DD210285A5 - Verfahren zur herstellung von a-21978c-cyclopeptidderivaten - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptidderivaten mit der aus dem Formelblatt hervorgehenden Formel I, worin R Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C tief 10-Alkanoylgruppe des Faktors C tief0 von A-21978C oder die speziellen C tief 12-Alkanoylgruppen der Faktoren C tief 4 und C tief 5 von A-21978C bedeutet und R hoch1 und R hoch 2 unabhaengig Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe darstellen, mit der Massgabe, dass wenigstens einer der Substuenten R hoch 1 und R hoch 2 fuer eine Aminoschutzgruppe stehen muss, falls R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe hat, oder von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen hiervon, durch Schutz von einer oder mehreren der Aminogruppen NHR, NHR hoch 1 und NHR hoch 2 unter Bildung einer Verbindung der Formel I, worin einer oder mehrere der Substituenten R, R hoch 1 und R hoch 2 eine Aminoschutzgruppe bedeuten, mit der Massgabe, dass einer oder mehrere der Substituenten R, R hoch 1 und R hoch 2 urspruenglich Wasserstoff sind, und/oder durch Deacylierung einer Verbindung der Formel I, worin R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe hat, unter Bildung einer Verbindung der Formrl I, worin R Wasserstoff ist, und gegebenfalls Entfernung irgendwelcher im Reaktionsprodukt vorhandener Aminoschutzgruppen R hoch 1 oder R hoch 2, wobei man zur Deacykierung vorzugsweise einen Mikroorganismus aus der Familie Actinoplanaceae verwendet, und zwar insbesondere mit Mikroorganismen Actinoplanes utahensis NRRL 12052, Streptosporgangium roseum var. hollandensis NRRL 12064, Actinoplanes missouriensis NRRL 12053, Actinoplanes sp. NRRL 2065 oder Actinoplanes sp. NRRL 8122 oderMutanten oder Varianten hiervon verwendet.

Description

Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptidderivaten

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf neue Derivate von Cyclopeptiden, die antibiotische Eigenschaften besitzen, und auf das Verfahren zur Herstellung dieser antibiotisch wirksamen Derivate auf semisynthetischem Weg.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung:

Die große Wahrscheinlichkeit und ständige Gefahr der BiI-dung antibiotikaspezifischer resistenter Stämme pathogener Mikroorganismen macht die Entwicklung neuer Antibiotika zu einem großen Bedürfnis- Vor allem Krankheitserreger innerhalb der grampositiven Arten von Staphylococcus und Streptococcus sind häufig resistent gegenüber herkömmlich verwendeten Antibiotika, wie Penicillin und Erythromycin, und in diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingewiesen auf W.O. Foye, Principles of iMedicinal. Chemistry, Seiten 684 bis 686 (1974). Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung neuer-und besonders wirksamer Antibiotika.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch neue

A-21978C-Cyclopeptidderivate und pharmazeutisch unbedenkliche Salze hiervon gelöst, die sich als wirksame antibiotische Mittel erwiesen haben.

Diese neuen Derivate können hergestellt werden durch Umsetzung des Kerns von A-21978C oder geschlitzter Derivate hiervon, wobei dieser Kern durch Deacylierung des geeignet blockierten Komplexes von A-21978C oder irgendeines seiner geeignet blockierten Einzelfaktoren C-, C-,, C~, C, , C. oder C₁. erhältlich ist, mit dem gewünschten Acylierungsmittel oder einem aktivierten Derivat hiervon.

Die erfindungsgemäßen A-21978C-Cyclopeptidderivate haben die Formel I

HOa

aC

>=o

Π3

rf

HOi

H3C '«

>IH

>=o

H H-i-

A /

r ϊ

,COsH

ΤΛ A >

1 r

β—R-

worin R Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C,„-Alkanoylgruppe des Faktors C_n von A-21978C oder die speziellen C,„-Alkanoylgruppen der Faktoren C.

12 und C_ von A-21978C bedeutet und R und R unabhängig Wasserstoff oder eine Amxnoschutzgruppe darstellen, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Substituenten R

2 und R für eine Aminoschutzgruppe stehen muß, falls R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Amino-. schutzgruppe hat, oder sind pharmazeutisch unbedenkliche Salze dieser Peptide, und diese Verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung semisynthetischer antibakterieller Mittel.

10 ,

Die Verbindungen der Formel I, worin R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe hat, sind blockierte Faktoren Cq,C,, C-, C₃, C. und C₅ des Antibiotikums A-21978C. Diese blockierten antibiotisch wirksamen Verbindungen eignen sich als Zwischenprodukte zur Herstellung bestimmter Peptide der Formel I, nämlich derjenigen Verbindungen, bei denen R Wasserstoff ist und wenigstens einer der Sub schutzgruppe bedeutet.

1 2 Die Verbindung der Formel I, worin R, R und R jeweils Wasserstoff bedeuten, ist das gemeinsame Cyclopeptid, das in den Faktoren C„, C-,, C-, C,, C₄ und C_ des Antibiotikums A-21978C vorhanden ist. Der Einfachheit halber wird diese Verbindung als Kern von A-21978C bezeichnet. Sie.läßt sich auch durch folgende Formel II wiedergeben:

1 2 nigstens einer der Substituenten R und R eine Amino-

Gi

D-AI 3 A L-A s o T ' L-O r r,	L-Th r ΐ	D-Ser ι 3MG i	0
\	L-Ky η
G I y

L-A-Sp 15 ^! .

N H 2

(II)

worin 3MG für L-threo-3-Methylglutaminsäure steht.

Zur Erfindung gehört ferner auch ein Verfahren zur enzy-

matischen Deacylierung des Komplexes von A-21978C, der Faktoren C _Q, C-, , C₂, C₃, C. und C₅ von A-21978C, des blockierten Komplexes von A-21978C und der blockierten

Faktoren C_Q, C₁ZC₃, C₃, C₄ und C₅ von A-21978C. Die natürlich vorkommenden Faktoren von A-21978C.haben einen gemeinsamen Cyclopeptidkern, weisen jedoch jeweils eine andere. Fettsauregruppe auf. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Entfernung der Fettsäuregruppen von den Faktoren von A-21978C besteht darin, daß man auf das Antibiotikum oder das blockierte Antibiotikum in einem wäßrigen Medium so lange ein durch einen Mikroorganismus aus der Familie Actinoplanaceae gebildetes Enzym einwirken läßt, bis die: Deacylierung praktisch beendet ist.

Eine bevorzugte Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung eines vom Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 gebildeten En-

] zyms zur Abspaltung der Fettsäureseitenkette. Zur Bewerkstelligung einer solchen Deacylierung gibt man das jeweilige Antibiotikum oder blockierte Antibiotikum zu einer Kultur von Actinoplanes utahensis und läßt die Kultur bis zur erfolgtenDeacylierung inkubieren. Das hierdurch erhaltene A--21978C-Cyclopeptid oder blockierte Peptid wird unterAnwendung an sich bekannter Methoden aus der Fermentationsbrühe abgetrennt.

Die A-21978C-Cyclopeptide der Formel I stellen wertvolle Produkte dar, da sie sich durch Reacylierung in neue an- - tibiotisch wirksame Substanzen überführen lassen.

Die aus der Zeichnung hervorgehenden Infrarotabsorptions-]5 Spektren, die in KBr aufgenommen sind, zeigen:

Fig. 1: A-21978C-Kern (Formel I: R, R¹, R² = H)

Fig. 2: A-21978C N_n -t-BOC-Kern (Formel I: R und R¹ = ~ Orn

20 H, A~ = t-Butoxycarbonyl)

In der vorliegenden Beschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet, bei denen es sich großteils um her-, kömmliche Bezeichnungen handelt:

AIa: Alanin

Asp: Asparaginsäure

GIy: Glycin

Kyn: Kynurenin

30 Orn: Ornithin

Ser: Serin · :

Thr: Threonin

Trp: Tryptophan

t-BOC: t-Butoxycarbonyl

35 Cbz: Benzyloxycarbonyl

DMF: Dimethylformamid

THF: Tetrahydrofuran

HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

1 TLC: Dünnschichtchromatographie UV: Ultraviolett

Die Antibiotika A-21978C sind engverwandte saure Peptidantibiotika und werden in US-PS 4 208 403 beschrieben, die hiermit eingeführt wird. Wie aus US-PS 4 208 403 her-. vorgeht, enthält der Antibiotikumkomplex A-21978 eine überwiegende Komponente, nämlich den Faktor C, bei dem es sich selbst wiederum um einen Komplex aus eng verwandten Faktoren handelt. Der Faktor C von A-21978, der als Komplex A-21978C bezeichnet wird, enthält die Einzelfaktoren

^C0' ^Cl ' ^C2' ^CV ^C4 ^{und C}5' '^Di^{e Faktoren c}i' C_ und C₃ sind überwiegende Faktoren, während die Faktoren C_Q/ C, und C₁- untergeordnete Faktoren darstellen. Die Struktur ]5 der Faktoren.von A-21978C geht aus der folgenden Formel III hervor:

	L-As ρ	GIy
-A I 3		.D-Ser 3MG i
t L-A s ρ ί L-Om		L—Ky π „ /
\ GIv

L—T'nr

L^Asp f

30 . ^LT^P

. L-Tr-p

35 . -

N worin 3MG für L-threo-3-Methylglutaminsäure steht und R einen speziellen Fettsäurerest bedeutet. Die speziellen

Reste R der einzelnen Faktoren haben die im folgenden angegebenen Bedeutungen:

	Faktoren von A-21978C	Rest RN
5	Cl	8-Methyldecanoyl
	C2	10-Methylundecanoyl
	C3	10-Methyldodecanoyl
	S	C-, Q-Alkanoyl *
U	C4	C12-Alkanoyl *
	C5	C-, 2~Alkanoyl *

* Die genaue Art dieser Reste ist bis heute noch nicht bestimmt worden 15

Steht man vor dem Problem einer Deacylierung eines Peptidantibiotikums, dann läßt sich nur äußerst schwer erkennen, ob es ein Enzym gibt, das man für diesen Zweck verwenden kann. Die Auffindung eines solchen Enzyms ist

sogar noch schwieriger, wenn das antibiotische Substrat einen Cyclopeptidkern enthält. Enzyme verfügen über ein hohes Ausmaß an Spezifität, und Unterschiede im Peptidrest und in der Seitenkette des Substrats beeinflussen daher das Ergebnis des Versuchs einer Deacylierung. Eine

Reihe von Mikroorganismen bildet darüber hinaus eine große Anzahl Peptidasen, die unterschiedliche Teile des Peptidrests angreifen. Dies führt häufig zu nicht handhabbaren Produktgemischen.

° Bei jedem der A-21978C-Antibiotika (Formel III) ist die

N Fettsäureseitenkette (R ) an die cX-Arninogruppe des Tryptophanrests gebunden. Diese Fettsäureseitenkette läßt sich nun erfindungsgemäß durch ein Enzym abspalten, ohne daß hierdurch die chemische Integrität des Rests des A-21978C-

Peptids beeinträchtigt wird.

Die Erfindung bezieht sich ferner auch auf ein neues Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptidderivaten

1 der Formel I

Q NHR¹

I)

worin R Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C,Q-Alkanoylgruppe des Faktors C_Q von A-21978C oder

die speziellen C₁^-Alkanoylgruppen der Faktoren C. und C_r

1 2 ⁴^

von A-21978C bedeutet und R und R unabhängig Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe darstellen,mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Substituenten R und R für eine Aminoschutzgruppe stehen muß, falls R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe hat, und von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen dieser Verbindun-

35 gen.

Die Cyclopeptide der Formel I oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze eignen sich als Zwischenprodukte zur

] Herstellung neuer .semisynthetischer antibakterieller Mittel, die sich durch eine besondere Wirksamkeit gegenüber grampositiven Mikroorganismen auszeichnen.

Die Angabe Aminoschutζgruppe bezieht sich auf die üblichen Aminoschutzgruppen, die mit den anderen funktioneilen Gruppen im Molekül von A-21978C verträglich sind. Bevorzugt werden solche Aminoschutzgruppen, die sich dann wieder leicht abspalten lassen. Beispiele für geeignete Schutzgruppen gehen hervor aus "Protective Groups in Organic Synthesis" von Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New. York 1981, Kapitel 7. Besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind t-Butoxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl. _

Zu den Cyclopeptiden der Formel 1, worin R Wasserstoff ist, gehören die Faktoren C_n, C-,, C^, C-,, C₄ und C₁. des Cyclopeptids A-21978C (A-21978C-Kern) und die blockierten Derivate des A-21978C-Kerns. Der A-21978C-Kern, nämlich die Verbindung der Formel I, worin jeder der Substituenten R, R und R Wasserstoff ist, wird auch durch die Formel II bezeichnet.

