HU195839B - Process for producing cyclic peptide derivatives marked a-21978 c - Google Patents

Description

Λ találmány tárgya eljárás antibiotikus tulajdonságokkal rendelkező ciklusos pepiidéi; új származékainak félszinloLikus úton va ló előál 11 tására.

Nagy szükség van új antibiotikumok ki- 5 fejlesztésére, mivel állandóan fenyeget az a lehetőség hogy kórokozó mikroorganizmusok antibiotikum-specifikus rezisztens törzsei jelennek meg· Különösen a Gram-pozitlv Slnphylococcun ós SlrepLococcus nembe tartozó 10 kórokozók rozisztensok gyakran a szokásosan használt antibiotikumokkal, mint penicillinnel és erütromicinnol szsroben (lásd például W.O. V'oye, l’rinciplos of Medicinái Chomistry, 684-686. oldal, 1974). 15

Λ találmány szerint hatékony vegyüloteknek találtuk az A-21978C ciklusos peptidok díj származékait és gyógyszerészetilog elfogadható sóikat.

Ezeket az ój származékokat úgy állítjuk 20 elő, tiogy az A-21978C magot vagy ennek védett származékait - melyeket a megfelelően védett A-21978C komplex vagy az utóbbi megfelelően vedott egyedi Co, Ci, C2, C3, C, vagy Cs faktorainak dezacilozésóvel állítot- 25 l.unk elő - a kívánt acilezőszerrel vagy annak roakcióképes származékával reagáltatjuk.

Λ találmány szerint az 1 általános képletű A-21978C ciklusos peptidok - melyekben R jelentése hidrogénatom, 1-C 30 szénatomos alkanoil-oxi-karbonil—csoport, 1-motil-dekanoil-, 10-metil-undekanoil-, lU-inetil-dodekanoil-csopoi'L, az A-21978C Co faktor specifikus 10 szénatomos 35 alkanoil-csoportja, vagy az A21978C·! és C5 faktorok specifi-, kue, 12 szénatomos alkanoil-csoportja;

11' és lí^z egymástól függetlenül .hidrogén- 40 atomot vagy 1-6 szénatomos alkanoiloxi-karbonil-csoportot jelent;

azzal a kikötéssel, hogy ha R hidrogénatomtól vagy 1-6 szénatomos alkanoiloxi-karboníl- 45 -csoporttól eltérő jelentésű, az R¹ ós R² szubsztituensek közül legalább az egyiknek 1-6 szénatomos alkanoiloxi-kurbonil-caoportot kell jelentenie, továbbá R, R* és R^s egyidejűleg nőm lehet 1-6 szónatomoe alkanoiloxi- 50 -knrbonil-CBoport - és o peptidok gyógyszorészotilog elfogadható sói közbenső termékekként használhatók félszinlotikus baktériumellenes hatóanyagok előállításához.

Az 1 általános képletű vegyületek, me- 55 lyekbcn R hidrogénatomtól vagy amino-védócsoporl.tól eltérő jolenl.ésű, az A-21978C antibiotikum komplex védett C«, Ci, C2, C3, C1 és Cs faktorai. E védott antibiotikus vegyületek hasznos közbenső termékei ogyos 1 ál- CO I,alános képletű poptidoknok, vagyis azoknak, melyekben R hidrogénatomot és az R* és Ii² szubszlituoiincknek legalább egyike ainino- védőcsoportot jelent.

Az 1 általános képletű vegyületet, ahol R, K¹ és R² hidrogénatomot jelent, az A-21978C antibiotikum komplex C„, Ci, C2, Cj, C« és Cs faktoraiban közösen jelenlevő ciklusos peptid. Kényolmi okból o vegyületet A-21978C magnak fogjuk nevezni. E vogyület a 2 képlettel írható le, melyben „3MG L-treo-3-metil-glutaninsavat jelent.

Egy másik vonatkozásban a találmány tárgyát egy nz A-21978C komplex, uz Λ-21978C Co, Ci, C2, Co, C« és Ct faktorok, a védeti A-21978C komplex ée a védett A-21978C Co, Ci, C2, Co, Ct ós Ct faktorok közül kiválasztott antibiotikum enzimalikus dezacilczéscnck eljárása képezi. A természetes előfordulású A-21978C faktoruknak közös ciklusos peptid magjuk van, de mindegyiknek más a zsirsavcsoportja. Az A-21978C faktorok ás blokkolt faktorok zslrsavcsoporljait a találmány szerint úgy lóvolitjuk cl, hogy az antibiotikumot vagy blokkolt antibiotikumot teljes dezacileződésig vizes közegben egy az AcLiuoplaiies nemzetségbe tartozó mikroorganizmus állal termelt enzim behatásának tesszük ki.

Λ találmány, előnyös eljárása szerint a zsirsav-oldallánc lehasitására az Actiriopinnes utahensis NRRL 12052 mikroorganizmus által termelt enzimet használjuk. A dozacilezóst szokásosan ügy hajtjuk végre, hogy nz A. utahensis tenyészetéhez hozzáadjuk a megfelelő antibiotikumot vagy blokkolt antibiotikumot ós fi tenyészetet a dezncilezódós bekövetkezéséig inkubáljuk. Az így kapott Λ-2J978C ciklusos peptidet vagy blokkolt pepiidet a fermentléből ismert módszerekkel választjuk oh

Az .1 általános képletű A-21978C ciklusos peptidok ujraacilezhetők ós belőlük ily módon új antibiotikus anyagok állíthatók elő.

A mellékelt infravörös abszorpciós spektrumok - melyeket KBr pasztillák formájában

vettünk fel - a következők:
1. ábra	- A-21978C mag (1 általános képlet, R, lí1, Ra = 11)
2. ábra	- A-21978C Nor.-t-UOC mag (1 általános képlet, R ós R1 = 11; R1 = terc-buloxi-karbonil-csoport).
A leírás	:ban a kővetkező általánosan is-
mert rövidítéseket alkalmazzuk:
Ala:	alanin
Asp:	aszparaginsav
Gly:	glicin
Iíyn:	kinurenin
Orn:	ornitin
Ser:	szerint
Thr:	treonin
Trp:	tri p tófűn
t-BOC:	terc-butoxl-karbonil-csoport
Cbz:	benzil-oxi-kurbonil-csoport
DME:	dimetil-formamid
THE:	tetrahidrofurán
HPLC:	nagyhatékonyságú folyadék kromalográfia

C

T1..C: vékonyrótog-kromatográfin

UV: ultraibolya

Az A-21978C antibiotikumok egymással szoros rokonságban álló savas pepiid antibiotikumok, ás az itt hivatkozott 4,208,403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti őket. A 4,208,403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint az A-21978 antibiotikum komplex főkompononse a C faktor, amely maga is szoros kapcsolatban álló faktorok komplexe. Az Λ-21978 C faktorok, melyet A-21978C komplexnek nevezünk, egyedi Co, Cl, Cz, C3, C4 és Cr. faktorokat tartalmaz. A Ci, Cz, és C3 faktorok a fő faktorok és a Co, C4 és Cs faktorok a kisebb mennyiségűéi;. Az A-21978C faktorok szerkezetét a 3 általános képlet szemlélteti, melyben .3MG’ L-treo-3-metil-glutaminsavat és R^H specifikus zslrsavrészt jelent. A faktorok specifikus R^N csoportjai a következők:

Λ-21978 C faktor	ItN rész
Ci	8-inelil-dokanoil
Ci	10-metil-undokanoil
Cj	10-metil-dodokanoil
Co	10 szénatomos alkanoil*
C«	12 szénatomos-alkanoil2
Cr.	12 Bzónatomos-alkanoil*
* Még nincs azonosítva.

Ha pepiid antibiotikumok dozacilezósénok problémája merül fel, rondkívül nehéz kideríteni, létezik-c ilyen célra alkalmas onzim. Ilyen onzimot találni még nehezebb, ha a szubsztrát antibiotikum ciklusos .pepiid magol. tartalmaz. Mivel az enzimek szubsztrál-spocificitása nagyfokú, a szubsztrát peptidrészébon és oldalláncában levő különbségek kihatunk a dezacilozésl kísérlet kimenőiére. Ezenfelül sok mikroorganizmus nagy szómban termői poptidázoknt, melyek a peptidrósz különböző részeit támadják. Ez gyakran a termék kezelhetetlen keverékéhez vezet.

Mindegyik A-Z1978C antibiotikumban <3 általános képlet) a zsirsav-oldallánc (R^N) a triptofán-rósz alfa-aminocsoportjához kapcsolódik. Megállapítottuk, hogy a zsíreav-oldollánc. enzimatikusnn úgy hasítható le, hogy közben az A-21978C peptid többi részének kémiai integritása megmarad.

A találmány körébe tartozik az új eljárás is, amellyel a fenti 1 általános, képletű Λ-21978C ciklusos peplideket ób e vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sóit állítjuk elő. Az J általános képletű ciklusos poptidek vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóik hasznos közbenső termékek baktériumellenes hatóanyagok előállításához, melyek különösen Grampozitív mikroorganizmusokkal szemben hatásosak.

Az 1 általános képletű ciklusos poptidek - melyekben R jelentése hidrogénatom - körébe tartozik az A-21978C Co, Ci, Ca, Co, C« és Cs faktorok közős ciklusos poptidje (Λ-21978C inag) és az A-21978C mag védett származékai. Az A-21978C mag, vagyis az olyan 1 általános képletű vegyület, melyben R, R^l és R^l hidrogénatomot jelent, a 2 képkittel is leírható.

Az A-21978C mag jellemzői nz alábbiak:

Alak: fehér amorf szilárd anyag, amely rövidhullámú UV-fényben fluoreszkál.

Tapasztalati képlet: CeiHesNnOis

Molekulasúly: 1465

Oldhatóság: vízben Oldódik

Infravörös (IR) abszorpciós spektrum (KBr): a rajzok közül az í. ábrán látható; abszorpciós maximumok a kővetkező frekvenciáknál figyelhetők meg (cm*¹):

3300 (széles), 3042 (gyenge), 2909 (gyenge), 1655 (erős), 1530 (erős), 1451 (gyenge), 1399 (közepes), 1222 (közepes), 1165 (gyenge), 1063 (gyenge) és 758 (közepes-gyenge).

UV abszorpciós spektrum (metanol:) UV-maximumok 223 nm (c 41,482) és 260 nin (c 6,687).

Eleklromelrikus titralás (66% vizes DMl·’): 4 LitrálhaLó csoport van jelen, melyeknek l'Ka értéke körülbelül 5,2; 6,7; 8,5 és 11,1 (kezdeti pH 6,12).

Különösen hasznos 1 általános képletű ciklusos peptid az olyan vegyület, melyben R és Ii¹ hidrogénatomot és R² (src-buloxi-karbonil-csoporlot jelent. Kényelmi okból e vegyület „t-BOC mag-nnk nevezzük. Az A-21978C t-BOC mugjúnak jellemzői u következők:

Alak: fehér nmorf szilárd anyag, amely rövidhullámú UV-fónybon fluoreszkál

Tapasztalati képlet: Cs7ll«iHi7O»

Molekulasúly: 1565

Oldhatóság: vízben oldódik

IR abszorpciós spektrum (KBr): a rajzok közül a 2. ábrán látható; abszorpciós csúcsok figyelhetők meg a következő frekvenciákon (cm*¹):

3345 (széles), 30G5 (gyenge), 2975 (gyenge), 2936 (gyenge), 1710 (váll), 1660 (erős), 1530 (erős), 1452 (gyenge), 1395 (közepes), 1368 (gyenge), 1341 (gyenge), 1250 (közepes), 1228 (közepes), 1166 (közepes - gyenge) és 1063 (gyenge).

