KR860001285B1 - A-21978c 사이클릭 펩타이드 유도체의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

A-21978C 사이클릭 펩타이드 유도체의 제조 방법

제1도는 A-21978C 핵[일반식(1)에서 R, R¹, R²=H]의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr법)에 관한 도.

제2도는 A-21978C Norn-t-BOC 핵[일반식(1)에서 R 및 R¹=H이고, R²=3급 부틸옥시카보닐이다]의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr법)에 관한 도.

본 발명은 항생물질로 유용한 하기 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드의 신규 유도체 또는 이의 약제학적으로 무독한 염의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서

R은 수소, 아미노보호그룹, 8-메틸데카노일, 10-메틸운데카노일, 10-메틸도데카노일, A-21978C인자 C₀의 특정 C₁₀-알칼노일 그룹 또는 A-21978C인자 C₄및 C₅의 특정 C₁₂-알카노일 그룹이고,

R¹및 R²는 독립적으로 수소 또는 아미노 보호 그룹이며, 단, R이 수소 또는 아미노 보호그룹이 아닌 경우에, R¹및 R²중 적어도 하나는 아미노 보호그룹이어야 한다.

병원 미생물의 항생제-특이성 내성 균주가 발현될 가능성이 매우 높고, 항상 그러한 염려가 있으므로 신규의 항생제를 개발해야 할 필요성이 크게 대두되었다. 특히 그람 양성 스타필로코커스(Staphylococcus)및 스트렙토코커스(Streptococcus)속의 병원균은 페니실린 및 에리트로마이신과 같은 상용 항생제에 대해 빈번히 내성을 나타낸다[참조 W.O. Foye, Principles of medicinal Chemistry, pp684-686(1974)].

본 발명에 따른 A-21978C 사이클릭 펩타이드의 신규유도체 및 그의 약제학적으로 무독한 염은 유효한 약제로 판명되었다.

이들 신규 유도체는 적절히 차단된 A-21978C 복합체 또는 적절히 차단된 개개의 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄또는 C₅를 탈아실화하여 제조된 A-21978C 핵 또는 그의 보호된 유도체를 바람직한 아실화제 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따르는 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 무독한 염은 반합성항균제 제조시의 중간체로서 유용된다.

R이 수소 또는 아미노 보호그룹이 아닌 일반식(1)의 화합물은 차단된 항생물질 A-21978C인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅이다. 이들 차단된 항생물질은 R이 수소이고 R¹및 R²중 적어도 하나는 아미노 보호그룹인 일반식(1)의 특성 펩타이드의 중간체로 유용하다.

R, R¹및 R²가 각각 수소인 일반식(1)의 화합물은 항생물질 A-21978C인자, C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅에 존재하는 통상의 사이클릭 펩타이드이며, 편의상 이 화합물을 A-21978C 핵으로 칭하고, 일반식(2)로 표시할 수 있다 :

상기식에서

3MG는 L-(트레오)-3-메틸글루탐산을 표시한다.

또 다른 면에서 있어서, 본 발명은 A-21978C 복합체, A-21978C인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅차단된 A-21978C 복합체 및 차단된 A-21978C인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅로 부터 선택된 항생물질을 효소분해로 탈아실화하는 방법에 관한 것이다. 천연적으로 생성되는 A-21978C 인자들은 통상의 사이클릭펩타이드 핵을 함유하지만, 각각의 인자는 다른 지방산 그룹을 갖는 본 발명에서 제조된 A-21978C인자 및 차단된 인자로 부터 지방산 그룹을 제거하는 방법은 수성 매질에서 항생물질 또는 차단된 항생물질을, 필요로 하는 탈아실화가 완결될때까지 악티노플라나세아에(Actinoplanaceae)과의 미생물에서 생성되는 효소에 노출시킴을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 방법은 지방산 촉쇄를 분해시키는데 악티노플레인스 유타엔시스(Actinoplanes utahe-sis) NRRL 12052(한국 기탁 번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관 : 한국 종균 협회, 기탁일 : 1983.8.17)에서 생성되는 효소를 사용하는 방법이나. 통상적으로, 탈아실화는 악티노플레인스 유타엔시스 배양물에 적합한 항생물질 또는 차단된 항생 물질을 가하고, 배양물을 탈아실화가 완결될 때까지 배양시켜 수행한다. 생성된 A-21978C 사이클릭 펩타이드 또는 차단된 펩타이드를 공지된 방법에 의해 발효액으로부터 분리한다.

일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드를 재아실화하여 신규의 항생물질을 제조할 수 있다.

A-21978C 핵[일반식(1)에서, R, R¹, R²=H이다] 및 A-21978C Norn-t-BOO 핵[일반식(1)에서, R 및 R¹=H이고, R²=3급 부틸옥시 카보닐이다]의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr법)은 첨부된 제1도 및 제2도에 나타낸 바와 같다.

본 명세서에서는 본 분야에서 그 대부분이 널리 공지된 하기의 약어를 사용한다.

Ala : 알라닌 Asp : 아스파르트산

Gly : 글리신 Kyn : 키뉴레닌

Orn : 오르니틴 Ser : 세린

Thr : 트레오닌 Trp : 트립토판

t-BCO : 3급-부톡시카보닐 Cbz : 벤질옥시카보닐

DMF : 디메틸포름아미드 THF : 테트라하이드푸란

HPLC : 고성능 액체 크로마토그라피 TLC : 박층 크로마토그라피

UV : 자외선

A-21978C 항생물질은 산성 펩타이드 항생물질과 밀접한 관계가 있으며, 본 발명에 인용된 참고 문헌인 미합중국 특허 제4,208,403호에 기술되어 있다. 미합중국 특허 제4,208,403호에 기슬되어 있는 바와 같이, A-21978 항생물질 복합체는 주성분으로 인자 C를 함유하며, 인자 C는 그 자체가 근연 인자들의 복합체로 되어 있다. A-21978C 복합체로 불리우는 A-21978C 인자 C는 개개 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅를 함유하며, 인자 C₁, C₂및 주(major)인자이고, 인자 C₀, C₄및 C₅는 부(minor)인자이다. A-21978C인자의 구조는 하기 일반식(3)으로 표시된다 :

상기식에서, 3MG는 L-(트레오)-3-메틸글루탐산을 표시하고, R^N은 특정 지방산 부위를 표시한다. A-21978C인자의 특정 R^N그룹은 하기와 같다 :

* 아직 동정되지 않음

펩타이드 항생물질을 탈아실화 할때, 탈아실화 목적으로 사용할 수 있는 효소의 존재 유무를 확인하기가 매우 어렵다. 더우기 기질인 항생물질이 사이클릭펩타이드 핵을 함유할 경우에는 효소 사용의 문제가 훨씬 더 어렵다. 효소는 고도의 선택성을 가지고, 기질의 펩타이드 부위 및 측쇄의 차이로 인해 탈아실화 결과에 영향을 주기 때문이다. 또한, 많은 미생물의 펩타이드 부위의 다른 위치를 공격하는 다수위 펩티디아제를 생성함으로써 빈번히 생성물이 혼합물의 형태로 되어 처리하기 어렵게 된다.

각각의 A-21978C 항생물질(일반식 3)에 있어서, 지방산 측쇄(R^N)는 트립토판 잔기의 α-아미노그룹에 결합되어 있는데, A-21978C 펩타이드의 잔여 부분의 화학적 특성에 영향을 주지 않고, 효소로써 지방산 측쇄를 분해할 수 있음이 알려져 있다.

일반식(1)의 사이클릭 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 무독한 염은 특히 그람 양성균에 유용한 신규의 반합성 항균제 제조시 중간체로서 유용하다.

"아미노 보호 그룹"은 A-21978C 분자내에 존재하는 다른 작용성 그룹과 양립할 수 있는 공지의 아미노 보호 그룹을 의미한다. 바람직하게는, 아미노 보호그룹은 후에 용이하게 제거될 수 있는 그룹이며, 적합한 보호그룹의 예는 테오도라 더블류. 그린, 죤 윌리 및 존스에 의해 저술된 문헌에 기술되어 있다[참조 : "Protective Groups in Organic Synthesis" New York, 1981, Chapter 7]. 특히 바람직한 아미노 보호 그룹은 3급-부톡시 카보닐 및 벤질옥시카보닐 그룹이다.

R이 수소인 일반식(1)의 사이클릭 펩타이드에는 A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅(A-21978C핵) 및 A-21978C 핵의 차단된 유도체의 통상적인 사이클릭 펩타이드가 포함 된다. R, R¹및 R²가 각각 수소인 일반식(1)의 화합물인 A-21978C 핵은 일반식(2)로도 표시된다.

A-21978C 핵은 하기의 특징을 갖는다.

형태 : 단파 UV 하에서 형광을 띠는 백색 무정형 고체

실험식 : C₆₂H₈₃N₁₇O₂₅

분자량 : 1465

용해성 : 수용성

적외선 흡수 스펙트럼(KBr 법) : 제1도 참조 ; 흡수 극대는 하기의 주파수에서 관찰된다(cm^-1). :

3300(브로드), 3042(약), 2909(약), 1655(강), 1530(강), 1451(약), 1399(중), 1222(중), 165(약), 1063(약) 및 758(중 내지 약)

자외선 흡수 스펙트럼(메탄올) : UV 최대 223nm(ε41,482) 및 260nm(ε8,687)

전위차 적정(66%수성 디메틸포름아미드) : 4개의 적정 가능한 그룹의 pKa 값은 약 5.2, 6.7, 8.5 및 11.1이다(초기의 pH 6.12).

일반식(1)의 특히 유용한 사이클릭 펩타이드는 R 및 R¹이 수소를 나타내고, R²는 3급 부톡시카보닐인 화합물이다. 편의상, 본 명세서에서는 화합물을 "t-BCO 핵"으로 명명한다.

A-21978C t-BCO 핵은 하기의 특징을 갖는다.