Der Kern von A-21978C hat folgende Eigenschaften: 25

Form: weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV-Licht fluoresziert

Empirische Formel: C,-_H_o_N,,0_,

oz ο Z Io Zo

Molekulargewicht: 1466 Löslichkeit: Löslich in Wasser

Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Fig. 1 der Zeichnung mit Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm ):

3300 (breit), 3042 (schwach), 2909 (schwach), 1655 (stark), 1530 (stark), 1451 (schwach),

1399 (mittel), 1222 (mittel), 1165 (schwach), 10 63 (schwach) und 758 (mittel bis schwach).

-ιοί Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanol): UV-Ma-

xima bei 223 ran (£ = 41482) und 260 nm (t = 8687).

Elektrometrische Titration (66 %-iges wäßriges Dimethylformamid): Anwesenheit von vier titrierba-

ren Gruppen mit pK -Werten von etwa 5,2, 6,7-,

8,5 und 11,1 (anfänglicher pH-Wert = 6,1.2).

Ein besonders brauchbares Cyclopeptid der Formel I ist die Verbindung, worin R und R jeweils Wasserstoff sind

und R für t-Butoxycarbonyl steht. Diese Verbindung wird der Einfachheit halber auch als t-BOC-Kern bezeichnet. Der A-21978C-t-BOC-Kern hat folgende Eigenschaften:

Form: weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV-Licht fluoresziert.

Empirische Formel:· C,_,H_n.,N, ,0~_o Molekulargewicht: 1566

Löslichkeit: Löslich in Wasser · . Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Fig..2 der

Zeichnung mit Absorptionsmaxima bei folgenden

— 1 Frequenzen (cm ) : .

3345 (breit), 3065 (schwach), 2975 (schwach), 2936 (schwach), etwa 1710 (Schulter), 1660 (stark), 1530 (stark), 1452 (schwach), 1395

(mittel), 13 68 (schwach), 1341 (schwach), 1250 (mittel), 1228 (mittel), 1166 (mittel bis schwach) und 1063 (schwach). Ultraviolettabsorptionsspektrum (90 %-iges Ethanol):

UV-Maxima bei 220 nm it = 42000) und 260 nm

(£. = 10600) .

Hochleistungsflüssigkeitschromatogrpahie: Retentionszeit = 6 Minuten auf einer 4,6 χ 30 0 nun-messenden und mit Siliciumdioxidgel-C-, „ gefüllten Säule unter Verwendung eines Lösungsmittel

systems aus H₂O/CH₃CN/CH,OH (80 :15:5) , das 0,2 % Ammoniumacetat enthält, und Anwendung einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min mit

- 11 1 UV-Detektion.

Die blockierten A-21978C-Faktoren der Erfindung sind die Verbindungen der Formel I, worin wenigstens einer der Substituenten R und R eine Aminoschutzgruppe ist und R ausgewählt ist aus 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, der speziellen C-, „-Alkanoylgruppe des .Faktors C_n von A-21978C und den speziellen C-, ₂~Alkanoylgruppen der Faktoren C₄ und C₁. von A-21978C.

Die blockierten Faktoren von A-21978C und Cyclopeptide der Erfindung sind zur Bildung von Salzen befähigt, welche ebenfalls Teil dieser Erfindung sind. Solche Salze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung und Reinigung der Verbindungen. Pharmazeutisch unbedenkliche Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Amin- und Säureadditionssalze sind besonders brauchbar. Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden solche Salze verstanden, die zur Chemotherapie warmblütiger Tiere geeignet sind.

Die A-21978C-Cyclopeptide der Formel I haben beispielsweise fünf freie Carboxylgruppen, die Salze bilden können. Zur Erfindung gehören daher Teilsalze, Mischsalze und vollständige Salze an diesen Carboxylgruppen. Bei der Herstellung dieser Salze sollen pH-Bereiche von über 10 vermieden werden, da die Verbindungen bei solchen pH-Werten instabil sind.

Zu Beispielen für geeignete Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze der A-21978C-Cyclopeptide der Formel I gehören die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Zu geeigneten Aminsalzen der A-21978C-Cyclopeptide gehören die Ammoniumsal-. ze sowie die primären, sekundären und tertiären C-,-C₄-Alkylammonium- und Hydroxy-C^-C,-alky!ammoniumsalze. Beispiele für Aminsalze sind unter anderem die durch Umsetzung eines A-21978C-Cyclopeptids mit Ammoniumhydroxid, •Methylamin, s-Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Di-

- 12 -

iso-propylamin, Ethanolamin, Triethylamin und 3-Amino-lpropanol gebildeten Verbindungen.

Die kationischen Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze der A-21978C-Cyclopeptide der Formel I werden.unter Anwendung von Verfahren hergestellt, wie sie für die Bildung kationischer Salze üblich sind. Hierzu löst man beispielsweise die freie Säureform des A-21978C-Cyclopeptids in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmem Methanol oder

TO Ethanol, und versetzt eine solche Lösung dann mit einer Lösung, die eine stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wäßrigem Methanol enthält. Das auf diese Weise gebildete Salz kann durch übliche Methoden isoliert werden, wie durch Abfiltrieren oder Verdampfen des

15 Lösungsmittels.

In ähnlicher Weise lassen sich auch die Salze organischer Amine bilden. Zu diesem Zweck kann man beispielsweise das jeweilige gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung eines A-21978C-Cyclopeptids in.einem geeigneten Lösungsmittel , wie Ethanol, geben und das Lösungsmittel und den Überschuß an Amin dann durch Verdampfung entfernen.

Die erfindungsgemäßen A-21978C-Cyclopeptide haben ferner , auch freie Aminogruppen und können daher Säureadditionssalze bilden, die ebenfalls Teil der Erfindung sind. Zu Beispielen für geeignete Säureadditionssalze der A-21978C-Cyclopeptide gehören unter anderem die Salze, die durch übliche Umsetzung mit sowohl organischen als auch anorga- nischen Säuren gebildet werden, wie mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure , Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäuren Sorbinsäu- re, Picrinsäure, Benzoesäure und Zimtsäure.

- 13 ] Herstellung der A-21978C-Cyclopeptide

Die A-21978C-Cyclopeptide der Formel I, worin R Wasserstoff ist, sind zugänglich durch Deacylierung eines Peptidantibiotikums, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Faktoren C_Q, C,, C₂, CU, C, und C₅ von A-21978C und der blockierten Faktoren C„, C,, C^, C-., C. und C_ von A-21978C.

10 I· Herstellung der Substrate

Die Faktoren C„, C,, C~, C₃, C₄ und C₅ von A-21978C werden wie in US-PS 4 208 403 beschrieben hergestellt. Diese Faktoren sind Komponenten des A-21978C-Komplexes, der wiederum Teil des A-21978-Komplexes ist.

Der A-21978-Komplex läßt sich herstellen durch Züchtung von Streptomyces roseosporus NRRL 11379 (hinterlegt,am 29. August 1978) unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität. Der A-21978-Komplex wird abgetrennt durch Filtrieren der Fermentationsbrühe,. Erniedrigung des pH-Werts des Filtrats auf etwa pH 3, Ausfallenlassen des Komplexes und Abtrennung des Komplexes durch Filtration. Der abgetrennte Komplex kann durch Extraktionstechniken weiter gereinigt werden. Zur Isolierung des einzelnen A-21978C—Komplexes und seiner einzelnen Faktoren sind chromatographische Trennverfahren erforderlich.

Der blockierte A-21978C-Komplex und die blockierten Faktoren C_Q, Cw C₂, C₃, C, und C₅ von A-21978C gemäß der Erfindung (Verbindungen der Formel I, worin R ausgewählt ist aus 8-iMethyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl und den C-, ^- sowie C, ^-Alkanoylgruppen der Faktoren C„, C, und C-) werden hergestellt unter Anwendung von Verfahren, wie sie zum Schutz von Aminogruppen bei Peptiden üblich sind. Hierzu geeignete Schutzgruppen lassen sich aus den verschiedenen bekannten Aminoschutzgruppen

auswählen, und Beispiele hierfür sind Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, o-Nitrophenylthio, Diphenylphosphinothioyl, Chlor- oder Nitrobenzyloxycarbonyl.

5 " .

Der blockierte A-21978C-Komplex ist als Substrat beson-,

ders geeignet. Er wird aus dem A-21978C-Komplex hergestellt, so daß man ohne die zur Bildung der einzelnen Faktoren von A-21978C benötigten Auftrennstufen auskommt. ]Q Die Deacylierurig dieses Komplexes führt jedoch zu einem einzigen Produkt, nämlich zum geeignet blockierten Kern.

II. DeacyIierungsverfahren 15 A. Herstellung des Enzyms l__:__Die_Produktionsmikroorganismen

Die Mikroorganismen, die sich zur Deacylierung der Faktoren C_Q, C₁, C₂, C₃, C₄ und C₅ von A-21978C und der blokkierten Faktoren C_Q, C-, , C_, C₃, C₄ und C von A-21978C eignen, lassen sich durch bestimmte Mikroorganismen aus der Familie Actinoplanaceae produzieren, und zwar vorzugsweise durch den Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 (hinterlegt am 9. Oktober 1979). Ein bevorzugtes Verfahren zur Züchtung von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 unter Bildung dieses Enzyms ist im später folgenden Beispiel 1 beschrieben. Statt dessen können jedoch auch andere Verfahren angewandt werden, die alle im Rahmen des üblichen fachmännischen Könnens liegen.·

Die Actinoplanaceae sind eine Familie von Mikroorganismen aus der Ordnung Actinomycetales. Nach einer ersten Beschreibung von Dr. John N. Couch wurde diese Familie dann 1955 begründet (J. Elisha Mitchell Sei. Soc. 71, 148 bis 155-(1955). Die Eigenschaften dieser Familie und mancher einzelner Genera hiervon sind zu finden in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8. Auflage, R.E.

Buchanan und N.E. Gibbons, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, Seiten 706 bis 723. Bisher sind die folgenden zehn unterschiedlichen Genera hiervon ermittelt worden:

I. Actinoplanes (der Typgenus und somit der am stärksten verbreitete Genus),

II. Spirillospora,

III. Streptosporangium,

IV. Amorphosporangxum, 10 V. Ampullariella,

VI. Pilimelia,

VII. Planomonospora,

VIII. Planobispora,

IX. Dactylosporangium und 15 X· Kitasatoa.

Einige Spezies und Varietäten, die bisher isoliert und charakterisiert worden sind, sind Actinoplanes philippinensis, Actinoplanes armeniacus, Actinoplanes utahensis und Actinoplanes missouriensis; Spirillospora albida; Streptosporangium roseum, Streptosporangium vulgäre, Streptosporangium roseum var. hollandensis, Streptosporangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampullariella regularis, Ampullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anulata, Planomonospora parontospora, Planomonospora venezuelensis, Planobispora longispora, Planobispora rosea, Dactylosporangium aurantiacum und Dactylosporangium thailandense.

Der Genus Actinoplanes ist: eine bevorzugte Qulle für das erfindungsgemäß benötigte Enzym. Innerhalb des Genus Actinoplanes ist die Spezies Actinoplanes utahensis eine besonders bevorzugte Enzymquelle.

Kulturen anderer repräsentativer brauchbarer Spezies sind beim Northern Regional Research Center, Agricultural Research Culture Collection (NRRL),'US-Department of Agri-

culture, 1815 North University St., Peoria, Illinois 61604, V.St.A. ohne Beschränkung über ihre Verfügbarkeit hinterlegt und von dort unter folgenden Bezugsnummern frei erhältlich:

Actinoplanes utahensis . NRRL 12052 (hinterlegt am

9. Oktober 1979 Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 (hinterlegt am

9. Oktober 1979) Actinoplanes sp. NRRL 8122 (hinterlegt am

17. Oktober 1975) Actinoplanes sp. NRRL 12065 (hinterlegt am

5. November 19 79) '

, Streptosporangium roseum NRRL 12064 (hinterlegt, am var. hollandensis 5. November 1979)

Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ist abgeleitet von einer Stammkultur, die bei der American Type Culture Collection (ATCC),12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, V.St.A., ohne Beschränkung über ihre Verfügbarkeit hinterlegt ist· und von dort unter der. Bezugsnummer ATCC 14539 frei beziehbar ist. Die Kultur'Actinoplanes utahensis ATCC 14539 kann ebenfalls als Quelle für.das Enzym verwendet werden.

