HU185021B - Process for the preparation of cyclic hexapeptides - Google Patents
Process for the preparation of cyclic hexapeptides Download PDFInfo
- Publication number
- HU185021B HU185021B HU298380A HU298380A HU185021B HU 185021 B HU185021 B HU 185021B HU 298380 A HU298380 A HU 298380A HU 298380 A HU298380 A HU 298380A HU 185021 B HU185021 B HU 185021B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- parent compound
- compound
- hydroxy
- hydrogen
- formula
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás az új I általános képletű ciklusos hexapeptid-származékok és ezek savaddíciós sóinak előállítására, ahol R1 hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, és ha R1 hidrogénatom, R2 hidrogénatom és R3 és R4 hidrogénatomok vagy hidroxilcsoportok és Rl hidroxilcsoport, R2 hidrogénatom, R3 hidroxilcsoport vágy oxicsoport és R4 hidroxilcsoport, vagy R2 karbamoilcsoport és R3 és R4 hidroxilcsoport. A találmány szerinti eljárással előállított új antibiotikumok gombaellenes aktivitással rendelkeznek. -1-The present invention relates to a process for the preparation of cyclic hexapeptide derivatives of the formula I and their acid addition salts, wherein R1 is hydrogen or hydroxy, and when R1 is hydrogen, R2 is hydrogen and R3 and R4 are hydrogen or hydroxy and R1 is hydroxy, R2 is hydrogen, R3 is hydroxy. and R4 is hydroxy or R2 is carbamoyl and R3 and R4 are hydroxy. The novel antibiotics of the present invention have antifungal activity. -1-
Description
A találmány tárgya eljárás az új 1 általános képletű ciklusos hexapeptid-származékok előállítására. A találmány szerinti vegyületek félszintetikus, gombaellenes vegyületek előállításakor köztes vegyületként használhatók.The present invention relates to a process for the preparation of novel cyclic hexapeptide derivatives of the general formula (1). The compounds of the present invention are useful as intermediates in the preparation of semi-synthetic antifungal compounds.
A fenti vegyületek előállítására úgy járunk el, hogy egy II általános képletű ciklusos peptid antibiotikumot acilhasítunk, ahol az általános képletben R telített vagy telítetlen zsírsav, és R1, R2, R3 és R4 az alábbiakban megadott jelentésűek.In preparing these compounds are prepared by acilhasítunk to a cyclic peptide antibiotic of formula II, wherein in formula R is saturated or unsaturated fatty acid, and R 1, R 2, R 3 and R 4 are as defined below meanings.
Úgy találtuk, hogy az R zsírsav-oldallánc enzimatikusan lehasítható a vegyületről, amikor megkapjuk a ciklusos hexapeptid alapvegyületet. A találmány szerinti eljárás értelmében az antibiotikumot vizes közegben egy, az Actionoplanaceae családba tartozó mikroorganizmus által termelt enzum hatásának teszszűk ki mindaddig, míg az acilhasítás megtörténik.It has been found that the fatty acid residue R can be enzymatically cleaved from the compound to give the cyclic hexapeptide parent compound. According to the method of the present invention, the antibiotic is exposed to an enzyme produced by a microorganism of the Actionoplanaceae family in an aqueous medium until acyl cleavage occurs.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint az Actionplanes utahensis NRL 12052 mikroorganizmus által bioszintetizált enzimet használjuk a zsírsav-oldallánc hasítására. Az acilhasítás általában úgy *örténik, hogy a megfelelő antibiotikumot hozzáadjuk az A. utahensis tenyészetéhez, majd a tenyészetet az acilcsoport lehasadásáig inkubáljuk. Az így kapott alapvegyületet elkülönítjük a tenyészléből, ismert módszerekkel. Ezeket az alapvegyületeket felhasználhatjuk arra, hogy ismét acilezve új antibiotikumokat állítsunk elő.In a preferred embodiment of the method of the invention, the enzyme biosynthesized by Actionplanes utahensis NRL 12052 is used to cleave the fatty acid side chain. Generally, acyl cleavage is achieved by adding the appropriate antibiotic to the culture of A. utahensis and incubating the culture until the acyl group is cleaved. The parent compound thus obtained is isolated from the culture broth by known methods. These parent compounds can be used to acylate again to produce new antibiotics.
Részletesebben, a találmány tárgya eljárás az I általános képletű ciklusos hexapeptid alapvegyületek előállítására, ahol az általános képletbenMore particularly, the present invention relates to a process for the preparation of cyclic hexapeptide parent compounds of formula I wherein:
R1 hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, és ha R1 hidrogénatom, R2 hidrogénatom, R3 és R4 pedig vagy hidroxilcsoport, és ha R1 hidroxilcsoport, R2 hidrogénatom, R3 hidroxilcsoport vagy metoxicsoport és R4 hidroxilcsoport, vagy R2 karbamoilcsoport és R3 és R4 mindegyik hidroxilcsoport.R 1 is hydrogen or hydroxy and when R 1 is hydrogen, R 2 is hydrogen, R 3 and R 4 are either hydroxy and when R 1 is hydroxy, R 2 is hydrogen, R 3 is hydroxy or methoxy and R 4 is hydroxy or R 2 is carbamoyl and R 3 and R 4 are each hydroxy.
A találmány szerinti eljárás során használt egyik alapvegyület az, ahol az általános képletben R*, R3 és R4 hidroxilcsoport és R2 hidrogénatom. Ezt az alapvegyületet A-30912 A alapvegyületként ismerjük. Az A-30912 A alapvegyületet úgy állítjuk elő, hogy azt a II általános képletű vegyületet, ahol R linoleöílcsoport, sztearoilcsoport vagy palmitoilcsoport és R1, R2, R3 és R4 azonos az A-30912 A alapvegyület megfelelő csoportjaival, acilhasítunk.One of the parent compounds used in the process of the present invention is wherein R *, R 3 and R 4 are hydroxy and R 2 is hydrogen. This parent compound is known as A-30912 A parent compound. The parent compound A-30912 A is prepared by acylating the compound of formula II wherein R is a linoleyl group, a stearoyl group or a palmitoyl group and R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same as the corresponding groups of the parent compound A-30912 A.
Ha a II általános képletű ciklusos peptid antibiotikumban R linoleoilcsoport, úgy az antibiotikumot A-30912 A antibiotikumként ismeijük, ugyanakkor, ha R sztearoilcsoport, úgy ez az antibiotikum a tetrahidro-A-30912 A komponens, míg, ha R palitoilcsoport, úgy az antibiotikum neve Aculeacin A.When the cyclic peptide of formula II is R-linoleoyl, the antibiotic is referred to as antibiotic A-30912 A, while if R is stearoyl, this antibiotic is the tetrahydro-A-30912 component A, while R is palitoyl. Aculeacin A.
Az A-30912 A komponens az A-30912 keverék egyik tagja, amely tartalmaz még B, C, D, E, F és G komponenseket is. Az A-30912 keveréket és az A komponenstől a G komponensig Hoehn és Michel munkájából ismeretes, lásd a 4.024.245 .számú amerikai szabadalmi leírást. Az A-30912 A komponens azonos a Higgens és Michel által a 4.024.246 számú amerikai szabadalmi leírásban ismertetett A-22082 jelű antibiotikummal.Component A-30912 A is a member of the A-30912 blend, which also contains components B, C, D, E, F and G. Mixture A-30912 and component A to component G are known from Hoehn and Michel, see U.S. Patent 4,024,245. Component A-30912 A is identical to the antibiotic A-22082 described by Higgens and Michel in U.S. Patent 4,024,246.