형태 : 단파 UV 하에서 형광을 띤 백색 무정형 고체

실험식 : C₆₇H₉₁N₁₇O₂₇

분자량 : 1565

용해성 : 수용성

적외선 흡수스펙트럼(KBr) : 제2도 참조 ; 흡수 극대는 하기의 주파수에서 나타난다.(cm^-1) :

3345(브로드), 3065(약), 2975(약), 2936(약), 약 1710(숄더), 1660(강), 1530(강), 1452(약), 1395(중), 1368(약), 1341(약), 1250(중), 1228(중), 1166(중 내지 약) 및 1063(약).

자외선 흡수 스펙트럼(90% 에탄올) : UV 극대 220nm(ε42,000) 및 260nm(ε10,600)

고성능 액체 크로마토그라피 : 정체시간 =6분(4.6×300mm 실리카겔 C₁₈칼럼, 0.2% NH₄OAc를 함유하는 H₂O/CH₃CN/CH₃OH(80 : 15 : 5)용매사용, 유출속도 2ml/분, UV 검출).

본 발명에 따르는 차단된 A-21978C 인자는 R¹및 R²중 적어도 하나가 아미노 보호그룹이고, R이 8-메틸데카노일, 10-메틸운데카노일, 10-메틸도데카노일, A-21978C 인자 C₀의 특정 C₁₀-알카노일그룹 및 A-21978C 인자 C₄및 C₅의 특정 C₁₂-알카노일 그룹 중에서 선택된 일반식(1)의 화합물이다.

본 발명의 A21978C 차단된 인자 및 사이클릭 펩타이드는 염을 형성할 수 있으며, 염 또한 본 발명에 포함된다. 이들 염은 본 발명의 화합물을 분리하고 정제하는데에 유용하다. 약제학적으로 무독한 알칼리금속, 알칼리 토금속, 아민 및 산부가염이 특히 유용하다. "약제학적으로 무독한"염이란 온혈 동물의 화학요법에 유용한 염을 말한다.

예를들면, 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드는 염을 형성할 수 있는 4개의 유리 카복실 그룹을 갖는다. 이들 카복실 그룹의 부분, 혼합 및 완전 염 모두 본 발명에 포함될 수 있다. 이들 염의 제조시 pH는 10이하여야 하는데, 그 이유는 그 이상에서 이들 화합물은 불안정하기 때문이다.

대표적인 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드의 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염에는 나트륨, 칼륨, 리튬, 세슘, 루비듐, 바륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 포함된다. A-21978C 사이클릭 펩타이드의 적합한 아민 염에는 암모늄 및 1급 2급 및 3급 C₁내지 C₄의 알킬암모늄 및 하이드록시 C₂내지 C₄의 알킬암모늄 염이 포함된다. 또 다른 아민 염의 예로는 A-21978C 사이클릭 펩타이드를 수산화암모늄, 메틸아민, 2급 부틸아민, 이소프로필아민, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 에탄올아민, 트리에틸아민 및 3-아미노-1-프로판올과 반응시켜 형성된 염을 들 수 있다.

일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드의 알칼리 금속 및 알칼리 토금속의 양이온성 염은 양이온성 염의 통상적인 제조방법에 따라 제조된다. 예를들면, A-21978C사이클릭 펩타이드의 유리산 형태를 온메탄올 또는 에탄올 등의 적합한 용매에 용해 시킨 후, 수성 메탄올중에 용해된 화학량론적 양의 바람직한 무기염기 용액을 가한다. 생성된 염을 여과 또는 용매의 증발과 같은 통상적인 방법으로 분리할 수 있다.

유사한 방법으로, 유기 아민과의 염을 제조할 수 있다. 예를들면, 아세톤과 같은 적합한 용매에 용해시킨 A-21978C 사이클릭 펩타이드 용액에 기체 또는 액체 아민을 가하고, 용매 및 과잉의 아민을 증발시켜 제거할 수 있다.

본 발명의 A-21978C 사이클릭 펩타이드도 유리 아미노 그룹을 가지며, 따라서 산부가염을 형성할 수 있고, 형성된 산부가염도 본 발명에 포함된다. 그외, A-21978C 사이클릭 펩타이드의 대표적인 적합한 산부가염에는 염산, 황산, 인산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 뮤스산, D-글루탐산, d-캄포르산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타르타르산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산 및 신남산 등과 같은 유기 및 무기산과 표준 반응시켜 형성된 A-21978C 사이클릭 펩타이드의 산부가염이 포함된다.

A-21978C 사이클릭펩타이드의 제조

R이 수소인 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드는 A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅및 차단된 A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅로 이루어진 그룹에서 선택된 펩타이드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다.

I. 기질의 제조

A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅는 미합중국 특허 제4,208,403호에 기술된 방법에 따라 제조한다. 이들 인자는 A-21978 복합체의 일부인 A-21978C 복합체의 성분이다.

A-21978 복합체는 액침 호기성 발효 조건하에서 상당량의 항생물질 역가가 얻어질 때까지 스트렙토마이세스 로제오스포루스(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379(1978년 8월 29일에 기탁됨)(한국 기탁번호 : KFCC-10051, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)를 배양시켜 제조할 수 있다. 발효액을 여과하여, 여액의 pH를 약 3으로 낮추고 복합체를 침전시킨 후, 여과하여 복합체를 분리시키는 방법에 의해 A-21978C 복합체를 분리한다. 분리된 복합체를 침전시킨 후, 여과하여 복합체를 분리시키는 방법에 의해 A-21978C 복합체를 분리한다. 분리된 복합체를 추출법으로 더욱 정제할 수 있다. 개개의 A-21978C 복합체 및 인자를 분리하기 위해 크로마토그라피 분리를 실시한다.

본 발명의 차단된 A-21978C 복합체 및 차단된 A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅(R이 8-메틸데카노일, 10-메틸운데카노일, 10-메틸도데카노일 및 인자 C₀, C₄및 C₅의 C₁₀-및 C₁₂-알카노일 그룹인 일반식(1)화합물)는 펩타이드의 아미노 그룹을 보호하기 위해 사용되는 방법에 따라 제조한다. 보호 그룹은 벤질옥시카보닐, t-부톡시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 0-니트로페닐티오, 디페닐포스피노티올, 클로로 또는 니트로벤질옥시카보닐 등의 여러 공지된 아미노 보호 그룹중에서 선택된다.

차단된 A-29178C 복합체가 기질로서 특히 바람직하다. 이는 A-21978C 복합체로부터 제조되는데, 분리 단계를 거치지 않고 개개의 A-21978C 인자를 수득할 수 있으나, 차단된A-21978C 복합체를 탈아실화하면 단일 생성물, 즉 적절히 차단된 핵이 수득된다.

Ⅱ. 탈아실화 방법

A. 효소의 제조

1. 효소생성 미생물

A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅차단된 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅의 탈아실화에 사용되는 효소는 악티노플라나세아에과의 특정미생물, 바람직하게는 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(1979.10.9.기탁)(한국 기탁번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)균에 의해 생성될 수 있다. 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(한국기탁번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)를 배양하여 이 효소를 생성하는 바람직한 방법은 실시예 1에 기술되어 있으나, 본 분야에서 숙련된 사람에게는 다른 방법을 사용할 수도 있다는 것이 인지될 것이다.

악티노플라나세아에는 악티노마이세탈레스(Actinomycetales)목에 속하는 균과이다. 닥터 죤 엔. 코우치에 의해 최초로 기술되었으며 공인되었다[참조 J.Elisha Mitchell Sci. Soc, 71,148-155)]. 이 과 및 다수의 개개의 속에 대한 특징은 하기에 기술되어 있다[참조 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology," 8th ed., R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, Eds., The Williams & Wikins Co., Baltimore, md., 974 pages 706-723]. 이에 따르면 10개의 속으로 분류되었다 :

Ⅰ. 악티노플레인스(대표 속이며 가장 통상적인 속)

Ⅱ. 스피릴로스포라(Spirillospora)

Ⅲ. 스트렙토스포르안지움(Streptosporangium)

Ⅳ. 아몰포스포란지움(Amorphosoporangium)

Ⅴ. 암폴라리엘라(Ampullariella)

Ⅵ. 필리멜리아(Pilimelia)

Ⅶ. 플라노모노스포라(Planomonospora)

Ⅷ. 플라노비스포라(Planobispora)

Ⅸ. 닥틸로스포란 지움(Dactylosporangium)

Ⅹ. 키타사토아(Kitasatoa)

현재까지 분리되어 특징지워진 종 및 변종은 하기와 같다 : 악티노플레인스 필리피넨시스, 악티노플레인스 아르메니아쿠스, 악티노플레인스, 유타엔시스, 및 악티노플레인스 미조우리엔시스 ; 스피릴로스포라 알비다 ; 스트렙토스포리안지움 로제움, 스트렙토토스포란지움 불가레, 스트렙토스포란지움 로제움 변종. 홀란덴시스, 스트렙토스포란지움 알붐, 스트렙토스포란지움 비리디알붐, 아몰포스포란지움 아우란티칼라, 암풀라리엘라 레귤라리스, 암플라리엘라 캄파뉼라타, 암풀라리엘라 로바타, 암풀라리엘라 디지타타, 필리멜리아 테레바사, 필리멜리아 아뉼라타, 플라노모노스포라 파론토스포라, 플라노모노스포라 베네주엘렌시스, 플라노비스포라론지스포라, 플라노비스포라 로제아, 닥틸로스포란지움 아우란티아큼, 및 닥틸로스포란지움 타일란데스.

악티노플레인스 속은 본 발명에서 유용되는 바람직한 효소 생성원이다. 악티노플레인스 속중 악티노플레인스 유타엔시스 종이 특히 바람직한 생성원이다.