UV abszorpciós spektrum (90% etanol):

UV maximumok 220 nm (c 42,000) és 260 nm (c 10,600)

HPLC: retenciós idő = 6 min, 4,6x300 mm-es Cje-szilikagél oszlopon; oldószer: 0,2% ammónium-acetátot tartalmazó HjOÍClbCN) ClhOH (80:15:5); áramlási sebesség: 2 ml/min; JV-detektálás.

A találmány szerinti védett A-21978C faktorok olyan 1 általános képletű vegyületek, melyekben R¹ és R² közül legalább az egyik Hzubsztituens 1-6 szénatomos alkanoiloxi-karbonil-vódöcsoportol jelent, és R jelentése 81

-metil-dekanoíl-, lO-inotil-undekanoil·-, 10-motil-dodokanoil-csoport, az A-21978C Co faktor specifikus 10 szénatomos alkanoilcsoporlja vagy _!17, Λ-21978Ο Ci ós Cs faktorok specifikus i2 szénatoinos aikanoilcsoportja.

Λ találmány szerinti A-21978C vádolt faktorok és ciklusos peptidek sókat képezhetnek, melyek közűi a gyógyszerószetileg elfogadhatók a találmány részét alkotják. Az ilyen sók például a vegyületek elválasztására én tisztítására használhatók. Különösen hasznosak a gyógyszorészotileg elfogadható alkálifém-, alkáliföldfém-, aminsók ós Havaddiciós sók. „Gyógyszerészetileg elfogadhatók a melegvérű állatok kemoterápiájában használható sók.

Például az 1 általános képletű A-21978C ciklusos peptidoknek négy szabad karboxilcsoportjuk van, melyek BÓkat tudnak képezni. Ezért a sók körébe beletartoznak e karboxilcsoportok parciális, vegyes és teljes sói. E sók előállításakor kerülni kell a 10-nél magasabb pll-szintnL, minthogy a vegyületek ilyen pli-értók felett bomlókonyak.

Λζ I általános képletű A-21978C ciklusos peptidek jellemző és alkalmas alkálifém- és alkáliföldférn-sói közé tartozik a nátrium-, kálium-, lítium-, cézium-, rubídiuin-, bárium-, kalcium- és magnéziumáé. Az A-21978C ciklusos peptidek aminaói közé tartozik az amméuiumsó, a primer, szekunder és tercier Ci-Cí-alkil-ammónium-sók ós a hídroxi-Ca-C«-nlkil-amiuónium-sók. Jollomző aminsók például egyebek mellett azok, amelyek ogy Λ-21978C ciklusos peptid ammónium-hidroxiddal, mclil-aminnal, szek-butil-aminnal, izopropil-aminnal, dictil-amirmal, diizopropil-aminuol, elanol-aminnal, trietil-aminnal ós 3-amino-l-propanollal való roagáltatásakor képződnek.

Az l általános képletű A-21978C ciklusos peptidek alkálifém- és alkáliföldfóm kationos sóit az ilyen sók preparálására használatos eljárásokkal állítjuk elő. Például a szabad sav-formájú A-21978C ciklusos pepiidet alkalmas oldószerben, mint meleg metanolban vagy etanolban oldjuk, majd kívánt szervetlen bázis sztöchiomotrikuB mennyiségét tarbilmnzó vizes metanolos oldatot adunk hozzá. Λ képződött só rutin módszerekkel izolálható, így szűréssel vagy az oldószer lepárlásával.

Szerves aminokkal képezett sók hasonló módon állíthatók elő. Például az A-21978C ciklusos pepiidet megfelelő oldószerben, mint acotonbari oldjuk és az oldathoz gazainkéi vagy folyékony amint adunk; az oldószert és az amin feleslegét lepárlással távolítjuk el. Ezon sók előállítása azonban nem tartozik a találmány körébe.

Λ találmány- szerinti A-21978C ciklusos peplideknok három szabad ainiuocsoportjuk van és ezért savaddíciós sókat, képezhetnek, amelyek előállítása szintén a találmány részét képezi. Az A-Z1978C ciklusos poptidok jellemző és alkalmas savaddíciós sói közó tartoznak a szerves és szervetlen savakkal, mint például sósavval, kénsavval, foszforsavval, ecetsavval, borostyánkősavval, citromsavval, tcjsavvnl, maleinsavvnl, fumársavval, palmitinsavval, koisavvni, pamoosavval, mucinsavval, D-glctaminsavval, d-kámforsavval, glutársavval, glikolsavval, ftálsnvvnl, borkősavval, laurir savval, sztearinBavvuI, szaliciisavval, metár.szulfonsavval, bcnzolszulfonsnvval, szorbinsuvvul, pikrinsavval, benzoesnvvnl és fahójsavvnl, stundard reakciókkal előállított sók.

A-21978C ciklusos peptidek előállítási]

Az 1 általános képletű A-21978C ciklusos pepiidékor, melyekben R hidrogénatomot jelent, az A-21978C Co, Ci, Cj, Cs, C« és C5 faktorok, valamint védett A-21978C Co, Ci, Ca, C3, C«, és Cs faktorok közül kiválasztott pepiid antibiotikumok dezacilezéso útján állítjuk eló.

1. A szubsztrátok előállítása

Az A-21978C C„, Ci, Ca, C.i, C< és Cs faktorokul, a 4,208,403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közöltek szerint állítjuk elő. E fuktorok komponensei az A-21973C komplexnek, amely viszont az A-21978 komplex része.

Λζ Λ-21978 komplexet Streptomyces roseosporus 8R11L 11379 (deponálva .1978. augusztus 29-én) süllyesztett aerob fermentációja útján állítjuk elő, a fermentációt az antibiotikus aktivitás megjelenéséig folytatva. Λζ 0-219^8 komplex elválasztása céljából a fermentlevet átszűrjük, a szőriét pll-ját körülbelül 3-ig csökkentjük, a komplexet kiválni hagyjuk, majd a komplexet szűréssel elkülönítjük. Az elválasztott komplex cxtrakciós eljárásokkal tovább tisztítható. Λζ egyedi Λ-21978C komplex és faktorok szeparálásához kromatográfiás elválasztás szükséges.

A találmány szerinti védett A-21978C komplexet és a blokkolt A-21978C Co, Ci, Ca, C3, C» ér Cs faktorokat (f általános képletű vegyületek, ahol R jelentése 8-melil-dekanoil-, 10-metil-undekanoil·-, 10-metil-dodekanoil-csoport, vagy a Co, Ci és C5 faktorok C10és Cn- -aikanoilcsoportja) a peptidek nini— nocsoport jait eljárások akalmazásával állítjuk elő. A vé Jőcsoportokát különböző ismort amino-védöcuopor tok közül választjuk, mint például ben zil-oxi-kar bonil-, tere-butoxi-kur bőiül-, í.ere-ainil-oxi-karbonil-, izobornil-oxi-karbonil-, ndamantil-oxi-karbonil-, o-nitro-fenil-tio-, difenil-foszfino-Lioil-, klór- vagy nitroberizil-oxi-kar bonil-esoport közül.

Λ védett A-2L978C komplex különösen előnyös szubszt.rát. Az A-21978C komplexből állítjuk < lő, elkerülve ezáltal az egyedi Λ-2.1978C faktorok előállításához szükséges szétválás'.ló műveleteket; dezacilezvc azonban egyeljen terméket kapunk: a megfelelően óluk költ magot.

II. Dozncilozó eljárás

Λ. Az enzim olőálJíhísa

1. A toríiiolő πυΆ.ΓσοΓ£·βηιζπιυβο.Ιι

Λζ A-21978C C₀₎ Ci, C₂, Ca, C« ós Cs faktorok dezacilezésóre használható enzimek az Actinoplanes ds Streptosporangium nemzetségbe tartozó egyes mikroorganizmusok, előnyösen az Actinoplanes utahensis NRRL 12052 mikroorganizmus (deponálva 1979. október 9-én) alttal termelhetők. Bár az 'enzim termelésére alkalmas az A. ulahensis NRRL. 12052 előnyös tenyésztési módszerót adjuk meg az 1. példában, a ezakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb eljárások is alkalmazhatók.

Néhány oddig izolált és jellemzett fajta és változat: Actinoplanes philippionsís, Actinoplanes armoniacus, Actinoplanes utahensis, és Actinoplanes mÍBBouriensis; Streptosporangium roseum, Streptosporangium vulgare, Slreplosporangium roseum, SlreptoBporangium vulgare, Streptosporangium roseum var. hollundonsis, Streptosporangium album, Slroplosporaugium víridialbum. Amorphospornugium auranlícolor, Ampuliarielia reguláris,

Az Actinoplanes nemzetség a találmányhoz használható enzim előnyben részesített forrása. Az actinoplanes nemen belül az Actinoplaiios ulahensis faj különösen előnyös enzimfonás.

Néhány egyéb hasznos fajtának tenyészetét a „Nothern Régiónál Research Center, Agriculturnl Research Culluro Colection (NRRL), tl.S. Department of Agriculture, 1815 Nörth University St., Peoria, Illinois 61604, IJ.S.A. bocsátja a nyilvánosság rendelkezésére, a következő nyilvántartási számokkal:

Actinoplanes utahensis NRRL 1205 (deponálva 1979. október 9.)

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 (deponálva 1979. október 9.)

ActinopJanes sp. NRRL 8122 (deponálva 1975. október 17.)

Actinoplanes sp. NRRL 12065 (deponálva ' *1979. novoinbor 5.)

Streptosporangium roseum var. hollandeneis NRRL 12064 (deponálva

1979. november 5.)

A törzs („parent”) tenyészet, melyből oz A. utahensis NRRL 12052 származik, részét képezi oz American Type Culturo Colleetion•nek is (ATCC) (12301 Parklawn Drivo, Rockville, Md. 20852) (A. utahensis ATCC 14539). Az A. utahensis ATCC 14539 tenyészet szintén használható enzimforrásként.

Az A.missuriensis NRRL 12053 az ATCC tenyészet-gyűjteményben ugyancsak deponált tenyészetből (A. missouriensis ATCC 14538) származik és az enzimnek egy másik forráséi képezi.

Az Actinoplanes nemzetségen belül valamely adott mikroorganizmus törzs dezacilező tatás-osságát a következő eljárással határoztuk meg. Alkulmas táptalajt beoltunk a mikroorganizmussal. A tenyészetet rotációs rázógépen mintegy 30 ’C-on 3 napig inkubáljuk. Ezután a szubsztrát antibiotikumok egyikét hozzáadjuk a tenyészethez, a fermentációs, közeg pH-jót körülbelül 7,0 értéken tartva. Λ tenyészet aktivitását Micrococcus Jutcus próbával mutatjuk ki, az eljárást a D. fejezetben ismertetjük. Az ontibiolikus aktivitás csökkenése azt jelenti, hogy u mikroorganizmus termeli a dezacilezéshez szükséges enzimet. Ezt azonban a kővetkező módszerek valamelyikével kell igazolni: 1/ líI’l.C-elemzés az ép mag jelenlétének kimutatására, vagy 2/ alkulmas oldallánccal (például lauroil-, n-dekanoil-, vugy n-dodekanoilesoporl) való űjraacilezés az aktivitás visszaállítása céljából. Az antibiotikus aktivitás csökkenése nehezen állapítható meg, ha blokkolt A-21978C anyagot dezacilozünk, minthogy a blokkoló csoport jelenléte az antibiotikus aktivitás 80-90%-os csökkenését okozza.