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 ist von einer Kultur abgeleitet, die ebenfalls bei der American Type Culture Collection (ATCC) ohne Beschränkung über ihre Verfügbarkeit hinterlegt ist und von dort unter der Bezugsnummer ATCC 1453.8 frei bezogen werden kann·. Diese Kultur Actinoplanes missouriensis ATCC 14538 ist eine weitere Quelle für das Enzym.: '

Die Wirksamkeit, eines bestimmten Stammes eines Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae zur Durchführung der erfindungsgemäßen Deacylierung wird nach folgendem Verfahren bestimmt. Ein geeignetes Wachstumsmedium wird.mit dem Mikroorganismus beimpft. Die Kultur wird zv/ei oder drei Tage bei etwa 30⁰C auf einem Rotations-

.- 17-

schüttler bebrütet- Sodann versetzt man die Kultur mit einem der Substratantibiotika und hält den pH-Wert des Fermentationsmediums auf etwa pH 7,0. Die Kultur wird bezüge lieh ihrer Aktivität durch Untersuchung mit Micrococcus luteus überwacht. Dieses Verfahren wird im später folgenden Abschnitt D. beschrieben. Ein Verlust an antibiotischer Aktivität ist ein Anzeichen dafür, daß der Mikroorganismus das zur Deacylierung geeignete Enzym bildet. Dies muß jedoch unter Anwendung einer der folgenden Methoden verifiziert werden: (1) Analyse durch HPLC bezüglich Anwesenheit des intakten Kerns oder (2) Reacylierung mit einer geeigneten Seitenkette, wie Lauroyl, n-Decanoyl oder n-Dodecanoyl, zur Wiederherstellung einer Aktivität. Eine Erniedrigung der antibiotischen Aktivität läßt sich nur schwer ermitteln, wenn man ein blockiertes A-21978C-Material acyliert, da die Einführung der Blockierungsgruppe zu einer 80 bis 90 %-igen Reduktion an antibiotischer Aktivität führt.

20 2_₁_Bedingungen_für_die_EnzYmproduktion

Zur Bildung des Enzyms kommt es unter Bedingungen, unter" denen ein Wachsen der Actinoplanaceae möglich ist, nämlich bei einer .Temperatur zwischen etwa 25 und etwa 30°C und einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 8,0 unter Durchmischung und Belüftung. Das Kulturmedium soll enthalten (a) eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Saccharose, Glucose, Glycerin und dergleichen, (b) eine Stickstoffquelle, wie Pepton,Harnstoff, Ammoniumsulfat und dergleichen, (c) eine Phosphatquelle, wie ein lösliches Phosphatsalz, und (d) anorganische Salze, die sich allgemein als zur Förderung des Wachstums von Mikroorganismen wirksam erwiesen haben. Eine wirksame Enzymmenge ergibt sich im allgemeinen innerhalb von etwa 40 bis etwa 6 0 stunden nach Beginn des Wachstumskreislaufs, und sie hält einige Zeit nach Erreichen eines wirksamen Wachstums an. Die Menge an produziertem Enzym schwankt von einer Spezies an Organismus zu einer anderen Spezies und ist ab-

- 18 . 1 hängig von den unterschiedlichen Wachstumsbedingungen.

Der Mikroorganismus, der das Enzym bildet, wie beispielsweise Actinoplanes utahensis NRRL 12052, ist natürlich einer Variation zugänglich. Künstliche Varianten und Mutanten dieser Stämme lassen sich beispielsweise erhalten durch Behandlung mit verschiedenen bekannten mutagenen . Mitteln, wie Ultraviolettstrahlung,. Röntgenstrahlung, Hochfrequenzwellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und. Mutanten, die von den Actinoplanaceae erhältlich sind und. das Enzym bilden, können erfindungsgemäß verwendet werden.

15 B. Deacylierunqsbedingungen.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Substrat wird der Kultur von Actinoplanaceae vorzugsweise zugesetzt, nachdem diese Kultur etwa 48 Stunden bebrütet worden ist. Die Konzentration des Substrats im Umwandlungsmedium kann innerhalb breiter Grenzen schwanken. Bei einer maximalen Aus- nutzung des Enzyms und praktisch vollständigen Deacylierung innerhalb einer Zeitdauer von 3 Stunden liegt die Konzentration an Substrat jedoch im allgemeinen zwischen etwa 1 und etwa 3 mg/ml. Niedrigere Konzentrationen können angewandt werden, können jedoch keine maximale Ausnutzung des Enzyms ergeben. · Man kann auch mit höheren Konzentrationen arbeiten, doch kann das Substrat dann nicht vollständig deacyliert werden, wenn die Fermenta-

30 . tionszeit nicht verlängert wird.

Eine Umwandlung des Substrätantibiotikums zum erfindungsgemäßen A-21978C-Kern läuft am besten bei einem pH-Wert des Fermentationsmediums im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 7,2 ab. Bei einem pH-Wert von unter 7 läuft die Deacylierung . nur langsam ab. Bei pH-Werten von über pH 7,2 ist der entstehende Kern dagegen einer zunehmend stärkeren alkalischen Hydrolyse ausgesetzt. In Rührfermentern läßt sich

der pH-Wert mit entsprechenden Sensoren einstellen- Falls dies aus praktischen Gründen ausscheidet, wie beispielsweise in Kolbenfermentern, dann kann man den pH-Wert einstellen, indem man das Medium vor der Zugabe des Substrats

5 mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer versetzt.

Nach erfolgter Zugabe des Substrats soll die Inkubation der Kultur etwa 3 bis 6 Stunden oder langer fortgeführt werden- Die Reinheit des Substrats beeinflußt die Geschwindigkeit an Deacylierung. Ein Substrat mit einer Reinheit von über 5 0 % wird beispielsweise in einer Geschwindigkeit von etwa '2, 5 mg/ml Antibiotikum in 3 Stunden deacyliert. Werden Substrate mit niedrigerer Reinheit angewandt, dann läuft die Deacylierung etwas langsamer ab.

Es kann auch eine Mehrfachzugabe an Substrat angewandt werden· So kann man beispielsweise Mengen von jeweils 0,75 mg/ml an Antibiotikum in Intervallen von 24 Stunden in Form von wenigstens fünf oder mehr Zugaben zusetzen.

Die Deacylierung kann über einen breiten Temperaturbereich durchgeführt werden, beispielsweise von etwa' 20 bis etwa 45⁰C. Aus Gründen einer optimalen Deacylierung und Stabilität des Substrats und.des Kerns wird jedoch eine Deacylierungstemperatur von etwa 30⁰C bevorzugt.

C. Das Substrat

Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, wird als Substrat ein gereinigtes Antibiotikum verwendet. Ein gereinigtes Substrat ist in Wasser oder einem Puffer löslich, und es läßt sich daher einfacher handhaben. Ferner läuft auch die Deacylierung mit einem gereinigten Substrat rascher ab. Auch halbgereinigte Substrate., die ^OJ nur etwa 15 % des Ausgangsantibiotikums enthalten, haben sich erfolgreich deacyTieren lassen.

Die Substratantibiotika sind antibakteriell wirksam. Die

Suhstratmaterialien, und zwar insbesondere diejenigen mit niedriger Reinheit, können zwar Bakterienzellen oder Sporen beherbergen, die im Deacylierungsmedium wachsen könnten und die Deacylierungsreaktion oder die Stabilität des Ausgangsantibiotikums oder des gebildeten Kerns beeinträchtigen könnten, doch sind solche Erscheinungen nicht beobachtet worden. Es ist daher nicht notwendig, daß die Substrate steril sind, und zwar insbesondere nicht bei kurzen Deacylierungszeiten

10

D. Überwachung der Deacylierung

Die Faktoren C_Q, C,, C-, C₃, C. und C₅ von A-21978C sind antibakterielle Mittel, die gegenüber Micrococcus luteus besonders wirksam sind. Zur Bestimmung der Mengen an vorhandenem Substrat ist daher ein Versuch unter Verwendung von Micrococcus luteus bevorzugt. Der gebildete A-21978C-Kern ist , in Wasser löslich, jedoch biologisch inaktiv. Eine Erniedrigung der biologischen Aktivität ist daher ein rascher und präsumtiver Test für eine Deacylierung.

Die Menge an gebildetem Kern läßt sich durch HPLC-Analyse unter Anwendung des hierin beschriebenen Systems quanti- fizieren.

E. Verwendung ruhender Zellen

Ein anderes Verfahren zur Deacylierung besteht in einer Entfernung der Zellen von Actinoplanaceae aus dem Kulturmedium, einer Resuspendierung der Zellen in einer Pufferlösung und einer Durchführung der Deacylierung in der oben im Abschnitt B. beschriebenen Weise. Bei Anwendung dieses Verfahrens kann man das enzymatisch aktive Mycel . erneut verwenden. So behält beispielsweise Mycel von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 eine Deacylaseaktivität nach einer Aufbewahrung von 1 Monat oder langer unter Kühlung (4 bis 8⁰G) oder im gefrorenen Zustand (-20⁰C)

bei. Eine bevorzugte Pufferlösung ist ein 0,1 molarer Phosphatpuffer.

F. Immobilisierte Enzyme

Ein weiteres Verfahren zur Durchführung der .Deacylierung besteht in einer Immobilisierung des Enzyms unter Anwendung bekannter Methoden. Hierzu wird beispielsweise hingewiesen auf "Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins", Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum Press, New York (1977), Band 1. Unter Verwendung eines solchen immobilisierten Enzyms läßt sich dann die gewünschte Deacylierung beispielsweise in einer Säule oder einem sonstigen geeigneten Reaktor erreichen.

Zusätzlich dazu kann man auch den Mikroorganismus selbst immobilisieren und zur Katalyse der Deacylierungsreaktion einsetzen.

20 Brauchbarkeit der A-21978C-Cvclopeptide

Die A-21978C-Cyclopeptide und ihre Salze sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung semisynthetischer antibakterieller Verbindungen.

Chemotherapeutisch brauchbare- Verbindungen sind in der am gleichen Tage eingereichten Parallelanmeldung mit dem internen Aktenzeichen X-5163 beschrieben, und diese Verbindungen haben die folgende allgemeine Formel IV:

S \h 6o₂h il Il i

Il i

¹⁵ I Ϊ } I

HOzC

IV

1 2 worin R, R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, C.-C-, .-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₂ ^-C-, g-Alkanoyl, Cc^-C-, Q-Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, R³, R⁴ und R⁵ alle Wasserstoff sind oder (i) R und R. und/oder (ii) R und R und/oder (iii) R und R zusammen eine C₄-C-, ,-Alkylidengruppe darstellen können, mit der Maßgabe, daß (1) wenigstens einer der Substituenten R, R oder R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, (2) wenigstens einer der Sub-

1 2 stituenten R oder R Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe darstellen muß, (3) die Substituenten R, R und R

zusammen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten müssen . und (4) falls R und R ausgewählt sind aus Wasserstoff oder einer Aminoschutzgruppe, der Substituent R dann .-nicht für 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldödecanoyl, die spezielle C-, _Q-Alkanoylgruppe des Faktors Cq von A-21978C oder die speziellen C-, ₂-Alkanoylgruppen der Faktoren C_a und C₅ von A-21978C stehen kann, oder sind Salze dieser Verbindungen.

Die Angabe C₄-C-, ₄-Alkylidenyl bezieht sich auf eine Gruppe der Formel

R³

3 4 worin R und R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 3 bis 13 Kohlenstoffatomen sind, mit der Maßgabe, daß. einer ·

3 4'

der Substituenten R und R eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben.muß und der weiteren Maßgabe, daß die Summe

3 4

der Kohlenstoffatome in den Substituenten R und R nicht größer als 13 sein darf. Diejenigen Verbindungen, bei denen einer der Substituenten R, R oder R für C₄-C₁₄-Alkylidenyl steht, werden als Schiff-Basen bezeichnet.