A 4.024.245. számú és a 4.24,246. számú amerikai szabadalmi leírások közlése óta kiderült, hogy az A-30912 A komponens azonos az Echinocandin Bvel (lásd Benz és munkatársai, Helv. Chim. Acta, 57,No. 4,024,245. and 4.24.246. Since the disclosure of U.S. Patents Nos. 3,690,940 and 5,630,600, it has been found that component A-30912 A is identical to Echinocandin B (see Benz et al., Helv. Chim. Acta, 57;
2459, 1974, és az 568,386. számú svájci szabadalmi leírás). Az SL 7810/F antibiotikum szintén azonos az echinocandin B (lásd Keller-Juslen és munkatársai, Tetrahedron Letters, 46, 4147-4150, 1976, továbbá a 823.289. számú belga szabadalmi leírás,2459, 1974, and 568,386. Swiss Patent Specification No. Antibiotic SL 7810 / F is also identical to echinocandin B (see Keller-Juslen et al., Tetrahedron Letters, 46, 4147-4150, 1976) and Belgian Patent 823.289,
Keller-Juslen és munkatársai az A-30912 A komponens szerkezetét olyan II általános képletű vegyülettel írják le, ahol R linoleoilcsoport, R1, R3 és R4 hidroxilcsoport, továbbá, ahol R2 hidrogénatom.Keller-Juslen et al. Describe the structure of component A-30912 with a compound of formula II wherein R is a linoleoyl group, R 1 , R 3 and R 4 are hydroxy groups, and wherein R 2 is hydrogen.
A tetrahidro-A-30912 A komponenst (tetrahidro-SL 7810/F, tetrhidro-echinocandin B) a 834.289. számú belga szabadalmi leírásban írják le, továbbá Benz és munkatársai ismertetik (Helv. Chim. Acta, 57, 2459-2477, 1974). A vegyület szerkezetét olyan II általános képletű vegyület írja le, ahol R sztearoilcsoport, R1, R3 és R4 hidroxilcsoport és R2 hidrogénatom. Ezt a vegyületet az egyszerűség kedvéért a jelen leírásban tetrahídro-A-30912 A-nak jelöljük.Tetrahydro-A-30912 Component A (Tetrahydro-SL 7810 / F, Tetrhydro-Echinocandin B) is disclosed in U.S. Patent 834,289. Belgian et al., Helv. Chim. Acta, 57, 2459-2477 (1974). The structure of the compound is described by a compound of formula II wherein R is stearoyl, R 1 , R 3 and R 4 are hydroxy and R 2 is hydrogen. For simplicity, this compound is referred to herein as tetrahydro-A-30912A.
Az Aculeacin A az Aculeacin keverék egyik komponense , amely hat minor komponens között (aculeacin B, C, D, É, F és G) a legnagyobb mennyiségben fordul elő. Az aculeacin komponenseket Mizuno és munkatársai írják el a 3.978,210. számú amerikai szabadalmi leírásban. Ahogy azt a 859.067. számú belga szabadalmi leírásban olvashatjuk, az aculeacin A valószínűleg hasonló ciklusos peptid szerkezettel rendelkezik, mint a tetrahidro-A-30912 A, azzal a különbséggel, hogy a sztearoil-oldallánc helyett palmitoil-oldallánc szerepel.Aculeacin A is one of the components of the Aculeacin blend that is found in the highest amounts among the six minor components (Aculeacin B, C, D, E, F, and G). The aculeacin components are described in Mizuno et al., U.S. Patent 3,978,210. U.S. Pat. As described in 859.067. In the Belgian patent no. 808, aculeacin A is likely to have a similar cyclic peptide structure to tetrahydro-A-30912A except that the stearoyl side chain is replaced by a palmitoyl side chain.
A találmány szerinti új ciklusos peptid alapvegyület, azaz az A-30912 A komponens (echinocandin B, SL 7810/F), a tetrahidro-A-30912 Á komponens és az aculeacin A olyan I általános képletű vegyület, ahol R1, R3 és R4 hidroxilcsoport, míg R2 hidrogénatom.The novel cyclic peptide parent compound of the invention, namely Compound A-30912 A (echinocandin B, SL 7810 / F), Compound A tetrahydro-A-30912 and aculeacin A, are compounds of Formula I wherein R 1 , R 3 and R 4 is hydroxy, while R 2 is hydrogen.
Az áz alapvegyület, (azaz az A-30912 A alapvegyület) fehér színű, amorf anyag, vízben, dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban és metanolban oldódik, ugyanakkor például kloroformban, toluolban és dietil-éterbert nem.The base parent compound (i.e. parent compound A-30912A) is a white, amorphous material, soluble in water, dimethylformamide, dimethylsulfoxide and methanol, but not in chloroform, toluene and diethyl ether, for example.
Az A-30912 A alapvegyület tapasztalati képlete’ C3 4 Hs j N7 O! 5, molekulasúlya pedig 797,83,Experimental formula for parent compound A-30912 A 'C 3 4 H s j N 7 O! 5 and a molecular weight of 797.83,
Az A-30912 A alapvegyület kálium-bromid tablettában vizsgált infravörös abszorpciós spektrumát az 1. ábrán mutatjuk be. Az alábbi abszorpciós maximumokat láthatjuk-.3340, széles (hidroxilcsoport, hidrogén-kötések), 2970, 2930, 2890 (CH, alifás CH3, CH), 1660 és 1625 (több karbonilcsoport), 1510-1550, 1430-1450 (CH), 1310-1340 1230-1260, 1080,835, 650 széles és 550, széles, cm4.The infrared absorption spectrum of parent compound A-30912 A in a potassium bromide tablet is shown in Figure 1. The absorption maxima shown below are -33340, broad (hydroxy, hydrogen bonds), 2970, 2930, 2890 (CH, aliphatic CH 3 , CH), 1660 and 1625 (more carbonyl), 1510-1550, 1430-1450 (CH). ), 1310-1340 1230-1260, 1080,835, 650 wide and 550 wide, cm 4 .
Az A-30912 A alapvegyület 66%-os, vizes dimetil-formamidban végzett elektrometrikus titrálása szerint egy titrálható csoport van jelen, amelynek pKaértéke 7,35 (eredeti pH 7,32).An electrometric titration of parent compound A-30912 A in 66% aqueous dimethylformamide showed a titratable group having a pK a of 7.35 (original pH 7.32).
Az A 30912 A alapvegyületet nagyfelbontású folyadékkromatográfiával izoláljuk. Az A-30912 A alapvegyület közelítő retenciós ideje (K*): 11,52 perc, ha az elkülönítés nagynyomású folyadékkromatográflával történik, az alábbi körülmények között:, oszlop:4 300 mm töltet: szi!ikagél/C j g • oldószer: ammónium-acetát, acetonitril és víz 1:2:97 arányú elegye áramlási sebesség: 3 ml/perc nyomás: 10 atm detektor: változtatható ultraibolya hullámhossz,The parent compound A 30912 A was isolated by high performance liquid chromatography. Approximate retention time (K *) of parent compound A-30912 A: 11.52 minutes when separated by high performance liquid chromatography under the following conditions: column: 4,300 mm packing: silica gel / Cg • solvent: ammonium acetate: acetonitrile / water 1: 2: 97 mixture flow rate: 3 ml / min pressure: 10 atm detector: variable ultraviolet wavelength,
230 nm érzékenység·. 0-04 A.U.F.S.230 nm sensitivity. 0-04 A.U.F.S.
Az alábbiakban ismertetjük az A-30912 A alapvegyület előállítását.The preparation of the parent compound A-30912 A is described below.
A szubsztrát előállításaPreparation of the substrate
A találmány szerinti A-30912 A alapvegyületet az A-30912 A komponensből, a tetrahidro-30912 A komponensből, vagy az aculeacin A-ból állítjuk elő. Ezeket az anyagokat tiszta vegyületként használhatÍuk, azonban ez nem lényeges. így például szubsztrátcént felhasználhatjuk az A-30912 A alapvegyület előállításakor azt az A-30912 keveréket, amelyben az A-30912 A komponens major komponensként van jelen.The parent compound of the present invention, A-30912 A, is prepared from component A-30912 A, tetrahydro-30912 A, or aculeacin A. These materials may be used as pure compounds, but this is not essential. For example, the A-30912 A mixture in which A-30912 A is present as a major component may be used as a substrate for preparing the parent compound A-30912 A.