2. Az enzimtermelés körülményei

Az enzim termelésű az Actinoplanes fejlődése szempontjából kielégítő körülmények között történik, azaz mintegy 25-30 ’C hőmérsékleten, mintegy 5,0-8,0 pli-tnrtományban, rázás és levegőztetés közben. A táptalajnak a) asszimilálható szénforrást, mint szacharózt, glükózt, glicerint vagy hasonlót, és b) nitrogénforrast, mint pepiont, karbamidot, ammónium-szufátot vagy hasonlót; c) foszfátforrást, mint oldható foszfátot; cs szervetlen sókat kell tartalmaznia a mikroorganizmus növekedésének hatékony előmozdítása céljából. A növekedési ciklus megkezdődése után általában 40-G0 óra múlva képződik hatásos enzimmennyisóg és ez az enzimszint a növekedési maximum elérése után bizonyos ideig Fennmarad. Λ képződött enzim mennyisége az organizmus fajtájától és különféle tenyésztési körülményektől függően változik.

Λ szakember előtt ismert módon az enzimet termelő mikroorganizmusok - így az Actinoplanes utahensis NRRL 12052 - változóko6 π

nyuk. Például o törzsek mesterségen variánsai és mutánsai állíthatók eló ismert mutagéiickkcl, mint UV-, röntgen-sugárzással, nagyfrckvenciájú hullámokkal, radiokatív sugárzással és kémiai anyugokkal való kezelés útján, Λζ Actínop/ancs-ből előállítható és az, enzimet termelő valamennyi természetes és mesterséges mutáns felhasználható a találmány szerint.

1). Dezaciíezésí körülmények

Λ kiindulási anyagónt használt szubsztrátol. előnyösen hozzáadjuk a mikroorganizmus tenyészethez, a tenyészet mintogy 48 órás iukubálásu utón. Λ roakciókőzegben a szubsztrát koncentrációja széles határok közöli. változhat. Mégis az enzim maximális felhasználása céljából és 3 órai időtartamon belüli teljes doz.acilozéshoz a szubsztrát konceulráciúlar lománya körülbelül 1-3 mg/ml. Alacsonyabb koncentrációk is használhatók, de ilyenkor nem használjuk fel teljesen az enzimet; magasnbb koncentrációk ugyancsak alkalmazhatók, de ilyenkor esetleg a szubsztrát nem dezacileződik tökéletesen, hacsak nem növeljük a fermentáció idejét.

Λ szubsztrát antibiotikumot A-21978C maggá a találmány szelént legelőnyösebben akkor alakíthatjuk át, ha a fermentációs közeg pH- ját mintogy 7,0-7,2 tartományban tartjuk. pH 7 alatt a dozacilozés lassan folyik le; amint a pH moghaladja a 7,2 értéket, a képződött mag egyre inkább lúgos hidrolízisnek vari kitéve. Kevert fermentorokban a pH érzékelő vezérlővel szabályozható. Ahol ez nem praktikus, például lombikos fermentációnál, a pH szabályozása céljából a tápkózoghez a szubsztrát hozzáadása előtt 0,1 mólos foszfátpufíert adunk.

Λ szubsztrát. hozzáadása után a tenyészet inkubálását mintegy 3-6 órán át vagy még tovább folytatjuk. A szubsztrát tisztasága befolyásolja a dozacilozés sebességét.

Például 50% vagy nagyobb tisztaságú szubsztrát 3 óra alatt dezacileződik mintegy 2,5 mg/ml sebességgel. Kevésbbé tiszta nzubsztrútokát használva a dozacilozés valamivel lassabb ütemben megy végire.

Többszöri szí ibsz tró l~bc táplálást végezhetünk. Például 0,75 mg/ml antibiotikumot 24 órás időközökben táplálhatunk be legalább 5 vagy több alkalommal.

A dezacilezés széles hőmérséklettartományban hajtható végro, például mintogy 20—15 °C között. Mégis optimális dozacilozés elérése és a szubsztrát. és a mag stabilitása érdekében a dezncilozóst előnyösen mintogy 30 C-on hajtjuk végre.

C. Λ szubsztrát

Előnyös, do nem alapvotő tisztított antibiotikumot használni szubsztrátként. Λ tisztilőtt szubsztrát vízben vagy pufferben oldódik, ezért kényelmesebben kezelhető. Ezenfelül tisztított szubsztráttal α dezacilezés lefolyása gyorsabb. Csak 15% kiindulási antibiotikumot tartalmazó féltiszta szubszlrálok már kielégiLőei> dezacilczödnek.

Λ szubsztrát antibiotikumok antibakteriális hatékonysággal rendelkeznek. Dér α szubsztrát anyagok (főleg a kis tisztaságúnk) baklériumuejlckel vagy spórákat rejtegethetnek, amelyek foltohetőori növekedni tudnának a dezacilczö közegben és befolyásolhatnak a dozacilozcsi reakciót vagy a kiindulási antibiotikum vagy a termék mag stabilitását, ilyen jelenségeket nem figyeltünk meg. Ezért nem szükséges, hogy szubszlrálok slerilok legyenek, különösen rövid dezacilczö periódusok esetén.

D. A dezacilezés ellenőrzése

Az A-21978C komplex Co, Ci, Cz, Cj, C« és Cr. fal torai antibakteriális anyagok, amelyek különösen Microcuccus luleue ellen hatásosak. Ezért a jelenlevő szubsztrát menynyisógének a meghatározására M.Iuteust alkalmazó próbát részesítünk előnyben. Λ képződő A-2J978C mag vizoldható, de biológiailag inaktív. Ezért a biológiai aktivitás csökkenése a dezacilezés jó becslést adó, gyors próbája.

A képződött mag mennyiségileg 1IPLC-elomzésscl mutatható ki, a már leírt rendszert alkalmazva.

E. Nyug'^r6 sejtek használata

A dezacilezés egyik alternatív eljárása aorán a sejteket eltávolítjuk a Lápközegből, pufforold itban újraszuszpendáljuk és α dezacilozést a B. fejezetben leírtak szerint elvégezzük, E rendszer alkalmazása esetén az enzimatikusan aktív micéliumok újrahasználhatok. Például az Λ. uta/iensís NKRL 12052 micéliuiuok dczociláz aktivitása hűtés mellett (4-8 °C) vagy lcfugynszloLl állapotban (-20 C) 1 hónapos vagy hosszabb tárolás után is megiiinrud. Előnyben részesítjük a 0,1 mólos főt zfátpuf fért.

E. ImmobilizúlL onzimok

A dezacilezés végrehajtásának egy további módszere az enzim ismert eljárásokkal való immobilizálása (lásd például „Bioiucdicul Applicati >ns of Immobilized Enzymos and Protcins, Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plcnum Press, Now York, 1977, 1. kötet). Az immobilizál . enzim azután oszlopban (vagy más alkalmas típusú reaktorban) használható a dezacilezés végrehajtására.

Ezenfelül a mikroorganizmus maga iiiimobilizálha’.ó és a dozacilozcsi reakció kutalizálásóra használható.

-613

Λβ A-21978C cikluson popLidek hasznosság»

Ar, A-21978C ciklusos pcptidek és sóik hasznos köztilermókok fólozintetikus onlibaktorlális vogyülotok előállításához.

E kemoterápiásán hatásos vegyületek 4 általános kóplotűck, ahol

R, If* ás R’ egymástól függetlenül hidrogénatomot, 4-14 szónatoiiios alkilcsoportot, adott esetben szubsztituált alkunoil-, alkonoítcsoportot vagy nmíno-védőcsoportot jelent,

R³, R⁴ ós R⁵ mindegyike hidrogénatomot jelent, vagy (i) IV ös R*; és/vagy (ii, II⁴ és R, és/vugy (iii) R⁵ és R² együttesen alkilid öncső por tol jolonthot, azzal a kikötéssel, hogy

1) az R, R^l vagy R² szubszlituenseknok legalább ogyiko hidrogénatomtól vagy amino-védőonoportlól eltérő jelentésű legyen,

2) R' vagy il¹ közül legalább az egyik szubsztituens hidrogénatom vagy amino-védőcsoport legyen,

3) az R, R‘ ós R* csoportok együtt legalább 4 szénatomot tartalmazzanak és

4) ha 11' és R^z hidrogénatomot vagy amiiiovédőcsoporlol jelentenek, R jelentése nem lehet 8-metil-dokanoil-, lO-metil-undekanoil-, lO-mctil-dodekanoil-csoporl, az Λ-21978Ο Co faktor specifikus 10 szénatomoB-alkarioilcsoportjo vagy nz A-21378C Ci és Cs faktorok specifikus 12 szénatomos alkanoilcsoport ja; vagy e vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sói.

Λζ „alkilidonil csoport megjelölés a általános kcpletű csoporLra vonatkozik, ahol R³ és R⁴ hidrogénatomot vagy 3-13 szénatomszántó alkilcsoportot jelent, azzal a kikötéssel, hogy R³ és Π⁴ egyike hidrogénatomtól eltérő jelentésű legyen, ezenfelül az R³ ós R⁴ szubsztitunnsok szénatomjainak összege no legyen több 13-náI. Azokat a vogyülcteket, inelyekbon az R, R^l vagy R¹ szubsztituensek egyike alkilidenilcsoporlol jelent, Schiff-bázisokkónt ismerjük.

Λζ „alkil” csoport meghatározás egyértékű telített, egyenes vagy elágazó láncú, 4-14 szénatomos alkilcsoportot jelöl. Azokat a vegyületeket ahol az R, R^l vagy R^J szubsztiluensck egyike alkilcsoportot jelent, olyan megfelelő vegyületek redukálásával állítjuk eló, melyekben az R, R^l vagy R² csoport jelentése nlkilidenilcsopor t ós „redukált Schiff-bázisokként” lemérték.

Λζ ..adott esetben szubsztituált -alkanoil” és „-alkenoíl” csoport meghatározás 2-19 illetve 5-19 szénatomot tartalmazó karbonsavakból származó) acilcsoportra vonatkozik. Ha nz R csoport alkanoilcsoportot jelent, az, nlI’ilrész egyórtékű telített, egyenes vagy elágaz» láncú széiihidrogóncsoport, amely adott esetben 1 szénhidrogéncsoportot, vagy klór-, bróm- és fluoratom közül kiválasztott 1-3 lialogén-szu.bszÁituensl visel. 11a li alkenoilrsoportót jelent, nz nlkenilrósz egyórtékű telítetlen, egyenses vagy elágazó láncú szónliidrogéncsoporl, amely nem tartalmaz 3-nál Gőbb kettóskötósl. Λ telítetlen szánt)ídrogönánc kollőskölés-részeG) cisz- vagy transz-konfigurációjúak lehetnek.

„Amino-vódőcsoport” alatt n fentebb meghatározott ismeri aiiiino-védöctíoporloluil értjük.