Die Angabe C₄-C-, .-Alkyl bezieht sich auf eine einwertige gesättigte geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 4 bis 14 Kohlenstoffatomen. Die Verbindungen, worin einer, der Substituenten R, R oder R für C₄-C,.-Alkyl steht, werden hergestellt durch Reduktion der entsprechenden Verbindungen, worin die Gruppe R, R oder R für'C.-C, ₄~Alkylidenyl steht und werden hierin als reduzierte Schiff-Basen bezeichnet.

Die Angaben gegebenenfalls substituiertes C--C-, g-Alkanoyl und C₅-C,Q-Alkenoyl beziehen sich auf Acylgruppen, die von Carbonsäuren abgeleitet sind, die 2 bis 19 bzw. 5-bis 19 Kohlenstoffatome enthalten. Bedeutet die Gruppe R Alkanoyl, dann ist der Alkylteil ein einwertiger gesättigter geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest, der wahlweise eine Hydroxylgruppe oder 1 bis 3 Halogensubstituenten ausgewählt aus Chlor, Brom oder Fluor tragen kann. Steht R für Alkenoyl, dann ist der Alkenylteil ein einwertiger ungesättigter geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest, der nicht mehr als drei Doppelbindungen enthält. Die Doppelbindungen der ungesättigten Kohlenwasserstoffkette können

- 24 entweder die eis- oder die trans-Konfiguration haben.

Die Angabe Aminoschutzgruppe bezieht sich auf die üblichen Aminoschutzgruppen der oben bereits angegebenen Art.

5 ...'

Als Unterklassen sind folgende Verbindungsgruppen aus der

Formel IV bevorzugt: -

,Q- (a) Die Verbindungen, worin R Alkanoyl der Formel

11

CH-(CH-) -C— bedeutet und η für eine ganze Zahl von 3 bis 17 steht;

12 (b) die Verbindungen, worin R Alkanoyl der Formel

.-o

Il

CH₃(CH₂)_n-C- bedeutet und η für 5 bis 14 steht;

(c) die Verbindungen, worin R Alkanoyl der Formel 20 ^CH-5 0

I ^J Il

CH-(CH-.) CH(CH-) -C- ist und die Indizes η sowie m j 2 η 2 m

jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 14 darstellen, : mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 1 und

nicht größer als 15 sein darf, und mit der weiteren Maßgabe,.daß, falls η für 0 steht, m nicht 8 sein

kann, und, falls η für 1 steht, m nicht 6 oder 8 sein kann;

(d) die Verbindungen, worin R eis- oder trans—Alkenyl der Formel . 0

CH-(CH-,). CH = CH(CH-) -C- bedeutet und η sowie m je-3 2 η . 2m ^J.

weils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 14 sind, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf;

35 . . -

(e) die Verbindungen, worin R für eis— oder trans—Alkenyl

- 25 der Formel 0

Il

CH- = CH (CH-, J-C- steht und η eine ganze Zahl von 4 bis 15 ist;

(f) die Verbindungen, worin R für Alkyl der Formel

CH₃(CH₂) — steht und η eine ganze Zahl von 5 bis 12 ist;

(g) die Verbindungen, worin R folgende Bedeutungen hat:

?

CH₃(CH₂)₅-C-

CH₃(CH

CH₃(CH₂)₇-C-

CH₃(CH₂)g-C-O

CH₃(CH₂J₁₀-C-

O CH₀=CH-(CH-)₀-C-

?

CH₃(CH₂J₁₁-C-

O CH₃(CH₂J₁₂-C-

CH₃-(CH₂J₃-CH=CH-(CH₂J₇-C-

O CH₃(CH₂J₁₃-C-

CH,CH-CH(CH,)-(CH₀),-C-35· ^{32 3}

CH₃(CH₂J₁₁-

(CH₂)₁₀CH=

10

CH₃(CH₂)₆-CH₃(CH₂J₅CH=

CH₃(CH₂)₉-

CH₃(CH₂)

15

Die in den am gleichen Tage wie die vorliegende Anmeldung eingereichten Parallelanmeldungen mit den internen Aktenzeichen .X—5108 und X-5205 beschriebenen chemotherapeutisch, brauchbaren Verbindungen haben die folgende allgemeine Formel V:

HO2

20 25

¹HOa

35

ν.

Bei den in der oben erwähnten Parallelanme1dung mit dem internen Aktenzeichen X-5205 beschriebenen Derivaten der

Struktur V handelt es sich um solche Verbindungen, worin R für Wasserstoff, 8-Methyldecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, 10—Methylundecanoyl, die spezielle C,„-Alkanoylgruppe des Faktors C_n von A-21978C oder die speziellen C,--Alkanoylgruppen der Faktoren C. und C, von A-21978C, eine Aminoschutzgruppe, eine Aminoacylgruppe der Formel

O - C - Q - NH₂

worin Q für C,-C,,-Alkylen steht, oder eine N-Alkanoyl-

aminoacylgruppe der Formel

Il

₁₅ -W-C-R²

steht, worin W einen der folgenden zweiwertigen Aminoacylreste bedeutet:

O 20 (a) -C-A-NH- ,

worin A für C -C. »-Alkylen oder C₅-C -Cycloalkyleh steht.,

O R³

(b) -C-CH-NH- ,

worin R Hydroxymethyl, Hydroxyethyl₇ Mercaptomethyl, Mercaptoe-thyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-IndolinethyI, Phenyl, Benzyl oder substituiertes Phenyl oder substituiertes Benzyl bedeutet, wobei der Benzolring durch Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃-AIkYl, Hydroxy, C₁-C₃-AIkOXy, C -C₃-AIlCyI-.

thio, Carbamyl oder C..-C -Alkylcarbamyl substituiert ist,

(C)

35 ^.

worin X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Amino,. Nitro, Cj-C^-Alkyl, Hydroxy, C.-C_-Alkoxy, Mercapto, C.-C-.-Alkylthio, Carbamyl oder C.-C^-Alkylcarbamyl ist,

oder Γ

worin X für Chlor, Brom, Iod, Amino, Hydroxy, C.-C-.-Alkyl oder C.-C^-Alkoxy steht,

15 . 20

oder [ j; oder

25 (f) 0

worin B einen zweiwertigen Rest der Formeln

'-/ worin η eine Zahl von 1 bis 3 ist,

₀)

2. η

-CH=CH-, -CH=CH-CH-- oder O

· . -CH-NHC- bedeutet und .

2 worin R für C₁-C --Alkyl oder C_-C .,-Alkenyl steht,

und R Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, eine Aminoacyl-

gruppe der Formel -C-Q-NH- der oben angegeben Art oder

eine N—Alkanoylaminoacylgruppe der Formel

"2

c -W-C-R der oben angegebenen Art bedeutet,

mit der Maßgabe, daß R Aminoacyl oder N-Alkanoylaminoacyl sein muß, falls R eine andere Bedeutung als Aminoacyl oder N-Alkanoylaminoacyl hat, und daß ferner R Aminoacyl oder N-Alkanoylaminoacyl sein muß, falls R eine Aminoschutzgruppe ist, oder die pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon.

Unter den hierin verwendeten Ausdrücken Alkylen, Alkyl, ]5 Alkoxy, Alkylthio und Alkenyl werden sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste verstanden. Unter Alkyl wird ein einwertiger gesättigter Kohlenwasser stoff rest verstanden. Alkenyl bedeutet einen einwertigen ungesättigten Kohlenwasserstoffrest, der ein, zwei oder drei Doppelbindungen enthält, die jeweils in eis- oder trans-Konfiguration orientiert sind. Alkylen bedeutet einen zweiwertigen gesättigten Kohlenwasserstoffrest. Cycloalkylen bedeutet einen zweiwertigen cyclischen gesättigten Kohlenwasserstoffrest. 25

Beispiele für C -C _Q- oder C -C _g-Alkylenreste, die bevorzugt sind, sind folgende:

R⁵

~^CE2~' ~^CH~ ' ^{worin r5 für} C -C -Alkyl steht, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, t-Butyl, Isobutyl oder 1-Methylpropyl, -(CH-) -, worin m für eine Zahl von 2 bis 10 steht und CH_-(CH_) -CH-(CH.) -,worin ρ eine

J 2 q ι 2 p

Zahl von 1 bis 8 ist und q eine Zahl von 0 bis 7 bedeutet, 35

mit der Maßgabe, daß die Summe aus ρ + q nicht größer als

8 sein darf.

Beispiele für C,- C, -Alkylgruppen, die bevorzugt sind, sind folgende:

(b) -(CH-) CH , worin η für eine Zahl von 1 bis 16 steht, und

ί^Η3

(c) - (CH₀) <~H (CH₀) CH , worin r und s unabhängig eine Zahl von 0 bis 14 bedeuten, wobei die Summe aus r + s jedoch nicht größer als 14 sein darf.

Beispiele für C₀-C --Alkenylgruppen, die bevorzugt sind, sind folgende:

(a) -(CH₀K-CH=CH-(CH₀) -CH , worin t und u unabhängig eine Zahl von 0 bis 14 bedeuten, mit der Maßgabe, daß die Summe aus t + u nicht größer als 14" sein darf,

(b) -(CH₀) -CH=CH-(CH-) -CH=CH-(CH₀) -CH,, worin ν und ζ unabhängig eine Zahl von 0 bis 11 bedeuten

on und y für eine Zahl von 1 bis 12 steht, mit der Maßgabe, daß die Summe aus ν + y + ζ nicht größer als 12 sein darf.

FolgendeC₁-C.₇-Alkylgruppen sind besonders bevorzugt: ²⁵

CH₃(CH₂)₆ 30

35 CH₃(CH₂)₁₆-

Folgende C₀-C,_-Alkenylgruppen sind besonders bevorzugt

CiS-CH₃(CH₂) CH=CH(CH₂) -. trans-CH₃(CH₂J₅CH=CH(CH₂J

- 31 CiS-CH₃(CH₂J₁₀CH=CH(CH₂)₄-

trans-CH₃(CH₂)_1QCH=CH CiS-CH₃(CH₂)₇CH=CH trans-CH₃(CH₂)_?CH=CH CiS-CH₃ (CH₂)₅CH=CH

. trans-CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)_g

CXS, CiS-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)_?- ¹⁰ trans, trans-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₃)_?-

cis,eis,CiS-CH₃CH₂CH=CHCH₂CK=CHCH₂CH=CH-(CH₂)₇-.

Steht der zweiwertige Aminoacylrest W für einen zwei-•tr wertigen Rest der Formel

-NH-

Il

dann können die Funktionen -C- und -NH- am Benzolring selbstverständlich in ortho-, meta- oder para-Konfiguration zueinander orientiert sein. Der Substituent X kann .25 an jeder verfügbaren Stellung des Benzolrings vorhanden sein. Bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen X Wasserstoff, ist und die Funktionen

O -C- . und -NH- in para-Konfiguration orientiert sind.

Unter den Angaben substituiertes Phenyl und substituiertes Benzyl, wie sie durch den Substituenten R in der Formel V definiert sind, wird ein Substituent an irgendeiner der verfügbaren Stellungen im Benzolring verstanden, so daß

25 sich dieser Substituent in ortho-, meta- oder para

Konfiguration befinden kann. Die Angabe C₁-C,-Alkyl gemäß den Substituenten R oder X in der Formel V beinhaltet Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Isopropyl.

Die in der am gleichen Tage wie die vorliegende Anmeldung eingereichten Parallelanmeldung mit dem internen Aktenzeichen X-5108 beschriebenen Derivate der Struktur V sind diejenigen, worin R eine substituierte Benzoylgruppe der folgenden Formel ist:

ίο \χ·

worin X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C,-C-.-Alkyl,

2 Hydroxy, C₁-C₃-AIkOXy oder C,-C^-Alkylthio ist und R für Cg-C-, ,.-Alkyl steht, und R' Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, oder pharmazeutisch unbedenkliche Salze hiervon.

In der substituierten Benzoylgruppe können die Funktionen

"2

-C- und -OR in ortho-, meta- oder para-Stellung zueinander orientiert sein. Die para-Orientierüng ist für diese Gruppen bevorzugt. Der Substituent X kann an jeder verfügbaren Stellung des Benzolrings vorhanden sein, die nicht von diesen beiden Gruppen besetzt ist.

Unter der Angabe Alkyl werden sowohl geradkettige als auch verzweigte Kohlenwasserstoffketten verstanden.

