellä mää- 0 ritelty kaava -C-&-NH2, tai N-alkanoyyliaminoasyyli, 0 jolla on edellä määritelty kaava -W-C-R2’ edellyttäen, 25 että kun R on muu kuin aminoasyyli tai N-alkanoyyliaminoasyyli, R2:n täytyy olla aminoasyyli tai N-alkanoyyliaminoasyyli ja kun R2 on aminon suojaryhmä, R:n täytyy olla aminoasyyli tai N-alkanoyyliaminoasyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

30 Määritteet "alkyleeni", "alkyyli", "alkoksi", "al- kyylitio" ja "alkenyyli" käsittävät sekä haarautumattomat että haarautuneet hiilivetyketjut. "Alkyyli" tarkoittaa yksivalenssista tyydyttynyttä hiilivetyryhmää. "Alkenyyli" tarkoittaa yksivalenssista tyydyttymätöntä hiilivety-35 radikaalia, joka sisältää yhden, kaksi tai kolme kaksois- 22 7 9 545 sidosta, jotka voivat olla suuntautuneet cls- tai trans-konfiguraatioon. "Alkyleeni" tarkoittaa kaksivalensslsta tyydyttynyttä hiilivetyradikaalia. "Sykloalkyleenl" tarkoittaa kaksivalenssista tyydyttynyttä hiilivetyradikaa-5 lia.

Esimerkkejä Cx.20- tai C3. 26-alkyleeniryhmistä, jotka ovat edullisia, ovat R5 -CH2-; —^Η—, jossa R5 on C2_4-alkyyli (so. metyyli, etyy-10 li, n-propyyli, i-propyyli, n-butyyli, tert-butyyli, i-butyyli eli 1-metyylipropyyli); -(CH2)b-, jossa m on kokonaisluku kahdesta kymmeneen ja CH3-(CH2 )q-CH-(CH2) -, jossa p on kokonaisluku yhdestä kahdeksaan ja q on kokonaisluku nollasta seitsemään edellyttäen, että p + q ei saa 15 olla suurempi kuin 8.

Esimerkkejä C2_27-alkyyliryhmistä, jotka ovat edullisia, ovat: (a) CH3 -; (b) -(CH2 )nCHj, jossa n on kokonaisluku yhdestä 20 kuuteentoista; ja CH3 (c) -(1ξη2 )rCH(CH2 ),CH3 , jossa r ja s kumpikin on toisistaan riippumatta kokonaisluku nollasta neljääntoista edellyttäen, että r + s ei voi olla suurempi kuin 14.

25 Esimerkkejä C2_i7-alkenyyliryhmistä, jotka ovat edullisia, ovat: (a) -(CH2)t-CH*CH-(CH2)u-CH, jossa t ja u kumpikin on toisistaan riippumatta kokonaisluku nollasta neljääntoista edellyttäen, että t + u ei voi olla suurempi kuin 30 14.

(b ) - (CH2 )v -CH-CH- (CH2 )r -CH-CH- ( CH2 )t -CH3 , jossa v ja z kumpikin on toisistaan riippumatta kokonaisluku nollasta yhteentoista ja y on kokonaisluku yhdestä kahteentoista edellyttäen, että v + y + z ei voi olla suu-35 rempi kuin 12.

23 79545

Varsinkin seuraavat C3 _ 3 7-alkyyliryhmät ovat edullisia: ch3- ch3(ch2 )5- 5 CH3(CH2)6- ch3(ch2 )8- CHjCCH; >„-CH3 (CHj )t 2 -ΟΗ,(ΟΗ, )1(- 10 CHS(CH;)1S-

Varsinkin seuraavat C2_17-alkenyyliryhmät ovat edullisia: cis-CH3 (CH2 )5CH=CH(CH2 )7 -trans-CH3 (CH2 )sCH=CH(CH2 )7 -15 cis-CH3 (CH2 )10CH=CH(CH2 )4- trans-CH3 (CH2 )l0CH=CH(CH2 )4 -cis-CH3 (CH2 )7CH=CH(CH2 )7 -trans-CH3 (CH2 )7CH=CH(CH2 )7 -cis-CH3 (CH2 )5CH=CH(CH2 )9-20 trans-CH3 (CH2 )5CH=CH(CH2 )9- .·.'·! cis,cis-CH3 (CH2 )4CH=CHCH2CH=CH(CH2 )7 - trans, trans-CH3 (CH2 )4 CH«CHCH2 CH-CH(CH2 )7 -:'. cis,cis,cis-CH3 CH2 CH-CHCH2 CH-CH- CHCH2CH-CH-(CH2 )7 .

25 Kun W on kaavan V\

Tf \/ 6

30 V

mukainen kaksivalenssinen radikaali, on alan ammattimie 0

II

helle selvää, että -C- ja -NH- ryhmät voivat olla liitty-35 neenä bentseenirenkaaseen orto-, meta- tai para-asemiin 24 79545 toisiinsa nähden. X:n tarkoittama substituentti voi olla liittynyt bentseenirenkaan mihin tahansa vapaaseen asemaan. Edullisia sovellutusmuotoja ovat yhdisteet, joissa

O

II

5 X on vety ja ryhmät -C- ja -NH- ovat toisiinsa nähden para-asemassa.

Kaavan (1) symbolin R3 määritelmään sisältyvät määritteet "substituoitu fenyyli" ja "substituoitu bentsyyli" käsittävät substituentin liittyneenä bentseenirenkaan mi- 10 hin tahansa käytettävissä olevaan asemaan, so. substituentti voi olla orto-, meta- tai para-asemassa. Kaavassa (1) olevien symbolien R3 ja X määritelmiin sisältyvä määrite "Cj.3-alkyyli" sisältää metyyli-, etyyli-, n-propyy-li- ja i-propyyliryhmät.

15 Patenttihakemuksessa 831746 kuvatut kaavan (1) mu kaiset johdannaiset ovat sellaisia, joissa R on substituoitu bentsoyyliryhmä, jolla on kaava g A, > 20 i-4- -|-^5 nx jossa X on vety, kloori, bromi, jodi, nitro, _3-alkyyli, 25 hydroksi, C1_3-alkoksi tai C13 -alkyylitio; R2 on vety tai aminon suojaryhmä ja R2' on C815 -alkyyli; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Substituoiduissa bentsoyyliryhmässä voivat ryhmät 0 li 30 -C- ja -OR2 olla toisiinsa nähden orto-, meta- tai para- asemassa. Näiden ryhmien liittyminen para-asemiin on edullinen. X:n tarkoittama substituentti voi olla liittyneenä mihin tahansa käytettävissä olevaan bentseenirenkaan asemaan, jossa ei ole kumpaakaan näistä kahdesta ryhmästä.

35 Ilmaisu "alkyyli" käsittää sekä haarautumattomat 25 7 9 5 4 5 että haarautuneet hiilivetyketjut.

Esimerkkejä Ce _ 2 5 -alkyyliryhmistä, jotka ovat edullisia ryhmänä R2 ' , ovat (a) -(CH2)nCH3, jossa n on kokonaisluku seitsemäs-5 tä neljääntoista, ja ch3 (b) -(CH2 )γ^Η(ΟΗ2 ),CH3 , jossa r ja s kumpikin on toisistaan riippumatta kokonaisluku nollasta kahteentoista edellyttäen, että r + s ei voi olla suurempi kuin 12 eikä 10 pienempi kuin 5.

: Em. patenttihakemuksissa 831 746, 831 747 ja 831 756 esitettyjä kaavan 1 mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa asyloimalla kaavan 1 mukainen yhdiste sopivalla asyylisivuketjulla käyttäen menetelmiä, jotka ovat alalla 15 tavanomaisia muodostettaessa amidisidos. Asylointi toteutetaan tavallisesti saattamalla valittu yhdiste reagoimaan haluttua sivuketjua vastaan hapon aktivoidun johdoksen kanssa.