Előnyösek az alábbi 4 általános képletű vegyületek.· n

(a) az R szubsztituens Clb(CIIi)n-Cképlotű alkanoilcsoportot jelent, ahol π 3-17 közöli) egész szám;

(b) R jelentése Clb(CIÍ2)n-C- képletű csoport, ahol ti - 5, C, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 vagy 14;

»» (c) R jelentése CIb(Clh)„-Cll(Clb)«-Cképlotü csoport, ahol n és m egymástól függetlenül 0-14 köz,ölti ogész számot jelent, azzul a kikötéssel, hogy ri+ui nem lehet kevesebb 1-nél és nem lehet nagyobb 15-nól; továbbá ha π = 0, m nem lehet 8, és ha η - 1, m nem lehet 6 vagy 8;

(d) R jelentése Clb(Clb)»CJI - ClI(Clh)»0

-C- képletű cisz- vagy transz-ulkenílesoporl, ahol n és m egymástól függetlenül 0-14 köz,ötti egész szám, azzal a kikötéssel, hogy n+ni nem lehet kevesebb 1-nél és nagyobb 15-nél;

II <e) R jelentése Clb=Cli(Cih)n-C- képletű cisz- vagy Irnnsz-allienileBoporl, ahol ti 4-15 közötti egész, számot jelent;

(f) R jelentése Clb(Cib)n-kcpielű alkilcsoport, ahol n 5-12 közötti egész szám; és

-715 (g) lí jelentése:

II

ClbfClhb-C0

II

Clb(Clb)o-Co

II

CIb(Cllz)7-Co

I»

CII.7(Cil2)e-Co

II ctbícthb-co

II

Ctb(CJh)i0-Co

II eih=eii-{c[h)_e-cII ciíjícib),!- i; o

II

Clb(CIIi)n - C ü

II

CI1.i(O1Í2)3-CH=CII-(CHj)7 - c o

II

Clb(ClÍ2)i3- C o

II

ClbCH2CIl(Clb)-(CIh)-e- c Clb(Clb)nCIb(Clfz)ioCH=

Clb(Clb)oCtbíCIhbCIIz

CtbfCIhbCIb(CH2)»CH=

Ugynucsak kemoterápiásán haeznos vogyűlotek 5 általános képlotűek, melyekben

H jelentése hidrogénatom, 8-mclil-deknrioil-, 10-nictil-dodckanoil-, 10—mobil— -undekanoilcsoport, nz A-2J978Co specifikus 10 BzónatomoB-alkanoilcsoportju vagy az A-21978C C« és Cs faktorok specifikus 12 szénatomos alkanoilcsoport ja, umino-védűcsoporl, ¹¹

-C-Q-N1Í2 általános képletű amino-ucil-csoporl, melyben Q alkilóncsoportot jelent, vagy

O

II

-W-C-R² általános képletű N-ulknnoil-amino-acil-csoport, ahol W jelentése

O

II (a· -C-A-Nll- általános képletű kétértékű amíno-acil-csoport, melyben A alkilén- vagy eikloulk iiériesoporl.ot jelent;

O Ra

II (b) -C-Cíl-NH- általános képletű kétértékű amino-ncil-csoport, ahol

R³ hidroxi-metil-, hidroxi-etil-, merkapto-mol.il-, morkupto-otil-, metil-tio-etil-, 2-tienil-, 3-indoi-mctil—, fenil-, benzil-, vagy sz.ubsztituált fenil- vagy szubsztituált benzilesoportot. jelent, melyekben a benzolgyűrűt klór-, bróm-, jóslatom, nil.ro-, alkil-, hidroxi-, alkoxi-, alkil-lio-, karbamíl- vagy alkil- kar bamil-cso port szubszti találja;

(e) b általános képletű csoport, ahol

X jelentése hidrogén-, klór-, bróm-, jódutom, amino-, nitro-, -alkil-, hidroxi-, alkoxi-, merkapto-, ulkiltio-, karbamil-, vagy alkil-karbamil-csoport;

(d) e vagy d általános képletű csoport, ahol

X^I klór-, bróm-, jódatomot, amino-, hidroxi-, alkil- vagy alkoxicsoportot jelöni;

(c) e vagy f képletű vagy g 'általános képletű csoport, ahol

I) jelentése —(CUa)n— képletű kétértékű csoport, melyben n 1-3 közöl.ti egész szám; -Cll = CH-,

II . .

-CIl=ClI-Cll2; vagy -CIhNII C - csoport;

1(^J jelentése - alkil-, vagy -nlkenilcsoporl; ó«

K¹ jelentése hidrogénatom, amino-védőc no port, <)

II

-C-Q-NIb általános képiéin, fentebb megadott amino-acil-csoporl, vagy

II

-W-C-R² általános képletű, fentebb megadott

N-nlkanoil-amino-acil~csoport; azzal a kikötéssel, hogy ha R amíno-ac.il- vagy N-alkanoil-amino-acjl-Csoporttól eltérő jelentésű, R* ainino-acil- vagy N-alkanoil-ainino-acilcsoporlol jelentsen; és ha R^l amino-védőc.soportot jelent, R amino-acil- vagy N-alkanoil-amlno-acil-CBoportot jelentsen;

vagy e vcgyüietek gyógyszerészetileg elfogadható sói.

Λζ „alkilén”, „alkil”, „alkoxi”, „alkil-tio és „alkenil” csoportok egyenes vagy elágazó szénhidrogénláncok. Λζ „alkil” csoport ogycrlókű telített szénhidrogóncsoporl. Λζ ,,«l— keni!” csoport egyórtókű telítetlen szénhidi'ogóncsoport lehet, amely cisz- vagy transz-konf igurációjú. Λζ „alkilén csoport kétértékű telített sz.éhidrogón csoport. Λ „ciktonlkilén” csoport, kétértékű ciklusos telített ο z é η I ii d r o g é n c só po r t.

Előnyben rész.esitott, jellemző nlkiléncsoport.ok az alábbiak:

-CH»-;

R⁵

I —CH—, ahol R⁵ jelentése Ci-C«-aIkilcso|kn'l (azaz metil-, etil-, η-propíl-, izopropil-, M- butil-, terc-butil-, izobutil— vagy l-metil-propil-csoport);

-(CIÍ2)m-, ahol in 2-10 közötti egész számot jelent; és

Glb-(CJl2>(i-CH-(CH2)p-,· ahol p 1-8 közötti egész számot és q 0-7 közötti egész Számot jelent, azzal a kikötéssel, hogy p+q nem lobot nagyobb 8-nál.

Előnyben részesített jellemző -alkilcsopor tok:

(a) Clb-;

(b) -(Clb)rCIb, ahol n egész számot, jelent; és	1-1G	kötólli
Clb
1 (c) -(CIb)rCIl(CIb)»CHj,	ahol r	óö s
egymástól függetlenül	0-14	közúti

egész szamot jelent, azzal a kikötéssel, hogy r+κ nem lehet nagyobb 14-nél.

Jellemző, előnyben rés7,osltett -alkenilcsopor tok:

(a) -(CIb)i-CII=CH-{Clh),,-Clb, ahol t és u egymástól függetlenül 0-14 közötti egész számot jelent, azzal a kikötéssel, hogy l+n nem lehet nagyobb 14-nél;

(b) -(ClÍ2),-CIJ=Cl[-(CIÍ2)y-Cll=CH-(Clb)z-CJb, ahol v ós z egymástól függetlenül 0-11 közötti egész, számot és y 1-12 közötti egész számot jelent, azzal a kikötéssel, hogy v+y+z nem lehet nagyol) 12-nél.

Különösen előnyben részesítjük az alábbi alkilcsopor Lókat:

ClbClb(Clb)5CIb(CIb)oCIb(Clb)eCIb(Clb)ioClb(Clb)i2CIb(CHz)HCIb(CIb)irKülőnösen előnyben részesítjük a következő a 1 k e π i 1 c. so por to k a t:

cá5z-CJb{CH2bCH=CIJ(CIb)7ü-ansz-Clb(CIb)5C]I=Cll(Clb)7c.isz-Clb(ClÍ2)ioCll=Cll{Clb)«transz-Clb(Clb)ioCH=CH(Clb)<cisz-CIb(Cll2bCH=CH(Cil2)7trunsz-ClbíCIbbClbCUÍClbbcisz-C!b(CIh)5Cn=ClI(C!l2)9Lransz-CJbíClbbClUCHÍCJb)»clsz, cÍsz-Clb(Clb)«CH=CHClbCH=CH(CIh)7transz, transzy-Clb(Clb)«CII=CHClbCH=CH (CIb)7cisz, cisz, císz-Cib Clb ClizCUCib Cil=CiiCJb Cli=Cll-(Clb)7-. '

Ha „W kétértékű, b általános képletű csoportot jelent, a szakember számára nyilvánvaló módon a -C- és

II az - Nil- funkciós csoportok orientációja a benzolgyürűbon egymáshoz képest orto-, méla- vugy para-konfiguráció lehet. Az X szubsztituens a bonzolgyűrü bármely rendelkezésre álló helyzetét elfoglalhatja. Előnyős, ha az X szubsztituens hidrogén0

II atomot jelent és a -C- és az -NH- funkció egymáshoz képest parn-helyzolben van.

Ha az 5 általános képlettel kapcsolatban mér leírt IV ezubsztituens „szubsztiLuáll feli il” és „szubsztituált benzil” csoportot jc10

-919 lent, n szubsztituens n benzolgyűrű bármely hozzáférhető bolyét elfoglalhatja, azaz a szubsztituens orto-, mota- vagy para-konfigurócióban lehet. Λζ, R³ vagy az X szubsztituonsre megadott „alkil csoport metil-, etil-, n-propil- vagy izopropílcsoportot jelent.

Az 5 általános képletű szerkezet előnyös származékai azok, amelyekben R jelentése Λ általános képletű szubsztituált benzoilcsoport, ahol X hidrogén-, klór-, bróm-, jódalomot, nitro-, alkil-, hidroxi-, alkoxi- vagy alkil-lio-csoporl; R¹ hidrogónatomoL vagy amino-vódőcsoporlol és R² alkilcsoportot jelent; vagy e vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sói.

Λ szubsztituált bonzoiiesoport, <1 a -C-funkció és az -OR² funkció a benzolgyűrűn egymáshoz képest orto-, méta-, vagy parn-orientáltságü lehet. E csoportoknál előnyös a para-orientáció. Λζ X szubsztituens a berizolgyűrűnek a fenti két csoport által szabadon hagyott bármoly rendelkezésre álló helyet elfoglalhatja.

Λζ „alkil csoport megjelölés egyenes és elágazó szónhidrogénláncokra vonatkozik.

Ha az R² szubsztituens alkilcsoportot jolont, előnyösen a következő csoportok jönnek tekintetbe:

(a) -(CILJnCIb, ahol n 7-14 közötti egész számot jelent; és (b) -(Clb)rCH(CIl2),CH₃, ahol r ée s egymástól függetlenül 0-12 közötti egész számol jelent, azzal a kikötéssel, hogy r+s nem lehet nagyobb 12-néi vagy kisebb 5-nél.

Λ 4 és 5 általános képletű vegyületeket égy állítjuk elő, hogy egy 1 általános képletű vogyülcteL a megfelelő acil-oldalánccal ncilozünk oniidkölés létrehozására alkalmas ismert eljárások segítségével. Az acilezés általában úgy történik, hogy a kiválasztott vegyületet a kívánt acil-oldallónc csoportnak inegfololö sav rcakcióképes származékával rengáltatjuk.

A „reakcióképos származók megjelölés olyan származékra vonatkozik, amely az ac.ilezöszor knrboxil-funkcióját reaktívvá teszi a primer aminocsoporttal való kapcsolódáshoz és a képződött amidkőtós az acil-oldalláncol a maghoz köti. A szakember ismeri az alkalmas reakcióképoB származékokat, előállításuk módját és primer aminokhoz acilezőszorkónt való felhasználásukat. Előnyös reakciókópes származékok a következők: (a) savhalogenidek (például savklorid); (b) savanhidridek (például alkoxl-hangyasavanhidridok vagy aril-oxi-hangyasavanhidridok), vagy (c) aktív észterok (például 2,4,5-triklór-fenil-észter). Λ karboxil- funkció reakoióképessó tételének további módszerei közé tartozik a karbonsav karbonil-diimiddoi (például Ν,Ν'-diciklohexil-kíirbodümiddel vagy N.N’-diizopropil-karbodiimiddel) való reagáltatása, amikor is reakciókópes közti termők képződik, melyet bomlókonysága miatt nem izolálnak. Ilyen reakció a primer aminnal in situ hajtható végre.

Λ 4 és 5 általános képletű vogyületok előnyösen az aktív észter-eljárással állíthatók elő. A kívánt sav 2,4,5-triklór-fciiil-ószterek az előnyben részesített ncilező reagens. E módszer szerint 1 mólfeleslcgben levő aktív észtert az .1 általános képletű vcgyülette: reagáltatunk szobahőmérsékleLen, közömbös szerves oldószerben, mint PMl·’-bari. A reakcióidő nem kritikus, bár előnyös a mintegy 6-20 órás időtartam. A reakciót végrehajtva az oldószer L eltávolítjuk és a maradékot ismert eljárással, például oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Λ t-IIOC csoportok a trifluor-ecetaav/anizol/trielil-sziián, vagy előnyösen trifluor-ecoLsav/l,2-etándiLiol keveréktik segítségével szobuhőmérsókloton mintegy 3-5 perc aluli távolíthatók el. Az oldószer lepárlása utón a maradék fordított fázisú IIPl C útján tisztítható.