그외 대표적인 유용한 종의 배양물은 NRRL [Northern Regional Research Center, Agricultural Research Culture Collection(NRRL), U.S. Department of Agriculture, 1815, North University St., Peoria, Illinois 61604, U.S.A]에 다음의 기탁번호로 기탁되어 일반에게 이용할 수 있게 되어있다. 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(1979.10.9 기탁)(한국 기탁번호 : KFCC-10054, 한국 기탁기관 : 한국 종균 협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스 미조우리엔시스 NRRL 12053(1979.10.9 기탁) (한국 기탁번호 : KFCC-10056, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스 종. NRRL 8122(1975.10.17 기탁) (한국 기탁번호 : KFCC-10052, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스 종. NRRL 12065(1979.11.5 기탁) (한국 기탁번호 : KFCC-10053, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 스트렙토스포란지움 로제움 변종. 홀란덴시스 NRRL 12064(1979.11.5 기탁) (한국 기탁번호 : KFCC-10055, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(한국 기탁번호 : KFCC-10052, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)는 ATCC(American Type Culture Collection)에도 기탁된 모 배양물로 부터 얻어진다[참조 : 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852(A. utahensis ATCC 14539)]. 악티노플레인스 유타엔시스 ATCC 14539 배양물도 효소의 생성원으로 사용될 수 있다.

악티노플레인스 미조우리엔시스 NRRL 12053(한국 기탁번호 :KFCC-10056, 한국기탁기관 : 한국종균협회 기탁일 : 1983.8.17)도 ATCC(A. missouriensis ATCC 14538)에도 기탁된 배양물로부터 얻어지며, 효소의 또다른 생성원으로 사용된다.

본 발명의 탈아실화를 수행하는 데에 있어서, 악티노플라나세아에 과의 특정 균주의 유효성은 하기 방법에 따라 측정한다. 적당한 배양매질에 미생물을 접종하고, 약 30℃에서 회전 진탕기상에서 2일 또는 3일간 배양시킨다. 다음에 발효 매질의 pH를 약 7.0으로 유지하면서 기질 항생물질중의 하나를 배양물에 가한다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 분석법으로 배양물의 활성도를 모니터 한다. 이 방법은 D항에서 후술한다. 항생물질 역가의 소실은 미생물이 탈아실화에 필요한 효소를 생성함을 뜻한다. 이 사실은 하기의 방법중 한가지를 사용하여 입증되어야 한다 : 1) 완전한 핵(intact nucleus)의 존재에 대한 HPLC분석법 또는 2) 활성을 회복시키기 위해 적합한 측쇄로(예 : 라우로일, n-데카노일 또는 n-도데카노일)재아실화법, 보호 그룹을 가함으로써 항새물질 역가가 80 내지 90% 감소되므로 보호된 A-21978C 물질을 탈아실화할때, 항생물질 역가의 감소를 구별하기 어렵다.

2. 효소의 생성 조건

악티노플라나세아에의 성장에 충분한 조건, 즉 약 25℃ 내지 30℃의 온도, pH 약 5.0 내지 8.0에서 진탕 및 통기하에서 효소가 생성된다. 배양 매질은 다음을 함유하여야 한다. a) 서당, 포도당, 글리세롤등과 같은 동화 가능한 탄소공급원, b) 펩톤, 요소, 황산 암모늄 등의 질소공급원, c) 가용성 인산염과 같은 인산염 공급원 및 d) 일반적으로 미생물의 성장을 촉진하는 것으로 밝혀진 무기염. 성장 주기가 시작된지 약 40 내지 60 시간 후에 일반적으로 유효량의 효소가 수득되며, 유효 성장에 도달된 후 얼마간 계속수득된다. 생성된 효소량은 미생물의 종 및 성장 조건에 따라 변한다.

본 분야에 관여하는 사람에게는 인지될 수 있는 바와 같이 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(한국 기탁번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관 : 한국 종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)와 같은 효소를 생성하는 미생물을 변이시킬 수 있다. 예를들면, 이들 균주의 인공 변종 및 돌연변이 주는 자외선, X선, 고주파, 방사선 및 화학물질과 같은 여러 가지의 공지의 돌연변이소로 처리하여 수득할 수 있다. 악티노플라나세아에로부터 수득되며 효소를 생성하는 모든 천연 및 인공의 변종 및 돌연변이주를 본 발명에 사용할 수 있다.

B. 탈아실화 조건

출발물질로 사용되는 기질은 바람직하게는 48시간 배양시킨 악티노플라나세아에 배양물에 가한다. 전환 매질중 기질의 농도는 매우 광범위하게 변화할 수 있다. 효소를 최대한 사용하고, 3시간 내에 탈아실화를 완결하기 위해 일반적으로 기질 농도를 1 내지 3mg/ml로 한다. 보다 저농도의 기질을 사용할 수 있으나, 효소를 최대로 사용할 수 없으며, 보다 고농도의 효소를 사용할 수 있으나, 발효 시간을 연장하지 않으면 기질이 완전히 탈아실화될 수 없다.

본 발명에 따라 기질 항생물질을 A-21978C 핵으로 전환시키는 공정은 발효 매질의 pH를 7.0 내지 7.2근처로 유지할때 가장 잘 진행된다. pH7이하에서는 탈아실화가 서서히 진행되고, pH는 약 7.2 이상으로 조절하면 생성된 핵이 알칼리 가수분해 되기 쉽다. 교반 발효기 내에서는 pH는 감지장치(sensor controller)로 조절할 수 있다. 플라스크 발효기중에서와 같이 이런 장치를 이용할 수 없을 때에는 기질을 가하기 전에 0.1몰 인산염 완충액을 가하여 pH를 조절할 수 있다.

기질을 가한 후, 3 내지 6 시간 또는 그 이상 배양을 계속한다. 기질의 순도는 탈아실화 속도에 영향을 준다. 예를들면, 순도 50% 이상의 기질은 3시간 후에 약 2.5mg/ml의 항생물질이 탈아실화된다. 보다 순도가 낮은 기질을 사용하면, 약간 저속도로 탈아실화가 진행된다.

기질을 수회에 걸쳐 가할 수도 있다. 예를들면, 24시간 간격으로 0.75mg/ml의 항생물질을 최소한 5회 또는 그 이상 가할 수 있다.

탈아실화는 광범위한 온도범위에 걸쳐 수행할 수 있는데, 예를들면 20 내지 45℃ 근처에서 수행할 수 있다. 그러나 기질을 최적으로 탈아실화 하고 기질을 핵의 안정성을 위해 약30℃에서 탈아실화를 수행함이 바람직하다.

C. 기질

정제된 항생물질을 기질로 사용함이 바람직하다. 필수적은 아니다. 정제된 기질은 물 또는 완충액에 용해될 수 있으므로 보다 편리하게 취급할 수 있다. 더우기, 정제된 기질을 사용하면 탈아실화가 보다 신속히 진행된다. 15% 정도의 소량의 출발 항생물질을 함유하는 반정제 기질도 성공적으로 탈아실화된다.

기질 항생물질도 항균작용을 가진다. 기질이(특히 순도가 낮은)탈아실화 매질 내에서 성장할 수 있고, 탈아실화 반응 또는 출발 항생물질 또는 생성된 핵의 안정성 영향을 줄 수 있는 균세포나 포자를 잠복시킬 수 있으나, 이러한 관찰된 것은 아니다. 그로므로 특히 단기간의 탈아실화 동안에는 기질을 반드시 멸균할 필요는 없다.

D. 탈아실화의 모니터

A-21978 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대해 특히 활성인 항균제이다. 따라서, 존재하는 기질의 양을 측정할때 마이크로코커스 루테우스를 사용하여 분석함이 바람직하다. 생성된 A-21978C 핵은 수용성이나 생물학적으로 불활성 이다. 그러므로 탈아실화의 신속한 추정 시험으로 생물학적 활성의 감소도를 시험한다.

생성된 핵의 양은 본 명세서에서 기술하는 시스템을 사용하여 HPLC 분석으로 정량할 수 있다.

E. 휴지세포(Resting cell)의 사용

또 다른 탈아실화 방법은 배양매질로부터 악티노플라나세아에 세포를 회수하여 완충액중에 재현탁시키고 B 항에서 기술된 바와같이 탈아실화를 수행하는 것이다. 이 방법을 사용할때, 효소적으로 활성인 균사를 다시 사용할 수 있다. 예를들면, 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(한국 기탁 번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관, 한국 종균협회, 기탁일 : 1983.8.17) 균사는 1달 또는 그 이상동안 냉장(4내지 8℃) 또는 동결상태(-20℃)로 보관한후에도 데아실라아제(deacylase) 활성을 보유한다. 바람직한 완충액은 0.1몰 인산염 완충액이다.

F. 고정시킨 효소(Immobilized Enzymes)

탈아실화시키는 또 다른 방법은 본 분야에서 공지된 방법으로 효소를 고정시키는 것이다[참조 : "Biomed-ical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins", Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum-Press, New York, 1977,Vol.1]. 다음에 탈아실화하기 위해 칼럼(또는 기타의 적합하 반응기)내에서 고정된 효소를 사용할 수 있다.

또한 탈아실화 반응 촉진시키기 위해 균자체를 고정시켜 사용할 수 있다.

A-21978C 사이클릭펩타이드의 유용성

A-21978C 사이클릭펩타이드 및 그의 염은 반합성 항균 물질의 제조시 중간체로 유용하다.

동일자에 출원된 특허원에 기술된 화학요법제는 하기 일반식(4) 및 그의 약제학적으로 무독한 염으로 표시 된다 :

상기식에서,

R, R¹및 R²는 독립적으로 수소, C₄내지 C₁₄의 알킬, 임의 치환된 C₂내지 C₁₉의 알카노일, C₅내지 C₁₉의 알케노일 또는 아미드 보호그룹 이고,

R³, R⁴및 R⁵는 모두 수소이거나, (i) R³및 R¹및/또는 (ii) R⁴및 R및/또는 (iii) R⁵및 R²가 함께는 C₄내지 C₁₄의 알킬리덴 그룹을 나타낼 수 있으며,

단, 1) R, R¹및 R²중 적어도 어느 하나는 수소 또는 아미노 보호그룹이 아니어야 하고,

2) R¹및 R²중 적어도 하나는 수소 또는 아미노 보호그룹이어야 하며,

3) R, R¹및 R²그룹은 함께 적어도 4개의 탄소원자를 함유해야 하고,

4) R¹및 R²모두가 수소 또는 아미노 보호그룹으로부터 선택됐을때, R은 8-메틸데카노일, 10-메틸운데카노일, 10-메틸도데카노일, A-21978C 인자 C₀의 특정 C₁₀알카노일 그룹 또는 A-21978C인자 C₄및 C₅의 특정 C₁₂-알카노일 그룹이 아니어야 한다.