Beispiele für C_g-C,^-Alkylreste, die als Substituent R bevorzugt sind, sind folgende:

.. (a) -(CH₂) CH , worin η eine ganze Zahl von 7 bis 14 ist,

. und. CH

(b) -(CH₉) CH(CH₉) CH-,, worin r und s unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 0 bis 12 stehen, wobei die Summe aus r + s jedoch nicht größer als 12 oder nicht kleiner als 5 sein darf.

' -Jj-

Die Verbindungen der Formeln IV und V können hergestellt werden durch Acylierung einer Verbindung der Formel I mit der geeigneten Acyl seitenkette unter Anwendung von Methoden, wie sie zur Bildung einer Amidbindung üblich sind. Diese. Acylierung wird im allgemeinen durchgeführt, indem man die jeweilige Verbindung mit einem aktivierten Derivat der Säure umsetzt, die der gewünschten Acylseitenkettengruppe entspricht.

Unter einem aktivierten Derivat wird ein Derivat verstanden, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels reaktionsfähig macht für eine Kupplung mit der primären Aminogruppe unter Bildung der Amidbindung, die die Acylseitenkette mit dem Kern verbindet. Geeignete aktivierte Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden zu ihrer Anwendung als Acylierungsmittel für ein primäres Amin sind dem Fachmann geläufig. Bevorzugte aktivierte Derivate sind (a) Säurehalogenide, wie Säurechloride, (b) Säureanhydride, wie Alkoxyameisensaureanhydride oder Aryloxyameisensaureanhydrxde, oder (c) aktivierte Ester, wie 2,4,5-Trichlorphenylester. Zu anderen Methoden für eine Aktivierung der Carboxylfunktion gehören eine Umsetzung der Carbonsäure mit einem Carbonyldiimid, wie, N,N:'i-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N ' -Diisopropylcarbodiimid, unter Bildung eines reaktionsfähigen Zwischenprodukts, das infolge seiner Instabilität nicht isoliert wird. Eine solche Umsetzung mit dem primären Amin wird direkt im Reaktionsgemisch durchgeführt.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der FormelnIV und V stellt die Methode über einen aktiven Ester dar. Hierzu wird vor allem der 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten Säure als Acylierungsmittel verwendet. Bei diesem Verfahren setzt man eine überschüssige Menge des aktiven Esters mit einer Verbindung der Formel I bei Raumtemperatur in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel, wie DMF, um. Die Umsetzungszeit ist nicht kritisch, obgleich eine Reak-

tionszeit von etwa 6 bis etwa 20 Stunden bevorzugt ist. Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand durch eine geeignete Methode gereinigt, beispielsweise durch Säulenchromatographie. Die t-BOC-Gruppen können durch Behandlung mit einem Gemisch aus Trifluoressigsäure, Anisol und Triethylsilan oder vorzugsweise einem Gemisch aus Trifluoressigsäure und 1,2-Ethandithiol über eine Zeitdauer von etwa 3 bis etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur entfernt werden. Nach Entfer^nen des Lösungsmittels kann man den Rückstand beispielsweise durch Umkehrphasen-HPLC reinigen.

Die 2,4,5-Trichlorphenylester der entsprechenden Säuren lassen sich am einfachsten durch Behandlung der gewünschten Säure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Anwesenheit eines Kupplungsmittels, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, herstellen. Andere zur Herstellung von Säureestern geeignete Methoden liegen im Rahmen des fachmännischen Könnens.

Die als Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Derivaten der Formel I und der aktivierten Derivate hiervon, insbesondere der Säurechloride und der 2,4,5-Trichlorphenylester, verwendeten Alkancarbonsäuren und Alken- carbonsäuren sind entweder bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen in an sich bekannter. Weise hergestellt werden. Die 2,4,5-Trichlorphenylester lassen sich am besten durch Behandlung des Säurechlorids der jeweiligen Alkancarbonsäure oder Alkencarbonsäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Anwesenheit von Pyridin oder durch Behandlung der freien Alkancarbonsäure oder Alkencarbonsäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid herstellen. Das 2,4,5-Trichlorphenylesterderivat kann beispielsweise durch Säulenchromatographie über Siliciumdioxidgel gereinigt werden.

Die.als Ausgangsmaterialien für Derivate der Formel V verwendeten N-Alkanoylaminosäuren oder N-Alkenoylaminosäuren sind entweder bekannte Verbindungen oder können

durch Acylierung der jeweiligen Aminosäure, mit der ge-, wünschten Alkanoylgruppe oder Alkenoylgruppe unter Anwendung an sich bekannter Methoden hergestellt werden. Ein bevorzugter Weg zur Herstellung der N-Alkanoylaminosäuren besteht in einer Behandlung der jeweiligen Aminosäure mit einem Älkancarbonsaurechlorid in Pyridin. Die Alkancarbonsäuren oder Alkencarbonsäuren, die aktivierten Derivate hiervon und die Aminosäuren sind wiederum entweder bekannte Verbindungen oder können nach bekannten Methoden oder Abwandlungen bekannter Methoden in an sich bekannter Weise hergestellt werden.

Enthält eine bestimmte Aminosäure eine acylierbare funktionelle Gruppe, bei der es sich nicht um die Aminogruppe handelt, dann muß eine solche Gruppe selbstverständlich geschützt sein, bevor man die Aminosäure mit dem Reagens umsetzt, das.zur Einführung der N-Alkanoylgruppe oder N-Alkenoylgruppe verwendet wird. Als Schutzgruppen eignen sich hierzu alle bekannten Gruppen, die bereits zum Schutz einer funktioneilen· Seitenkettengruppe bei Peptidsynthesen verwendet werden. Solche Gruppen sind wohlbekannt, und die Auswahl einer bestimmten Schutzgruppe und Methode zu ihrer Anwendung liegt im Rahmen des fachmännischen Könnens. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingewiesen auf "Protective Groups In Organic. Chemistry", M. McOmie, Plenum Press, N.Y. (1973).

Bestimmte Aminosäuren, die zur Synthese dieser Produkte verwendet werden, können in optisch aktiven Formen vorkommen. Als Ausgangsmaterialien lassen sich sowohl die natürliche Konfiguration (L-Konfiguration) als auch die nichtnatürliche Konfiguration (D-Konfiguration) verwenden.

Die als Ausgangsmaterialien für einige Derivate von A-21978C und die aktivierten Derivate hiervon verwendeten substituierten Benzoesäuren sind entweder bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen nach

an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Die AIkoxybenzoesäuren lassen sich am einfachsten ausgehend von einer entsprechenden Hydroxybenzoesäure herstellen, indem man ein geeignetes Alkylhalogenid mit dem Dinatriumsalz

5 der jeweiligen Hydroxybenzoesäure umsetzt.

Die bei den beschriebenen Verfahren als Ausgangsmaterialien verwendeten Hydroxybenzoesäuren und substituierten Derivate hiervon sind ebenfalls entweder bekannte Verbindüngen oder können unter Anwendung herkömmlicher Methoden hergestellt werden.

Die aus den erfindungsgemäßen Zwischenprodukten hergestellten Derivate, nämlich die Verbindungen der Formeln IV und V, hemmen das Wachstum pathogener Bakterien, wie sich durch übliche biologische Untersuchungsverfahren zeigen läßt. Diese Verbindungen eignen sich daher zur Bekämpfung des Wachstums von Bakterien auf .entsprechenden Oberflächen, nämlich beispielsweise als Antiseptika, oder zur Behandlung von durch Bakterien hervorgerufenen Infektionen. Die antibakterielle Wirksamkeit dieser Verbindungen ist in vitro unter Anwendung des Scheibendiffusionstests auf Agar-Platten und von Agar-Verdünnungsversuchen sowie in vivo durch Versuche an Mäusen ermittelt worden, die mit Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes infiziert worden sind. Die Verbindungen eignen sich vor allem ,zur Behandlung von durch grampositive Organismen hervorgerufenen Infektionen,

Verwendet man ein erfindungsgemäßes A-21978C-Cyclopeptid als antibakterielles Mittel, dann läßt sich dieses entweder oral oder parenteral verabreichen. Die Verabreichung einer Verbindung von A-21978C erfolgt gewöhnlich selbstverständlich.zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel. Die Dosis ,der jeweiligen Verbindung von A-21978C ist abhängig von einer Reihe von Überlegungen, wie beispielsweise der Art und Stärke der zu behandelnden Infektion. Die für eine

Verabreichung geeigneten Dosierungsbereiche und Dosierungseinheiten lassen sichvom Fachmann ohne weiteres unter Zugrundelegung der MIC-Werte und der ED^-Werte sowie der Toxizitätsdaten in Verbindung mit anderen Faktoren ermitteln, wie der Pharmakokinetik, den Merkmalen des Patienten oder Wirts und dem für die Infektion verantwortlichen Mikroorganismus.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert, welche nicht als beschränkend aufzufassen sind.

15 Beispiel 1

Herstellung des Kerns von A-2197 8C

A. Fermentation von Actinoplar.es utahensis

; .; Man stellt eine Vorratskultur von Actinoplanes utahensis.

NRRL 12052 her und hält diese auf einer Agarschräge. Zur Herstel-lung der Schräge verwendet man eines der folgenden Medien: 25

Medium A	Bestandteile	Menge
Vorgekochtes Hafermehl	60,0 g
Hefe	2,5 g
K2HPO4	1/0 g .
Czapek-Mineralmischung*	5,0 ml
Agar	25,0 g
Deionisiertes Wasser σ.	s. auf .1 Liter

Der pH-Wert vor dem Autoklavieren beträgt etwa.5,9. Er wird durch Zugabe von NaOH auf pH 7,2 eingestellt. Nach

- 38 ..] dem Autoklavieren liegt der pH-Wert bei etwa 6,7. .

* Die Czapek-Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung; Bestandteile Menge

5 FeSO₄-7H₂O (gelöst in 2 ml konz. HCl) 2 g KCl 100 g

MgSO₄-7H₂O 100 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Medium B

Bestandteile Menge.

J5 Kartoffeldextrin (Hefeextrakt Enzymhydrolysat von Casein* Rinderextrakt Glucose Maisstärke Fleischpepton Rohrzuckermelasse . 'MgSO.*7H-0

CaCO₃ Czapek-Mineralmischung

Agar

Deionisiertes Wasser q.s.

* N-Z-Amin A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ, ³⁰ V. St.A.

Die, Schräge wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 12052 inokuliert und die inokulierte Schräge etwa 8 bis 10 Tage bei 30⁰C inkubiert. Unter Verwendung von etwa der Hälfte des

- '

Schragenwachstums inokuliert man dann 50 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung:

5,0	g	g
0,5	g	ml
3,0	g	g
0,5	g	auf 1 Liter
12,5	g
5,0	g
5,0	g
2,5	g
0,25 g
1,0
2,0
20,0

- 39 ] Bestandteile Menge

Vorgekochtes Hafermehl 20,0 g

Saccharose 20,0 g

5 Hefe 2,5 g

Getrocknete Kornschlempe* 5,0 g

K₂HPO₄ 1,0 g

Czapek-Mineralmischung 5,0 ml Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Das Ganze wird mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt, wobei der

pH-Wert nach Autoklavieren bei etwa 6,8 liegt.

* National Distillers Products Co., 9 9 Park Ave., New York, NY, V.St.A.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben etwa 7 2 Stunden bei 3 0⁰C auf einem Rotations schüttler inkubiert, der sieh in einem Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm mit 25 0 U/min bewegt.

Das inkubierte vegetative Medium kann direkt zur Inokulierung eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Wahlweise und vorzugsweise bewahrt man dieses vegetative Medium bis zu einem späteren Gebrauch auf, indem man die Kultur in einer Dampfphase aus flüssigem Stickstoff hält. Für eine solche Aufbewahrung füllt man die Kultur in folgender Weise in eine Anzahl kleiner

™ Fläschchen ab: In jedes Fläschchen gibt man 2 ml inkubiertes vegetatives Medium und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung (Cryobiol 10, 364 bis 367 (1973)). Die so gebildeten Suspensionen werden in einer Dampfphase aus flüssigem

Stickstoff aufbewahrt

35

Unter Verwendung einer in dieser Weise hergestellten aufbewahrten Suspension (1 ml) beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe, welches die oben

] beschriebene Zusammensetzung hat. Das inokulierte vegetative Medium der ersten Stufe wird dann in der oben beschriebenen Weise inkubiert.