Λ megfelelő suvak 2,4,5-triklór-fenil-úszlereil kényelmesen állíthatjuk elő úgy, hogy a kívánt savat 2,4,5-triklúr-fenollal kezeljük kapcsoló reagens, mint Ν,Ν’-diciklühoxil-knrbodiimid jelenlétében. A sav észterei természetesen más alkalmas eljárással is előállíthatok.

A 4 általános képlotű származékok és reakcióképes származékaik (különösen a savkloridok és a 2,4,5-triklőr-fenil-észterek) előállításira használt alkin- és alkénsav kiindulási anyagok ismert vegyületek, vagy ismeri vegyületekből ismert eljárásokkal előállithatók. Λ 2,4,5-trikiór-fenil-észterokct célszerűen úgy állítjuk elő, hogy az alkánvagy all.énsav savkloridját 2,4,5-triklór-fenollul kezeljük piridin jelenlétében, vagy a szabad nlkán- vagy ulkénsavuL 2,4,5-lriklór-fenollal kezeljük NjN-dicikloliexil-karbodiimid jelenlétében. A 2,4,5-lriklór-fenil-észtor származék szilikagélen oszlopkromatográfiával tisztítható.

Az 5-általános képletű származékok előállításúhoz kiindulási anyagként használt N-alkaanoil-aminosavak vagy N-nlkcnoil-aminosavak ismert vegyületek, vagy ismert eljárásokkal a megfelelő aminosavból állíthatók elő a kívánt alkanoil- vagy alkenoilcsoporttul való acilezés útján. N-alkanoil-aminosavak előnyös módon úgy állíthatók elő, hogy a megfelelő aininosavat piridínben alkónsavkloriddal kezeljük. Az alkán- vagy alkénsuvak, reakciókópes származékaik és a használt aminosavak ismert vegyületek, vagy ismert módszerokke;, vagy a szakember előtt ismert eljárások módosításával állíthatók elő.

Ha egy adott atninosuv az aminocsoporton kívül acilezhctö funkciós csoportot tartalmaz, a szakén bér számára nyilvánvaló módon az ilyen csoportot meg kell védeni, mielőtt az aminosavat az Ν-alkanoil-, vagy n-alkcnoilcsoport kapcsoláséra használt reagenssel roll

-1021 agáltatnánk. Alkalmas védöcsoport lohol a pephid-szintézisben oldulláncbeli funkciós csoportok megvédésére használatos bármely csoport. E csoportok jól ismerlek és az adott vódőcsopyrt kiválasztása ós alkalmazásának 5 módja a szakirodalomból könnyen megtudható (lásd például „Protectivo Groups in Organic Chemistry”, M.McOmio, Ed., Plenum Press,

N.Y., 1973).

termékek szintézisére használt bizo- 10 nyos nininosavak optikailag aktív formájúnk lehetnek és kiindulási anyagként a természetes konfiguráció (L-konfiguráció) és a nem-természetos konfiguráció (D-konfiguráció, egyformán alkalmazható. _: 15 kígyós A-21978C származékokhoz kiindulási anyagként használt szubsztituált benzoesavak és ezek reakcióképes származékai ismert vegyületek, vagy ismert vegyületekből ismert eljárásokkal előállíthatok. Az alkoxi- 20 -benzoosavak célszerűen alkalmas hidroxi-benzoosavakból állíthatók elő, a megfelelő nlkil-halogonidet megfelelő hidroxi-benzoosuv-diná triumsóval reagálhatva.

A leírt eljárásban kiindulási anyagokként 25 használt hidroxi-bonzoesavak és szubsztituált származékaik iemert vegyületek, vagy ismert eljárásokkal o lő á 11 ί l h a ló k.

A találmány szerinti köztitnrmékekbői előállított. származékok, azaz 4 és 5 általános 30 képletű vegyületek gátolják kórokozó baktériumok növekedését, amint ez standard biológiai próbákkal kimutatható. Ezért e vegyületek (mint antiszoptikumok) gátolják, hogy baktériumok a környezeti felületeken 35 szaporodjanak és baktériumok okozta fertőzések kezelésére használhatók. Λ vegyületek antibaktoriális hatásosságát agár-lemezen korong-dirfúziór? próbával in vitro, vagy agar lugihásos próbával in vivő mutattuk ki Stap- 40 hylncoc.cus nureussal és SLropLococcus pyogonessel fertőzött egereken. Λ vegyületek különösen hasznosak Gram-poziLív mikrooi- 1 ganizmusok okozta fertőzések kezelésére.

Λ találmány szerinti. A-21978C ciklusos 45 peptid mint baktériumellenes anyag orálisan vagy parenterálisan alkalmazható. Λζ Λ-Z1978C vegyületet szokásosán gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy hígítóval együtt alkalmazzuk. Az A-21978C vegyü- 50 let dózisát, számos megfontolás befolyásolja, mint például o kezelendő fertőzés Lormészote és súlyossága. Az alkalmazandó dózis-tartományokat és/vagy dózisegysógeket a szakember előtt ismert módon a MIC (minimális gátló 55 koncentráció) és az EDso (hatásos dózÍB 50%-a, értékek, a toxieitási adatok, valamint egyéb, példul farmakokinetikai tényezők, a (beteg gazdnszervezot) és a fertőző mikroorganizmus jellemzői figyelembevételével haté- 60 rozzuk meg.

A találmány l.eljosobb bemutatására szolgálnak az alábbi példák, anélkül, hogy a találmány hatókörét korlátoznánk.

1. példa

A-2I978C mag preparálása

A. Aclitjoplanes ulahensis larnicn Ládája

Ferde agáron Actinoplanes utaharieie Lőrzstenyészetet készítünk ós tartunk fenn. Ferde agar táptalajként a következők egyikét használjuk:

A. táptalaj

Alkotórészek Mennyiség

Előfőzött zabliszt 60.0 g

Élesztő 2.5 g

KjlIPOi 1.0 g

Czapek-féle ásványi törzsoldat* 5.0 ml

Agar 25.0 g lonmeiitesltott víz 1 literig.

Autoklávozás előtt a pH körülbelül 5.9; u pH-t nátrium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk be; uutoklávozás után a pll körülbelül 6,7.

* A Cznpck-félc ásványi Lőrzsoldal összetétele az alábbi:

Alkotórészek Mennyiség

FeSO*.71hO (2 ml konc. HGl-ban 2 g oldava)

MgSO*.7IhO 100 g

KC1 100 g loniiientesilctt víz 1 literig

13. táptaluj

Alkotórészek Mennyiség

Durgonya-dextrin 5.0 g

Élesztőkivonat ’ 0.5 g

Kazein enzimutikus hidrolizátuma* 3.0 g

Marhuhüskivonat 0.5 g

Glükóz 12.5 g

Kukoricakeményitő 5.0 g llús-peptori 5.0 g

Melasz 2.5 g

MgSO».711iO 0.25 g

CaCOa 1.0 g

Czapek-féle ásványi törzs oldat 2.0 ml

Agar 20.0 g

Ionmentesített víz 1 literig ' N-Z-Amine A, llumko Sheffield Chemical, Ly ndhurst,

N.,1.

A ferde agart beoltjuk Aciljictplance utuhensis NllRL 12052-vel és 30 °C-on 8-10 napig inkubáljuk. A ferde agaron nőtt tenyészet felével beoltjuk a következő összetételű 50 ml vegetatív táptalajt;

-1123 I95839 24

Alkotórészek	Mennyiség-	Alkotórészek	Mennyiséig (gramm per 1)
		MgS0,.7lii0	0.25
E lőfűző1.1. za b I i sz (	20.0 g	Csupvíz	l literig.
Szacharé,/,	20.0 g
Élesztő	2.5 g	r 121 C-on	45 percig mintegy .110-124 kPa
Szárított szeszgyári	gabonatörköly' 5.0 g	nyomás alatt	végzett nutoklávozás után a
KalIPO*	1.0 g	táptalaj j ,11-jn	körülbelül 6,9.
Czapek-féle ásványi	törzsoldat 5.0 ml
lonmentesitctt víz	1 literig.		11. táptalaj

Λ pll-1. nálrium-hidroxiddal 7,4-re állítjuk be; autoklávozás utón a pH körülbelül 6,8.

'National Dislillers Products Co., 99 Park Avo.,

New York, N.Y.

A beoltott vegolnlív táptalajt 250 ml-es bőnyakú üj-lenttioyor-lomblkban 30 °C-on mintegy 72 óráig inkubáljuk, 5 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen.

Λ fenti inkubált vogotalív táptalajjal közvetlenül beoltunk egy második fokozatú vegetatív táptalajt. Előnyösen félretesszük későbbi felhasználáshoz, a tenyészetet folyékony nitrogén gőzfázisábnn tartva. Ilyen tároláshoz a tenyészetet több kis fiolában állítjuk elő a következőképpen: mindegyik fiolába bemérünk 2 ml inkubált vegetatív táptalajt és 2 ml glicoriri/laktóz oldatot (W.A.Oailey és C.E. Higgins, „Presoration and Slorogo of Microorganisms in the Gas Pliaso of Liquid Nitrogén,,, Cryobiol. 10, 364-3G7 /1973/). Az előállított szuszponziókat a folyékony nitrogén gázfázisúban tároljuk.

Az igy elkészített tárolt szuszpenziót (1 ml) használjuk 50 ml első fokoz,atü vegetatív táptalaj beoltására (melynek összetételét fentebb megadtuk). A beoltott első fokozatú vegetál.iv táptalajt a fentiek szerint ink η bál juk.

Nagyobb térfogatú inokulum előállítása céljából az inkubált olső fokozatú vegetatív táptalaj 10 ml-óvel beoltunk 400 ml második fokozaté) vegetatív táptalajt, melynek összetétele azonos az első fokozatúéval. A második p,hozató táptalajt 2 literes bőnyakú Erlenmeyei-lombikban 30 «C-on 48 óráig inkubáljuk 5 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen.

A fentebb leírtak szerint előállított, jnkubáll. második fokozatéi vegetatív táptalajjal (H0 ml) beoltunk 10 liter steril szaporító táptalajt, melynek összetétele az alábbiak egyike:

Alkotórészek	Mennyiség (g por
Szacharóz	30.0
Pcpton	5.0
KiHPO.	1.0
KC1	0.5
MgSO,.7lhO	0.5
EeSO<.71bO	0.002 ,
Ionmentes ítélt víz j literig.
A pll-t 1IC1-	val 7.0-re állítjuk be; au
klávozás után a	pll körülbelül 7,0. ILI. táptalaj
Alkatrészek	Mennyiség (g per
Glükóz	20.0
N1UC1	3.0
NajSO,	2.0
ZnCh	0.019
MgCb.GlbO	0,304
KeCb.GlJaO	0.062
MnCh.4IhO	0.35
CuCh.21hO	0.005
CaC03	G.O
KlbPO.'	0.67
Csapvtz	1 literig.

Alkotórészek

1. táptalaj

Mennyiség (gramm per 1)

G0

Eőldimogyoröliszt Old haté) hús-popton Szacharóz

KJhPO,

IhllPO,

10.0

5.0

20.0

0.5

1.2 * Külör. sterilizálva és fertőző anyagoktól mentesen hozzáadva.

Végső pll körülbelül G,G.

A beoltott szaporító táptalaj fermentációját 14 1-ei; fcrnionlorbnn mintegy 30 °C-on körülbelül 56 óráig folytatjuk. A fermentációs közeget szokásos keverőkkel körülbelül 600 ford/perc sebességgel keverjük ée steril levegővel levegőztetjük ügy, hogy az oldott oxigén szintjét 30%-os levegötelités felett tartsuk légköri nyomáson.