"C₄내지 C₁₄-알킬리데닐"은

그룹을 나타내며, 여기에서 R³및 R⁴는 수소 또는 C₃내지 C₁₃의 알킬 그룹인데, 단, R³및 R⁴중 어느 하나는 수소가 아니어야 하고, R³및 R⁴의 탄소원자의 합은 13이하여야 한다. R, R¹또는 R²중 어느 하나가 C₄내지 C₁₄의 알킬리데닐인 화합물은 쉬프 염기(Schiffs bases)로 공지되어 있다.

"C₄내지 C₁₄의 알킬"이란 1가의 포화, 직쇄 또는 측쇄의 탄소수 4 내지 14인 알킬 그룹을 의미 한다. R, R¹및 R²중 어느 하나가 C₄내지 C₁₄의 알킬인 화합물은 R, R¹또는 R²그룹이, C₄내지 C₁₄의 알킬리데닐인 상응하는 화합물을 환원함으로써 제조되며, "환원ㄷ한쉬프 염기"로 칭한다.

"임의 치환된 C₂내지 C₁₉의 알카노일"및 C₅내지 C₁₉의 알케노일"은 각각 탄소수 2 내지 19 및 탄소수 5 내지 19인 카르복실산으로부터 유도된 아실 그룹을 의미한다. R 그룹이 알카노일일때, 알킬 부부은 임의로 하나의 하이드록실 그룹 또는 염소, 브롬 및 부로솔부터 선택된 1 내지 3개의 할로 치환기를 함유할 수 있는 1가의 포화, 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 라디칼이다. R 이 알케노일일때, 알케노일 부분은 3개 이하의 2중 결합을 함유하는 1가의 불포화 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 라디칼이다. 불포화 탄화수소 쇄의 이중 결합 부분은 시스 또는 트랜스 배위일 수 있다.

"아미노 보호 그룹"은 앞에서 정의된 공지의 아미노 보호그룹을 뜻한다.

하기에 일반식(4) 화합물의 바람직한 태양을 기술한다 :

(a) R이

(여기에서, n은 3 내지 17이다)의 알카노일인 화합물,

(b) R이

(여기에서, n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13또는 14이다)의 알카노일인 화합물,

(c) R이

(여기에서, n및 m은 독립적으로, 0 내지 1의 정수이고, n+m이 1 이상 15이하이며, 단, n이 0일때 m은 8이 아니고, n이 1일때 m은 6 또는 8이 아니라)의 알카노일인 화합물,

(d) R이

(여기에서, n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 14의 정수이고, 단, n+m은 1이상 15이하이다)의 시스 또는 트랜스알케닐인 화합물,

(e) R은

(여기에서, n은 4 내지 15의 정수)의 시스 또는 트랜스 알케닐인 화화물,

(f) R이 CH₃(CH₂)_n- (여기에서, n은 5 내지 12의 정수이다)의 알킬인 화합물,

(g) R이 하기와 같은 화합물

동일자에 출원된 또 다른 두개의 특허원에 기술된 화학요법제는 일반식 (5)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 무독한 염이다.

상기 언급된 특허원중의 하나에 기술된 일반식 (5) 화합물의 유도체는,

R이 수소, 8-메틸데카노일, 10-메틸도데카노일, 10-메틸운데카노일, A-21978C의 특정 C₁₀알카노일 그룹, 또는 A-21978C 인자 C₄및 C₅의 특정 C₁₂-알카노일 그룹, 아미노보호그룹, Q가 C₁내지 C₁₆의 알킬렌인 일반식

인 아미노아실 그룹 또는 일반식

인 N-알카노일아미노아실 그룹이고 ;

W는 하기 일반식의 2가 아미노아실 라디칼이며,

(a)

(여기에서, A는 C₁내지 C₁₀의 알킬렌 또는 C₅내지 C₆의 사이클로알킬렌이다)

(b)

(여기에서, R³는 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 머캅토메틸, 머캅토에틸, 메틸티오에틸, 2-티에닐, 3-인돌-메틸, 페닐, 벤질 또는 치환된 페닐 또는 치환된 벤젠(이때 벤젠환은 클로로, 브로모, 요도, 니트로, C₁내지 C₃의 알킬, 하이드록시, C₁내지 C₃의 알콕시, C₁내지 C₃의 알킬티오, 카바밀 또는 C₁내지 C₃의 알킬카바밀로 치환된다)이다.

(여기에서, X는 수소, 클로로, 브로모, 요도, 아미노, 니트로, 탄소수 1 내지 3의 알킬, 하이드록시, 탄소수 1 내지 3의 알콕시, 머캅토, 탄소수 1 내지 3의 알킬티오, 카바밀, 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬카바밀이다)

(d)

(여기에서, X¹는 클로로, 브로모, 요도, 아미노, 하이드록시, 탄소수 1내지 3의 알킬 C₁내지 C₃의 알콕시이다)

(e)

(여기에서, B는 n이 1 내지 3의 정수인 식 (-CH₂)_n-인 2가의 라디칼, -CH=CH-, -CH-CH-CH₂- 또는

이다) ;

R²는 C₁내지 C₁₇의 알킬 또는 C₂내지 C₁₇의 알케닐이며 ;

R¹은 수소, 아미노보호그룹, 본 명세서에서 정의된 식

의 아미노아실그룹, 본 명세서에서 정의된 식

의 N-알카노일아미노아실 그룹인데,

단, R이 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이 아닐때,

R¹은 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이어야 하고,

R¹이 아미노보호그룹일 때, R은 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이어야 하는 화합물 또는 그의 약제학적으로 무독한 염이다.

"알키렌", 알킬" "알콕시", "알킬티오", 및 "알케닐"은 직쇄 및 측쇄의 탄화수소 쇄를 뜻한다. "알킬"은 1가의 포화 탄화수소 라디칼을 뜻하고, "알케닐"은 1, 2 또는 3개의 이중결합을 함유하는 1가의 불포화 탄화수소 라디칼을 뜻하며 시스 또는 트랜스 배치로 될 수 있다. 또 "알킬렌"은 2가의 포화 탄화수소 라디칼을 뜻하며, "사이클로알킬렌"은 2가의 사이클릭 포화 탄화수소 라디칼을 뜻한다.

바람직한 C₁내지 C₁₀또는 C₁내지 C₁₆의 알킬렌 라디칼의 예는 -CH₂-, R⁵가 C₁내지 C₄의 알킬(예 : 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸 또는 1-메틸프로필)인 일반식

, m이 2 내지 10의 정수인 -(CH₂)_m- 및 p가 1 내지 8이고 q가 0 내지 7이며 단, p+q가 8이하인

를 들 수 있다.

바람직한 C₁내지 C₁₇의 알킬 그룹의 예는 하기와 같다 :

(a) CH₃-

(b) n이 1 내지 16인 -(CH₂)_nCH₃

(c) r 및 s가 독립적으로 0 내지 14이나,

단, r+s가 14 이하인

바람직한 C₂내지 C₁₇의 알케닐 라디칼의 예는 하기와 같다 :

(a) t 및 u가 독립적으로 0 내지 14이나

단, t+u가 14이하인 -(CH₂)_t-CH=CH-(CH₂)_u-CH₃

(b) v 및 z가 독립적으로 0 내지 11이며, y가 1 내지 12이나

단, v+y+z가 12 이하인 -(CH₂)_VCH=CH-(CH₂)_y-CH=CH-(CH₂)_Z-CH₃

특히 다음의 C₁-C₁₇알킬그룹이 바람직하다 :

CH₃-, CH₃(CH₂)₅-, CH₃(CH₂)₁₀-, CH₃(CH₁₂)₁₂-,

CH₃(CH₂)₆-, CH₃(CH₂)₈-, CH₃(CH₂)₁₄-, CH₃(CH₂)₁₆-,

특히 다음의 C₂-C₁₇알케닐 그룹이 바람직하다 :

시스 -CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₇-

트랜스 -CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₇-

시스 -CH₃(CH₂)₁₀CH=CH(CH₂)₄-

트랜스 -CH₃(CH₂)₁₀CH=CH(CH₂)₄-

시스 -CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇-

트랜스 -CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇-

시스 -CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₉-

트랜스 -CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₉-

시스, 시스 -CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇-

트랜스, 트랜스 -CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇-

시스, 시스, 시스 -CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH-(CH₂)₇-

"W"가 다음 일반식의 2가 라디칼일 때,

본 분야 전문가라면

작용기 및 -NH- 작용기가 벤젠환 상에서 서로에 대해 오르토, 메타, 또는 파라 배위로 배향할 수 있음을 이해할 것이다. X로 표시된 치환체는 벤젠환의 어느 위치에서나 될 수 있다.

X가 수소이고

및 -NH- 작용기가 파라 배위로 배향된 경우가 바람직하다.

"치환된 페닐" 및 "치환된 벤질"은 , 일반식(5)에서 R⁵로 정의되었듯이, 벤젠환의 가능한 어느 위치에서나 치환된 경우를 나타낸다. 즉 치환체는 오르토, 메타 또는 파라 배위를 취할 수 있다. 일반식(5)에서 R³또는 X로 정의된 바와 같이 "C₁-C₃알킬"에는 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 i-프로필 그룹이 포함된다.

전술된 두개의 특허원중 다른 하나에 기술된 일반식(5)의 유도체는 R이 하기 일반식의 치환된 벤조일 그룹인 화합물 또는 그의 약제학적으로 무독한 염이다 :

상기식에서,

X는 수소, 클로로, 브로모, 요도, 니트로, C₁내지 C₃의 알킬, 하이드록시, C₁내지 C₃의 알콕시 또는 C₁내지 C₃의 알킬티오이고,

R¹은 수소 또는 아미노 보호그룹이며 ; R²는 C₈내지 C₁₅의 알킬이다.

치환된 벤조일 그룹,

및 -OR²기는 벤젠 환에서 서로가 오르토, 메타 또는 파라 위치로 배향할수 있으나, 파라 배향이 바람직하다. X로 표시된 치환기는 전술된 이들 두 그룹을 포함하는 벤젠환의 어느 위치에도 치환될 수 있다.