Az A-30912 A komponenst az alábbi törzsek süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között való tenyésztésével állítjuk elő: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Aspergillus nídulans NRRL 8112, c) Aspergillus nídulans var. echinulatus A32204, NRRL 3860, d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039, vagy e) Aspergillus nídulans var. roseus NRRL 11440.Component A-30912 A is prepared by culturing immersed aerated fermentation conditions of the following strains: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Aspergillus nidulans NRRL 8112, c) Aspergillus nidulans var. echinulatus A32204, NRRL 3860, d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039, or e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Ha az A-30912 A komponens előállításához az A. nídulans var, roseus NRLL 11440 mikroorganizmust használjuk, úgy a komponensek keverékét kapjuk, amit az egyszerűség kedvéért A-42355 antibiotikumkeveréknek nevezünk. Az A-42355 antibiotikum-keverék major komponense az A-30912 A komponens. Az A-42355 keverék minor komponensei qz A-30912 B, D és H komponensek. Az A-30912 A-tetrahidro-származékot az A-30912 A komponensből állítjuk elő ismert hidrogénezési módszerekkel, qmikor a redukciót addig végezzük, míg a linoleoil-oldallánc mindkét kettős kémiai kötése redukálódik.Using the microorganism A. nidulans var, roseus NRLL 11440 for the preparation of component A-30912 A results in a mixture of components, referred to simply as the A-42355 antibiotic mixture. Major component of the A-42355 antibiotic mixture is component A-30912. Minor components of the A-42355 mixture are q, A-30912 components B, D and H. The A-30912 A-tetrahydro derivative is prepared from component A-30912 A by known hydrogenation procedures, whereby the reduction is effected until both double chemical bonds of the linoleoyl side chain are reduced.
Az aculeacin A előállítására az Aspergillus aculeatus NRRL 8075 mikroorganizmust a 3.978.210. számú, és a jelen leírásban is imertetett amerikai szabadalmi leírás szerint fermentáljuk.For the production of aculeacin A, the microorganism Aspergillus aculeatus NRRL 8075 is disclosed in U.S. Patent 3,978,210. fermented according to U.S. Pat.
A találmány szerinti eljárás egy másik kivitelzési változata szerint olyan alapvegyületet állítunk elő, ahol R1 és R2 hidrogénatomok, R3 ésR4 pedig hidroxilcsoportok. A találmány szerinti ilyen alapvegyületet A-30912 B alapvegyületnek nevezzük. Az A-30912 B alapvegyületet úgy állítjukelő, hogy egy olyan II általános képletű ciklusos peptid antibiotikumot, ahol R linoleoilcsoport vagy sztearoilcsoport, és R1, R2, R3 és R4 az A-30912 B alapvegyület ismertetésekor megadott, acilhasítunk.In another embodiment of the process of the present invention there is provided a parent compound wherein R 1 and R 2 are hydrogen and R 3 and R 4 are hydroxy. Such a parent compound of the invention is referred to as A-30912 B parent compound. The parent compound A-30912 B is prepared by acylating a cyclic peptide antibiotic of formula II wherein R is a linoleoyl group or a stearoyl group, and R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are as described in parent compound A-30912 B.
Abban az esetben, ha a II általános képletben, R linoleilcsoport, úgy a ciklusos peptid antibiotikumot A-30912 B komponensnek nevezzük, ugyanakkor, ha R sztearoilcsoport, úgy ennek az antibiotikumnak tetrahidro-A-30912 B komponens a neve.In the case where R is a linoleyl group in Formula II, the cyclic peptide antibiotic is referred to as Component A-30912, whereas when R is a stearoyl group, this antibiotic is referred to as tetrahydro-A-30912 Component B.
Az A-30912 B komponens az A-30912 jelű keverék egyik tagja, a keverék tartalmazza az A, C, D, E, F és G komponenseket is. Az A-30912 keveréke Hoehn és Micnel írja le a 4.024.245. számú amerikai szabadalmi leírásban.Component A-30912 B is a member of the A-30912 blend, and also includes A, C, D, E, F, and G. A mixture of A-30912 is described by Hoehn and Micnel in 4,024,245. U.S. Pat.
Az A-30912 B komponens a vizsgálatok szerint azonos az echinocandin C-vel (lásd Traber és munkatársai, Helv. Chim Aeta, 62, 1252, 1979) és az SL 7810/F-II jelű antibiotikummal (lásd a 834.289. számú belga szabadalmi leírást).Component A-30912 B has been shown to be identical to echinocandin C (see Traber et al., Helv. Chim Aeta, 62, 1252, 1979) and antibiotic SL 7810 / F-II (see Belgian Patent No. 834,289). description).
Traber és munkatársai szerint az echinocandin C antibiotikum szerkezetét olyan II általános képletű vegyület adja meg, ahol R* és R2 hidrogénatomok,According to Traber et al., The structure of the echinocandin C antibiotic is provided by a compound of formula II wherein R * and R 2 are hydrogen atoms,
R és R4 hidroxilcsoportok és R linoleoilcsoport. A tetrahidro-echinocandin C szerkezete Traber és munkatársai szerint olyan II általános képletű vegyület, ahol R* és R2 hidrogénatomok, R3 és R4 hidroxilcsoportok, míg R sztearcilcsoport.R and R 4 are hydroxy and R is linoleoyl. The structure of tetrahydro-echinocandin C, according to Traber et al., Is a compound of formula II wherein R * and R 2 are hydrogen, R 3 and R 4 are hydroxy and R is stearyl.
A tetrahidro-A-30912 B komponenst (tetrahidro-SL 7810/F-II, tetrahidro-echinocandin C) a 834.289, számú belga szabadalmi leírásban ismertetik, továbbá Traber és munkatársai közük (Helv, Chim. Aeta, 62, 1979), a vegyület olyan II általános képletű vegyület szerkezetével azonos szerkezetű, ahol R‘ és R2 hidrogénatomok, R3 és R4 hidroxilcsoportok, míg R sztearoilcsoport. A jelen leírásban az egyszerűség kedvéért ezt a vegyületet tetrahidro-A-30912 B-nek nevezzük.Tetrahydro-A-30912B (Tetrahydro-SL 7810 / F-II, Tetrahydro-echinocandin C) is described in Belgian Patent 834,289, and Traber et al., Helv, Chim. Aeta, 62, 1979, Compound II has the same structure as the compound of formula II wherein R 1 and R 2 are hydrogen, R 3 and R 4 are hydroxy and R is stearoyl. For purposes of simplicity, this compound is referred to herein as tetrahydro-A-30912B.
A találmány szerinti új ciklusos hexapeptid alapvegyületnek, azaz az A-30912 B alapvegyületnek és a tetrahidro-A-30912 B alapvegyületnek a szerkezetét olyan I általános képletű vegyület adja meg, ahol R1 és R2 hidrogénatomok és R3 és R4 hidroxilcsoportok.The structure of the novel cyclic hexapeptide parent compound of the invention, the parent compound A-30912 B and the tetrahydro-A-30912 B parent compound, is represented by a compound of formula I wherein R 1 and R 2 are hydrogen and R 3 and R 4 are hydroxy.
Az A-30912 B alapvegyület tapasztalati képlete C3 4Hs ] N7O i 4, molekulasúlya pedig 781,83.The parent compound of A-30912 B has an empirical formula C 3 4 H s ] N 7 O 14 and a molecular weight of 781.83.
Az alábbiakban ismertetjük az A-30912 B alapvegyület előállítását.The preparation of parent compound A-30912 B is described below.
A szubsztrát előállításaPreparation of the substrate
Az A-30912 B alapvegyületet az A-30912 B komponensből, vagy a tetrahidro-A-30912 B-ből állítjuk elő. Mivel az A-30912 B komponens nem major komponense az antibiotikum keveréknek, azt bizonyos mértékig tisztítani kell az együtt keletkező többi komponens eltávolítására szubsztrátként való felhasználás előtt.The parent compound A-30912 B is prepared from component A-30912 B or tetrahydro-A-30912 B. Because Component A-30912 is not a major component of the antibiotic blend, it must be purified to some extent before being used as a substrate to remove the other components that are formed.