Ilmaisu "aktivoitu johdos" tarkoittaa johdosta, 20 joka muuttaa asylointiaineen karboksyyliryhmän reaktiiviseksi liittymään primääriseen aminoryhmään niin, että muodostuu amidisidos, joka liittää asyylisivuketjun ytimeen. Sopivat aktivoidut johdokset, niiden valmistusmenetelmät ja niiden käyttö primääristen amiinien asylointiin on alan 25 ammattimiehelle tunnettua. Edullisia aktivoituja johdoksia ovat: (a) happohalogenidi (esim. happokloridi), (b) hap- poanhydridi (esim. alkoksimuurahaishappoanhydridi tai aryylioksimuurahaishappoanhydridi) tai (c) aktivoitu esteri (esim. 2,4,5-trikloorifenyyliesteri). Muihin karbok-30 syyliryhmän aktiviointimenetelmiin kuuluu karboksyylihapon reaktio karbonyylidi-imidin (esim. N,N'-disykloheksyyli-karbodi-imidin tai N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidin) kanssa, jolloin saadaan reaktiivinen välituote, jota sen epästabiilisuuden vuoksi ei eristetä. Tällainen reaktio 35 primäärisen amiinin kanssa toteutetaan in situ.

26 79545

Edullinen menetelmä em. kaavan 1 mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on aktivoidun esterin käyttö. Halutun hapon 2,4,5-trikloorifenyyliesteri on edullinen asy-lointiaine. Tässä menetelmässä aktiivisen esterin ylimäärä 5 saatetaan reagoimaan kaavan 1' mukaisen yhdisteen kanssa huoneen lämpötilassa inertissä orgaanisessa liuottimessa kuten DMFtssa. Reaktioaika ei ole ratkaiseva, vaikkakin reaktioaika noin 6 tunnista noin 20 tuntiin on suositeltava. Reaktion lopussa liuotin poistetaan ja jäännös puh-10 distetaan tunnetulla menetelmällä kuten pylväskromatogra-fiällä. t-BOC-ryhmät voidaan poistaa käsittelemällä tri-fluorietikkahappo/anisoli/trietyylisilaani -seoksella tai edullisesti trifluorietikkahappo/1,2-etaanidioli -seoksella noin kolmesta noin viiteen minuuttia huoneen lämpöti-15 lassa. Sen jälkeen kun liuotin on poistettu, voidaan jäännös puhdistaa käänteisfaasi-HPLC:11a.

Haluttujen happojen 2,4,5-trikloorifenyyliesterei-tä voidaan valmistaa helposti käsittelemällä vastaavaa happoa 2,4,5-trikloorifenolilla kytkentäaineen kuten N,N'-20 disykloheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa. Muut happojen esterien valmistusmenetelmät ovat alan ammattimiehelle ilmeisiä.

Patenttihakemuksessa 831 756 esitettyjen kaavan (1) mukaisten johdosten valmistuksessa lähtöaineina käytetyt 25 alkaanikarboksyylihapot ja alkeenikarboksyylihapot ja niiden aktivoidut johdokset (varsinkin happokloridit ja 2,4,5-trikloorifenyyliesterit) ovat tunnettuja yhdisteitä tai niitä voidaan valmistaa tunnetuista yhdisteistä tunnetuilla menetelmillä. 2,4,5-trikloorifenyyliestereitä 30 valmistetaan yksinkertaisesti käsittelemällä aikaani- tai alkeenikarboksyylihapon happokloridia 2,4,5-trikloorifenolilla pyridiinin läsnä ollessa tai käsittelemällä vapaata aikaani- tai alkeenikarboksyylihappoa 2,4,5-trikloorifeno-1111a N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa. 35 2,4,5-trikloorifenyyliesterijohdos voidaan puhdistaa pyi- 27 79545 väskromatografiällä silikageelin läpi.

Patenttihakemuksissa 831 746 Ja 831 747 esitettyjen kaavan (1) mukaisten johdosten valmistuksessa lähtöaineina käytetyt N-alkanoyyliaminohapot tai N-alkenoyyliaminohapot 5 ovat tunnettuja yhdisteitä tai niitä voidaan valmistaa asyloimalla sopiva aminohappo halutulla alkanoyyli- tai alkenoyyliryhmällä tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Edullinen tapa valmistaa N-alkanoyyliaminohappoja on sopivan aminohapon käsitteleminen alkaanikarboksyylihappoklo-10 ridilla pyridiinissä. Käytetyt aikaani- tai alkeenikarbok-syylihapot, niiden aktivoidut johdokset ja aminohapot ovat tunnettuja yhdisteitä tai niitä voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä tai tunnettujen menetelmien muunnoksilla, jotka ovat ilmeisiä alan ammattimiehelle.

15 Jos kysymyksessä oleva aminohappo sisältää amino- ryhmän lisäksi muun asyloituvan funktionaalisen ryhmän, on alan ammattimiehelle selvää, että tällainen ryhmä täytyy suojata ennen kuin aminohappo saatetaan reagoimaan N-alkanoyyliryhmän tai N-alkenoyyliryhmän liittämiseen 20 käytetyn reagenssin kanssa. Sopivia suojaryhmiä ovat kaikki ryhmät, joiden tällä alalla tiedetään sopivan käytettäviksi peptidisynteesissä sivuketjun funktionaalisen ryhmän suojaamiseen. Tällaiset ryhmät ovat hyvin tunnettuja ja kysymykseen tulevan ryhmän ja sen käyttötavan valinta 25 on alan ammattimiehen helposti suoritettavissa, [katso esimerkiksi "Protective Groups in Organic Chemistry", M. McOmie, toim., Plenum Press, N.Y., 1973].

Tietyt näiden tuotteiden synteetissä käytettävät aminohapot voivat esiintyä optisesti aktiivisina muotoina. 30 Sekä luonnossa esiintyvä konfiguraatio (L-konfiguraatio) että luonnossa esiintymätön konfiguraatio (D-konfiguraa-tio) ovat käyttökelpoisia lähtöaineina.

Muutamien A-21978C -johdoksien valmistuksessa lähtöaineina käytetyt substituoldut bentsoehapot ja niiden 35 aktivoidut johdokset ovat tunnettuja yhdisteitä tai ne 28 79545 voidaan valmistaa tunnetuista yhdisteistä alalla tunnetuilla menetelmillä. Alkoksibentsoehappoja voidaan valmistaa yksinkertaisesti sopivasta hydroksibentsoehaposta saattamalla sopiva alkyylihalogenidi reagoimaan sopivan 5 hydroksibentsoehapon dinatriumsuolan kanssa.

Kuvatuissa menetelmissä lähtöaineina käytetyt hyd-roksibentsoehapot ja niiden substituoidut johdokset ovat tunnettuja yhdisteitä tai ne voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin.

10 Tämän keksinnön mukaisista välituotteista, ts. uu sista kaavan 1' mukaisista yhdisteistä valmistetut johdokset, so. patenttihakemuksissa 831 746, 831 747 ja 831 756 esitetyt yhdisteet estävät patogeenisten bakteerien kasvua kuten on osoitettu biologisilla vakiokokeilla. Yhdisteet 15 ovat sen vuoksi käyttökelpoisia bakteerien kasvun hillitsemiseen ympäristöpinnoilla (antiseptisenä aineena) tai bakteerien aiheuttamien tulehdusten hoitoon. Yhdisteiden antibakteerinen aktiivisuus on osoitettu in vitro agar-levyillä liuska-diffuusiokokeissa ja agar-laimennuskokeilla 20 sekä in vivo -kokeilla hiirissä, jotka on infektoitu lajeilla Staphylococcus aureus ja Streptococcus pyogenes. Yhdisteet ovat erityisen käyttökelpoisia käsiteltäessä gram-posiviivisten organismien aiheuttamia infektioita.