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum inokuliert man 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium der ersten Stufe hat, mit 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums der ersten Stufe. Das Medium der zweiten TQ Stufe wird in einem 2 1 fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben etwa 48 Stunden bei 3O⁰C.auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der unter einem Bogen von 5 cm Durchmesser mit 250 U/min bewegt wird.

Mit dem in der oben beschriebenen Weise hergestellten inkubierten vegetativen Medium der zweiten Stufe (80 ml) inokuliert man dann 10 1 eines der folgenden sterilen Produktionsmedien:

Medium I

Bestandteile Menge (g/1)

Erdnußmehl 10,0

Lösliches Fleischpepton . · 5,0

Saccharose 20,0

KH₂PO₄ 0,5

K₂HPO₄ 1,2

MgSO₄-7H₂O 0,25

Leitungswasser q.s. auf 1 Liter

Dieses Medium hat nach 45 Minuten langer Sterilisation durch Autoklavierung bei 121⁰C unter einem Druck von etwa 1,1 bis 1,3 bar einen pH-Wert von etwa 6,9.

- 41 Medium II

Bestandteile Menge (g/l)

5 Saccharose 30,0

Pepton 5,0

K₂HPO₄ 1,0

KCl 0,5

MgSO₄-7H0 0,5

in ¹ FeS0.-7H_0 0,002

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Das Ganze wird mit HCl auf einen pH-Wert von 7,0 ein- ^5 gestellt, wobei der pH-Wert nach Autoklavierung bei etwa 7,0 liegt.

	Medium III	Menge (g/l)
Bestandteile		20,0
Glucose		3,0
NH4Cl		2,0
Na2SO4		0,019
ZnCl2		0,304
MgCl-*6H-0		0,062
FeCl3-6H2O		0,035
MnCl2-4H2O		' 0,005
CuCl2-2H2O		6,0 .
CaCO3		0,67
KH2PO4*		q.s. auf 1 Liter
Leitungswasser

* Getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Am Ende liegt der pH-Wert, bei etwa 6,6.

] Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 14 1 fassenden Fermentationsgefäß etwa 66 Stunden bei einer Temperatur von etwa 30°C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mittels herkömmlicher Rührer bei einer Geschwindigkeit von etwa 60 0 Ü/min gerührt und mit steriler Luft so belüftet, daß die gelöste Menge an Sauerstoff auf über 30 % an Luftsättigung bei atmosphärischem Druck gehalten wird.

in B- Deacylierunq von A-21978C

Man fermentiert Actinoplanes utahensis unter Anwendung des im Abschnitt A. beschriebenen Verfahrens und Einsatz des Mediums A für die Schräge und des Produktionsmediums ι r I, wobei man das Produktionsmedium etwa 67 Stunden inkubiert. Roher A-21978C-Komplex (100 g) wird zu dem Fermentationsmedium zugesetzt.

Die Deacylierung des Komplexes von A-21978C wird durch on Untersuchung gegenüber Micrococcus luteus überwacht.. Man läßt- die Fermentation bis zur vollständigen Deacylierung weiterlaufen-, die" sich durch ein Verschwinden der Aktivität gegenüber Micrococcus luteus äußert, was nach einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden der Fall. ist.

Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wird auch bestimmt, ob ein anderer Mikroorganismus den gewünschten Kern von A-21978C produziert. Der gewünschte Kern wird vor allem auch durch Actinoplanes missouriensis NRRL 12053, Actinoplanes sp. NRRL 8122, Actinoplanes sp.

NRRL 12065 und Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064 gebildet, wie der Einsatz dieser Mikroorganismen anstelle .von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 bei dem obigen Verfahren gezeigt hat. Durch HP.LC-Vergleich unter Verwendung authentischer Proben des nach diesem Verfahren unter Einsatz von Actinoplanes utahensis als Deacylierungsenzym erhaltenen Kerns wird bestätigt, daß diese weiteren Mikroorganismen ebenfalls den Kern von A-21978C bilden. -

- 43 1 ^C* Isolierung des Kerns von A-2197 8C

Die in der im Abschnitt B beschriebenen Weise erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (20 1) wird unter Ver-Wendung einer Filterhilfe {Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.) filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das erhaltene Filtrat wird durch eine Säule geführt, die 1,5 1 HP-20-Harz enthält (DIAION Hochporöses Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japan). Der dabei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann zur Entfernung restlicher filtrierter Brühe mit deionisiertem Wasser (10 1) gewaschen. Das dabei anfallende Waschwasser wird ebenfalls verworfen. Sodann eluiert man die Säule mit Gemischen aus Wasser und Acetonitril (jeweils "10 1 in Verhältnissen von 95 : 5, 9 : 1 und 4 : 1), wobei man Fraktionen von jeweils 1 1 auffängt.

Die Elution wird durch analytische HPLC unter Einsatz von Siliciumdioxidgel-C.^ und eines Lösungsmittelsystems aus Wasser und Methanol,(3 : 1), das 0,1 % Ammoniumacetat enthält, und Detektion des Kerns mit einem UV-Monitor bei 254 nm überwacht. Die Fraktionen, die den Kern enthalten, werden.vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Acetonitrils eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 40,6 g halbgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

D. Reinigung des Kerns von A-21978C

Man löst den gemäß obigem Abschnitt C erhaltenen halbgereinigten Kern von A-21978C (15 g)in75 ml eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (82 : 10 : 8), das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält. Die Lösung wird in eine 4,7 χ 192 cm messende Säule gepumpt, die 3,33 1 Siliciumdioxidgel-C.jg enthält (Quantum LP-D . Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelsystem entwickelt. Es werden Fraktionen

mit einem Volumen von jeweils 350 ml gesammelt. Die Auftrennung wird bei 280 nm mit einem UV-Monitor überwacht. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung der Lösungsmittel eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 5,2 g gereinigtem Kern von A-21978.C gelangt.

Be. ispiel-2 Anderes Verfahren zur Herstellung des Kerns von A-21978C

Der Kern von A-21978C wird nach dem im

Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit Ausnahme bestimmter Änderungen im Abschnitt B hergestellt. Die Kultur von Actinoplanes utahensis wird zuerst etwa 48 Stunden inkubiert. Das Substrat ist ein halbgereinigter Komplex von A-21978C (50 g). Nach Zusatz des Substrats wird etwa 16 Stunden.inkubiert. Die filtrierte Brühe wird durch eine Säule geführt, die 3,1 1 HP-20-Harz enthält.

Die ^äule wird mit, 10 Volumina Wasser gewaschen und ,dann mit einem Gemisch aus Wasser und Acetonitril (95 : 5) eluiert. Die Elution wird wie beim Herstellungsbeispiel 1 überwacht. Nach Sammeln von 24 1 Eluat wird, weiter unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches

^AJ aus Wasser und Acetronitril (9 : 1) eluiert. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Die dabei anfallenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung von Acetonitril eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 24,3 g

halbgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

Dieser halbgereinigte Kern von A-21978C \(24,3 g) wird in Wasser (400 ml) gelöst. Die Lösung wird in eine 4,7 χ 192 cm messende Stahlsäule gepumpt, die 3,33 1 SiIi-

ciumdioxidgel-C. g (Quantum LP-1). enthält, das in einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (8 :1 : 1) zubereitet ist, welches 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungs-

mittelgenisch bei einem Druck von etwa 136 bar entwickelt, wobei man Fraktionen mit jeweils 350 ml sammelt. Die Elution wird durch UV-Licht bei 280 nm . überwacht. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung der Lösungsmittel eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 14 g hochgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

Beispiel3

Herstellung der Faktoren C- und C- von N -t-BOC-A-21978C -

Ein gemäß US-PS 4 208 403 hergestelltes Gemisch der 1'5 Faktoren C_ und C₃ von A-21978C (10 g) wird unter Beschallung (200 mg/ml) in Wasser (50 ml) gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird von 4,05 durch Zugabe von 5n NaOH (3,6 ml) auf 9,5 eingestellt. Man gibt Di-tbutyldicarbonat (3,0 ml) zu und rührt das Reaktionsge-

misch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch manuelle Zugabe von 5n NaOH (6,5 ml werden innerhalb von 2 Stunden zugesetzt) auf 9,5 gehalten.

Die Reaktion wird periodisch durch TLC über Siliciumdioxidgel unter Anwendung eines Losungsmittelsystems aus CH₃CN und H.O ( UV-Licht überwacht.

aus CH₃CN und H.O (7 : 3 und 8:2) und Detektion durch

Nach etwa 10 Minuten trübt sich die Reaktionslösung

rasch ein und erhöht sich der Verbrauch an Base. Nach etwa 3 0 Minuten erniedrigt sich die Geschwindigkeit der Erhöhung der Eintrübung und des Verbrauchs an Base, was „ die Beendigung der Reaktion anzeigt. Unabhängig davon wird die Reaktion zur Sicherstellung ihrer Beendigung jedoch noch weitere 90 Minuten fortgeführt. Am Ende der zweistündigen Umsetzungszeit wird das Reaktionsmaterial sofort lyophilisiert,. wodurch man zu 12,7 g der Faktoren

C- und C- von N -t-BOC-A-219 78 gelangt. 2 3 Orn .

Unter Anwendung ähnlicher Verfahren führt man auch zwei Reaktionen mit 10 g Material und eine Reaktion mit 30 g Material durch. Bei jeder dieser Reaktionen beträgt die Umsetzungszeit nur 40 Minuten. Die zwei Versuche mit 10 g Material führen zu 10,9 g bzw. zu 12,1 g Produkt. Die Umsetzung mit 30 g Material ergibt 35,4 g Produkt.

B e i s ρ " i e 1 4

Herstellung des Kerns von A-21978C-N. -t-BOC

Orn

A. Fermentation von Actinoplanes utahensis

Man fermentiert Actinoplanes utahensis nach dem im Beispiel 1 unter Abschnitt A beschriebenen

Verfahren unter Verwendung des schrägen Mediums A und des Produktionsmediums I, wobei man das Produktionsmedium.etwa 66 Stunden inkubiert. ;

B. Deacylierung des Komplexes von N_Q -t-BOC-A-21978C ~~~

Der Komplex von A-21978C-N. -t-BOC {1185 g an rohem

orn

Substrat, das etwa 176 g Komplex an A-21978C enthält) wird zum Fermentationsmedium gegeben. Die Deacylierung

wird wie beim Beisoiel 1 im Abschnitt B

beschrieben durchgeführt. Die Deacylierung ist aufgrund

einer.HPLC nach etwa 24 Stunden beendet.

' C. Isolierung des Kernsvon A-21978C-N -t-BOC

35 ; ] ^Orn

Die gemäß Abschnitt B erhaltene Fermentationsbrühe (100 1) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo.

] Super-Cel) filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule geführt, die 7,5 1 HP-20-Harz (DIAION) enthält, und die Säule wird mit Wasser (38 1) gewaschen. Die Elution wird durch Siliciumdioxidgel-C. „-HPLC unter UV-Detektion bei 254 nm überwacht. Mit der Waschflüssigkeit wird eine gewisse Menge an Kern eluiert. Die anschließende eigentliche Elution des Kerns wird unter Verwendung folgender Gemische aus Wasser und Acetonitril durchgeführt:

♦ .

40 1 (95 : 5), 40 1 (9 : 1) und 100 1 (85 : 15). Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 298,5 g halbgereinigtem Kern von A-21978C-N^ -t-BOC gelangt.

D. Reinigung des Kerns von A-21978C-N -t-BOC

Der nach. Abschnitt C erhaltene halbgereinigte Kern von A-21978C-N -t-BOC (30 g) wird in einem Gemisch aus Wasser und Acetonitril (9 : 1) gelöst, das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält (75 ml). Die Lösung wird auf eine 4,7 χ 192 cm messende Stahlsäule gegeben, die 3,33 1 Siliciumdioxidgel-C.ο (Quantum LP-1) enthält, das mit dem gleichen Lösungsmittelsystem äquilibriert worden ist. Die Säule wird unter Druck mit einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Acetonitril und Methanol (80 : 15:5) entwickelt, das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält, wobei man Fraktionen von jeweils 350 ml sammelt

^ou und die Detektion des Produkts durch UV-Licht bei 280 nm durchführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 18,4 g des gereinigten Kerns von A-21 t-BOC gelangt.