Az A-30912 B komponenst az alábbi mikroorganizmusokat .süllyesztett) levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Apergillus nídulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039, vagy d) Aspergillus nídulans var. roseus NRRL 11440.Component A-30912 B is cultured under (a) immersed aerated fermentation conditions: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Apergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039, or d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Ha az A.nidulans var. roseus NRRL 11440 mikroorganizmust használjuk az A-30912 B komponens előállítására, úgy az egyszerűség kévéért A-42355 antibiotikum-keveréknek nevezett keveréket kapunk? ’ Az A-42355 antibiotikum-keverék major komponense az A-30912 A komponens. A keverék minor komponensei az A-30912 B, D és H komponensek.If A.nidulans var. roseus NRRL 11440 is used to produce component A-30912 B, so for the sake of simplicity we get a mixture called antibiotic mixture A-42355? The major component of the A-42355 antibiotic mixture is component A-30912. Minor components of the mixture are A-30912 B, D and H.
A tetrahidro-A-30912 B-t az A-30912 B komponensből állítjuk elő ismert hidrogénezési módszerekkel. A redukciót addig végezzük, míg a linoleoil-oldal•láns kettős kémiai kötései redukálódnak.Tetrahydro-A-30912 B is prepared from component A-30912 B by known hydrogenation techniques. The reduction is performed until the double chemical bonds of the linoleoyl side chain are reduced.
A találmány szerinti eljárás egy következő kivitelezési változata szerint olyan vegyületeket állítunk elő, ahol R1, R2, R3, és R4 mindegyike hidrogénatom. Ezt a vegyületet A-30912 D alapvegyületnek nevezzük. Ezt a vegyületet az olyan II általános képletű ciklusos hexapeptid antibiotikum dezacilezésével állítjuk elő, ahol az általános képletben R linoleoil- vagy sztearoilcsoport, és R1, R2, R3 és R4 az A-30912 D alapvegyület ismertetésekor megadott jelentésűek.In another embodiment of the process of the invention, compounds are prepared wherein R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each hydrogen. This compound is referred to as the parent compound A-30912 D. This compound is prepared by deacylating a cyclic hexapeptide antibiotic of formula II wherein R is a linoleoyl or stearoyl group and R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are as defined in parent compound A-30912 D.
Ha a II általános képletű ciklusos hexapeptid antibiotikumban R linoleoilcsoport, úgy az antibiotikumot A-30912 D komponensnek nevezzük, ugyanakkor, ha R sztearoilcsoport, úgy a vegyület neve tetrahidro-A-30912 D komponens.When the cyclic hexapeptide of formula II is an R-linoleoyl group, the antibiotic is referred to as Component A-30912, whereas when the R is a stearoyl group, the compound is designated as tetrahydro-A-30912 Component D.
Az A-30912 D komponens az A-30912 keverék egyik komponense, a keverék tartalmazza még az A, B, C, D, E, FésG komponenseket is. Az A-30912 keveréket Hoehn és Michel írja le a 4,024.245. számú amerikai szabadalmi leírásban.Component A-30912 D is a component of the A-30912 blend, and also includes A, B, C, D, E, FesG. The A-30912 blend is described by Hoehn and Michel in 4,024,245. U.S. Pat.
A D komponens azonos az echnoncandin D antibiotikummal (lásd Traber és munkatársai, Helv. Chim. Acta, 62, 1252, 1979) és az SL-7810/F-I1I antibiotikummal (lásd a 834,289. számú belga szabadalmi leírást). |Component D is identical to antibiotic echnoncandin D (see Traber et al., Helv. Chim. Acta, 62, 1252, 1979) and antibiotic SL-7810 / F-II (see Belgian Patent No. 834,289). |
Traber és munkatársai az echinocandin D antibiotikum szerkezetére olyan II általános képletű vegyületet javasolnak, ahol R1, R2, R3 és R4 mindegyike hidrogénatom, ugyanakkor R linoleoilcsoport. A tetrahidro-echinocand D antibiotikum szerkezete Traber és munkatársai szerint olyan ΓΙ általános képletű vegyület szerzetével azonos, ahol R1, R2 , R3 és R4 hidrogénatomok, ugyanakkor R sztearoilcsoport.Traber et al. Propose a compound of formula II for the echinocandin D antibiotic structure wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each hydrogen and R is a linoleoyl group. The structure of the antibiotic tetrahydro-echinocand D is, according to Traber et al., Identical to that of a compound of the formula ΓΙ wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are hydrogen atoms and R is a stearoyl group.
A fenti vegyületet az egyszerűség kedvéért (azonos a tetrahidro-SL 7810/F-III, tetrahidro-echinocandin D vegyületekkel) tetrahidro-A-30912-D-nek nevezzük.The above compound is referred to as tetrahydro-A-30912-D for simplicity (identical to tetrahydro-SL 7810 / F-III, tetrahydro-echinocandin D).
A találmány szerinti új ciklusos peptid alapvegyületet, azaz az A-30912 D komponens (echinocandin D, SL 7810/F-I1I) alapvegyületét és a tetrahidro-A-30912 D-t olyan 1 általános képlettel jellemezhetjük, ahol R1, R2, R3 és R4 mindegyike hidrogénatom.The novel cyclic peptide parent compound of the present invention, that is, the parent compound of Component A-30912 D (echinocandin D, SL 7810 / F-IIII) and tetrahydro-A-30912 Dt can be characterized by the general formula 1 wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each hydrogen.
Az A-30912 D alapvegyület tapasztalati képlete C3 4 Hs i N7 0! 2, molekulasúlya pedig 749,83.Experimental formula for parent compound A-30912 D C3 4 H s i N 7 0! 2 and a molecular weight of 749.83.
Az alábbiakban ismertetjük az A-30912 D alapvegyület előállítását.The preparation of parent compound A-30912 D is described below.
A szubsztrát előállításaPreparation of the substrate
Az A-30912 D alapvegyületet az A-30912 D komponensből, vagy a tetrahidro-A-30912 D-bői állítjuk elő. Mivel az A-30912 D komponens az antibiotikum-keverék minor komponense, így ez bizonyos mértékig tisztítanunk kell a többi, együtt termelődő komponens eltávolítására szubsztrátként való felhasználása előtt.The parent compound A-30912 D is prepared from component A-30912 D or tetrahydro-A-30912 D. Since Component A-30912 is a minor component of the antibiotic mixture, it needs to be purified to some extent before being used as a substrate to remove other co-producing components.
Az A-30912 D antibiotikum komponenst az alábbi mikroorganizmusok süllyesztett, levegőztetett ferméntációs körülmények közötti tenyésztésével áílítjuk elő: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (a 834289 számú belga szabadalmi leírás), vagy d) Aspergillus nidulans var, roseus NRRL 11440.The antibiotic component A-30912 D is prepared by culturing the following microorganisms under immersed, aerated fermentation conditions: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (Belgian Patent 834289), or d) Aspergillus nidulans var, roseus NRRL 11440.
Ha az A-30912 D komponens előállítására az A. nidulans var. roseus NRRL 11440 mikroorganizmust használjuk, úgy a komponensek egy keverékét kapjuk meg, amit az egyszerűség kedvéért A4-2355 antibiotikum-keveréknek nevezünk, A keverék major komponense az A-30912 A komponens. Az A-30912 B, F és H komponensei az A-42355 keverék minor összetevői.If A. nidulans var. roseus NRRL 11440 is used to obtain a mixture of components, referred to simply as the A4-2355 antibiotic mixture, for simplicity, the major component of which is component A-30912 A. Components B, F and H of A-30912 are minor components of A-42355.
A tetrahidro-A-30912 D-t az A-30912 D komponensből ismert hidrogénezés! módszerekkel állítjuk elő. A redukciót addig végezzük, míg a linoleoii-oldallánc kettős kötései redukálódnak.Tetrahydro-A-30912 D is hydrogenated from component A-30912 D! methods. The reduction is carried out until the double bonds of the linoleol side chain are reduced.