Kun em. syklisiä A-21978C -peptidijohdannaisia käy-25 tetään antibakteerisena aineena, niitä voidaan antaa joko oraalisesti tai parenteraalisesti. Kuten on alan ammatti-miehille selvää, annetaan A-21978C -yhdistettä tavallisesti yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen tai laimentimen kanssa. A-21978C -annostus riippuu eri 30 tekijöistä kuten esimerkiksi kulloinkin käsiteltävän infektion luonteesta ja vakavuudesta. Kuten alan ammattimiehet tietävät, voidaan sopivat annostusalueet ja/tai annos-yksiköt määrittää annettujen MIC- ja ED50-arvojen sekä myrkyllisyystietojen perusteella yhdessä sellaisten teki-35 jöiden kanssa kuin potilaan tai mikrobinkantajan tai in- 29 79545 fektoivan mikro-organismin farmakokinetiikka ja tunnusmerkilliset ominaisuudet.

Keksinnön havainnollistamiseksi täydellisemmin esitetään seuraavat esimerkit.

5 Esimerkki 1 A-21978C -ytimen valmistus A. Actinoplanes utahensis -lajin fermentointi

Valmistetaan Actinoplanes utahensis NRRL 12052:n varastoviljelmä ja säilytetään se agar-vinoalustalla.

10 Vinokasvualustan valmistuksessa käytettävä kasvualusta valitaan seuraavista:

Kasvualusta A

Aineosa Määrä

Esikeitetty kaurajauho 60,0 g 15 Hiiva 2,5 g K2HP04 1,0 g

Czapekin mineraaliravinto-liuos * 5,0 ml

Agar 25,0 g 20 Deionisoitu vesi täydennetään 1 litraksi pH ennen autoklaaviin sijoittamista noin 5,9; säädetään pH-arvoon 7,2 lisäämällä NaOH; autoklaavissa pitämisen jälkeen pH on noin 6,7.

* Czapekin mineraaliravintoliuoksella on seuraava koostu-25 mus:

Aineosa Määrä

FeS04 .7H2 0 (liuotettuna 2 ml:aan väkevää HC1) 2 g KC1 100 g 30 MgS04 . 7H2 0 100 g

Deionisoitu vesi täydennetään 1 litraksi Kasvualusta B

Aineosa Määrä

Perunadekstriini 5,0 g 35 Hiivauute 0,5 g so 79545

Kaseiinin entsymaattinen hydrolysaatti * 3,0 g

Lihauute 0,5 g

Glukoosi 12,5 g 5 Maissitärkkelys 5,0 g

Lihapeptoni 5,0 g

Sokeriruokomelassi 2,5 g

MgS04 . 7H2 0 0,25 g

CaC03 1,0 g 10 Czapekin mineraaliravintoliuos 2,0 ml

Agar 20,0 g

Deionisoitu vesi täydennetään 1 litraksi *N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Vinoviljelmään siirrostetaan Actinoplanes utahensis 15 NRRL 12052 ja ympättyä vinoviljelmää inkuboidaan 30eC:ssa 8-10 vuorokautta. Noin puolella vinoviljelmän kasvustosta ympätään 50 ml kasviskasvualustaa, jolla on seuraava koostumus :

Aineosa Määrä 20 Esikeitetty kaurajauho 20,0 g

Ruokosokeri 20,0 g

Hiiva 2,5 g

Distiller's Dried Grain* 5,0 g K2HP04 1,0 g 25 Czapekin mineraaliravintoliuos 5,0 ml

Deionisoitu vesi täydennetään 1 litraksi Säädetään pH arvoon 7,4 NaOH:lla; autoklaavissa pitämisen jälkeen pH on noin 6,8.

♦National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, 30 N.Y.

Ympätty kasviskasvualusta inkuboidaan 250 ml:n laa-jasuisessa erlenmeyerpullossa 30°C:ssa noin 72 tuntia ra-vistimessa, joka pyörii halkaisijaltaan 5,1 cm:n kaaressa nopeudella 250 kierrosta minuutissa.

35 Tätä inkuboitua kasviskasvualustaa voidaan käyttää 3i 79545 suoraan toisen valheen kasviskasvualustan ymppöämlseen. Vaihtoehtoisesti ja edullisesti se voidaan varastoida myöhempää käyttöä varten säilyttämällä viljelmä nestetypen kaasukehässä. Viljelmä preparoidaan tällaista varastointia 5 varten useihin pieniin pulloihin seuraavasti: Jokaiseen pulloon siirretään 2 ml Inkuboltua kasvlskasvualustaa ja 2 ml glyseroli-laktoosi -liuosta [yksityiskohtien suhteen katso W. A. Dalley ja C. E. Higgens, Preservation and Storage of Microorganisms In the Gas Phase of Llguld Nitro-10 gen, Cryobiol 10, 364-367 (1973)]. Valmistetut suspensiot varastoidaan nestetypen kaasukehässä.

Näin valmistettua varastoitua suspensiota (1 ml) käytetään ympättäessä 50 ml ensimmäisen vaiheen kasviskas-vualustaa (jolla on aikaisemmin kuvattu koostumus). Ensim-15 mälsen vaiheen ympättyä kasvlskasvualustaa inkuboidaan edellä kuvatulla tavalla.

Suurempien määrien aikaansaamiseksi ympätään 10 . . ml:11a ensimmäisen vaiheen inkuboltua kasvlskasvualustaa 400 ml toisen vaiheen kasvlskasvualustaa, jolla on sama 20 koostumus kuin ensimmäisen vaiheen kasviskasvualustalla. Toisen vaiheen kasvualustaa inkuboidaan laajasuisessa kahden litran erlenmeyerpullossa 30°C:ssa noin 48 tuntia ra-vistimessa, joka pyörii halkaisijaltaan 5,1 cm:n kaaressa nopeudella 250 kierrosta minuutissa.

25 Yllä kuvatulla tavalla valmistettua inkuboltua toi sen vaiheen kasvlskasvualustaa (80 ml) käytetään ympättäessä 10 litraa steriiliä tuotantokasvualustaa, joka on jokin seuraavista:

Kasvualusta I

30 Aineosa Määrä (g/1)

Maapähkinäjauho 10,0

Liukoinen llhapeptoni 5,0

Ruokosokeri 20,0 KH2P04 0,5 35 K2HP04 1,2 32 7 9 5 4 5

MgS0,.7H,0 0,25

Vesijohtovesi täydennetään 1 litraksi

Kasvualustan pH on noin 6,9 sen jälkeen, kun se on steriloitu autoklaavissa 121°C:ssa 45 minuuttia paineessa 5 noin 1,10 - 1,24 bar.

Kasvualusta II

Aineosa Määrä (g/1)

Ruokosokeri 30,0

Peptoni 5,0 10 K2HP04 1,0 KC1 0,5

MgS04 . 7H2 0 0,5

FeS04.7H2 0 0,002

Deionisoitu vesi täydennetty 1 litraksi 15 Säädetään pH arvoon 7,0 HClilla; autoklaavissa pi tämisen jälkeen pH on noin 7,0..

Kasvualusta III

Aineosa Määrä (g/1)

Glukoosi 20,0 20 NH4C1 3,0

Naa S04 2,0

ZnCl2 0,019

MgCl2.6H20 0,304

FeCl3 . 6H2 0 0,062 25 MnCl2.4H20 0,035

CuCl2 .2H2 0 0,005

CaC03 6,0 JH2P04* 0,67

Vesijohtovesi täydennetään 1 litraksi 30 * Steriloidaan erikseen ja lisätään aseptisesti. Lopul linen pH noin 6,6.

Ympättyä tuotantokasvualustaa fermentoidaan 14-lit-raisessa fermentointisäiliössä noin 30°C:n lämpötilassa noin 66 tuntia. Fermentointiseosta sekoitetaan tavanomai-35 silla sekoitimilla nopeudella noin 600 kierrosta minuutis- 33 79545 sa ja sitö ilmastetaan steriilillä ilmalla liuenneen hapen pitoisuuden pitämiseksi yli 30 %:na ilmalla kyllästetystä normaalipaineesta.