11. Az A-2i!)7fíC deziicilczős

Λζ A. utnhensfs fenne nláciéíjút az Λ. fejezetbon leírtak szerint hajtjuk végre fprde A. táptalajt ér I. szaporító táptalajt használva és a szapoiító táptalajt mintegy 67 óráig inkubálva. Λ fermentációs közeghez nyers Λ-21978C komploxot adunk (100 g).

Az A-21978C komplex dezucilezósét Micrococcus lulous-szal végzett próba oogítségóvel követjük. A fermentacit teljes dczacileződcsig folytatjuk; czL a H. luLeus-snl szembeni aktivitás eltűnése jelzi (körülbelül 24 óra).

-1225

Ugyanezt a próbál használjuk annak a megállapítására, hogy más mikroorganizmusok termelni ludják-e a kívánt A-21978C magot. Ha a fonti eljárásban Actinoplanes utahensis NRRL 12052 helyeit különösen Actinoplanes missourié nsis NRRL 12053-al, Actinoplanes sp. NRRL 8122-L, Actinoplanes sp NRRL 12065-öt ős SlropCosporangíuin roseum var. hollandénsis NRRL 12064-el használunk, a kívánt mag termelése bekövetkezik. Az A, utahensis dozncilező enzim alkalmazásával kapott mag autentikus mintáival való összehasonlító HPLC elemzések igazolják, hogy a fentebb felsorolt ogyéb mikroorganizmusok is termelik az Λ-21978C magol.

C, Λζ A-21978C mag izolálása

Λ 13. fejezetben loirtak szerint kapott teljes formontlovot (20 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Col, Johns Manvillo Corp.) átszűrjük. Λ micólium eltávolítása után a szürlotlevel 1,5 liter 1IP-Z0 gyantát (DIAION lligh Porous l’olytnor, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) tartalmazó oszlopon bocsátjuk ál. A kapott efflucnsl döntjük. Az oszlopot ionmentesítet.t vízzel (10 liter) mossuk a szűrtló maradékának eltávolítása céljából. A mosófolyadékot olöntjük. Ezután az oszlopot 10 liter térfogatú víz/acotonitril elogyekkel (95:5, 9:1 és 4:1) eluáljuk, 1 literes frakciókat gyűjtve.

Az elúciút. analitikai llPLC-vel ellenőrizzük, fordított fázisú sziiikagél/Cje adszorbenst és 0,1% animónium-acotátot tartalmazó víz/melanol (3:1) oldószerrendszort használva, a magot UV monitorral 254 nm hullámhossznál detektálva. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az acetonitrilt vákuumban lopárolva és a maradékot gyo.rsbűtóssol szárítva 40,6 g félig tisztított A-21978C magot kapunk.

D, Λζ A-21978C mag tisztítása

A C. fejezetben leírtak szerint kapott félig tisztított magot (15 g) 0,2% ecotsavat és 0,8% piridint tartalmazó 75 ml víz/motanol/acotonilril (82:10:8) elegyben odjuk. Az oldatot 3,33 liter szilikagél (Quantum LP-1) /Cu töltetet tartalmazó, 4,7 x 192 cm-es oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószérrondszerrel eluáljuk. 350 ml terfogutú frakciókat gyűjtünk. Az elválasztást 280 nm hullámhosszon UV-monitorral detektáljuk. Λ magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az oldószereket vákuumban lepárolva és gyorehűtéssel szárítva 5,2 g tisztított A-Z1978C magol kapunk.

2. példa

Altornntív eljárás az A-21978G mag előállítására

Az A-21978C magot az 1. példában leírt eljárás szerint állítjuk elő, kivéve bizonyos változtatásokat π B. fejezetben. Az A. tilahensis tenyészetet először mintegy 48 óráig inkubáljuk; a szubszlrát félig tisztított Λ-21978C komplex (50 g); a szubszlrát hozzáadása után az inkubálási idő körülbelül 16 óra. Λ szűrtlcvet 3,1 liter HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. az oszlopot 10 térfogaL vizzel mossuk, majd vlz/acctonitril (95:5) eleggyel eluáljuk. Az elúció.t az 1. példában leírtak szerint detektáljuk. 24 liter összegyűjtése után az eluenst kicseréljük víz/acotonitril (9:1) ologyro. A magol tartalmazó frakciókat ezzel az oldószerrel eluáljuk. E frakciókat egyesítjük, az acetonitril eltávolítása céljából vákuumban bcpároljuk és gyorshutóssel szárítjuk. 24,3 g félig tisztított A-21978C magot kapunk.

E Télig tisztított magot (24,3 g) vízben (400 ml) oldjuk. Az oldatot 0,2% ccelsavat és 0,8% piridint tartalmazó viz/melunol/acctonilril (8:1:1) eleggyel készült 3,33 liter szilikagél (Quantum LP-1) /Cm töltetet tartalmazó, 4,7 x 192 cm-es acéloszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószerrel körülbelül 13750 kPa nyomáson eluáljuk, 350 ml-es frakciókat gyűjtve. Az elúciót 280 nm-núl UV-monitorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószereket vákuumban lepároljuk és a muradókot gyorshűtéssel szárítjuk. 14 g nagylisztaságú A-2I978C magot kapunk.

3. példa

Norn-t-l3OC-A-21978C Ct (nútrlumsó) Ct és Cj faktorok előállítása

A-21978C O2 és Cj faktorok keverékét (10 g) (előállítva a 4,208,403 számú amorikui egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint) vízben (50 ml) oldunk szonikálás közben (200 mg/ml). Az oldat pH-ját 4,05-ről 9,5-re állítjuk be 5n nátrium-hidroxid-oldat (3,6 ml) segítségével. Di-torc-butil-dikarbonátot (3,0 ml) adunk hozzá és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 óráig keverjük. Az elegy pH-ját 9,5-ön tartjuk 5n nálriuiii-hidroxid-oldat kézi hozzáadásával (6,5 ml lúghozzáadás 2 óra alatt).

Λ reakciót időnként szilikagél TLC-vel ellenőrizzük, acetouilril/vlz (7:3 ós 8:2) oldószer-rendszert használva és UV fényben detektálva.

Körülbelül 10 pere múlva az oldat gyorsan megzavarosodik ós a lúgfogyasztás emelkedik. 30 perc múlva csökken a zuvarosság sebessége és n lúgfogynsztás ütomo, a roak14

-1327 ciő végét jelezve. Ennek ellenerő a reakciót még 90 porcig folytatjuk a teljes átalakulás biztosilÓBH céljából. 2 órai reagáltatás után a képződött anyagot azonnal liofilizálva 12,7 g Non.-t-BOC-A-Z1978C Cj és Cs faktort kapunk.

Hasonló eljárást alkalmazva két 10 g-os és egy 30 g-os roukciót is indítunk. Ezeknél a reakcióidő csak 40 perc. Λ két 10 g-oe kísérletből 11,9 illetve 12,1 g terméket kapunk. Λ 30 g-os reakció 35,4 g terméket eredményez.

Λζ előállilott N„,„-l-BOC-A-21978C C faktor nátriumséjának UV-spoktruma: ).223 (139900) és λ2ΐ;ο (ε 7400).

4. példa

A-21Í178C Norn-t-llOC mag előállítása

Λ. A. utaheiisis fermentációja

Az. A. itlnlianeie fermentációját az 1. példa A. fejezetében leírtak Bzorínt hajtjuk végre, ferde A. táptalajt és I. szaporító táptalajt használva és a szaporító táptalajt mintegy GG óráig inkubálva.

b. Nuni-I-HOC komplex dozacilezéscs

Az. Λ-21978C Norn-t-BOC komplexet (1185 g nyers szuŐsziről, mely körülbelül 17G g U-21978C komplexet tartalmaz) hozzáadjuk a fermentációs közeghez. A dezaciloz.ést az 1. példa B. fejezőiében loirtak szerint hajtjuk végre. HPLC elemzéssel kimutatva a dezncilezós körülbelül 24 óra alatt teljes.

C. A-21H78C Norn-l-íiOC mag izolálása

A 11. fejezetben leírtak szerint kapott fermentlevet (100 1) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Cel) átszűrjük. Λ szűrletet 7,5 liter gyantát (DIAION) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át; az oszlopot vízzel (38 liter) mossuk. Az elóciót szilikagél/Cia HPLC-vei ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon UV detektálással. Kevés mag a mosófoly adók kai oluálóilik. Λ magul, ezután a következő viz/acetonili-il (Hegyekkel eluáljuk: (95:5) - 40 liter; (9:1) - 40 liter; és (85:15) - 100 liter. Á magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bopároljuk ás fagyasztva szárítjuk. 298,5 g félig tisztított A-21978C Norn-t-BOC-iniij; kapuid',.

I). Az A-21978C Norn-t-I)OC mag tisztítása

A C. fejezetben loirtak szerint kapott, félig tisztított A-21978C Norn-t-BOC magol. (30 g) 0,2% ecolsnval és 0,8% piridint tartalmazó víz/acolonili'il elegyben (9:1) (75 ml) oldjuk. Az oldatot 3,33 liter Bzilikagól (Quantum bl’-l)/Cm töltetet tartalmazó, a fenti oldószer-rendszőrrel kiegyensúlyozott

4,7 x 192 cm-es acéloszlopra visszük fel. Az oszlopot nyomás alatt 0,2% ccolsavnl cs 0,8% piridint tartalmazó IhO/ClbCN/CJbOH elegygyel (80:15:5) eluáljuk. 350 iid-nél frakciókat gyűjtünk és a lermékot 280 rnn-nél UV detektorral detektáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószer eltávolítása céljából vákuumban bepéroljuk ók gyorshűtéssel szárítjuk. 18,4 g tisztított A-21978C Nom-l-BOC magot kapunk.

5. példa

Az A-21978C Norn-t-BOC mug alternatív tisztítása

Λ 4. példa C. fejezetében loirtak szerint kapott, félig tisztított A-21978C Norn-l-BOC magot (10,8 g) vízben oldjuk és 80 ini Λ111berlile 1KA-68 gyantát (acetét-ciklus) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és 5 ml/min áramlási sebességgel, egymás után 0,05n ecetsavoldattal (1080 ml), 0,1b ecetsavoldattal (840 ml) és 0,2n ecctsavold; tlul (3120 ml) eluáljuk, 120 ml-cs frakciókat gyűjtve. Az oszlop elúcióját analitikai HPLC-vei szilikagél/Cje tölteten, 0,2% ammóniun-aceLátót tartalmazó víz/acctonitril/metanol (80:15:5) oldószerrendszort liasználvu ellenőrizzük és a terméket 254 run-aól UV-monito'ral detektáljuk. Λ terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük; az oldat pll-ját piridinnel 5,8-ra állítjuk be; a kapott oldatot vákuumban mintegy 200 ml térfogatra bepereljük. Λ koncentrátumhoz vizel, adunk és a képződött oldatot a piridin eltávolítása céljából isinél koncentráljuk. Λ maradókból fagyasztó szárítással 3,4G g tisztított A-21978C Norn- t-BOC magot kapunk.

6. példa

A következő folyamat a 4 általános képletű vegyületek „uktiv észter eljárással történő előállításút mutatja bo. Az eljárás szerint ilyan specifikus 4 általános képletű vegyük leket állítunk elő, ahol K jelentése Clb/C Ih/eCO- (n-dekanoij) csoport, R^l hidrogénatomot és R² t-BOC csoportot vagy hidrogénatomot jelent, R·¹, R’ és R^s jelentése hidrogénatom.