A találmány szerinti eljárás egy következő kivitelezési változata szerint olyan alapvegyületet állítunk elő, ahol R1 és R4 hidroxiicsoportok, R2 hidrogénatom és R3 1-6 metoxicsoport. Ezt az alapvegyületet A-30912 H típusú alapvegyületnek nevezzük. Az A-30912 H-típusú alapvegyületet az olyan II általános képletű ciklusos hexapeptid antibiotikum acilhasításával állítjuk elő, ahol R linoleoilcsoport vagy sztearoilcsoport, R*, R2, R3 és R4 pedig az A-30912 H-típusú alapvegyület ismertetésekor megadott jelentésűek.The invention according to a further embodiment variant is prepared by a basic compound, wherein R1 and R4 are hydroxyl groups, R 2 hydrogen and R 3 1-6 methoxy. This parent compound is referred to as the parent compound A-30912 H. The A-30912 H-type parent compound is prepared by acylating the cyclic hexapeptide antibiotic of formula II wherein R is a linoleoyl or stearoyl group, and R *, R 2 , R 3 and R 4 are as defined in the A-30912 H-type parent compound.
Ha R a II általános képletű ciklusos hexapeptid antibiotikumban linoleoilcsoport és R3 metoxicsoport, úgy ezt a vegyületet A-30912 H komponensnek nevezzük, ugyanakkor, ha R sztearoilcsoport ás R3 metoxicsoport, úgy az antibiotikum neve tetrahidro-A-30912 H komponens.When R is a linoleoyl group and R 3 is a methoxy group in the cyclic hexapeptide of formula II, this compound is referred to as Component A-30912 H, whereas when R is a stearoyl group and R 3 is methoxy, the antibiotic is called tetrahydro-A-30912 Component H.
Az A-30912 H komponens az A-30912 jelű keverék egyik összetevője, amely keverék tartalmazza továbbá az A, C, D, E, D és G komponenseket is. Az A-30912keveréketHoehn és Michel írja le a 4.024.245 számú amerikai szabadalmi leírásban. Az A-30912 H komponens később felfedezett A-30912 antibiotikum komponens, leírását megtaláljuk Michel Antibiotic A-309J2 Factor H című, 117.739. számú, i 980. február 1-én beadott leírásában, amely része az 1979. június 8-án benyújtott 46,875. számú leírásnak, ezeket a jelen leírásba beépítjük.Component A-30912 H is a component of the A-30912 blend, further comprising A, C, D, E, D, and G. Mixture A-30912 is described by Hoehn and Michel in U.S. Patent 4,024,245. Component A-30912 H is a later discovered antibiotic component A-30912 and is described in Michel Antibiotic A-309J2 Factor H, 117,739. filed February 1, 980, which is part of U.S. Patent No. 46,875, filed June 8, 1979. are incorporated herein by reference.
Az A-30912 H komponens szerkezetének felfedezését követően nyilvánvalóvá vált, hogy az A-30912 H komponens rövidszénláncú-alkiloxi-homológjai használható vegyületek lennének. Ez előtt az idő előtt az előállított alkiloxi-szárntazékok használhatóságát nem ismerték fel, előállításukat csak szerkezet-meghatározás céljából végezték. A rövidszénláncú-2-6-aikoxi-homológokat az A-30912 A komponensből· állítjuk elő.Following the discovery of the structure of component A-30912 H, it became apparent that the lower alkyloxy homologues of component A-30912 H would be useful compounds. Prior to this time, the usefulness of the alkyloxy derivative prepared was not recognized, but was only made for structure determination. Short-chain 2-6-alkoxy homologs are prepared from component A-30912A.
Az A-30912 A antibiotikum komponest az alábbi mikroorganizmusok süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között való tenyésztésével állítjuk elő: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Aspergillus nidulans NRRL 8112, c) Apergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, d) Aspergillus rugulosos NRRL 8039, vagy e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.The antibiotic component A-30912 A is prepared by culturing the following microorganisms under submerged aeration fermentation conditions: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, b) Aspergillus nidulans NRRL 8112, c) Apergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, d) Aspergillus rugulosos NRRL 8039, or e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Mivel az A-30912 H alapvegyület aminocsoportot tartalmaz, a vegyület sóként is létezhetnek. Ezeket a sókat felhasználhatjuk intermedier vegyületként és tisztításkor. Az A-30912 H alapvegyület gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit különösen előnyösen használhatjuk, mivel a végtermékek tisztítása könnyebb. Gyógyszerészeti szempontból elfogadható sók azok a sók, amelyek toxieitása a szabad bázishoz képest nem növekszik melegvérű állatokkal szemben.Because parent compound A-30912 H contains an amino group, the compound may exist as a salt. These salts can be used as intermediates and for purification. Pharmaceutically acceptable salts of parent compound A-30912 H can be used particularly advantageously since the final products are easier to purify. Pharmaceutically acceptable salts are salts that do not increase their toxicity in comparison to the free base in warm-blooded animals.
Az alábbiakban ismertetjük az A-30912 H alapvegyület előállítását.The preparation of the parent compound A-30912 H is described below.
A szubsztrát előállításaPreparation of the substrate
Az A-30912 H alapvegyületet, azaz azt az I általános képletű vegyületet, ahol az általános képletben R1 és R4 hidroxilcsoport, R2 hidrogénatom és R3 metoxicsoport, az A-30912 H komponensből, vagy a tetrahidro-A-30912 H-ból állítjuk elő. Mivel az A-30912 H komponens az antibiotikum-keverék minor komponense, a többi jelenlévő antibiotikum-komponens eltávolítására bizonyos mértékig tisztítanunk kell szubsztrátként való felhasználás előtt.The A-30912 H parent compounds, i.e. the compound of formula I, wherein in formula R 1 and R 4 OH, R 2 is hydrogen and R 3 methoxy, A-30 912 H-component or tetrahydro-A-30912 H from. Since Component A-30912 H is a minor component of the antibiotic mixture, it is necessary to purify to some extent to remove the remaining antibiotic components before use as a substrate.
Az A-30912 H antibiotikum komponenst az alábbi mikroorganizmusok fermentációjával állítjuk elő: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, vagy b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.The antibiotic component A-30912 H is prepared by fermentation of the following microorganisms: a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, or b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Ha az A-30912 H komponens előállítására az A. nidulans var. roseus NRRL 11440 törzset használjuk, úgy a komponensek keverékét kapjuk meg, amit Á4If A. nidulans var. roseus strain NRRL 11440 to obtain a mixture of components as described in FIG
-42355 antibiotikum-keveréknek nevezünk. A keveréknek az A-30912 A komponens major összetevője, mig a B, D és H az A-42355 keverék minor komponensei.This is called a -42355 antibiotic mixture. The mixture is a major component of A-30912 component A, while B, D and H are minor components of A-42355 mixture.
A találmány szerinti eljárás során egy további alapvegyületet állítunk elő, ahol R*, R3 és R4 hidroxilcsoport és R2 karbonsav-amid-csoport. A találmány szerinti, fenti alapvegyületet S 31794/F-l alapvegyületnek nevezzük. Az S 31794/F-l alapvegyületet az olyan II általános képletű ciklusos peptid antibiotikum acilhasításával állítjuk elő, ahol az általános képletben R mirisztoilcsoport és R1, R2, R3 és R4 az S-31794/F-l alapvegyület ismertetésekor megadott jelentésűek.The process of the present invention provides a further parent compound wherein R *, R 3 and R 4 are hydroxy and R 2 is a carboxylic acid amide. The above parent compound of the invention is referred to as the parent compound S 31794 / F1. S 31794 / Fl parent compound prepared is the II cyclic peptide antibiotic acilhasításával general, where in the formula the meanings given R myristoyl and R 1, R 2, R 3 and R 4 S-31794 / Fl basic compound represents.
A találmány szerinti S31794/F-1 alapvegyület előállítására az S 31794/F-l ciklusos hexapeptid antibiotikumot dezacilezzük.To produce the parent compound of the present invention, S31794 / F-1, the cyclic hexapeptide antibiotic S 31794 / F-1 is deacylated.