- 48 1' Beispiel 5

Andere Reinigung des Kerns von A-21978C-N -t-BOC

5 Man löst den nach dem Beispiel 4, Abschnitt

C, erhaltenen halbgereinigten Kern von A-21978C-NL· -t-BOC (10,8 g) in Wasser und gibt die Lösung auf eine Säule, die 80· ml Amberlit IRA-68 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA, V.St.A-, Acetatcyclus) enthält. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und bei einer Fließgeschwindigkeit, von 5 ml/min der Reihe nach zuerst mit 0,05n Essigsäure (1080 ml), dann mit 0,1n Essigsäure (840 ml)· und schließlich mit 0,2n Essigsäure (3120 ml) eluiert, wobei man Fraktionen von jeweils 120 ml sammelt.

Die Säule wird durch analytische HPLC über Siliciumdioxidgel-C.Q überwacht, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Wasser, Acetonitril und Methanol (80 : 15 : 5) verwendet wird, das 0,2 % Ammoniumacetat enthält, und die Detektion des Produkts durch UV-Licht bei 254 nm

vorgenommen wird. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Pyridin auf 5,8 eingestellt. Die Lösung wird dann unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt.

Das Konzentrat wird mit Wasser versetzt und die erhal-

tene Lösung zur Entfernung von Pyridin erneut konzentriert. Dieses Konzentrat wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 3 gelangt.

man zu 3,46 g gereinigtem Kern von A-21978C-N -t-BOC

- 49 1 Beispiel 6

Das folgende Verfahren zeigt die Herstellung von Verbindungen der Formel IV nach der Methode über einen aktiven Ester. Im einzelnen werden hiernach Verbindungen der Formel IV hergestellt, worin R für CH-(CH₀KCO- (n-Decanoyl) steht, R Wa stoff steht.

1 2

steht, R Wasserstoff ist und R für t-BOC oder Wasser-

10 N,_Tr -(n-Decanoyl) A-21978C-Kern

A. Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat

Eine Lösung von Decanoylchlorid (5,6 ml) und 2,4,5-Trichlorphenol (5,6 g) in Diethylether (1 Liter) und Pyridin (120 ml·) wird 4*Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum getrocknet. Das 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat wird in einer mit Siliciumdioxidgel gefüllten Säule (Woelm) unter Verwendung von To-

luol als Eluiermittel gereinigt. Die Fraktionen werden durch TLC unter Verwendung von kurzwelligem UV-Licht zur Detektion überwacht. Die geeigneten Fraktionen werden zusammengefaßt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu

10,4 g 2,4,5-Trichlorphenvl-n-decanoat gelangt. 25

B. Acylierung von N -t-BOC-A-21978C-Kern mit 2, 4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat _:

Eine Lösung von N -t-BOC-A-21978C-Kern (15,0 g) und JU

2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat (15,0 g) in trockenem DMF (500 ml) wird unter Stickstoff bei Umgebungstemperatur 25 Stunden gerührt. Das Gemisch wird dann 5 Stunden bei 60⁰C so lange gerührt, bis sich im TLC die Beendigung der Reaktion zeigt. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum auf etwa 200 ml eingeengt und mit 1,2 1 eines Gemisches aus Diethylether und Toluol (5 : 1) gerührt. Das Produkt wird durch Filtration abgetrennt, mit Diethyl-

ether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 15,05 g des N -(n-Decanoyl)-N_Orn-t-BOC-A-21978C-Kernzwischenprodukts (Formel IV: R= n-Decanoyl, R = H,

R² = t-BOC) erhält.

C. Reinigung von ISL· -(n-Decanoyl)-N_Q -t-BOC-A-21978C-Kern

Das N -(n-Decanoyl)-N -t-BOC-A-21978C-Kernzwischenprodukt wird in folgender Weise gereinigt. Die rohe Präparation wird in etwa 50 ml des zur Eluierung verwendeten Lösungsmittel systems gelöst und dann durch HPLC unter Verwendung des Waters Prep 500'Systems, das eine mit Umkehrphasen-C,Q-Siliciumdioxidgel als Adsorbens gefüllte Patrone enthält, gereinigt. Das System wird mit Ή O :

MeOH : CH₃CN (50 : 15 : 35), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält, eluiert. Die Fraktionen werden durch UV-Licht bei 280 nm überwacht.Die geeigneten Fraktionen werden zusammengefaßt und unter Vakuum getrocknet, wodurch 20, man zu 8,56 g gereinigtem N -(n-Decanoyl)-N -t-BOC-A-21 9 78C-Kern -gelangt . - .

D. Entfernung der N₀ -t-BOC-Gruppe

zur Entfernung der t-BOC-Gruppe rührt man eine Lösung von

ISL -(n-Decanoyl);-N_n -t-BOC-A-21978C-Kern (1,47 g) in Xo-M urn

15 ml eines Gemisches aus Trifluoressigsäure und 1,2-Ethandithiol (10 : I) 3 Minuten bei Umgebungstemperatur. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum getrocknet und der Rückstand mit Diethylether (50 ml) behandelt. Das behandelte Produkt wird nach Waschen mit 20 ml Diethylether erneut unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 2,59 g rohem N ' -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern (Formel IV: R = n-

P 1 ' 2 Decanoyl, R und R = H) gelangt.

- 51 1 E. Reinigung von N -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern

Der rohe N -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern wird in folgender Weise durch Ümkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Probe (2,59 g) wird in Form einer Lösung in 4,0 ml eines Gemisches aus H₂O : MeOH : CH₃CN :.Pyridin ·. HOAc (50 : 15 : 35 : 2 : 2) in eine 2,5 χ 83 cm messende Säule aus rostfreiem Stahl eingespritzt, die mit LP-l/C,_o als Adsor-

1 O

bens gefüllt ist. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelsystem eluiert. Die Elution wird bei einem Druck von 83 bis 117 bar und unter einer Fließgeschwindigkeit von 10 bis 12 ml/min unter Verwendung einer LDC-Duplexpumpe (Milton Roy) durchgeführt. Der Säulenabstrom wird mit einem UV-Detektor (Isco Modell UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior. Avenue, Lincoln, Nebraska 68504) bei 280 nm überwacht. Alle 2 Minuten werden Fraktionen (20 bis 24 ml) gesammelt. Die gewünschten Fraktionen, was sich durch eine antimikrobielle Wirksamkeit zeigt, werden vereinigt und unter Vakuum Getrocknet, wo-

durch man zu 1,05 g Produkt gelangt.

Dieses Reinigungsverfahren wird unter Verwendung von 4,35 g, 4,25 g, 2,14 g, 2,00 g und 1,75 g rohem Ausgangsderivat wiederholt, wodurch man insgesamt 5,58 g gereinig-

ten N_Tr -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern erhält. Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Verbindungen der Formel V. Nach diesem Verfahren werden Verbindungen der Formel V hergestellt, worin R für N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl und R für t-BOC oder Wasserstoff stehen.

Herstellung von N_m -/N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl/-

irp -

A-21978C-Kern _;

A. Herstellung von N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl-2,4,5-5'. Trichlorphenolat

Eine Lösung von N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanin (31,9 g, 0,1 Mol) und 2,4,5-Trichlorphenol (19,7 g, 0,1 Mol) in 1 Liter wasserfreiem Ether wird mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (20,6 g, 0,1 Mol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene N,N¹-Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und verworfen. Das FiItrat wird unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit Ether behandelt, und die Feststoffe (restlicher Cyclohexylharnstoff) werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Acetonitril umkristallisiert, wodurch man zu 36,9 g kristallinem N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl-2,4,5-trichlorphenolat gelangt, das bei 122'bis 124⁰C schmilzt.

B. Herstellung von N -/N-(n-Decanoyl)-L-ohenylalanyl/-

irp -

N_n -t-BOC-A-21978C-Kern

Grn

Eine Lösung von N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl-2,4,5-trichlorphenolat (10 g, 0,02 MoIO und N_Orn-t-BOC-A-21978C-Kern (10 g, 0,006 Mol) in wasserfreiem DMF (1 Liter) wird unter Stickstoffatmosphäre 96 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Das zurückbleibende Material wird 2 Stunden mit einem Gemisch aus Diethylether (800 ml I und Chloroform (200 ml) gerührt. Das Produkt wird durch Filtration abgetrennt, wodurch man zu einem hellbraunen Pulver (10,3 g) gelangt.. Dieses Material (9,9g) wird in Methanol (200 ml) gelöst und durch präparative HPLC unter Verwendung einer Prep LC/System 500-Einheit und einer PrepPak-500/C-, _O-Säule als stationäre Phase gereinigt. Die

IO

Säule wird isokratisch unter Verwendung eines Lösungsmit-

telsystems aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1: 2) und Auffangen von 250 ml-Fraktiönen unter einer Geschwindigkeit von einer Fraktion pro Minute eluiert. Die gewünschte Verbindung wird in den Fraktionen 9 bis 22

5 eluiert.

Die Fraktionen werden auf Basis des TLC vereinigt (Umkehrphasensiliciumdioxidgel/C, „, Entwicklung mit einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (3 : 3 : 4), Detektion mit Van Urk-Sprühmittel). Die vereinigten Fraktionen werden durch Bioautographie (TLC mit Siliciumdioxidgel unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Acetonitril, Aceton und Wasser (2 : 2 : 1) und Einsatz von Micrococcus luteus als Detektionsorganismus) untersucht, wodurch sich ergibt, daß sie aus einer einzigen bioaktiven Komponente bestehen. Dieses Verfahren ergibt 6,0 2 g an N -/N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl/-N_n -t-BOC-A-21978C-Kern (Verbindung der Formel V: R = N-(n-De-

canoyl-L-phenylalanyl), R = t-BOC

C. Herstellung von N -/N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl/-A-21978C-Kern

Ein Kolben (100 ml) wird in einem Eisbad auf 5 C gekühlt.

Der Kolben wird zuerst mit N -/N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl7-N_Orn-t-BOC-A-21978C-Kern (6,02 g, 0,008 Mol), welches gemäß obigem Abschnitt B. hergestellt worden^ ist, und dann mit wasserfreier Trifluoressigsäure, die 2 % Anisol (50 ml) enthält, versetzt. Das Gemisch, das innerhalb von etwa 2 Minuten in Lösung geht, wird' 10 Minuten unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wird unter verringertem Druck bei einer Temperatur von unter 4O⁰C zur Trockne eingedampft, wodurch man zu einem gummiartigen Feststoff gelangt, den man zweimal mit einer Lösung aus Diethylether und Dichlormethan (4 : .1) (zweimal jeweils 100 ml) behandelt. Dia Feststoffe werden durch Filtration gesammelt und mit Diethylether gewaschen, wodurch man zum TFA-SaIz gelangt. Dieses Salz löst man in Wasser

(50 ml) und stellt den pH-Wert der Lösung mit Pyridin auf 5,4 ein. Die Lösung wird dann lyophilisiert, wodurch man 6,1 g weißliches Lyophilisat erhält.

Das Lyophilisat wird in Methanol (35 ml) gelöst und mittels einer Urnkehrphasen-C,_O-Siliciumdioxidgel-Säule (Waters Associates, Prep 500) gereinigt, wobei man unter einem stufenweisen Gradienten mit einem Lösungsmittelgemisch aus H„0 : CH^OH : CH-CN, das 0,1 % Pyridiniumacetat enthält, unter Verhältnissen von 3:1:2,2:1:2 und 1:2:2 eluiert und dabei Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 250 ml sammelt. Das gewünschte Produkt wird während der 2 : 1 : 2 -Elution eluiert. Die das. Produkt enthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert, wodurch man

]5 zu 2,23 g cremefarbenem N -/N-(n-Decanoyl)-L-phenylalanyl7-A-21978C-Kern (Verbindung der Formel V: R = N-(n-Decanoyl ) -L-ph'enylalanyl , R = H) gelangt.

Zur Beurteilung untersucht man das Produkt durch analytisehe HPLC.(Umkehrphasen-C,„-Siliciumdioxidgel-Säule, Lö-

^AV Io

sungsimittel gemisch aus MeOH : .CH-CN : H_0 : PyOAc (15 :

35 : 49 : 1), ÜV-Detektion bei 230. nm), durch TLC (Umkehrphasen-C,--Siliciumdioxidgel-Platten (Whatman), Lösungsmittelgemisch aus HO : CH-OH : CH CN (3 : 3 : 4), Detektion durch Besprühung mit Van Urk-Sprühmittel und durch kurzwelliges UV-Licht) und durch Bioautographie (TLC mit Siliciumdioxidgel (Merck), Lösungsmittelgemisch aus H-O : CH₃CN : Aceton (1 : 2 : 2), Detektionsorganismus Micrococcus luteus).Jedes dieser Verfahren zeigt, daß das Produkt homogen ist. Eine Substitution an der N-terminalen Stellung des Tryptophans wird durch 360 MHz PMR bestätigt. Durch eine Aminosäureanalyse wird die Einführung von einem Äquivalent L-Pheny!alanin in das Produkt bestätigt. .