N-rp-(n-0ckauoil)-A-2 U17HC mag

A. 2,1,5-Triklór-fenil-n-dokanoút előállítása

III knnoil-klorid (l’faltz és Bauer, 5,8 ml) és 2,4,5-triklór-fcnol (5,G g) dietil-éterrel (1 liter) és piridinnel (120 ml) készült oldatát 4 óráig keverjük. Λ reakcióelogycl szűrjük és vákuumban szárítjuk. A 2,4,5-lriklér-fenil-ri-dekaiioátot szilikugéloszlupon (Woclm) tisz15

-1429

I, itjuk toluol oluonst használva. A frukciókal TLC-vol ellenőrizzük, a detektáláshoz rövidhulláim'· UV fényt használunk. A megfelelő frakciókat egyesítve és vákuumban megszáritva 10,4 g 2,4,5-triklőr-fonil-n-dokanoátot kapunk.

II. Na,n-t~BOC-A-21978C mag acilezéeo 2,4,5- tri klór-feni l-n-dokanoátlal

Nom-t~BOC-A-2.1978C mag (15,0 g) és 2,4,5-triklór-feiiil-n-dekanoát (15,0 g) vízmentes DMF-dal (500 ml) készült oldatát nitrogéngáz alatt környezeti hőmérsékleten 25 óráig keverjük. Ezután az elegyet 6(1 °C-on 5 óráig, vagy pedig addig keverjük, amíg a TEC a reakció befejeződését jelzi. Λ reakcióelegyet vákuumban körülbelül 200 ml-re bepároljuk és 1,2 liter EtnO/toluol (5:1) elegyg.vcl keverjük. A terméket szűréssel elkülönítjük, ElzO-val mossuk és vákuumban szárítjuk. 15,05 g NTi-p-(n-dekanoil)-Norn-l-BOC-A-21978C mag köztiterméket kapunk (4 általános képlet: R = n-dekanoil, R¹ = II,

IC = t-BOC).

0. Az NTrii-(a-dekurioil)-Norn-l.-llOC-A~2I!)7RC mag tisztítása

Az Nrrp-(u-dekanoil)-Nor>i-t-110C-A-2I978C mag köztiterméket n következő módon tisztítjuk: a nyers készítményt, körülbelül 50 ml elualő oldőszerrendszerben oldjuk és az oldatot IIPLC-vel tisztítjuk, fordított fázisú szilikngóI/Cie adszorbonssel töltött patront tartalmazó Wutors Prep 500 rendszert használva. Λ rendszert IhO/MoOíl/ ClbCN (50:15:35) clggyel eluáljuk, amely 0,2% piridint és 0,2% HOAc-ot tartalmaz. A frakciókat UV monitorral detektáljuk 280 rim-nél. A megfelelő frakciókat egyesítve és vákuumban szárítva 8,56 g tisztított NTrp-/n-deknnoil/-Non>-t-BOC-A-21978C magot kapunk.

D. Az Norn-t-BOC csoport eltávolítása

Λ t-BOC csoport eltávolítása céljából az Nir p-(n-dokai ioit)-No™-t-BOC-A-21978C magot (1,47 g) 15 ml trifluor-oceteav/J ,2-otánditiol (10:1) elegyben környezeti hőmérsékleten 3 percig keverjük. A reakciőolegyel vákuumban megszárítjuk és a maradékot EI2O-val (50 ml) trituráljuk. 20 ml Et2O-v.1l való mosás után a triturált anyagot vákuumban mogszáritva 2,59 g nyers Ντγρ /n-dekanoil/A-21978C magot kapunk (4 általános képlet: 1? = n-dekanoil; R¹ és ii² - II).

E. Az N-rii'-(ii-<lehrnioil)-A-2]978C mag tiszti t.iisa

Λ nyers NTri,-(n-doknnoil)-A-21978C mugol. fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk a következőképpen: a mintát (2,59 g) 4,0 ml

ILO/MeOH/CJbCN/piridin/KOAc (50:15:35:2:2) elegyben oldva LP-l/Cie adszorbonssel megtöltött 83 x 2,54 cin-cB rozsdamentes acéiosz.lopba fecskendezzük be. Az oszlopot a fenti otdÓHZoreloggycI eluáljuk. Az oh’icióL 10-12 ml/min áramlási sebességgel hajtjuk végié LDC kétdugutlyús szivattyúi (Milton-Roy) Luszriálvn. Az cffluenst UV-monitorrsl (Jsco Modol UA-5, Inutrument Speciálist Co., 4700 Suporior Avonuo, Lincoln, Nobraska 68504) detektáljuk 280 nm-nél. 2 percenként frakciókat (20-24 ml) gyűjtünk. A kívánt frakciókat - mikrobuellones hatékonyságuk alapján - egyesítve ,és vákuumban szárítva 1,05 g ‘.érmékét kapunk.

E tisztítást 4,35 g, 4,25 g, 2,14 g, 2,00 g ás 1,75 g nyers kiindulási származékkal megismételve összesen 5,58 g tisztított Ντη>-(π-dekanoil)-A-21978C magol kapunk.

7. példa

E példában az. 5 általános képletű vegyület előállítását ismertetjük. Az eljárással olyan specifikus 5 általános képletű vegyületeket állítunk elő, ahol R jelentése N-(n-dekanoilj-b-fend-alaiiil-csoport és R¹ l-HOC csoportot vagy hidrogénatomot jelent.

Ντη·-ίΝ- {n-Dokunoiij-L-fünií-uíninlJ-A-2H178C mag clőállitása

Λ. N- (n~DaknnoiI)-L-fenil-aluniI-2,4,5- trilliói—

-feriolát eiőáiiítása

N-ín-DekanoilJ^-L-foriil-alanint (31,9 g,

0,1 mól) és 2,4,5-triklór-fenolt (10,7 g, 0,1 mól) 1 liter vízmentes éterben oldunk és az oldatot N,N'-diciklohexil-karbodnmiddol (20,6 g, 0,1 mól) kezeljük. A keveréket éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált Ν,Ν'-dicjklohexil-kurbamidot leszűrjük és eldobjuk. A szűrietet vákuumban szárazra pároljuk. A kapott maradékot éterrel eldől— zsöljük és a szilárd anyagot (maradék cikloboxil-karbamid) szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot acetonitrilből kristályosítva 36,9 g kristályos N-(n-dokanoil)-l,-fenil-alanil-2,4,5-triklór-fonolútot kapunk; olvadáspont 122-124 ’C.

B. NTr/>-{N~(n-DeknjioiJ)~L-fe/jiJ-aIani]J-N.»rp-L-UOC-A-21978C mag előállítása

N-(n-Dekunoil)-L-fenil-ulunil-2,4,5-tri klór-fcnolátot (10 g, 0,02 1110I) és Norn-t-BOC-A-21978C magot (10 g, 6 millimól) vízmentes DMF-ban (1 liter) oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten, niLrogénatmoszféra alatt 96 óráig keverjük. Az oldószert csökkentőit nyomáson lepároljuk. A maradékot dictil-éfer/kloroforiti eleggyel (800 111I + 200 ml) 2 óráiig keverjük. A terméket szűréssel elkülő-1531

1ÍI5839 ιιίΙ,νο világosbarna pori (10,3 g) kapunk. Az. anyagól (9,9 g) metanolban (200 ml) oldjuk ók preparatív IIPI,0-vol tisztítjuk, „Prop bC/3yslem 500 egységet és stneionor fáziskénl Prop l’ak-500/Cje oszlopot használva. Az oszlopot izok ralik usnn (úllalitlói oldóiszerösszeLétel) eluáljuk víz/motaiiol/aeotoiiitril (2:1:2) eleggyel és 250 ml-es frakcióikat gyűjtünk, 1 rrakeió/ιιιϊη sebességgel. A kívánt vegyület a 9-22. frakcióiban eluálódik.

Λ frakcióikat 3'LC alapján egyesítjük Iforditol.l. fázisú nzilikagél/Cn,; kifejlesztve vÍz/itiolnuul/nceloiiit.ril (,3:.3:4) eleggyel, Vau Urk permetező reagenssel detektálvaj. Az ' gyesitett frakcióikat bioati lográfin segítségiível vizsgálva 1 szilikagél TLC, acotonitril/acoluii/viz (2:2:1) oldóiszorrendszer én Micrw.ocι un íuíeus detektáló) mikroorganizmus] megállapítható, hogy egyetlen . bioaktív komponenst tartalmaznak. Az eljárással 6,02 g Ντπ>-|Ν- (π-dokauoiD-I,-fenil-akin ilJ-Norn-t-I10C-A-2I97Í1C magol, kapunk LG általános képleté vegyülni.: R = N-(n-dcknnoil-L-foiul-nlnnil);

11' --- t-lll)C|.

C. Nrri’-I N-(n-M ni ioi 1)-1.-fonil-iibiniJ J-A-21978C mag előá Ilii fisa bombíkot (100 ml) jeges fürdőben 5 °C-ra lehűtünk. A lombikba bemérünk Ντπ>-[Ν-(n-dokaiioil)-! ,-fenil-alani)]-Norn-t-BOC-A-219791' magot (6,02 g, 8 millimól, u 11. fejezetben leírtak szerint előállt,va), majd 2z(. anizolt tartalmazói vízmentes trifluor-ecotsavat (50 ml). A keveréket - amely mintegy 2 perc alatt oldattá alakul - nitrogénatinoszfórn alatt 10 porcig keverjük. Az oldatot csökkentett nyomáson 40 °C-on szárazra párolva gumiszerű szilárd anyagot kapunk, melyei, iliotil-éler/dikiór-melán (4:1) . eleggyel (2 x 100 ml) oldörzsölünk. A szilárd anyagot szűréssel óisszegyöjtve ós dietil-éterrel mosva trifluor-ecetsavas sót kapunk. Az utóbbit vízben (50 ml) oldjuk és az oldat pll-ját pirídinnel 5,4-re állítjuk be. Ezután az oldatot liofilizálva 6,1 g sárgásfehér anyagot ka1 nink.

A liofilizáll, anyagot metanolban (35 ml) híjuk és fordított fázisú szilikagél/Cie oszlopon (Waters Associates, Prop 500) tisztítjuk, 0,1% piridiuiom-acetátot tartalmazó lépcsős gradienssel (IhO/CIbOIf/CIbGN, 3:1:2; 2:1:2 éri 1:2:2 arány) eluáljuk és 250 ml-es frakcióikat gyűjtünk. A kívánt termék a 2:1:2 arányi! eleggyel eluálódik. A terméket tartalmazói frakcióikat liofilizálva 2,23 g krémszínű Nr, (,-[ N- (n-dekíinoil)-l ,-fenil-alanilJ-A-21978C magot kapunk J5 általános képielű vegyület: R ^_ N~{n-dekarioil)-I,-fenil-f.dnnil; R* = II].

Λ terméket analitikai (IPLC-vel [fordított fázisói szilikagél/Cm oszlop, MeOll/CIbCN/ IhO/l’iOAc (15:39:49:1) oldószer és 230 nm-nél UV detektálás], TI.C-vol [fordított fázisú szilikagél/Cin lemezek (Whalman), IhO/Cií.iOH/ ClbCN (3:3:4) oldószer, Van Urk-pormctoző reagens és rövid ind Iá mi! UV detektálás] és bioautográfiával [szilikagél TL.C (Merck), IhO/CIbCM/aeclon (1:2:2) oldószer, Microc.oc·.cuk íuteus detektáló) mikroorganizmus] értékeljük. Mindegyik eljárás a termék homogén voltát mutatja ki. Az N-lorminális triptofán szubszlitucnsét 360 MHz-νπ PMK-roI (prolon-mágne.sos rozonanciu) igazoljuk. Amhiosav-urializis alapján megállapítható, hogy n termékbe l ekvivalens 1 .-fenil-alanin épült be.