Az S 31794/F-l gombaellenes hatású antibiotikumot a 2.628.965. számú német, és a 4.173.629. számú amerikai szabadalmi leírás tárgyalja, előállítására az Acrophialophora limonsipora nov. spec. Dreyfuss et Muller NRRL 8095 mikroorganizmust tenyésztjük. Az S 31794/F-l vegyület az alábbi jellemzőkkel rendelkezik: 178 °C és 180 °C közötti hőmérsékleten az amorf por bomlás közben olvad, a kristályos pedig 1R0—183 °C hőmérsékleten szintén bomlás közben: (aj2 p. ^4 közben: [α/^θθ: -24° (c= 0,5, metanolban), vagy »37° (c = 0,5, piridinben), (kristályos anyag), metanolban vizsgált ultraibolya abszorpciós spektruma: 194 nm (Ej 1%, cm: 807), 225 nm (vállas), (Ei 1%, cm: 132), 276 nm (Ej 1%, cm: 12,8), 284 nm (vállas), E! 1%, cm: 10,5), a deutero-metanolban (190 mg, 1,5 ml deutero-metanolban, belső standard tetrametil-szilán) vizsgált Ci3-mágneses magrezonancia spektrum (kristályos anyag) az alábbi:Anti-fungal antibiotic S 31794 / Fl is disclosed in U.S. Patent No. 2,662,965. German Patent No. 4,673,629; U.S. Pat. No. 4,198,123 to Acrophialophora limonsipora nov. spec. Dreyfuss et Muller NRRL 8095 was cultured. Compound S 31794 / F1 has the following characteristics: At 178 ° C to 180 ° C, the amorphous powder melts at decomposition and the crystalline at 1 ° C to 183 ° C also decomposes: (at 2 p ^ 4: [ α-λθθ: -24 ° (c = 0.5 in methanol) or ,37 ° (c = 0.5 in pyridine) (crystalline material): ultraviolet absorption spectrum in methanol: 194 nm (ε 1%, cm: 807), 225 nm (shoulder), (E1%, cm: 132), 276 nm (E1%, cm: 12.8), 284 nm (shoulder), E1%, cm: 10, 5), the C 13 nuclear magnetic resonance spectrum (crystalline material) of deuteromethanol (190 mg, 1.5 ml deuteromethane, internal standard tetramethylsilane) is as follows:
A kristályos anyagot 2 órán át 100 °C hőmérsékleten, erősen csökkentett nyomású térben szárítva az alábbi elemanalízist kapjuk: 55,5-56,5% szén, 7,5-7,7% hidrogén, 10,5—10,8% nitrogén és 25,5)26,0% oxigén, a vegyület metanolban etanolban, piridinben, dimetil-szulfoxidban jól oldódik, gyengén oldódik vízben, klorformban, etil-acetátben, dietil-éterben, benzolban és hexánban, a vegyület gombaellenes hatású, különösen Candida albicans mikroorganizmussal szemben.The crystalline material is dried for 2 hours at 100 [deg.] C. under a high vacuum to give the following elemental analysis: 55.5-56.5% carbon, 7.5-7.7% hydrogen, 10.5-10.8% nitrogen and 25.5) 26.0% oxygen, the compound is highly soluble in methanol in ethanol, pyridine, dimethylsulfoxide, slightly soluble in water, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether, benzene and hexane, the compound has antifungal activity, especially Candida albicans. against a microorganism.
Az S 31794/F-l antibiotikum szerkezetét az olyan II általános képletű vegyület adja meg, ahol R mirisztoilcsoport, R , R3 és R4 hidroxilcsoport, és R2 karbonsav-amidcsoport.The structure of S 31794 / Fl antibiotic enter a compound of Formula II wherein R myristoyl, R, R 3 and R 4 OH and R 2-carboxylic acid amide.
A találmány szerinti új ciklusos peptid alapvegyület, azaz az S 31794/F-l antibiotikum alapvegyülete az alábbi szerkezetű: olyan I általános képletű vegyület, ahol R1, R3 és R4 hidroxilcsoport, R? pedig karbonsa v-amidcsoport.The novel cyclic peptide parent compound of the present invention, the parent compound of antibiotic S 31794 / F1, has the following structure: A compound of formula I wherein R 1 , R 3 and R 4 are hydroxy, R? and carbonsa is a v-amide group.
Az S 31794/F-l alapvegyület tapasztalati képlete C3 s Hs 2N8O1 β, molekulasúlya pedig 840,87.The parent compound of S 31794 / Fl has an empirical formula C 3 s H s 2 N 8 O 1 β and a molecular weight of 840.87.
Az alábbiakban ismertetjük az S 31794/F-l alapvegyület előállítását.The preparation of the parent compound S 31794 / F-1 is described below.
A szubsztrát előállításaPreparation of the substrate
Az S 31294/F-l alapvegyület az S 31794/F-l antibiotikumból állítjuk elő.The parent compound S 31294 / F-1 is prepared from the antibiotic S 31794 / F-1.
Az S 31794/F-l antibiotikumot úgy állítjuk elő, hogy az Acrophialophora limonispora limonspora NRRL 8Ó95 mikroorganizmust süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük. A mikroorganizmust letétbe helyeztük a Norther Régiónál Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culturs Collention, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, állandó törzsgyűjteményébe, itt a törzs az NRRL 8095 számot kapta.The antibiotic S 31794 / F-1 is prepared by culturing the microorganism Acrophialophora limonispora limonspora NRRL 89595 under submerged aeration. The microorganism was deposited with the Norther Region Research Center, U.S.A. Department of Agriculture, Agricultural Research Cultures College, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, here the strain is given the NRRL 8095.
Az egyes antibiotikumok végső tisztításához előnyösen reverz fázisú, nagyfelbontású, alacsony nyomású folyadékkromatográfiát használunk szilikagél/ Cl8 adszorbenssel. Az eljárás során a nyers antibiotikum-keveréket oldószerben oldjuk, az oldatot hasonló oldószerrel kiegyensúlyozott oszlopra helyezzük. Az oldószerrel ezután eluáljuk az oszlopot. Frakciókat gyűjtünk, és ezeket Candida albieans bioautográfiával és/vagy ultaibolya fényben (a viszonylagos retenciós időn alapulva) vizsgáljuk. Az egyes antibiotikum komponenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Esetenként további kromatográfiás elkülönítést kell végeznünk, az egyes komponensek tiszta alakjának elkülönítése érdekében.Final purification of the individual antibiotics preferably reversed-phase high-resolution, low-pressure liquid chromatography using silica gel / C l8 adsorbent. The process involves dissolving the crude antibiotic mixture in a solvent and placing the solution on a column equilibrated with a similar solvent. The column is then eluted with the solvent. Fractions were collected and analyzed by Candida albieans bioautography and / or ultraviolet light (based on relative retention time). Fractions containing each antibiotic component were collected. Occasionally, additional chromatographic separation is required to isolate the pure form of each component.
A nyers antibiotikumok-keveréket az A-30912 vagy A-42355 esetében például a teljes tenyészlé vagy a micélium metanolos és kloroformos extrakciójával állítjuk elő.For example, the crude antibiotic mixture for A-30912 or A-42355 is prepared by extraction of the whole culture broth or mycelium with methanol and chloroform.
Az antibiotikumok kromatográfiás elkülönítéséhez előnyösen metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyét használjuk.Preferably, a 7: 2: 1 mixture of methanol, water, and acetonitrile is used for chromatographic separation of the antibiotics.
A nyers S 31794/F-l antibiotikumot úgy állítjuk elő, hogy a teljes fermentlevet etil-acetát és izopropanol 4:1 arányú elegyével extraháljuk, az extraxtumot ezután kromatografáljuk.The crude antibiotic S 31794 / F-1 was prepared by extracting the whole fermentation broth with ethyl acetate: isopropanol (4: 1) and then chromatographing the extracts.
Az egyes antibiotikum-komponenseket vékonyréteg-kromatográ fiával azonosítjuk. Adszorbensként előnyösen szilikagélt használunk.Each antibiotic component is identified by thin layer chromatography. The adsorbent is preferably silica gel.