"알킬"은 직쇄 및 측쇄의 탄화수소를 뜻한다.

R²로 바람직한 C₈내지 C₁₅의 알킬 라디칼의 예는 하기와 같다 :

(a) n이 7 내지 14의 정수인 -(CH₂)₇CH₃및

(b) r 및 s가 독립적으로 0 내지 12의 정수이나,

단, r+s가 12이하이거나 5이상인

일반식(4) 및 (5)의 화합물은, 본 분야에서 아미드 결합 생성에 통상적으로 사용되는 방법을 사용하여 일반식(1) 화합물을 적절한 아실 측쇄로 아실화하여 제조한다. 아실화 반응은 일반적으로 선택된 화합물을 원하는 아실 측쇄 또는 그룹에 상응하는 산 활성화 유도체와 반응시킴으로써 이루어진다.

"활성화 유도체"란 아실화제의 카복실 작용기가 1급 아미노 그룹과의 커플링에반응성을 나타내 아실흑쇄를 핵에 연결하는 아미드 결합을 생성하는 유도체를 의미한다. 적절한 활성화 유도체, 그 제조방법, 및 1급 아민에 대한 아실화제로써의 그 사법용을 본분야의 전문가라면 알고 있을 것이다. 바람직한 활성화 유도체는 다음과 같다 : (a) 산 할라이드(예. 산 클로라이드), (b) 산 무수물(예. 알콜시포름산 무수물 또는 아릴옥시포름산 무수물), 또는 (c) 활성화 에스테를(예. 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르, N-하이드록시-벤조트리아졸 에스테르, 또는 N-하이드록시-석시니미드 에스테르). 카복실 작용기를 활성화하는 다른 방법에는 카복실산과 카보닐디이미드(예. N, N'-디사이클로 헥실카보디이미드 또는 N, N'-디이소프로필카보디이미드)의 반응이 포함되는데, 그 결과로 반응성 중간체가 생성되며, 그의 불안정성 때문에 분리하지는 않는다. 그런 경우 1급 아민과의 반응은 반응계내에서 수행한다.

일반식(4) 및 (5) 화합물의 바람직한 제조방법은 활성에스테르 법이다. 목적하는 산의 2, 4, 5-트리클로로페 닐에스테르가 적합한 아실화제이다. 본 방법에서는, 과량의 활성 에스테르를 일반식(1)의 화합물과 DMF와같은 비반응성 유기 용매중, 실온에서 반응시킨다. 반응시간이 결정적인 것은 아니나, 약 6 내지 20시간 동안 반응시킴이 바람직하다. 반응이 종결됐을 때, 용매를 제거하고, 잔사를 칼럼 크로마토 그라피와 같은 공지된 방법으로 정제한다. t-BOC 그룹은 트리플루오로아세트산아니솔/트리에틸실란, 또는 바람직하게는 트리플루오로아세트산/1, 2-에탄티올로 약 3 내지 5분간 실온에서 처리하여 제거한다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 정제한다.

상응하는 산의 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르는 산을 N, N'-디시클로헥실카보디이미드와 같은 커플링제의 존재하에 2, 4, 5-트리클로로페놀로 처리하여 편리하게 제조할 수 있다. 산 에스테르를 제조하는데 적절한 다른 방법은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다.

일반식(4) 및 그의 활성화 유도체(특히, 산 클로라이드 및 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르)를 제조하기 위한 출발물질로 사용되는 알카노산 및 알케노산은 공지의 화합물이거나 공지된 방법으로 제조될 수 있는 공지된 화합물이다. 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르는 알카노산 또는 알케노산의 클로라이드를 피리딘 존재하에 조2, 4, 5-트리클로로페놀로 처리하거나, 유리 알카노산 또는 알케노산을 N, N'-디사이클로헥실 카보디이미드 존재하에 2, 4, 5-트리클로로페놀로 처리함으로써 편리하게 제조할 수 있다.

일반식(5)의 화합물의 유도체를 제조하기 위한 출발물질로 사용되는 N-알카노일아미노산 또는 N-알케노일아미드산은 공지 화합물이거나, 적합한 아미노산을 목적하는 알카노일 또는 알케노일 그룹으로 통상적 방법에 따라 아실화시켜 제조할 수 있다. N-알카노일아미노산의 바람직한 제조방법은 적합한 아미노산을 피리딘중의 알카노산 클로라이드로 처리하는 것이다. 본 발명 생성물의 제조에 사용되는 알카노산 또는 알케노산 그의 활성화 유도체, 및 아미노산은 공지 화합물이거나 본 분야 전문가에 알려진 공지 방법 또는 그 변형 방법에 의해 제조할 수 있다.

특정한 아미노산이 아미노 그룹외의 아실화될 수 있는 작용성 그룹을 함유하는 경우에, N-알카노일 또는 N-알케노일 그룹을 부착시키기 위해 사용하는 반응제와 아미노산을 반응시키기 이전에 그런 그룹은 먼저 보호시켜야 한다. 보호그룹으로는 펩타이드 합성분야에서 측쇄 작용성 그룹의 보호에 유용하다고 공지된 그룹이면 적절하다. 그런 그룹은 잘 알려져 있으며, 특정 보호그룹의 선택 및 그 사용법은 이 분야 전문가라면 쉽게 이해할 것이다. [참조문헌 예, "Protective Groups In Organic Chemistry"M.McOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973].

본 발명 생성물의 합성에 사용되는 일부 아미노산은 광학적 활성 형태로 존재할 수 있으며, 천연적 배치(L-배치) 및 비천연적 배치(D-배치)를 모두 출발물질로 사용할 수 있다.

수종의 A-21978C 유도체 및 그의 활성화 유도체의 제조를 위해 출발물질로 사용되는 치환된 벤조산은 공지의 화합물이거나, 본분야에서 공지된 방법으로 제조될 수 있는 공지의 화합물이다. 또 알콕시벤조산은 적합한 하이드록시 벤조산으로부터 편리하게 제조할 수 있는데, 적합한 알킬할라이드를 적합한 하이드록시 벤조산의 2나트륨 염과 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명 화합물의 제조과정에서 기술된 출발물질로 사용되는 하이드록시벤조산 및 그의 치환된 유도체는 공지의 화합물이거나 통상적인 방법으로 제조될 수 있는 화합물이다.

본 발명 화합물의 중간체로부터 제조되는 유도체인 일반식(4) 및 (5)의 화합물은 병원균의 성장을 억제함이 표준생물학적 시험법으로 입증된다. 따라서, 이들 화합물은 주위 환경에서의 세균 성장을 억제하거나(소독방부제로), 세균에 의한 감염증을 치료하는데 유용하다. 화합물의 항균활성은 시험관내 한천 평판 디스크 확산시험 및 한천 희석 시험 및 스타필로코커스 아우레우스 및 스트렙토코커스 파이오제네스로 감염시킨 마우스에 대한 생체내 시험으로 측정한다. 이들 화합물은 그람 양성 균에 의한 감염증을 치료하하는데 특히 유용하다.

본 발명의 A-21978C 사이클릭펩타이드를 항균제로 사용할때, 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 이 분야 전문가가 이해하듯이, A-21978C 화합물은 통상적으로 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 투여한다. A-21978 화합물의 투여량은 여러가지 조건, 예를들어 치료를 요하는 감염증의 종류 및 정도에 좌우된다. 투여시의 적절한 용량범위 및/또는 용량단위는 본 명세서의 MIC 및 ED₅₀값 및 독성 데이타와 약물역학적 특징, 환자 또는 호스트의 특성 및 감염 미생물과 같은 인자를 함께 고려하여 결정한다.

다음의 비-제한적 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

[실시예 1]

A-21978C 핵의 제조

A. 악티노플레인스 유타엔시스의 발효

악티노플레인스 유타엔시스 NRRL12052(한국 기탁 번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.7.17)의 저장 배양물을 사면 한천상에서 제조하여 유지시킨다. 사면 배양물을 제조하는데 사용되는 배지는 다음중에서 선택한다 :

[배지 A]

고압멸균 전의 pH는 약 5.9이며 ; NaOH를 가해 pH 7.2로 조절하고 ; 고압멸균 후의 pH는 약 6.7이다.

* 쟈펙 광물질 저장액의 조성은 다음과 같다 :

[배지 B]

* N-Z-아민 A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ.

사면배양물에 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(한국기탁번호 : KFCC-10054, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)를 접종하고, 접종한 배양물을 30℃에서 약 8 내지 10일간 배양한다. 사면 증식물의 약 1/2를 다음 조성을 증식성 배지 50ml에 접종한다 :

NaOH에 의해 pH 7.4로 조절한다 ; 고압멸균 후의 pH는 약 6.8이다.

* National Distillers Products Co., 99Park Ave., New York, NY.

접종한 증식성 배지를 250ml 용 광구 삼각플라스크에 옮겨 250RPM의 속도에서 직경 2인치의 호를 그리는 회전 진탕기상에서 30℃로 약 72시간 배양한다.

배양한 상기의 증식성 배지는 제2단계 증식성 배지 접종에 직접 사용하거나 추후의 사용을 위해 액체질소의 증기상증에 배양물을 유지시켜 저장할 수 있는데, 후자의 경우가 바람직하다. 그와 같은 저장을 위해서는 배양물을 소바이알 단위로 제조한다. 각 바이알에는 배양된 증식성 배지 2ml 및 2ml의 글리세롤-락토스 용액이 함유된다[W.A.Dailey and C.E. Higgens, "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364-367(1973)]. 제조한 현탁액은 액체 질소의 증기상 중에 저장한다.

이와같이 제조한 저장 현탁액(1ml)을 사용하여 전술한 바와같은 조성의 제1단계 증식성 배지 50ml를 접종하고, 전술한 바와 같이 배양한다.

다량의 접종물을 얻으려면, 배양한 제1단계 증식성 배지 10ml를 사용하여 제1단계 증식성 배지와 동일한 조성의 제2단계 증식성 배지 400ml를 접종하고, 2ι 용 광구 삼각 플라스크에 옮겨, 250RPM 속도에서 직경 2인치의 호를 그리는 회전 진탕기상에서 30℃로 약 48시간 배양한다.