B. A-21978C;n deasylointi 5 Lajia A. utahensis fermentoidaan kohdassa A kuva tulla tavalla käyttäen vinopintakasvualustaa A ja tuotan-tokasvualustaa I ja inkuboimalla tuotantokasvualustaa noin 67 tuntia. Puhdistamatonta A-21978C-kompleksia (100 g) lisätään fermentointikasvualustaan.

10 A-21978C -kompleksin deasyloitumista seurataan ko keella Micrococcus luteus -lajia vastaan. Fermentoinnin annetaan jatkua kunnes deasyloituminen on täydellinen, mikä ilmenee siten, että teho M. luteusta vastaan katoaa, noin 24 tunnin jakso.

15 Tätä samaa menetelmää käytettiin tutkittaessa, tuottaisivatko muut mikro-organismit haluttua A-21978C-ydintä. Varsinkin kantojen Actinoplanes missouriensis NRRL 12053, Actinoplanes sp. NRRL 8122, Actinoplanes sp. NRRL 12065 ja Streptosporangium roseum var. hollandesis 20 NRRL 12064 havaittiin tuottavan haluttua ydintä, kun niitä käytettiin Actinoplanes utahensis NRRL 12052-kannen asemesta yllä kuvatussa menetelmässä. HPLC-vertailukokeet, joissa käytettiin autenttisina näytteinä tuotetta, joka oli saatu käytettäessä tässä menetelmässä deasylointient-25 syyminä A. utahensis -kantaa, varmistivat, että nämä muut mikro-organismit tuottivat A-21978C-ydintä.

C. A-21978C -ytimen eristäminen

Koko fermentointiliemi (20 litraa), joka saatiin kohdassa B kuvatulla tavalla, suodatettiin suotimen läpi 30 (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.). Huovastokakku poistettiin. Näin saatu suodos ajettiin kolonnin läpi, joka sisälsi 1,5 litraa HP-20 -hartsia (DIAION High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japani). Läpi virrannut neste heitettiin pois. 35 Kolonni pestiin sitten deionisoidulla vedellä (10 1) jäi- 34 79545 jellä olevan suodosliemen poistamiseksi. Tämä pesuvesi heitettiin pois. Kolonni eluoitiin sitten vesi/asetonit-riili -seoksilla (10 1 kukin, 95:5, 9:1 ja 4:1) ja otettiin talteen 1 litran fraktioina.

5 Eluoitumista seurattiin analyyttisellä HPLC:lla käyttäen silikageeli/C^ e ja liuotinsysteemiä vesi/metanoli (3:1), joka sisälsi 0,1 % ammonlumasetaattia, haluttu ydin todettiin UV-ilmaisimella 254 nm:ssa. Ydintä sisältävät fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin tyhjössä asetonitrii-10 Iin poistamiseksi ja jäädytyskuivattiln, jolloin saatiin 40,6 g puolipuhdasta A-21978C-ydintä.

D. A-21978C -ytimen puhdistus

Puolipuhdasta A-21978C -ydintä (15 g), joka oli saatu kohdassa C kuvatulla tavalla, liuotettiin 75 ml:aan 15 vesi/metanoli/asetonitriili -seosta (82:10:8), joka sisälsi 0,2 % etikkahappoa ja 0,8 % pyridiiniä. Tämä liuos pumpattiin 4,7- x 192-cm kolonniin, joka sisälsi 3,33 1 sili-kageeliä (Quantum LP-1)/C18. Kolonni kehitettiin samalla liuotlnsysteemillä. Otettiin talteen tilavuudeltaan 350 20 ml:n fraktiot. Erottumista seurattiin 280 nm:ssa UV-ilmaisimella. Yhdistettiin fraktiot, jotka sisälsivät ydintä, väkevöitiin tyhjössä liuottimien poistamiseksi ja jäädy-tyskuivattiin, jolloin saatiin 5,2 g puhdistettua A-21978C-ydintä.

25 Esimerkki 2

Vaihtoehtoinen menetelmä A-21978C -ytimen valmistamiseksi A-21978C -ydin valmistettiin esimerkin 1 menetelmän mukaisesti lukuunottamatta eräitä muutoksia vaiheessa B.

A. utahensis -viljelmää inkuboitiin aluksi noin 48 tuntia; 30 substraatti oli puolipuhdas A-21978C-kompleksi (50 g); ja substraatin lisäämisen jälkeen inkuboitiin noin 16 tuntia. Ravintoliuossuodos ajettiin kolonnin läpi, joka sisälsi 3,1 litraa HP-20-hartsia. Kolonni pestiin 10 tilavuudella vettä ja eluoitiin sitten vesi/asetoni -seoksella (95:5). 35 Eluointia seuraattlin kuten esimerkissä 1. Kun oli otettu 35 79545 talteen 24 litraa, muutettiin eluointiliuottimeksi vesi/-asetonitriili-seos (9:1). Ydintä sisältävät fraktiot eluoituivat tällä liuottimena. Nämä fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin asetonitriilin poistamiseksi ja jäädy-5 tyskuivattiln, jolloin saatiin 24,3 g puolipuhdasta A-21978C -ydintä.

Tämä puolipuhdas A-21978C-ydin (24,3 g) liuotettiin veteen (400 ml). Liuos pumpattiin 4,7- x 192-cm teräsko-lonniin, joka sisälsi 3,33 litraa sillkageeliä (Quantum 10 LP-1)/C1B, joka oli valmistettu vesi/metanoli/asetonitrii- li-seokseen (8:1:1), joka sisälsi 0,2 % etikkahappoa ja 0,8 % pyridiiniä. Kolonni kehitettiin samalla liuottimena noin 138 barin paineessa ja otettiin talteen 350 ml:n fraktioina. Eluointia seurattiin UV:n avulla 280 nm:ssa. 15 Haluttua ydintä sisältävät fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin tyhjössä liuotinten poistamiseksi ja jäädytyskui-vattiin, jolloin saatiin 14 g erittäin puhdasta A-21978C-ydintä.

Esimerkki 3 20 N„__-t-BOC-A-21978C:n tekijöiden C, ja O, valmistus A-21978C:n tekijöiden C2 ja C3 seos (10 g), joka oli valmistettu US-patentissa 4 208 403 kuvatulla tavalla, liuotettiin veteen (50 ml) ultraäänisekoittimessa (200 mg/ml). Liuoksen pH säädettiin 4,05:stä 9,5 %:een 5N 25 NaOH:lla (3,6 ml). Lisättiin di-tert-butyylidikarbonaattia (3,0 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Reaktioseoksen pH pidettiin 9,5:ssä manuaalisesti lisäämällä 5-normaalista NaOH (6,5 ml lisättynä 2 tunnissa).

30 Reaktiota seurattiin ajoittain TLC:lla silikageel- lä käyttäen CH3CH/H20-liuotinsysteemeitä (7:3 ja 8:2) ja UV-ilmaisinta.

Noin 10 minuutin kuluttua reaktioseos sameni äkkiä ja emäksen kulutus suureni. 30 minuutin kuluttua sameuden 35 lisääntymisnopeus ja emäksen kulutusnopeus pienenivät 36 79545 osoittaen, että reaktio oli mennyt loppuun. Reaktiota jatkettiin kuitenkin vielä 90 minuuttia reaktion päättymisen varmistamiseksi. Kaksituntisen reaktion jälkeen reaktio-tuote lyofilisoitiin välittömästi, jolloin saatiin 12,7 g 5 N0 rn-t-BOC-A-21978:n tekijöitä C2 ja C3.

Käyttäen samanlaisia menetelmiä toteutettiin kaksi 10 gramman reaktiota ja 40 gramman reaktio. Kaikissa näissä reaktioaika oli vain 40 minuuttia. Kaksi 10 g:n koetta antoivat 11,9 ja vastaavasti 12,1 g tuotetta. 30 g:n reak- 10 tio antoi 35,4 g tuotetta.