Az A-30912 A-G komponensek szilikagél vékonyrétegen, benzol és metanol 7:3 arányú elegyével vizsgált R/pértékeit az I. táblázatban adjuk meg.The R / P values of the A-30912 A-G components on a silica gel thin layer with a 7: 3 mixture of benzene and methanol are given in Table I.
A vizsgálatokat Candida albicans bioautográfiával végeztük.The studies were performed by Candida albicans bioautography.
I. TáblázatTable I
A 30912 komponens RáértékComponent 30912 has a value on it
A 0,35A 0.35
B 0,45B 0.45
C 0,54C, 0.54
D 0,59D, 0.59
E 0,27E, 0.27
F 0,18F, 0.18
G 0,13G, 0.13
III. táblázatIII. spreadsheet
A 30912 komponens Retenciós idő másodpercekbenComponent 30912 is the Retention Time in seconds
A 792792
B 870B 870
H 990H 990
D 1140D 1140
Az A-30912 A, B, C, D és H komponensek különböző oldószerekkel szilikagélen (Merck-Darmstadt szilikagél No. 60, 20 x 20 cm) Candida albicans mikroorganizmussal kivitelezett bioautográfiával kapott Rjértékeit a 11. táblázatban adjuk meg.Components A-30912 A, B, C, D, and H have Ri values obtained using bioautography of Candida albicans with various solvents on silica gel (Merck-Darmstadt silica gel No. 60, 20 x 20 cm).
H, TáblázatH, Table
A 30912 komponens Rpértékek oldószer-elegy á b ö dThe Rp values for component 30912 are in the solvent mixture
Á komponens 0,2Ö 0,14 0,28, 0,43Component A 0.20 0.14 0.28, 0.43
B komponens 0,39 0,21 0,42 0,47Component B 0.39 0.21 0.42 0.47
C komponens 0,46 0,31 0,51 0,58Component C 0.46 0.31 0.51 0.58
D komponens 0,50 0,38 0,57 0,61Component D 0.50 0.38 0.57 0.61
H komponens 0,42 0,27 0,36 0,53H component 0.42 0.27 0.36 0.53
Oldószer-ejegyek a: etil-acetát és metanol 3:2 arányú elegye , b: etil-acetát és metanol 7:3 arányú elegye c: acetonitril és víz 95:5 arányú elegye d: etil-acetát, etanol és ecetsav 40:60:0,25 arányú elegye.Solvent tickets a: ethyl acetate: methanol 3: 2, b: ethyl acetate: methanol 7: 3 c: acetonitrile: water 95: 5 d: ethyl acetate, ethanol: acetic acid 40:60 : 0.25.
Az A-30912 A, B, D és H komponenseket azonosíthatjuk nagy felbontású, alacsony nyomású folyadékkromatográfiával is, az alábbi feltételek mellett: oszlop: üveg, 0,8 x 15,0 cm töltés: Nucleosil1 lÖ-Cje (Mechery-Nagel and Company), a feltöltést a későbbiekben ismertetettek szerint végezzük oldószer: metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegye minta térfogat: 8 μί minta súlya: 8 pg oszlop hőmérséklete: szobahőmérséklet áramlási sebesség: 18, ml/perc nyomás: 9,8 atm detektor: UV-detektálás 222 nm-en (ISCO Model 1800, változtatható hullámhosszúság, UV-érzékelő monitor) pumpa: LDC Duplex Minipump injektálás: tűinjekció.The A-30912 A, B, D and H components can also be identified high-resolution, low-pressure liquid chromatography under the following conditions: Column: glass, 0.8 x 15.0 cm packing: Nucleosil C-1 lÖ je (Mechery-Nagel and Company), fill as follows Solvent: methanol: water: acetonitrile 7: 2: 1 Sample volume: 8 μί Sample weight: 8 pg Column temperature: Room temperature Flow rate: 18, ml / min Pressure: 9 , 8 atm detector: UV detection at 222 nm (ISCO Model 1800, variable wavelength, UV sensor monitor) Pump: LDC Duplex Minipump injection: needle injection.
A III. táblázatban megadjuk az A-30912 A, B, D és H komponensek retenciós idejét.In III. Table A shows the retention times for components A-30912 A, B, D and H.
Az enzim előállításaPreparation of the enzyme
1. A termelő mikroorganizmus1. Producing micro-organism
A találmány szerinti antibiotikumok dezacilezéséhez használt enzimet az Actinolanaceae családba tartozó bizonyos mikroorganizmusok, előnyösen az Actínoplanes utahensis NRRL 12052 törzs termeli.The enzyme used to deacylate the antibiotics of the invention is produced by certain microorganisms of the Actinolanaceae family, preferably strain Actinoplanes utahensis NRRL 12052.
Az enzim hasonló lehet a penicillinek dezacilezéséhez használttal, ezt a munkát Kleinschmídt, Wright, Kvanagh és Stark ltja le a 3.150.059. számú amerikai szabadalmi leírásban. Bár az 1. példában Ismertetjük az A. utahensis NRRL 12052 törzs tenyésztésének előnyös módszerét, a szakember számára nyilvánvalóan más módszerek is lehetségesek.The enzyme may be similar to that used for the deacylation of penicillins, this work is described in Kleinschmid, Wright, Kvanagh and Stark 3,150,059. U.S. Pat. Although Example 1 describes a preferred method of culturing A. utahensis strain NRRL 12052, other methods will obviously be apparent to those skilled in the art.
Az Actinoplanaceae viszonylag új családja az Actinomycetales rendnek, Első esetben Coueh írja le 1955-ben ezt a családot (J. Elisha -Mitchell, Sci. Soc. 71, 148, 1955). A család és egyes nemek jellemzőit az alábbi irodalomban találjuk meg: Bergey s Manual of Determinative Bacteriology, 8tn ed,, R.E. Ruchanan and N. E. Gibbons, Eds., Th Williams Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, 7Ű6-723. oldal. Mindezideig 10 nemet különböztetnek meg:The Actinoplanaceae is a relatively new family of the Actinomycetales, first described by Coueh in 1955 (J. Elisha-Mitchell, Sci. Soc. 71, 148, 1955). Family and gender characteristics can be found in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8tn ed ,, R.E. Ruchanan and N. E. Gibbons, Eds., Th Williams Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, 7Ű6-723. side. So far, 10 genders have been distinguished:
I. Actínoplanes (a típusnem, és mindeddig a leggyakrabban előforduló,I. Actinoplanes (the type and the most common,
II. Spíríllospora, Ilii. Streptosporangium, IV. Amorphosporangurn, V. Ampullariella, VI. Pilimelia, VII. Planomonospora, VTII. Planobispora, IX. Datylospprangium és X. Kitasatoa,II. Spirillospora, Ilii. Streptosporangium, IV. Amorphosporangurn, V. Ampullariella, VI. Pilimelia, VII. Planomonospora, VTII. Planobispora, IX. Datylospprangium and X. Kitasatoa,
Egy izolált és jellemzett fajok és változatok például az alábbiak: Actínoplanes philippinensis, Actínoplanes armenlacus, Actínoplanes utahensis és Actínoplanes missuríensls, Spirillospora albida, Streptosporiangium roseum, Streptosporangium vulgare, Streptosporangium roseum var. Hollandénsis, Streptospirangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampullariella reguláris, Ampullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anulata, Planomonospora parontospora, Planomonospora venezuelensis, Planobispora longispora, Planomospora rose, Dactylosporangium aurantiacum és Dactylosporangium thailandense.For example, isolated and characterized species and variants include Actinoplanes philippinensis, Actinoplanes armenlacus, Actinoplanes utahensis and Actinoplanes missurensens, Spirillospora albida, Streptosporiangium roseum, Streptosporangium vulgare, Streptosporangium roseum var. Hollandensis, Streptospirangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampullariella regular, Ampullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anulata, Planomonospora parontospora, Planomonospora, Planomonospora
A találmány szerinti eljárás során használt enzim előnyös forrása az Actinoplanes nem. Az Actinoplanes nemen belül az Actinoplanes utahensis faj különösen előnyösen használható.A preferred source of the enzyme used in the process of the invention is not Actinoplanes. Within the genus Actinoplanes, the species Actinoplanes utahensis is particularly advantageous.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott fajok tenyészeteit a Northern Régiónál Research Laboratory törzsgyűjteményéből megrendelhetjük az alábbi kódszám alatt:Cultures of the species used in the method of the present invention can be ordered from the Northern Region Research Laboratory strain collection under the following code number:
Actinoplanes utahensis NRRL 12052Actinoplanes utahensis NRRL 12052
Actinoplanes missouriensis ' NRRL 12053Actinoplanes missouriensis' NRRL 12053
185.021185 021
Actlnoplanes sp. Actinoplanes sp. Actinoplanes sp.Actlnoplanes sp. Actinoplanes sp. Actinoplanes sp.