전술한 바와같이 하여 얻은 제2단계 증식성 배지 배양물(80ml)을 사용하여 다음에서 선택된 생산용 멸균 배지 10l를 접종한다 :

121℃에서 45분간 약 16 내지 18psi로 고압멸균한 후의 배지 pH는 약 6.9이다.

HCI에 의해 pH 7.0으로 조절한다 ; 고압멸균후의 pH는 약 7.0이다.

[배지 Ⅲ]

* 따로 멸균하여 무균적으로 가한다. 최종 pH는 약 6.6이다.

접종한 생산용 배지를 14l들이 발효기에 옮겨 약 30℃에서 약 66시간 발효시킨다. 발효배지를 통상적인 교반기로 약 600RPM으로 교반하고 멸균공기를 통해주어 대기압에서 용존 산소 수준이 공기 포화도의 30%를 초과하도록 한다.

B. A-21978C의 탈아실화

에이. 유타엔시스의 발효는 사면배지 A 및 생산용 배지 I를 사용하여 생산용 배지를 약 67시산 배양하여 A항에서 기술된 바와 같이 수행한다. 조 A-21978C 복합체(100g)를 발효배지에 가한다.

A-21978C 복합체의 탈아실화는 마이크로-코커스 루테우스에 대한 분석으로 추적한다. 마이크로-코커스 루테우스에 대한 활성이 소실되는 대로 표시되는 약 24시간 동안의 탈아실화가 완결된 때까지 발효를 계속한다.

이와같은 방법으로 다른 미생물도 목적하는 A-21978C 핵을 생성하는지를 측정한다. 특히, 상기 방법에서 악티노플레인스 유타엔시스 대신 악티노플레인스 미조우리엔시스 NRRL 12053(한국기탁번호 : KFCC-10056, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스 종 NRRL 8122(한국기탁번호 : KFCC-10052, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스 종 NRRL 12065(한국기탁번호 : KFCC-10053, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17) 및 스트렙토스포란지움 로제움변종. 홀란덴시스 NRRL 12064(한국기탁번호 : KFCC-10055, 한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)를 사용했을 때, 목적하는 핵을 생성함이 판명되었다. 탈아실화 효소로 악티노플레인스 유타엔시스를 사용하여 상기에 기술된 방법으로 제조하여 수득된 핵의 표준시료를 사용한 HPLC 비교 결과, 다른 미생물도 A-21978C 핵을 생성함이 확인되었다.

C. A-21978C 핵의 분리

B항에 기술된 대로 수득한 전, 발효육즙(20l)을 여과보조기(Hyflo Super-cel, Johns Manville Corp.)를 통해 여과하고, 균사체 케이크는 버린다. 수득한 여액을 HP-20 수지(DIAION High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) 1.5l를 함유한 칼럼을 통과시키고, 그 통과액을 버린다. 칼럼을 탈이온수 10l로 세척하여 잔류한 여과 육즙을 제거한다. 이 세척수는 버린다. 칼럼을 물 : 아세토니트릴 혼합물(10l, 각 95 : 5, 9 : 1 및 4 : 1)로 용출시켜 1l 분획을 수집한다.

실리카겔/C₁₈및 0.1% 암모늄 아세테이트를 함유하는 용매계로써 물 : 메탄올(3 : 1)을 사용하고, 254nm UV 모니터로 핵을 검출하는 분석적 HPLC에 의해 용출을 모니터한다. 핵을 함유하는 분획을 합해, 진공농축시켜 아세토니트릴을 제거하고 동결 건조시켜 반-정제 A-21978C 핵 40.6g을 생성한다.

D. A-21978C 핵의 정제

C항에서 기술된 바와 같이 하여 수득한 반-정제 A-21978C 핵 15g을 0.2% 아세트산 및 0.8% 피리딘을 함유하는 75ml의 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(82 : 10 : 8)에 용해하고, 이 용액을 3.33l의 실리칼겔(Quantum LP-1)/C₁₈을 함유하는 4.7×192cm 칼럼상에 적용한다. 칼럼을 동일 용매계로 처리하고, 350ml용적으로 분획을 수집한다. 280nm에서 UV 모니터로 분리과정을 추적한다. 핵을 함유하는 분획을 합해, 진공 농축시켜 용매를 제거하고 동결 건조시켜 5.2g의 정제된 A-21978C 핵을 수득한다.

[실시예 2]

A-21978C 핵의 다른 제조방법

B항을 일부 변화시키는 것을 제외하고는 제조실시예 1의 방법에 따라 A-21978C 핵을 제조한다. 에이-유타엔시스 배양물을 처음에 약 48시간 배양하고, 기질(반-정제 A-21978C 복합체 50g)을 가한후 약 16시간 배양한다. 육즙 여액을 3.1l의 HP-20 수지를 함유한 칼럼에 통과시키고, 칼럼을 10배량의 물로 세척한 뒤 물 : 아세토니트릴(95 : 5)로 용출시킨다. 제조실시예 1과 같이 용출을 모니터한다. 24l를 모은후, 용출 용매를 물 : 아세토니트릴(9 : 1)로 바꾼다. 핵을 함유하는 분획은 이 용매로 용출된다. 이들 분획을 합해, 진공 농축시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 24.3g의 반-정제 A-21978C 핵을 생성한다.

이 반-정제 A-21978C 핵(24.3g)을 물(400ml)에 용해한다. 이 용액을 0.2% 아세트산 및 0.8% 피리딘을 함유하는 물 : 메탄올 : 아세토니트릴( 8 : 1 : 1)중에서 3.33l의 실리카겔(Quantum LP-1)/C₁₈을 함유한 4.7×192cm 강철 칼럼상에 적용한다. 칼럼을 약 2000psi에서 동일 용매로 처리하여 350ml/분획을 수집한다. 280nm UV로 용출을 모니터하여 핵을 함유한 분획을 합해, 진공 농축시켜 용매를 제거하고, 동결 건조시켜 14g의 매우 순수한 A-21978C 핵을 수득한다.

[실시예 3]

N_Orn-t-BOC-A-21978C 인자 C₂및 C₃의 제조

미합중국 특허 제4,208,403호에 기술된 바와 같이 제조한 A-21978C 인자 C₂및 C₃의 혼합물 10g을 물 50ml에 고주파 분해하에 용해한다(200mg/ml). 용액의 pH는 5N NaOH 3.6ml에 의해 4.05로부터 9.5로 조절하고, 디-3급-부틸 디카보네이트 3.0ml를 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 교반한다. 반응액의 pH는 5N NaOH를 가해 9.5로 유지시킨다(2시간동안 6.5ml를 가함).

반응은 CH₃CN : H₂O(7 : 3 및 8 : 2) 용매계를 사용한 실리카겔상 TLC에 의해 주기적으로 모니터한다. 검출은 UV에 의한다.

약 10분 후에 반응 용액은 급격히 혼탁해지며 염기의 소모가 증가된다. 30분후에, 혼탁도의 증가속도 및 염기소모 감소속도는 반응의 완결을 시사한다. 그러나, 반응을 90분간 더 지속시켜 완결을 확실히 한다. 2시간에 걸친 반응의 끝무렵에 반응물질을 동결건조시켜 12.7g의 N_Orn-t-BOC-A-21978 인자 C₂및 C₃를 생성한다.

유사한 과정에 따라, 반응물 10g을 사용하여 2회, 30g을 사용하여 1회 반응을 실시한다. 각각의 경우에 반응 시간은 불과 40분이다. 10g을 사용한 2회의 실험에서, 각각 11.9 및 12.1g의 생성물이 수득된다. 30g을 사용하여 반응을 수행한 결과 35.4g의 생성물이 수득된다.

[실시예 4]

A-21978C N_Orn-t-BOC 핵의 제조

A. 에이. 유타엔시스의 발효

에이. 유타엔 시스의 발효는 사면 배지 A 및 생산용 배지 I를 사용하고 생산용 배지를 약 66시간 배양시켜 제조실시예 1, A항에 기술된 바와 같이 수행된다.

B. N_Orn-t-BOC 복합체의 탈아실화

A-21978C N_Orn-t-BOC 복합체(약 176g의 A-21978C 복합체를 함유한 1185g의 조 기질)를 발효 배지에 가하고, 제조 실시예 1, B항에 기술된 바와 같이 탈아실화시킨다. 약 24시간후에 탈아실화의 완결이 HPLC로 확인된다.

C. A-21978C N_Orn-t-BOC 핵의 분리

B항에 기술된 대로 수득한 발효육즙 100l를 여과 보조기(Hyflo super-cel)로 여과한다. 7.5l의 HP-20수지(DIAION)를 함유한 칼럼에 여액을 통과시키고, 칼럼을 물(38l)로 세척한다. 실리카겔/C₁₈HPLC 및 254nm에서의 UV 검출로 용출을 모니터한다. 소량의 핵의 세척시 용출된다. 물 : 아세토니트릴 혼합물로 핵의 용출을 계속한다 : (95 : 5)-40l; (9 : 1)-40l; 및(85 : 15)-100l, 핵을 함유한 분획을 한해, 진공 농축시켜 용매를 제거하고, 동결 건조시켜 298.5g의 반-정제 A-21978C N_Orn-t-BOC 핵을 수득한다.

D. A-21978C N_Orn-t-BOC 핵의 정제

C항에서 기술된 바와 같이 반응을 수행하여 수득한 반-정제 A-21978C N_Orn-t-BOC 핵 30g을 0.2%아세트산 및 0.8% 피리딘을 함유하는 물 : 아세토니트릴(9 : 1) 75ml에 용해하고, 동일 용매계중에서 평형화시킨 실리카겔(Quantum LP-1)/C₁₈3.33l를 함유하는 4.7×192cm 강철 칼럼에서 적용시킨다. 칼럼을 0.2% 아세트산 및 0.8% 피리딘을 함유한 물 : 아세토니트릴 : 메탄올(80 : 15 : 5)로 가압하에 처리하여, 350ml 씩의 분획을 수집하여 280nm UV로 생성물을 검출한다. 생성물을 함유하는 분획을 합해, 진공 농축시켜 용매를 제거하고 동결 건조시켜 18.4g의 순수한 A-21978C 핵을 수득한다.