Esimerkki 4 A-21978C-N„, n-t-BOC -ytimen valmistus A. utahensis-lajin fermentointi A. utahensis fermentoitiin kuten on kuvattu esimer-15 kissä 1 kohdassa A käyttäen vinoviljelmäkasvualustaa A ja tuotantokasvualustaa I ja inkuboiden tuotantokasvualustaa noin 66 tuntia.

B. N„,, -t-BOC-kompleksin deasylointi A-21978C-N0rn-t-BOC-kompleksi (1185 g epäpuhdasta 20 substraattia, joka sisälsi noin 176 g A-21978C -kompleksia) lisättiin fermentointiravintoalustaan. Deasyloitiin kuten esimerkissä 1 kohdassa B on kuvattu. Deasyloituminen 011 täydellinen noin 24 tunnin kuluttua, mikä todettiin HPLC:11a.

25 C. A-21978C-N„rn-t-BOC -ytimen eristys

Fermentointiliuos (100 1), joka oli saatu kohdassa B kuvatulla tavalla, suodatettiin suotimella (Hyflo Super-cel). Suodos ajettiin läpi kolonnin, joka sisälsi 7,5 1 HP-20-hartsia (DIAION), kolonni pestiin vedellä (38 1).

30 Eluoitumista seurattiin silikageeli/C^ 8-HPLC:11a ilmaisimena UV 254 nm:ssa. Jonkin verran ydintä eluoitui pesussa. Pesua seuraava ytimen eluointi suoritettiin vesi/asetonit-riili -seoksilla seuraavasti: (95:5) 40 1; (9:1) - 40 1 ja (85:15) - 100 1. Ydintä sisältävät fraktiot yhdistet-35 tiin, väkevöitiin tyhjössä liuottimen poistamiseksi ja 37 79545 jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin 208,5 g puolipuhdasta A-21978C-N0rn-t-BOC-ydintä.

D. A-21978C-N___-t-BOC-ytimen puhdistus

Puolipuhdas A-21978C-N0rn-t-BOC-ydin (30 g), joka 5 oli saatu kohdassa C kuvatulla tavalla, liuotettiin vesi/ asetonitriili -seokseen (9:1), joka sisälsi 0,2 % etikka-happoa ja 0,8 % pyridiiniä (75 ml). Tämä liuos ajettiin 4,7 x 192-cm teräskolonniin, joka sisälsi 3,33 1 silika-geeli (Quantum LP-l)/Cie ja joka oli tasapainotettu samal-10 la liuotinsysteemillä. Kolonni kehitettiin paineen alaisena vesi/asetonitriili/metanoli -seoksella (80:15:5), joka sisälsi 0,2 % etikkahappoa ja 0,8 % pyridiiniä, jolloin otettiin talteen 350 ml:n fraktiot ja tuote todettiin UV:n avulla 280 nm:ssa. Tuotetta sisältävät fraktiot yh-15 distettiin, väkevöitiin tyhjössä liuottimen poistamiseksi ja jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin 18,4 g puhdasta A-21978C-N0rn-t-BOC-ydintä.

Esimerkki 5

Vaihtoehtoinen A-21978C-N„,, -t-BOC-ytimen puhdistus 20 Puolipuhdas A-21978C-N0rn-t-BOC -ydin (10,8 g), joka oli saatu esimerkin 4 kohdassa C kuvatulla tavalla, liuotettiin veteen ja ajettiin kolonniin, joka sisälsi 80 ml Amberlite IRA-68 (asetaattivaihe). Kolonni pestiin vedellä ja eluoitiin virtausnopeudella 5 ml/min peräkkäin 25 0,05 N etikkahapolla (1080 ml), 0,1 N etikkahapolla (840 ml) ja 0,2 N etikkahapolla (3120 ml), ja otettiin talteen 120 ml:n fraktioina. Kolonnia seurattiin analyyttisen HPLC:n avulla silikageeli/C18:11a käyttäen systeemiä vesi/asetonitriili/metanoli (80:15:5), joka sisälsi 0,2 % 30 ammoniumasetaattia, ja tuotteen toteamiseen UV:tä 254 nm:ssa. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, liuoksen pH säädettiin arvoon 5,8 pyridiinillä, saatu liuos väkevöitiin tyhjössä noin 200 ml:n tilavuuteen. Väkevöit-teeseen lisättiin vettä ja muodostunut liuos väkevöitiin 35 uudelleen pyridiinin poistamiseksi. Tämä väkevöite jäädy- 38 79545 tyskuivattiin, jolloin saatiin 3,46 g puhdistettua A-21978C-N0rn-t-BOC -ydintä.

Esimerkki 6

Seuraava menetelmä havainnollistaa patenttihakemuk-5 sessa 831 756 esitettyjen kaavan 1 mukaisten yhdisteiden valmistusta menetelmällä, jossa käytetään "aktiivista esteriä". Tällä menetelmällä valmistetut yksittäiset yhdisteet ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa R on CH3(CH2)8CO- (n-dekanoyyli), R1 on vety ja on R2 t-BOC tai 10 vety.

NT r p-(n-dekanoyyli)-A-21978C -ydin A. 2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaatin valmistus

Liuosta, jonka muodostavat dekanoyylikloridi (Pfalz ja Bauer, 5,6 ml), 2,4,5-trikloorifenoli (5,6 g), dietyy-15 lieetteri (1 1) ja pyridiini (120 ml), sekoitetaan 4 tuntia. Reaktioseos suodatetaan ja kuivataan tyhjössä.

2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaatti puhdistetaan sili-kageelikolonnissa (Woelm) käyttäen eluenttina tolueenia. Fraktioita seurataan TLC:lla käyttäen ilmaisuun lyhytaal-20 toista UV:tä. Oikeat fraktiot yhdistetään ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan 10,4 g 2,4,5-trikloorifenyyli-dekanoaattia.

: B, N„r_-t-BOC-A-21978C -ytimen asylointi 2,4,5-trikloori- fenyyli-n-dekanoaatllla 25 Liuosta, jonka muodostavat N0rn-t-BOA-A-21978C-ydin (15,0 g) ja 2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaatti (15,0 g) kuivassa DMF:ssa (500 ml) sekoitetaan typessä huoneen lämpötilassa 25 tuntia. Sen jälkeen seosta sekoitetaan 60°C:ssa 5 tuntia eli kunnes TLC osoittaa reaktion menneen 30 loppuun. Reaktioseos väkevöidään tyhjössä noin 200 ml:ksi ja sekoitetaan 1,2 litraan Et20/tolueeni -seosta (5:1). Tuote erotetaan suodattamalla, pestään Et20:11a ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan 15,05 g NTrp-(n-dekanoyy-li)-N0rn-t-BOC-A-21978C -ydinvälituotetta (kaava 1: R * 35 n-dekanoyyli, R1. H, R2 = t-BOC).

39 79545 C. N,r p-(n-dekanoyyl±)-N„r n-t-B0C-A-21978C -ytimen puhdistus NT r p-(n-dekanoyyli)-N0 rn-t-BOC-A-21978C -ydinväli-tuote puhdistetaan seuraavalla tavalla: Raakatuote liuo-5 tetaan noin 50 ml:aan eluointiliuotinsysteemiä ja tämä puhdistetaan HPLC:llä käyttäen Waters Prep 500-systeemiä, joka sisältää käänteisfaasi-C^ e-silikageelillä täytetyn kasetin. Systeemi eluoidaan H20/MeOH/CH3CN-seoksella (50:15:35), joka sisältää 0,2 % pyridiiniä ja 0,2 % HOAc. 10 Fraktioita seurataan UV:n avulla 280 nm:ssa. Oikeat fraktiot yhdistetään ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan 8,56 g puhdistettua NTrp-(n-dekanoyyli)-N0rn-t-BOC-A-21978C -ydintä.