/1. példa

Λ következő eljárás egyéb 5 általános képletű vegyületek előállítását illusztrál ja. Az eljárássá’ előállított specifikus 5 általános képlotű vegyületekben R jelentése p(n-dodecil-oxi)-beii7,oil)-esoport és R¹ t-BOG csoportot vagy hidrogénatomot jelent.

A, Wrfp-_J)-(u-í7()c/ecíí~oxi)-ö<!nzoj/-Norn~t-IIOC -Λ-21U78C mag eíőáíh’lása p-(n- Dodecil-oxi)-bori zoil-2,4,5-triklór-fenolátot (0,9 g, 1 mól) és Λ-21978Ο L-BOC magot (0,9 g, 1 mól) 400 ml vízmentes DMK-ban oldunk és az oldatot szobahőmérsók lelon, nit.rogénalmoszférn alatt 120 óráig keverjük. Az. oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. Λ ιι nrndékot dietil-éter (400 ml) és Rio— roform (400 ml) elegyévol 2 órán ál keverjük. A terméket szűréssel elválasztva és szárítva világosbarna port (0,962 g) kapunk. Az anyag egy részét (0,78 g) metanolban (200 ml) oldjuk és preparatív HPLC-vel tisztítjuk, „Prep LC/Systom 500 egységet (Waters Associates, Iric., Mil-ford, Mass.) és állói fáziskén'. Prep Pak-500/Cie oszlopot (Waters Assiciutcs) használva. Az oszlopot izokratikusan eluáljuk vlz/mctanol/acetonitril (2:1:2) oldószerrendszerrel és 250 ml-es frakciókat gyűjtünk (1 frakciói per perc). A kívánt vegyületet a 2-6. frakcióban eluáljuk.

A fr ikciókat TLO [fordított fázisú szilikagél/C.in, kifejlesztve viz/metanol/acetonitr il (3:3:4) eleggyel, Van Urk-pcrmolezö reagenssel detektálvaj alapján egyesítjük. Az egyesített frakciók bioautográf iá ja [szilikagél TLC-L, loctonilril/ucolon/viz (2:2:1) oldószert és Sl.aphylococcus aureue detektáló mikroorganizmust használva] azt. mutatja, hogy a termék egyetlen bioaktív komponensből áll. Az eljárással 0,421 NTri>-p-(n-dodecil-oxi)benzoil- Nor»-l-BOC-A-21978C magot kapunk.

Β. Ντη· -p-(n-dodeeil-oxi'J-Liei izei 1-Λ-21978C mag clőá/h’tása

N-rrp-p-(n-Dodecil-oxi)-benzoil-Norn-l-BOC-A-21978C magot (230 mg) 2% anizolt tarlulmazó 5 ml trifluor-ecetsavban oldunk és 5 percig 0 C-on keverjük. Az oldat bepárlása után kapott olajat EUO-vul (100 ml) eldörzsőljük. A szilárd anyagot elkülönítjük,

-1633 levegőn szárítjuk és vízben (10 ml) felveszazük. Az oldat pll-ját 3,25-ről píridínnol 7-re állítjuk bo. A képződött oldatott liofilizálva 179 mg fehér amorf Ni-rp-p-{ n-dodccil-oxi)-benzoil-A~21978C magot kapunk. Szilikagél TbC-n acelonilril(aceton) víz (2:2:1) oldószerrendszert és a detektáláshoz Van Vlrkpermol.ező reagenst használva o vegyüld Ei-órlókc kőrülbolül 0,78.

9. példa

Λ 4 és 5 általános képletű vegyületek baktériumellenes aktivitása in vitro ngarlemez.eri végzett standard korong-diffúziós próbákkal és ln'gitásos próbákkal, és egereken in vivő standard próbákkal mutatható ki; e próbák a szisztémás bakteriális fertőzések elleni hatékonyság értékelésére alkalmának. Jellemző 4 és 5 általános képletű vegyületek antibakteriális tesztelésének eredményeit mutatja az I, It. és Ili. táblázat.

Λζ I. táblázat a 6-8. példák vegyületeivel kapott in vitro próbák eredményeit tartalmazza, melyekhez agnr-lemezcn korong-diffúziós módszerrel jutottunk.

A II. táblázatban a 6-8. példák vcgyületoivel végzett standard agar-hígításos pró5 oák eredményei láthatók. Λ 11. táblázatban az íktivilást a minimális gátló koncentrációval (MIC) mérjük, vagyis azzal a legkisebb koncentrációval, amelynél a vizsgálandó vegyüld gátolja a mikroorganizmusok növekedését.

A származékok kísérletes baktériumos fertőzésekkel szembeni hatékonyságának kimutatására egereken végzett in vivő próbák eredményeit a 111. táblázatban ismertetjük. íí próbákban a vizsgálandó Yogyület két dózi15 sál szubkután vagy orálisan alkalmazzuk jellomző mikroorganizmusokkal fertőzött egereknek. Λ megfigyelt aktivitást EDso értékként fejezzük ki [hatásos dózis mg/kg-ban, amoly u kísérleti állatok 50%-át megvédi: lásd War20 ron Wick ós munkatársai, J. Bacteriol. 81,

233-235 (1961)].

Jellemző 4 és 5 általános képletű vogyűi letek mérgezőképosségét a IV. táblázat ismerteti.

J. táblázat általános képletű vegyületek antibakteriális aktivitása agar-Jemezou diffúziós próbával kim itatva

Vegyüld Gátlási zóna mérete (mm)®

Példa száma	Képlet száma	Nn-r szubsztituens Slaphyloctxcus Jhnubtilis	Mitíl'öcoccus U.subtilis
aureus ‘ ATCC G73bP	ATCC 6633	lutcus ATCC 9341	ATCC 66331’
6.	4	.Clb/Clk/eCO- 24	40	22	29
7.	5	(b) Clb/CJh/e- -CONlICIl/CIhCüb/CO- 30	22	24	31
8.	5	i képlet 0	13	18	20

’A vogyületekot vizben szuszpendáljuk 1 mg/ml koncentrcióban; 7 mm-es korongot bemértünk a szuszpenzióba, majd az agar-lemoz felületére helyezzük; inkubálás-. 24-48 h, 25-37,25 ’C ''Por-lápaguron („Minimál iiutriont agar) tenyésztve ff. táblázat

Antibakteriális aktivitás agar-hígításos próbával meghatározva

Viszgált organizmus	A vizsgált vegyületek MIC <	-írtékor 8
6‘>	7·
S tap h y lococcus aureun	XI. 1	1.	0,5	0.5	1
II <<	V416	1.	0.5	0.5	1
II ·'	X400c	2.	1	1	2
II ,1 ·	S13K	1.	1..5 .	0.5	1
fíl.nphy hicoecUH ej á dér mid is;	EPI!	2.	i;	1	4
II 11	ΕΙΊ2	1.	0.5	0.5	2

-1735

196839

Viezgá/l organizmus

Λ vir.ugtíli vegyületek MIC értékei¹¹ < ·> 7 8

Slroptucocrns pyogenes C2O3 peiuiinonaie Parit 1

I) X66 csoport 9960

0.25

1.

16.

2.

0.125

0.5

0.25

0.5 »

0.25

0.015

MIC: iii< g/iiil; vegyület számú - példa száma ^bPoniciliin-rezÍHzLens törzs Melicillin-rczisztoiis törzs '’Kót kísérlet Három kísérlet átlagértéke fii. táblázat

A-21978C ciklusos peptidek in vivő aktivitása

Vegyület EDso értékek’

Példa Képlet N-rrp szubsztituens Stiipliyiococcus száma száma nurein; Stroptococcos pyogenes szubkután szubkután orális

6.	4	Clb/CIb/eCO-	0.28	0.03	66
7.	5	/1,/ CIb/CIb/.CONHCIt/ -/OHiCelIs/CO-	0.7; 0.98»	0.39	>200
8.	5	í képlet	3.35	0.31	>200

mg/kg x 2 ¹¹ Két kísérlet

IV. Iá blúzul.

A-2J078C ciklusos peptidek iiiérgezőképossége

Vegyület

Példa Képlet Ντι·_Ρ szubsztituens bOr.o (mg per kg) száma száma száma ' egérnél”

6. 4

7. 5

8. 5

CIb/Clb/»CO/L/ CHs/CHz/eCONlICil/CIIaCGlb/COi képlet >300

600

67.5 'lel ravénásaa alkalmazva

Claims (6)

1. Eljárás (1) általáluos képletű A-2I978C jelzésű ciklusos peptidek - ahol If jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomon ni konoi loxi-kurbonil-csnport, 10-melil-dokanoil-, 10-metil-undekaiioil-, 10-metil-dodeknooil-esoport, nz A-21978C C« faktor specifikus 10 szénatomos alkanoilcsoporl ja, vagy az Λ-219780« és Cs faktorok specifikus, 12 szénatomos alkanoilcsoJí¹ és IP egymástól függetlenül biti— rogénatomol vagy 1-6 szénatomos a lkai ιοί loxi-kar bon il-csopor tol. jelent, azzal a k kötéssel, hogy ha K hidrogénatomtól vagy 1-6 szénatomos alkanoiloxi-karbonil-esoporttél eltérő jelentésű, az 1Ϊ¹ és IP szubsztituensek közül legalább az, egyiknek 1-6 szénatomos alkunoiloxi-kurbouil-csoportot kell jelentenie és azzal további feltétellel, hogy If, IP és IP egyidejűleg nem lőhet 1-6 szénatomos nlkunoiloxi-knr borii 1-csoporl -, vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóik

-1837 előállítására, azzal jotlomozve, hogy ;i) olyan (1) állolános képletű vegyületek előállítására, ahol az Ii, R* és R² jolentése a fenti, azonban közülük egy vagy több (-6 szénatomos alkanotloxi-knrbonll-csoporlol je- 5 lent, valamely (1) általános képletű vegyülclet, ahol R, R‘ éa R² íi fenti, de közülük legalább az egyik hidrogénatom, az 1-G szénatomos aikarioiloxi-karbonil-csoport bevitelére alkalmas rengenssel kezelünk, és/vagy 10

b) olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására, melyekben 11 hidrogénatomot jelent és 11' és R² a fenti, olyan (1) általános képletű vegyüietet, ahol R hidrogénatomtól vagy 1-G szénatomon alkanoíloxi-kar bonil- 15 -csoporttól eltérő jelentésű, Ael inoplanes vagy Streptosporangium nemzetségbe tartozó mikroorganizmussal, célszerűen az Actinoplanns missouriensis NRRL 12053, Actinoplanes sp. NRRL 8122, Actinoplunos sp. NRRL 12065, 20 Streptosporangium roseum ver. hollandiensis NRRL 12064 vagy Actinoplanes utahensis NRRL 12052 törzzsel termelt enzimmel dezacilez.ünk, és

- kívánt esetben a jelenlevő R¹ vagy R² 1-G szénatomoK alkanoiloxi- karbon il-cso portokat Ichnsitjuk,

- és kívánt esetben egy keletkezett szn1 ad vegyüietet gyógyszoiész.etileg elfogadható sóvá alakítunk.

2. Az. 1. igénypont szerinti 1>) eljárás, azzal jellemezve, hogy αζ Λ. utahensis NRRL J2052 mikroorganizmust alkalmazzuk.

3. Λζ. 1. igénypont szerinti b) eljárás, rzzal jellemezve, hogy a Streptosporangium roseum var. hollandeiisis NRRL 12064 mikroorganizmust alkalmazzuk.

4. Λζ 1, igénypont szerinti b) eljárás, azz,al jellemezve, hogy az Actinoplanes iiiísholirionsis NRRL 12053 mikroorganizmust alkalmazzuk.

5. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, ! zzal jellemezve, hogy Actinoplanes sp. 120G5 ί likroorgauizmust alkalmazunk.

6. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, i zzal jellemezve, hogy Actinoplanes r,p. NRRL 1122 mikroorganizmust alkalmazunk.