[실시예 5]

A-21978C N_Orn-t-BOC 핵의 다른 정제방법

제조실시예4의 C항에서 기술한 바와 같이 수행하여 수득한 반-정제 A-21978C N_Orn-t-BOC 핵(10.8g)을 물에 용해시켜 80ml의 앰버라이트 IRA-68 (아세테이트 사이클)을 함유한 칼럼에 적용한다. 칼럼을 물로 세척하고, 5mL/분의 유속으로, 0.05N 아세트산(1080ml), 0.01N 아세트산(840ml), 및 0.2N 아세트산(3120ml)으로 연속 용출시켜, 120ml 씩의 분획을 모은다. 실리카겔/C₁₈상에서, 0.2% 암모늄 아세테이트를 함유한 물 : 아세토니트릴 : 메탄올(80 : 15 : 5) 혼합물을 사용하여 분석적 HPLC를 실시하고 254nm UV로 생성물을 검출한다. 생성물을 함유하는 분획을 합해, 피리딘에 의해 용액의 pH를 5.8로 조절하고, 이용액을 진공하에 약 200ml 용적으로 농축한다. 농축물에 물을 가하고, 생성된 용액을 재농축시켜 피리딘을 제거한다. 이 농축물을 동결 건조시켜 순수한 A-21978C N_Orn-t-BOC 핵 3.46g을 수득한다.

[실시예 6]

하기 방법은 "활성 에스테르"법에 의해 일반식(4)의 화합물을 제조하는 방법을 설명해 준다. 본 방법에 따라 제조되는 선택적 화합물은 R이 CH₃(CH₂)₈CO-(n-데카노일)이고, R¹이 수소이며 R²가 t-BOC 또는 수소인 일반식(4)의 화합물이다.

N_Trp-(n-데카노일) A-21978C 핵

A. 2, 4, 5-트리클로로페닐 n-데카노에이트의 제조

디에틸에테르(1l) 및 피리딘(120ml) 중에 용해시킨 데카노일 클로라이드(Pfaltz and Bauer, 5.6ml) 및 2, 4, 5-트리클로로페놀(5.6g)의 용액을 4시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고 진공하에서 건조시킨다. 용출제로 톨루엔을 사용하여 실리카겔 칼럼(Woelm) 상에서 2, 4, 5-트리클로로페닐 n-데카노에이트를 정제한다. 분획을 TLC로 추적하고 단파 UV를 사용하여 검출한다. 적합 분획을 취하여 진공하에서 건조시켜, 10.4g의 2, 4, 5-트리클로로페닐 n-데카노에이트를 수득한다.

B. 2, 4, 5-트리클로로페닐 n-데카노에이트를 사용한 N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵의 아실화 무수 DMF(500ml)중에 용해시킨 N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵(15.0g) 및 2, 4, 5-트리클로로페닐 n-데카노에이트(15.0g)의 용액을 주위온도에서 N₂대기하에 25시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 60℃에서 5시간동안 또는 TLC 분석으로 반응이 완결됨이 확인될때까지 교반한다. 반응 혼합물을 진공하에서 약 200ml로 농축시키고, 1.2리터의 Et₂O/톨루엔(5 : 1)을 가하여 교반한다. 여과하여 생성물을 분리하고, Et₂O로 세척한 후, 진공하에서 건조시켜 19.05g의 N_Trp-(n-데카노일)-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵 중간체(일반식(4)에서 R=n-데카노일, R¹=H, R²=t-BOC인)를 수득한다.

C. N_Trp-(n-데카노일)-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵의 정제

N_Trp-(n-데카노일)-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵 중간체를 하기의 방법으로 정제한다. 조 생성물은 약 60ml의 용출 용매계에 용해시키고, 역상 C₁₈실리카겔 흡착제를 충진한 카트리지(cartridge)를 포함하는 Wa-ters Prep 500 system을 사용하여, HPLC로 정제한다. 이계(system)를 0.2% 피리딘 및 0.2% HOAc를 함유하는 H₂O : MeOH : CH₃CN(50 : 15 : 35)로 용출시키고, 분획을 280nm에서 UV로 추적한다. 적합한 분획을 합치고 진공하에서 건조시켜 8.56g의 정제된 N_Trp-(n-데카노일)-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵을 수득한다.

D. N_Orn-t-BOC 그룹의 제거

15ml의 트리플루오로아세트산/1, 2-에탄디티올(10 : 1)에 N_Trp-(n-데카노일)-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵(1.47g)을 용해시키고, 주위온도에서 3분동안 교반하여 t-BOC그룹을 제거한다. 반응 혼합물을 진공하에서 건조시키고, 잔사를 Et₂O (50ml)로 연마시킨다. 이를 20ml의 Et₂O 세척하고, 진공 건조시켜 2.59g의조 N_Trp-(n-데카노일)-A-21978C 핵(일반식(4)에서 R=n-데카노일, R¹및 R²=H인)을 수득한다.

E. N_Trp-(n-데카노일)-A-21978C 핵의 정제

하기에 기술된 역상 HPLC 법으로 조 N_Trp-(n-데카노일)-A-21978C 핵을 정제한다. 시료(2.59g)를 4.0ml의 H₂O : MeOH : CH₃CN : 피리딘 : HOAc(50 : 15 : 35 : 2 : 2)중에 용해시키고, LP-1/C₁₈흡착제를 충진한(33×1 인치) 스테인레스스티일 칼럼중에 주사한다. 칼럼을 상기와 동일 용매계로 용출시키는데. 1200 내지 1700psi, 10 내지 12ml/분의 유출속도로 LDC 이중펌프(Milton-Roy)를 사용하여 용출시킨다. 용출물을 UV 검출기[ISCO Model UA-5, Instument Specialist Co., 4700 Superior Avenue, Lincoln, Nebraska 68504]를 사용하여 280nm에서 추적한다. 2분마다 분획(20 내지 24ml)을 합쳐 항균활성으로써 지시되는 바람직한 분획을 합치고 진공 건조시켜 1.05g의 생성물을 수득한다. 4.35g, 4.25g, 2.14g, 2.00g 및 1.75g의 조 출발 발유도체를 반복하여 정제함으로써 총 5.58g의 정제된 N_Trp-(n-데카노일)-A-21978C 핵을 수득한다.

[실시예 7]

본 실시예는 일반식(5)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 본 방법에 따라 제조된 선택적 화합물은 R이 N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐이고 R²가 t-BOC 또는 수소인 일반식(5)의 화합물이다.

N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-A-21978C 핵의 제조

A. N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐

2, 4, 5-트리클로로페놀레이트의 제조

1리터의 무수 에테르중에 용해시킨 N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐(31.9g, 0.1몰) 및 2, 4, 5-트리클로로페놀(19.7g, 0.1몰)의 용액을 N, N'-디사이클로헥실카보디아미드(20.6g, 0.1몰)로 처리하고, 실온에서 밤새 교반시킨다. 여과하여 침전된 N, N'-디사이클로헥실우레아를 제거하고 여액을 진공하에서 농축 건조시킨다. 수득된 잔사를 에테르로 연마하고, 여과하여(사이클로헥실우레아잔사) 고체를 제거한다. 감압하에 서 여액을 증발건조시킨다. 잔사를 아세토니트릴로 결정화하여 36.9g의 결정성 N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐2, 4, 5-트리클로로페놀레이트를 수득한다(융점 122 내지 124℃).

B. N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵의 제조

무수 DMF중에 용해시킨 N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐 2, 4, 5-트리클로로페놀레이트(10g, 0.02몰), N_Trp-t-BOC-A-21978C 핵(10g, 0.006몰)의 용액을 질소대기하 실온에서 96시간동안 교반시킨다. 감압하에 증류시켜 용매를 제거한다. 잔사에 디에틸에테르(800ml) 및 클로로포름(200ml)의 혼합물을 가하여2시간동안 교반한다. 여과하여 생성물을 분리하고 연갈색 분말을 수득한다(10.3g). 이(9.9g)를 메탄올(200ml)에 용해시키고, 정지상으로 "Prep LC/System 500" 단위 및 PrepPak-500/C₁₈칼럼을 사용하여 제조용 HPLC 함으로써 정제한다. 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(2 : 1 : 2) 용매계를 사용하여 칼럼을 용출시키고, 1분당 1분획의 속도로 250ml의 분획을 모은다. 목적 화합물은 9번째 분획 내지 22번째 분획에서 용출된다.

TLC 분석을 기초로 분획을 합친다[역상 실리카겔/C₁₈사용, 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(3 : 3 :4)로 전개시키고, Van Urk Spray로 검출함]. 합친 분획을 바이오오토그라피(bioautography)하고 [실리카겔 TLC 아세토니트릴 : 아세톤 : 물(2 : 2 : 1) 용매계, 검출미생물로 마이크로코커스 루테우스 사용], 단일의 생물학적 활성 성분으로 구성되었는지를 확인한다. 이렇게 함으로써 6.02g의 N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵[일반식(5)에서 R=N-(n-데카노일-L-페닐알라닐)이고, R¹=t-BOC 인 화합물]을 수득한다.

C. N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-A-21978C 핵의 제조

100ml 용 플라스크를 빙욕중에서 5℃로 냉각시킨다. B항에서 기술된 바에 따라 제조된 N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵(6.02g, 0.008몰)및 2% 아니솔(50ml)을 함유하는 무수 트리플루오로아세트산을 차례로 플라스크에 가한다. 이 혼합물는 약 2분후에 용액으로 되는데, 질소 대기하에서 10분간 교반시킨다. 이 용액을 감압하 40℃ 이하에서 증발 건조시켜, 고무상의 고체를 수득하며, 디에틸 에테르 : 디클로로메탄(4 : 1)액 100ml로 2회 연마시킨다. 여과하여 고체를 수득하고 디에틸 에테르로 세척하여 TFA 염을 수득한다. 이를 물(50ml)에 용해시키고, 피리딘을 사용하여 pH를 5.4로 조절한다. 다음에 용액을 동결건조시켜 6.1g의 회백색 동결건조물을 수득한다.