D. N„ . ,-t-BOC -ryhmän poisto 15 t-BOC -ryhmä poistetaan sekoittamalla NT r p - (undeka- noyyli)-N0rn-(BOC-A-21978C -ydintä (1,47 g) 15 ml:ssa tri-fluorietikkahappo/-l,2-etaanidioli -seosta (10:1) huoneenlämpötilassa 3 minuuttia. Reaktioseos kuivataan tyhjössä ja jäännöstä trituroidaan Et20:n kanssa (50 ml). Kun tri-20 turaatti on pesty 20 ml:11a Et20:a, se kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan raakatuotteena 2,59 g NTrp-(n-dekanoyyli)-A-21978C -ydintä (kaava 1: R = n-dekanoyyli; R1 ja R2 = H).

E. NT r p-(n-dekanoyyli)-A-21978C -ytimen puhdistus 25 Epäpuhdas NIrp-(n-dekanoyyli)-A-21978C -ydin puh distetaan käänteisfaasi-HPLC:llä seuraavalla tavalla: Näyte (2,59 g) liuotetaan 4,0 ml:aan seosta H20/MeOH/CH2-CN/pyridiini/HOAc (50:15:35:2:2), ruiskutetaan 84- x 2,54-cm ruostumatonta terästä olevaan kolonniin, joka on täy-30 tetty LP-1/C18-absorbentillä. Kolonni eluoidaan samalla liuotinsysteemillä. Eluointi suoritetaan 82,7 - 117,2 barin paineessa virtausnopeudella 10-12 ml/min käyttäen LOC duplex-pumppua (Milton-Roy). Ulos virtaavaa nestettä seurataan UV-ilmaisimella (Inco Model UA-5, Instrument Spe-35 cialist Co., 4700 Superior Avenue, Lincoln, Nebraska 40 7 9 5 4 5 68504) 280 nm:ssa. Fraktiot (20,24 ml) otetaan joka toinen minuutti. Antimikrobisen aktiivisuuden perusteella halutuiksi todetut fraktiot yhdistetään ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan 1,05 g tuotetta.

5 Tämä puhdistusmenettely toistettiin käyttäen 4,35 g, 4,25 g, 2,14 g, 2,00 g ja 1,75 g epäpuhdasta lähtöaine johdannaista, jolloin saatiin yhteensä 5,58 g puhdistettua NT r p-(n-dekanoyyli)-A-21978C -ydintä.

Esimerkki 7 10 Tämä esimerkki havainnollistaa patenttihakemuksessa 831746 ja 831747 esitettyjen kaavan 1 mukaisten yhdistei den valmistusta. Tällä menetelmällä valmistetut yksittäiset yhdisteet ovat kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa R on N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyli ja R2 on t-BOC tai 15 vety.

NT r p-/[N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyll]-A-21978C -ytimen valmistus A. N-(n-dekanoyyli )-L-denyylialanyyli-2,4,5-trikloorifeno- laatin valmistus 20 Liuosta, jonka muodosti N-(n-dekanoyyli)-L-fenyy- lialaniini (31,9 g, 0,1 moolia) ja 2,4,5-trikloorifenoli (19,7 g, 0,1 moolia) 1 litrassa vedetöntä eetteriä, käsi-teltiin N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidillä (20,6 g 0,1 moolia). Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpö- 25 tilassa. Saostunut N,N*-disykloheksyyllurea poistettiin suodattamalla. Suodos haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Saatua jäännöstä trituroitiin eetterillä ja kiinteä aines (jäljellä oleva sykloheksyyliurea) poistettiin suodattamalla. Suodos haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa.

30 Jäännös kiteytettiin asetonitriilistä, jolloin saatiin 36,9 g kiteistä N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyli-2,4,5-trikloorifenolaattia, sp. 122-124eC.

B. N, r p-[N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyll]-N„r n-t-BOC-A-21978C -ytimen valmistus 35 Liuosta, jonka muodostivat N-(n-dekanoyyli)-L-de- 4i 79545 nyylialanyyli-2,4,5-trikloorifenolaatti (10 g, 0,02 moolia) ja NOrn-t-B0C-A-21978C -ydin (10 g, 01006 moolia) vedettömässä DMF:ssa (1 1), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 96 tuntia typessä. Liuotin poistettiin haihduttamal-5 la alennetussa paineessa. Jäännösmateriaalia sekoitettiin dietyylieetterin (800 ml) ja kloroformin (200 ml) seoksessa 2 tuntia. Tuote erotettiin suodattamalla, jolloin saatiin vaaleanruskea jauhe (10,3 g). Tämä aine (9,9 g) liuotettiin metanoliin (200 ml) ja puhdistettiin preparatii-10 visellä HPLC:11a käyttäen "Prep LC/System 500" -yksikköä PrepPak-500/C^8-kolonnia stationaarifaasina. Kolonni eluoitiin isokraattisesti käyttäen liuotinsysteeminä ve-si/metanoli/asetonitriili (2:1:2) ja kerättiin 250 ml:n fraktioita nopeudella yksi fraktio minuutissa. Haluttu 15 yhdiste eluotui fraktioissa 9-22.

Fraktiot yhdistettiin TLC:n perusteella [käänteis-faasi-silikageeli/Cj8; kehitys seoksella vesi/metanoli/ asetonitriili (3:3:4); ilmaisu Van Urk -sprayllä]. Yhdistetyt fraktiot tutkittiin bioautografiällä [silikageeli-20 TLC, liuotinsysteemi asetonitriili/asetoni/vesi (2:2:1) ja Micrococcus luteus toteamisorganismina] ja osoittautui, että se koostui yhdestä ainoasta bioaktiivisesta komponentista. Tämä menetelmä antoi 6,02 g NTrp-[N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyli]-N0rn-t-BOC-A-21978C -ydintä kaavan 1 25 mukainen yhdiste: R = N-(n-dekanoyyli-L-fenyylialanyyli); R2 - t-BOC].

C._NT pp-[N-(n-dekanoyyli)-L-fenyyllalanyyli]-A-21978C- ytimen valmistus

Pullo (100 ml) jäähdytettiin 5eC:een jäähauteessa. 30 Kohdassa B kuvatulla valmistettu NTrp-[N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyli]-N0rn-t-B0C-A-21978C -ydin (6,02 g 0,008 moolia) ja sen jälkeen vedetöntä trifluorietikkahappoa, joka sisälsi 2 % anlsolia (50 ml), lisättiin pulloon. Seosta, joka muuttui liuokseksi noin kahdessa minuutissa, 35 sekoitettiin typessä 10 minuuttia. Liuos haihdutettiin <2 79545 kuiviin alennetussa paineessa alle 40°C:ssa, jolloin saatiin kumimainen kiinteä aine, jota trituroitiin kahdesti liuoksella dietyylieetteri/dikloorimetaani (4:1) (kaksi 100 ml:n erää). Kiinteä aine otettiin talteen suodattamal-5 la ja pestiin dietyylieetterillä, jolloin saatiin TFA-suo-la. Tämä liuotettiin veteen (50 ml) ja liuoksen pH säädettiin arvoon 5,4 pyridiinillä. Sen jälkeen liuos lyofili-soitiin, jolloin saatiin 6,1 g luonnonvalkoista lyofili-saattia.

10 Metanoliin (35 ml) liuotettu lyofilisaatti puhdis tettiin käyttäen käänteisfaasi-C18-silikageelikolonnia (Waters Associates, Prep 500), eluoiden asteittaisgradien-tin avulla liuotinsysteemeillä H20/CH30H/CH3CN, jotka sisälsivät 0,1 % pyridiniumasetaattia ja liuotinsuhteet oli-15 vat 3:1:2, 2:1:2 ja 1:2:2 ja otettiin talteen 250 ml:n fraktiot. Haluttu tuote eluoitui liuotinsuhteella 2:1:2. Tuotetta sisältävät fraktiot lyofilisoitiin, jolloin saatiin 2,23 g kermanväristä NTrp-[N-(n-dekanoyyli)-L-fenyy-lialanyyli]-A-21978C -ydintä (kaavan 1 mukainen yhdiste: 20 R = N-(n-dekanoyyli)-L-fenyylialanyyli; R2 « H).