Beispiel 8.

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung anderer Ver-

bindungen der Formel V. Nach diesem Verfahren werden solche Verbindungen der Formel V hergestellt, worin R für p-(η-Dodecyloxy stoff bedeutet.

p-(n-Dodecyloxy)benzoyl steht und R t-BOC oder Wasser-

A. Herstellung von N -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-N t-BOC-A-219 78C-Kern

Eine Lösung von p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-2,4,5-trichlorphenolat (0,9 g, Mol), A-21978C-t-BOC-Kern (0,9 g, Mol) in 400 ml wasserfreiem Dimethylformamid wird 120 Stunden unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel durch Verdampfen unter verringertem Druck entfernt. Das zurückbleibende Material wird 2 Stunden mit einem Gemisch aus Diethylether (400 ml) und Chloroform (400 ml) gerührt. Das Produkt wird durch Filtration abgetrennt und getrocknet, wodurch man zu einem hellbraunen Pulver (0,962 g) gelangt. Ein Teil dieses Materials (0,78 g) wird in Methanol (200 ml) gelöst und durch präparative HPLC unter Verwendung einer Prep LC/System 500-Einheit (Waters Associates, Inc. MiIford, Mass.) und einer Prep Pak-500/C-, _O-Säule (Waters Associates) als

i O

stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird isokratisch unter Einsatz eines Lösungsmittelsystems aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2 : 1 : 2) und Sammeln von 250 ml-Fraktionen (eine Fraktion pro Minute) betrieben. Die gewünschte Verbindung wird in den Fraktionen 2 bis 6 eluiert.

Die Fraktionen werden auf Basis des TLC vereinigt (Umkehrphasen/C,„-Siliciumdioxidgel, Entwicklung mit einem

i O

Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (3 : 3 : 4), Detektion durch Besprühen mit Van ürk-Sprühmittel). Durch Bioautographie der vereinigten Fraktionen unter Anwendung einer TLC über Siliciumdioxidgel, eines Lösungsmittelsystems aus Acetonitril, Aceton und Wasser (2 : 2 : 1) und Einsatz von Staphylococcus aureus als Detektionsorganismus ergibt sich, daß das Produkt aus einer einzigen bio-

aktiven Komponente besteht. Durch dieses Verfahren gelangt man zu 0,421 g N -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-N_Q -t-BOC-A-21978C-Kern.

B. Herstellung von N -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-A-21978C-

Kern · ' .

Man löst N_Tr -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-N_0rn-t-BOC-A-21978C-Kern (230 mg) in 5 ml Trifluoressigsäure, die 2 % Anisol enthält, und rührt die Lösung 5 Minuten bei 0⁰C. Die Lösung wird unter Vakuum zu einem Öl eingeengt und das Öl mit Diethylether (100 ml) behandelt. Die Feststoffe, werden abgetrennt, an der Luft getrocknet und in Wasser (10 ml) aufgenommen. Der pH-Wert dieser Lösung wird durch Zugabe von Pyridin von 3,25 auf 7 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird lyophilisiert, wodurch man zu 179 mg weißem amorphem N_ -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-A-21978C-Kern gelangt. Diese Verbindung hat im TLC über Siliciumdioxidgel einen R^-Wert von etwa 0,78, und zwar bei Anwendung eines Lösungsmittelsystems aus Acetonitril, Aceton und Wasser (2: 2 : 1) und Detektion.durch Besprühen mit-Van Urk-Sprühmittel. .

Beispiel 9

Die antibakteriell Wirksamkeit der Verbindungen der Formeln IV und V läßt sich in vitro durch Scheibendiffusionstests auf Agar-Platten und durch Agar-Verdünnungstests sowie in vivo durch übliche Tests an Mäusen zeigen, die eine Wirksamkeit gegenüber einer systemischen Bakterieninfektion belegen. Die bei der Untersuchung typischer Verbindungen der Formeln IV und V auf ihre antibakterielle Wirksamkeit erhaltenen Ergebnisse gehen aus den folgenden Tabellen I, II und III hervor. '35 · . 'Ζ ' . .. .

Die Tabelle I zeigt die Versuchsergebnisse bei der in vitro—Untersuchung der Verbindungen der Beispiele 6 bis 8 unter Anwendung des Scheibendiffusionstests auf Agar-Plat-

- 57 1 ten.

Die Tabelle II zeigt die bei der Untersuchung der Verbindungen der Beispiele 6 bis 8 unter Anwendung des üblichen Agar-Verdünnungstests erhaltenen Ergebnisse. In dieser Tabelle II ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC-Werte) gemessen, nämlich die niedrigste Konzentration der Verbindung, die das Wachstum des Mikroorganismus hemmt.

Die bei den in vivo-Tests zur Ermittlung der Wirksamkeit.

der Derivate gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen an Mäusen erhaltenen Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor. Bei diesen Versuchen verabreicht man Mäusen mit den gezeigten Infektionen subkutan oder oral zwei Dosen der zu untersuchenden Verbindung. Die beobachtete Wirksamkeit wird in Form der ED '.,-Werte gemessen (wirksame Dosis in mg/kg, die einen Schutz von 50 % der Versuchstiere ergibt) (J. Bacteriol. 81,233 bis

20 23 5 (1961)).

Die Toxizität typischer Verbindungen der Formeln IV und «V gehen aus der Tabelle IV hervor.

TABELIiE.-I'

Antibakterielle Wirksamkeit von Verbindungen der Formel I nach dem Scheibendiffusionstest

auf Agar-Platten

Verbindung	Bei spiel Nr.	For mel Nr.	N -Substituent S	Größe	der Hemmzonen (mm)	Mierococcus luteus ATCC 9341	Bacillus sub- tilis , ATCC 6633
6 7 8	IV V V	CH3(CH2)8C0- (L)CT3(CH2)gCONHCH(CH2G6H5)CO- CH3(CH2)11O-/ ^-CO-	Staphylococcus aureus ATCC 6738P	Bacillus sub til is ATCC 6633	22 24 18	29 31 20
24 30 0	40 2 2 13

^aDie jeweiligen Verbindungen sind in Wasser in einer Konzentration von. 1 mg/ml suspendiert In die Suspension wird eine 7 mm große Scheibe getaucht, die man dann auf die Agar-Ober-

fläche legt. Es wird 24 bis 48 Stunden bei 25 bis 37°C inkubiert. Auf Minimalnähragar gewachsen

TABELLE II Antibakterielle Wirksamkeit nach dem Agar-Verdünnungsversuch

Versuchsorganismen

MTC-Werte der untersuchten Verbindungen' 6^d 7^e 8

Staphylococcus aureus Xl.1 Staphylococcus aureus V41 Staphylococcus aureus X400 Staphylococcus aureus S13E Staphylococcus epidermidis EPIl Staphylococcus epidermidis EPI2 Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumoniae Park I Streptococcus Gruppe D X66 Streptococcus Gruppe 9960

1,	0,5	0,5
1,	0,5	0,5
2,	1	1
1,	0,5	0,5
2,	1	1
1/.	0,5	0,5
0,	25, 0,125	0,25
1,	0,5	0,5
16	, 16	8
2,	2	2

1 1

0,2 0,015

MIC-Werte in μg/ml, Nummer der Verbindung = Beispielsnummer

Penicillinresistenter Stamm

Methicillinresistenter Stamm Zwei Versuche

Mittelwert aus drei Versuchen

TABELLE III

In vivo-Wirksamkeit von A-21978C-Cyclopeptiden

	For mel Nr.	Verbindung	ED -Werte a	Streptococcus pyogenes subkutan oral
Bei spiel Nr.	IV	Nm -Substituent Trp	Staphylococcus aureus subkutan	0,0 3 66
6	V	CH3(CH2)8C0-	0,28	0,39 >200
7	V	(L)CH^ (CH0 )oC0NHCH(CH„C,H1- )C0-	0,7, 0,98b	0,31 >200
8	CH3 (CH2 J110-<^Γ^>-CO	. 3,35

mg/kg x 2 Zwei Versuche

TABELLE IV

Toxizität von A-21978C-Cyclopeptiden

Verbindung

Bei- Forspiel rnel Nr. Nr.

N _ -Substituent LD »-Werte (mg/kg) an der Maus

IV

CH-, (CH₀) „CO-

V (L)CH (CH₂J₈CONHCH(CH₂C₆H )CO- > 300 600

8 V CH₃ (CH₂

-/Λ-ΓΠ-

CO-67,5

Intravenös verabreicht

Claims (13)

1. Erfindunqsansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptidderivaten der Formel CI-)

   . ü l\ S

   HOs(Z

   worin R Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C,„-Alkanoylgruppe des Faktors C_n von A-21978C oder die speziellen C₁_-Alkanoylgruppen der Faktoren C. und C^

   1 " von A-21978C bedeutet und R und R unabhängig Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe darstellen, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Substituenten R und R für eine Aminoschutzgruppe stehen muß, falls R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe hat, oder von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen hiervon,

   dadurch

   κ e η η ζ

   i c h η e t

   da 3 man

   .a)' eine öder mehrere der Aminogruppen NHR, NHR «und

   2 NHR schützt und hierdurch eine Verbindung der For-

   mel (I) herstellt, in der ein oder mehr Substituen-

   1 2
   ten R, R und R eine Aminoschutzgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, daß einer oder mehrere der Substi-

   1 2

   tuenten R, R und R ursprünglich Wasserstoff sind,

   5 und/oder

   (b) eine Verbindung der Formel (I), worin R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Amirogruppe hat, deacyliert und hierdurch eine Verbindung der Formel (I) herstellt, worin R Wasserstoff ist, und wahlweise gewünschtenfalls im Reaktionsprodukt vor-

   1 2 handene Aminoschutzgruppen R oder R entfernt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Deacylierung auf die jeweilige Verbindung der Formel (I) in einem wäßrigen Medium so lange ein durch einen Mikroorganismus aus der Familie Actinoplanaceae gebildetes deacylierendes Enzym einwirken läßt, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. .
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus aus der Familie Actinoplanaceae einen Vertreter des Genus Actinoplanes verwendet.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Actinoplanes utahensis verwendet.

   30 5. Verfahren nach Punkt 3, dadurch ge

   kennzeichnet , daß man als Mikroorganismus . Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder eine Mutante oder Variante hiervon verwendet.

   35 6. Verfahren nach Punkt 3, dadurch ge

   kennzeichnet , daß man als Mikroorganismus Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064 oder eine Mutante oder Variante hiervon verwendet.
5. 7. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus Actinoplanes missouriensis NRRL 1205 3 oder eine Mutante oder Variante hiervon verwendet.
6. 8. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 12065 oder eine Mutante oder Variante hiervon verwendet.
7. 9. Verfahren nach Punkt 3,-dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus. Actinoplanes sp. NRRL 8122 oder eine Mutante oder Variante hiervon verwendet.
8. 10. Verfahren nach Punkt 2, 3, 4, 5, 6, 7, -8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Enzym arbeitet, das in einer Kultur des produzierenden Mikroorganismus von Actinoplanaceae vorhanden

   20 ist.
9. 11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin R Wasserstoff ist, oder ein pharmazeutisch

   25 unbedenkliches Salz hiervon herstellt.
10. 12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin R Wasserstoff ist, oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon herstellt.
11. 13. Verfahren nach Punkt 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet , daß man Verbindungen, worin

    2
    R Wasserstoff ist, oder ein

    35 ches Salz hiervon herstellt.

    R Wasserstoff ist, oder ein pharmazeutisch unbedenkli-
12. 14. Verfahren nach Punkt 11 oder 12, d a d u r c h ge k e η η ζ e i c h η e t , daß man Verbindungen,worin

    - 65 -

    R eine Aminoschutzgruppe ist, oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon herstellt.
13. 15. Verfahren nach Punkt 11, 13 oder 14, d a -

    durch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin R eine Aminoschutzgruppe ist, oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon herstellt.