동결건조물은 메탄올(35ml)에 용해시키고, 역상 C₁₈실리카겔칼럼(waters Associates, Prep 500)을 사용하고, 0.1% 피리디늄 아세테이트를 함유하는 3 : 1 : 2, 2 : 1: 2 및 1 : 2 : 2 비의 H₂O : CH₃OH : CH₃CN를 용출제로 차례로 용출시켜 정제하고, 250ml의 분획을 모은다. 목적 생성물은 2 : 1 : 2 비의 상기 용출제로 용출시키는 동안 용출된다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 2.23g의 크리임 색 N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-A-21978C 핵 (일반식(5)에서 R=N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐이고 R¹=H인 화합물)을 수득한다.

생성물을 하기 조건에서 각각 HPLC, TLC 및 바이오오토그라피로 분석 평가한다.

이들 방법 각각으로, 생성물이 균일함을 확인한다. 트립토판 N말단 위치의 치환은 360MHz PMR로 확인한다. 또한 생성물에 1당량의 L-페닐알라닌이 결합됨을 아미노산 분석으로 확인한다.

[실시예 8]

하기 방법은 그외 일반식(5)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 본 방법에 따라 선택적으로 제조되는 화합물은 R이 p-(n-도데실옥시)-벤조일이고 R¹이 t-BOC 또는 수소인 일반식(5)의 화합물이다.

A. N_Trp-p-(n-도데실옥시)벤조일-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵의 제조

400ml의 무수 디메틸포름아미드중에 용해시킨 p-(n-도데실옥시)벤조일 2, 4, 5-트리클로로페놀레이트(0.9몰), A-21978C t-BOC 핵(0.9몰)의 용액을 질소대기하 실온에서 120시간동안 반한다. 감압 증류하에 용매를 제거하고, 잔사에 디에틸에테르(400ml)와 클로로포름(400ml)의 혼합물을 가하여 2시간동안 교반한다. 생성물을 여과하여 분리하고 건조시켜, 연갈색 분말(0.962g)을 수득한다. 이 물질의 일부(0.78g)을 메탄올(200ml)에 용해시키고 "Prep LC/System 500" 단위(Waters Associates, Inc., Milford Mass) 및 Prep Pak-500/C₁₈칼럼(Waters Associates)을 정지상으로 사용하여, 제조용 HPLC에 의해 정제한다. 칼럼을 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(2 : 1 : 2) 용매계로 처리하고, 250ml의 분획(1분획/분)을 모은다. 목적 화합물은 2번째 내지 6번째 분획에서 용출된다.

TLC[역상/C₁₈실리카겔, 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(3 : 3 : 4)로 전개시키고, Van Urk spray로 검출한다. 분석결과를 기준으로 분획을 합쳐 실리카겔 TLC, 아세토니트릴 : 아세톤 : 물(2 : 2 : 1) 용매 및 스타필로코커스 아우레우스를 시험 미생물로 사용하여 바이오오토그라피하여, 생성물이 단일 생물활성 성분임을 확인한다. 이와 같은 방법으로, 0.421g의 N_Trp-p-(n-도데실옥시)-벤조일-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵을 수득한다.

B. N_Trp-p-(n-도데실옥시)벤조일 A-21978C 핵의 제조

2% 아니솔을 함유하는 5ml의 트리플루오로아세트산중에 용해시킨 N_Trp-p-(n-도데실옥시)벤조일-N_Orn-t-BOC-A-21978C 핵(230mg)의 용액을 0℃에서 5분간 교반한다. 이 용액을 진공하에서 오일로 농축시키고, 오일을 Et₂O(100ml)로 연마한다. 고체를 분리하고, 건조시켜 물(10ml)중에 가한다. 피리딘을 가하여 이 액의 pH를 3.25 내지 7로 조절한다. 생성된 용액을 동결 건조하여 179mg의 백색 무정형 N_Trp-p-(n-도데실옥시)벤조일-A-21978C 핵을 수득 한다. 이 화합물은 아세토니트릴 : 아세톤 : 물(2 : 2 :1)용매계 및 검출하기 위해 Van Urk spray를 사용하여 실리카겔상에서 TLC 할때, R_f치가 약 0.78이다.

[실시예 9]

일반식(4) 및 (5)의 화합물에 대한 항균 활성은 마우스에 대한 시험관내 표준 한천 평판 디스크 확산 시험 및 한천 희석시험 및 전신성 세균 감염에 대한 효능을 평가하는 생체내 표준 시험으로 확인한다. 대표적인 일반식(4) 및 (5) 화합물의 항균 시험 결과는 표(I), (Ⅱ) 및(Ⅲ)에 명시되었다.

표(I)는 실시예 6 내지 8의 화합물에 대한 한천 평판 디스크 확산법에 의한 시험관내 시험 결과를 나타낸다.

표(Ⅱ)는 실시예 6 내지 8의 화합물에 대한 표준 한천 희석시험 결과를 나타낸다. 표(Ⅱ)에서, 활성은 시험화합물이 균의 성장을 억제할 수 있는 최저 농도, 즉 최소 억제농도(MIC)로 측정된 것이다.

마우스에 있어서 실험실적 세균감염에 대한 유도체의 효능을 평가하는 생체내 시험 결과를 표(Ⅲ)에 명시하였다. 이들 시험에서는, 두가지 용량의 시험 화합물을 감염 중의 마우스에 피하 또는 경구투여하여, 그활성을 ED₅₀값[시험동물의 50%를 보호하는 mg/kg 단위의 유효용량 : 참조 Warren Wick, et al., J.Bacteriol 81, 233-235(1961)]으로 나타낸다.

대표적인 일반식(4) 및 (5) 화합물의 독성은 표(Ⅳ)에 명시되었다.

[표 I]

한천 평판 디스크 확산 시험에 의한 일반식(I) 화합물의 항생물질역가

a 화합물을 1mg/ml의 농도로 수중 현탁시키고, 7-mm 디스크를 현탁액중에 담갔다 한천 면에 놓은 후 25 내지 37 1/4℃에서 24 내지 48시간동안 배양시킴.

b 최소 영양 한천에서 성장.

[표 Ⅱ]

한천 희석 시험에 의한 항생물질역가

a mcg/ml로 표시한 MIC화합물 번호=실시예 번호

b 페니실린-내성균주

c 메티실린-내성균주

d 2회 실험

e 3회 실험의 중앙값

[표 Ⅲ]

사이클릭 펩타이드의 생체내 역가

a mg/kg×2

b 2회 실험

[표 Ⅳ]

A-21978C 사이클릭 펩타이드의 독성

a 정맥내 투여

Claims (15)

1. (a) R, R¹및 R²중 하나이상이 수소인 일반식(1) 화합물에서 아미노그룹 NHR, NHR¹및 NHR²중 하나 이상을 보호하여 R, R¹및 R²중 하나 이상이 아미노 보호그룹을 나타내는 일반식(1) 화합물을 제조하고/하거나 (b) R이 수소 또는 아미노보호 그룹이 아닌 일반식(1)의 화합물을 탈아실화하여 R이 수소인 일반식(1)의 화합물을 제조하고, 임의로, 필요하면, 반응 생성물중에 존재할 수 있는 R¹또는 R²아미노보호 그룹을 제거함을 특징으로 하여, 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.

   

   상기식에서, R은 수소, 아미노보호그룹, 8-메틸데카노일, 10-메틸운데카노일, 10-메틸도데카노일, A-21978C 인자 C₀의 특정 C₁₀-알카노일 그룹 또는 A-21978C 인자 C₄및 C₅의 특정 C₁₂-알카노일 그룹이고, R¹및 R²는 독립적으로 수소 또는 아미노 보호5그룹 이나, 단, R이 수소 또는 아미노 보호그룹이 아니면 R¹및 R²중 적어도 하나는 아미노 보호그룹이어야 한다.
2. 제1항에 있어서, 탈아실화단계를, 수성 매질 중의 일반식(1)의 화합물을 탈아실화가 상당히 완결될때까지 악티노플라나아세아에(Actinoplanaceae)과의 미생물에 의해 생성되는 탈아실화 효소에 노출시켜 수행하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 악티노플라나세아에(Actinoplanaceae)과의 미생물이 악티노플레인스(Actinoplanes)속의 구성원인 방법.
4. 제3항에 있어서, 미생물이 악티노플레인스 유타엔시스(Actinoplanes utahensis)인 방법.
5. 제3항에 있어서, 미생물이 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(한국 기탁번호 : KFCC-10054, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 또는 그의 돌연변이체 또는 변종인 방법.
6. 제3항에 있어서, 미생물이 스트렙토스포란지움 로제움 바르. 홀란덴시스(Streptosporangium roseum var. holandensis) NRRL 12064(한국 기탁번호 KFCC-10055, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17) 또는 그의 돌연변이체 또는 변종인 방법.
7. 제3항에 있어서, 미생물이 악티노플레인스 미조우리엔시스(Actinoplanes missouriensis) NRRL 12053(한국 기탁번호 : KFCC-10056, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17)또는, 그의 돌연변이체 또는 변종인 방법.
8. (정정) 제3항에 있어서, 미생물이 악티노플레인스 종(Actinoplanes sp.) NRRL 12065(한국 기탁번호 : KFCC-10053, 한국 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 또는 그의 돌연 변이체 또는 변종인 방법.
9. 제3항에 있어서, 미생물이 악티노플레인스 종(Actinoplanes sp.) NRRL 8122(한국 기탁번호 : KFCC-10052, 한국 기탁기관, 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 또는 그의 돌연변이체 또는 변종인 방법.
10. 제2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9항에 있어서, 효소가 악티노플라나세아에 균 생성 배양물중에 존재하는 방법.
11. 제1항에 있어서, R이 수소인 방법.
12. 제11항에 있어서, R¹이 수소인 방법.
13. 제12항에 있어서, R²이 수소인 방법.
14. 제12항에 있어서, R²가 아미노 보호그룹인 방법.
15. 제11항에 있어서, R¹가 아미노 보호그룹인 방법.