Tuote arvosteltiin analyyttisellä HPLC:lla [kään-teisfaasi-Cj^ 8 -silikageelikolonni, MeOH/CH3 CN/H2 0/Py0Ac (15:35:49:1) liuottimena ja UV-ilmaisu 230 nm:ssa, TLC:lla [käänteisfaasi-Cj 8-silikageelilevyt (Whatman), H20/CH30H/-25 CH3CN (3:3:4) liuottimena ja Van Urk-spray sekä lyhytaaltoinen UV ilmaisu] ja bioautografiällä [silikageeli-TLC (Merck), liuotin H20/CH3CN/asetoni (1:2:2) ja Micrococcus luteus toteamisorganismina]. Jokainen menetelmä osoitti tuotteen olevan homogeeninen. Tryptofäänin N-päätteessä 30 oleva substituutio varmistettiin 360 MHz:n PMR:llä. Amino-happoanalyysi varmisti, että tuote sisälsi yhden ekvivalentin L-fenyylialaniinia.

Esimerkki 8

Seuraava menetelmä havainnollistaa muiden patentti-35 hakemuksissa 831746 ja 831 747 esitettyjen kaavan 1 mu- 43 7 9 5 4 5 kaisten yhdisteiden valmistusta. Tällä menetelmällä valmistetut yksittäiset yhdisteet ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa R on p-(n-dodekyylioksi)-bentsoyyli ja R2 on t-BOC tai vety.

5 A_NTrpZ2zi n-dodekyylioksl)bentsoyyli-N„,_-t-BOC-A- 21978C -ytimen valmistus

Liuosta, jonka muodostivat p-(n-dodekyylioksi)-bentsoyyli-1,4,5-trikloorifenolaatti (0,9 g/mooli) ja A-21978C-t-BOC -ydin (0,9 g, 1 mooli) 400 ml:ssa vedetön-10 tä dimetyyliformamidia, sekoitettiin huoneen lämpötilassa 120 tuntia typessä. Liuotin poistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa. Jäännöstä sekoitettiin dietyylieet-terin (400 ml) ja kloroformin (400 ml) seoksen kanssa 2 tuntia. Tuote erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jol-15 loin saatiin vaaleanruskea jauhe (0,062 g). Erä tätä ainetta (0,78 g) liuotettiin metanoliin (200 ml) ja puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä käyttäen "Prep LC/Sys-tem 500"-yksikköä (Waters Associates, Inc. Milford Mass.) ja Prep Pak-500/C18-kolonnia (Waters Associates) statio-20 naarifaasina. Kolonnia käytettiin isokraattisesti ja liuo-tinsysteeminä vesi/metanoli/asetonitriili (2:1:2) ja otettiin 250 ml:n fraktioita (1 fraktio/min). Haluttu tuote eluoitu fraktioihin 2-6.

Fraktiot yhdistettiin TLC-perusteella [käänteisfaa-25 si/C1 8-silikageeli, kehitys liuotinsysteemillä vesi/ meta-noli/asetonitriili (3:3:4), ilmaisu Van Urk-sprayllä]. Yhdistettyjen fraktioiden bioautografia, jossa käytettiin eilikageeli-TLC: tä, liuottimena asetonitriili/asetoni/vesi (2:2:1) ja toteamisorganismina Staphylococcus aureus, 30 osoitti, että tuote oli yksi ainoa bioaktiivinen komponentti. Tämä menetelmä antoi 0,421 g NTrp-p-(n-dodekyyli-oksi)bentsoyyli-N0rn-t-BOC-A-21978C -ydintä.

Bj._NT r r -p- (n-dodekyylioksi )bentsoyyli-A-21978C -ytimen valmistus 35 NT r p-p-(n-dodekyylioksi)bentsoyyli-N0 r n-t-BOC- 44 79545 A21978C -ydin (230 mg) liuotettiin 5 ml:aan trifluorietik-kahappoa, joka sisälsi 2 % anisolia, ja sekoitettiin 5 minuuttia 0°C:ssa. Liuos väkevöitiin öljyksi tyhjössä ja öljyä trituroitiin Et20:11a (100 ml). Kiinteät ainekset 5 erotettiin, kuivattiin ilmassa ja otettiin veteen (10 ml). Tämän liuoksen pH säädettiin 3,25:sta arvoon 7 lisäämällä pyridiiniä. Muodostunut liuos lyofilisoitiin, jolloin saatiin 179 mg valkeata amorfista NTrp-p-(n-dodekyylioksi)-bentsoyyli-A-21978C -ydintä. Tämän yhdisteen Rf-arvo on 10 noin 0,78 silikageeli-TLC:ssa, jossa käytetään liuotinsys-teemiä asetonitriili/asetoni/vesi (2:2:1) ja ilmaisuun Van Urk-spraytä.

Esimerkki 9

Patenttihakemuksissa 831 746, 831 747 ja 831 576 15 esitettyjen, kaavan 1 mukaisten yhdisteiden antibakteeri-nen aktiivisuus voidaan osoittaa in vitro agar-levyillä liuska-diffuusio-vakiokokeissa ja agar-laimennuskokeissa sekä in vivo vakiokokeissa hiirillä, jolloin nähdään teho systeemistä bakteeri-infektiota vastaan. Kaavan 1 mukais-20 ten esimerkkiyhdisteiden antibakteerista tehoa tutkittaessa saadut tulokset on esitetty taulukoissa I, II ja III.

Taulukossa I on esitetty tulokset, jotka on saatu tutkittaessa esimerkkien 6-8 yhdisteitä in vitro agarle-25 vyllä liuska-diffuusiomenetelmillä.

Taulukossa II on tulokset, jotka on saatu tutkittaessa esimerkkien 6-8 yhdisteitä vakioiduissa agar- lai-mennuskokeissa. Taulukossa II aktiivisuus on ilmoitettu mlnimiestopitoisuutena (MIC), so. alimpana pitoisuutena, 30 jolla yhdiste estää mikro-organismin kasvun.

Tulokset, jotka on saatu in vivo-kokeissa, joissa arvosteltiin yhdisteiden teho kokeellisesti aiheutettuja bakteeri-infektioita vastaan hiirissä, on annettu taulukossa III. Näissä kokeissa kaksi annosta tutkittavaa yh-35 distettä annettiin subkutaanisesti tai oraalisesti hiiril- 45 79545 le, joilla oli esimerkin mukainen infektio. Havaittu aktiivisuus mitattiin EDS0-arvona [tehokas annos mg/kg suojaamaan 50 % koe-eläimistä, katso Warren Wick, et ai. J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)].

5 Kaavan 1 mukaisten esimerkkiyhdisteiden myrkylli syys on esitetty taulukossa IV.

46 79545 (O c|

Ai ..

»to g d ‘H jQ £

•H r-( CO

Η Ή **! Γ"

Hl vO

*(ä Λ VO σ> rH O _,

•*5 3 cm ro cm P

ή in cj rd ·' rH O (Ö Q) r '-g -Ί s ϊί φ f mm

f-l w w -n C

I 3 »h -H C

M u tn <r tn -H

<d O y 3 <T -h d

S O 3 O' CM HT 00 (rt I

m 7$ U P tN<N rH 2i,

O O 3 CJ Λ H

Ai M H U rH (0 O uh rd en Λ G ΙΠ < .G rd

« 0) CO

4-1 gj tn tn CO · * C

. AI 3 -rt vo H 0)

d AI rHi—tvOOCH CO E -P

Φ X, rH -P -VT (N i—t \ 4J

d Xl 7*. £ CH -H

•H ..o u^u E » 0) > * M * rH d

(1) O tn -H

H +J 4J 3 C -H

Ai UI U fc O) -p

SS W o tn co Φ -P

cj 3 r--. -P Φ

-¾ -P o t) Ό -j o O G -P

G -P rH P CN CO G -P

ή e £> 3 <-> tn o 2 to 'a H -H -ro rd E r. « < o -H tn

En e 4J i .p tn tn Φ crt O -P ·· ό o d td o

h , -ro O

0) J0 G r- td

•P cQ ι Φ G CO i—I

tn u o a> o i rH

•H -H CH O -P o t-Π -H

T3 -P K ι φ -p r- n rd -PH > tn ns >1 d T /\ G 1,1 t? S 5 T h c ω "1 10 d g x I I -h di -p tn Φ td -p z · · -h tn d e -P tn -h o '•v / +) 3 d d tn tn -P , · -p tn -p -p

HtUtu » (3 r-f3 o O > rd Φ -P Λ u evj A-t Ό C oo rd

AiAi tn d 00 X rHG-r)*3<iH

d O -rl tn r. O -rv φ -p | -r|

6 AI T3 l. N CM d -P ^ E

O xl &OX g tn -p e -H

rH -H x H 3 5 S d Φ G

tn z co>—. co tn -P ·· -P

d d xxx tn -ri g

td G u w O4J(04J

> tp Φ Ai G -P

(0 lp φ -p G

rd -H 4-> (d O G

« Ό tn a: Λ td h tn d > Ό G ai tn I x: -rl G rd

Ai X rH -P «

P

Φ

E o Ό r-~ ao ttj X

•P Z

tn -p W Ai 47 79545 (O m -P m r-ί Ο mo K» * *

P OOiprpmrpTfmOOmip H3 I

O

M

5 in m in m in m m C CD » ·* — — —

<D r^OOiHOiHOOOQOCN

Ό <0 ·ρ CO e) co -P m <U co m in in mmm CD 'j - - - . «p .m

X Ό Ό O' O rp O rp O o rp m O

O m O P

,¾ > _ ... .. ,. Q)

to 5! rHrHmMmH.^rHvomS 2 S m rP S

C M m ! C

C

Φ o fi

H g -P

H -H Ai

(0 P

O rH 0)

Αί i g (0 nJ

X U -H +J -P

3 CO rH m to C C

r—I tT> L. L_| CD Cd <0

3 (0 o S H MM

fl W S 11

5~l O m nt ^ ri ·Η -H

•S ΉΛ o ω CO OPieioP £ t{

13 «rHom-P m <o vo σ\ £ £ Q

Ö X > M W H m ai n =>+>+> P

2 «n P Φ « ° c « « .2 •H g m§‘cSQ,ww ·*

P P....^.2,Cg.+J(D<D CO

S 0u <U S C

(0 . ΰ 2 S >1 -H -H CD

Xtp g CCC0CD

•P tn H H H ·- ·Ρ ·Ρ -P M

-P 2 2 u rP -p -p +J O

Cc R ° 2 g rP -P CD A! «q 5 2 2 0 \. .—i »h o 6 5---5-2 en -p -p aj c P = = = 2 CO CO.H 0) n "P \-P-Ptog

m .C CU O C -P Ai rP

2 & a<D M CD CD Cd o « to cop s^a««

^ 4-> 4J 4J

•w m ui (ΟΛΟΌΟ 48 7 9 5 4 5

-H

M $

ω -r-j O

c n vo o o

<u Ό O CM

«S «N A

O tl Λ ω £ o rt «h M 3 +3 •H u w .j o *rf m os in Z -ff o }g O <n •H O o m o -P > +J o o m m & a as * i 2 | 0 oi ϋ § > τ>ί •H O I co

> ω I 3 H

i U +i J3 r* , a en oo

” ( O CO -H CT' UI

•n u D d oo n O 0) tn cm o H d τ' hS N * ti H CU - « h ° *“ M ^ Ή. m | ^ Λ ^ <o -S a O Ή up r* -P Tl Ui X ft 0 Φ .

: 0 f4 ά m a ϋ

Eh oo m r~ Ä σι ό i u o T; cm a

™ ,_j 33 I

1 rt U · * % z f \ s I - 1 il

Ti Γ) z · · : +1 .¾ o /

0) Γ) o NV

•H to I «3 I

i—I Ω O /—V C

ί 13 u τι Ή •e s oo Ä i—t >i as I ^ a /-s W +J CM ·—' cm to a s m as •H nasu ,rt ,2 h -w- o v_, "j ? 33 m en f4

J3 "C a s -P

>H a w a ω

CM O

X ^ 00 -r^ ^ ω . ^ ·* λ «id # e ·* S cg ja -rt O Ό e'» oo

«•HZ

M Λ! 49 79545 S' :<o C to to m <D _ _ - e u 00 w3 ° s Λ

Cj

PI

to >1 •’’Ί .

tn I

•H O

.-H u

rH

Sh m λ; = M m

>1 -ι-l U I

E +1 ™ 0 -P ® U * 3 3 0, φ Φ — · > -n d x // \ Η Ό -P U f ·

•h -H ® I

O 4J -P 2 1 il a; p< to 0 ^ /

,* ω χία V

3 a 3 1 00 1

Λ I to o O

3 U I CJ CM rH

3 00 a CO ® rH

E-' r* p ^ a —

σι E-· in '— (N O

1-1 Z X m ® -P

™ a sc a S

I — a — ό «< m —* m - S J — Tn

S u ~ u S

• Λ :θ to 3 -Η Φ ' .. . ' rH > -- Ai 3

-- >i P

::: to Λ I 3

.--. M M

φ 3 c * .¾ O m r* 00

to -H 2 W M

Claims (5)

50 79545

1. Menetelmä syklisen A-21978C-ydinpeptidin valmistamiseksi, jolla on kaava (1') 5

0 NH? 1 i /CH / \ /\ HO-C \/ J f Y N· Il !v' / Χ/Ν./χ O 0=/ , V C°NH2 h \ 1 β o H X n2 I «,<7 . >- X iv ‘ >, / ‘wX/1 °*ν \=*o h ,•—7· pH3 O H H-N S ho2c γΛΛ/νν-»2 o 1 I * ho2c 25 jossa R2 on vety tai aminon suojaryhmä, ja sen suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että A-21978C-kompleksi, A-21978C:n tekijä C0, Cx, C2 , C3, C4 tai C5, estetty A-21978C-kompleksi tai estetty 30 A-2l978C:n tekijä C0 , C, , C2 , C3 , C4 tai C5 , joilla on kaava (1) si 79545 O NHR2 5 /\ /H3 / V \ il! ! 'ν' ίο h/C0NH2 h > ”-> y * w xi y YYYYvV

20 HOsci jossa R on 8-metyylidekanoyyli, 10-metyyliundekanoyyli, 10-metyylidodekanoyyli, A-21978C:n tekijälle C0 tunnus-25 omainen Cx0-alkanoyyliryhmä tai A-21978C:n tekijöille C4 ja C5 tunnusomainen C12-alkanoyyliryhmä, ja R2 on vety tai aminon suojaryhmä, deasyloidaan entsymaattisesti vesipitoisessa väliaineessa deasyloivalla entsyymillä, jota tuottaa Actinoplanaceae-heimon mikro-organismi, joka on 30 Actinoplanes utahensis NRRL 12052, Streptosporangium ro-seum var. hollandensis NRRL 12064, Actinoplanes missou-riensis NRRL 12053, Actinoplanes sp. NRRL 12065 tai Actinoplanes sp. NRRL 8122, haluttaessa näin saadusta tuotteesta poistetaan aminon 35 suojaryhmä R2, 52 79545 ja haluttaessa saatu tuote muutetaan suolakseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on läsnä sitä tuottavan Actinoplanaceae-mikro-organismin viljelmässä.

3. Patenttivaatimuksien 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (1') mukainen yhdiste, jossa R2 on vety, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

4. Patenttivaatimuksien 1 tai 2 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (1’) mukainen yhdiste, jossa R2 on aminon suojaryhmä, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

5. Patenttivaatimuksessa 1 määritelty kaavan (1') mukainen yhdiste. 53 79545