NRRL 8122 NRRL 12065. NRRL 42064NRRL 8122 NRRL 12065. NRRL 42064
Az A. utahensis NRRL 12052 törzset az American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md.. 20852 törzsgyűjteményéből származik (A. utahensis ATCC 14539). Az A. utahensis ATCC 14539 törzset szintén felhasználhatjuk enzimforrásként.A. utahensis strain NRRL 12052 is from the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md .. 20852 (A. utahensis ATCC 14539). A. utahensis strain ATCC 14539 may also be used as an enzyme source.
Az A. mossourinesis NRRL 12053 törzs szintén az ATCC törzsgyűjteményből származik (A. missouriensis ATCC 14538), és ez is enzimforrás.A. mossourinesis strain NRRL 12053 is also from the ATCC strain collection (A. missouriensis ATCC 14538) and is also an enzyme source.
Az Actinoplanaceae családba tartozó mikroorganizmusok adott törzseinek a jelen találmány szerinti acilhasítási reakcióban való hatásosságát, az alábbi eljárással állapítjuk meg. A mikroorganizmussal beoltunk egy előnyös összetételű táptalajt. A tenyészetet 2 vagy 3 napon át körkörös rázógépen 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Ezután hozzáadjuk az egyik, szubsztrátként alkalmazott antibiotikumot a tenyészethez. A tenyészlé ph-ját 6,5-ös értéken tartjuk. A tenyésztés során az aktivitást Candida albicans mikroorganizmussal végzett érték-méréssel határozzuk meg. Az antibiotikum aktivitás csökkenése azt jelzi, hogy a mikroorganizmus az acilhasítási reakciót Katalizáló enzimet termeli. Ezt azonban az egyik, alábbi módszerrel bizonyítani kell:The potency of particular strains of the Actinoplanaceae family of microorganisms in the acyl cleavage reaction of the present invention is determined by the following procedure. The microorganism was inoculated with a medium of preferred composition. The culture was cultivated on a rotary shaker at 28 ° C for 2 or 3 days. One of the substrate antibiotics is then added to the culture. The pH of the broth is maintained at 6.5. During cultivation, activity is determined by measuring with Candida albicans. A decrease in antibiotic activity indicates that the microorganism produces an enzyme that catalyses the acyl cleavage reaction. However, this must be demonstrated by one of the following methods:
1) a telje? alapváz jelenlétét bizonyítandó, nagynyo· mású folyadékkromatográfiás analízist végzünk, vagy1) the axle? performing high performance liquid chromatography (HPLC) to confirm the presence of a skeleton, or
2) megfelelő oldallánccal újra-acilezzük a vegyületet, például linoleoil-, sztearoil-, palmítoil- vagy mirosztoil-oldallánccal, az aktivitás visszaállítására.2) re-acylating the compound with a suitable side chain, such as a linoleoyl, stearoyl, palmitoyl or myrostoyl side chain, to restore activity.
2. Az enzimtermelés körülményei2. Enzyme production conditions
Az enzimtermelés azon körülmények között történik, amely előnyös az Actionplanaceae növekedésének, azaz 25 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, 5,0 és 8,0 közötti pH-η, keverés és levegőzés közben. A táptalajnak tartalmaznia kell: a) felhasználható szénforrást, például szacharózt, glükózt, glicerint vagy másokat, b) nitrogénforrást, például peptont, karbamidot, ammónium-szulfátot vagy másokat,, c) foszfátforrást, például oldható foszfát sót, végül d) szervetlen sókat, amelyek általában növelik a mikroorganizmusok növekedését.Enzyme production is carried out under conditions that are advantageous to the growth of Actionplanaceae, i.e., at 25 ° C to 30 ° C, at a pH of 5.0 to 8.0, with stirring and aeration. The culture medium must contain: a) a useful carbon source such as sucrose, glucose, glycerol or others, b) a nitrogen source such as peptone, urea, ammonium sulfate or others, c) a phosphate source such as soluble phosphate salt, and d) inorganic salts, which generally increase the growth of microorganisms.
Hatásos mennyiségű enzimet a növekedési fázist követő 40—60. órában kapunk, amikor a gyors növekedést követően bizonyos idő már eltelt. A termelt enzim mennyisége a használt fajtól függ, és a különböző növesztési körülményektől.An effective amount of the enzyme is 40-60 after the growth phase. hours, when a certain amount of time has passed after the rapid growth. The amount of enzyme produced will depend on the species used and the different growth conditions.
Ahogy az a területen tájékozott szakember számára nyilvánvaló, a mikroorganizmusok, így az Actinoplanes utahensis NRRL 12052, vagyis az enzimet termelő mikroorganizmus is variálhat. így például mesterséges variánsokat és mutánsokat lehet kani ezen törzsekből, különböző ismert mutagének, például ultraibolya sugárzás, X-sugarak, nagyfrekvenciájú hullámok, radioaktív sugárzás és kemikáliák segítségével. Az összes természetes és mesterséges variáns és mután, amely a fenti törzsekből származik, és amely termeli az enzimet, használható a jelen találmány szerinti eljárásban,As will be apparent to one of ordinary skill in the art, microorganisms such as Actinoplanes utahensis NRRL 12052, i.e., the enzyme producing microorganism, may also vary. For example, artificial variants and mutants can be removed from these strains using various known mutagens, such as ultraviolet radiation, X-rays, high-frequency waves, radioactive radiation and chemicals. All natural and artificial variants and mutants of the above strains which produce the enzyme can be used in the process of the present invention,
Az acilhasítás körülményeiConditions for acyl cleavage
A szubsztrátot előnyösen azután adjuk az Actinoplanaceae tenyészetéhez, miután a törzset legalább 48 órán át Inkubáltuk. A szubsztrát koncentrációja az át10 alakító táptalajban széles határok között változhat. Az enzim maximális kihasználása érdekében, és a gyakorlatilag teljes dezacilezés 24 órán belüli bekövetkezésére azonban általában milliliterenként 0,5 mg és 1,0 mg közötti mennyiségű szubsztrát koncentrációt használunk. Adagolhatunk kevesebb szubsztrátot is, akkor azonban az enzim nincs maximálisan kihasználva, magasabb szubsztrát-koncentráció alkalmazása esetén a fermentációs idő meghosszabbítása nélkül nem teljes a dezacilezés.Preferably, the substrate is added to the culture of Actinoplanaceae after incubation of the strain for at least 48 hours. The concentration of the substrate in the transforming medium may vary within wide limits. However, for maximum utilization of the enzyme, and for virtually complete deacylation within 24 hours, substrate concentrations of 0.5 mg to 1.0 mg per ml are generally used. However, less substrate may be added, but the enzyme is not fully utilized, and at higher substrate concentrations, the deacylation is incomplete without prolongation of the fermentation time.
A szubsztrát antibiotikumok találmány szerinti megfelelő alapvegyületté való átalakulása abban az esetben történik leggyorsabban, ha a fermentációs táptalaj pH-ját 6,0 és 7,0 közötti értéken tartjuk. pH = 6-on, vagy ennél alacsonyabb értéken lassú a dezacilezés, ahogy a pH érték 6,0 fölé emelkedik, mind a szubsztrát, mind pedig a keletkező alapvegyület egyre kevésbé stabil. Maximális stabilitást 6,0 pH-η étjük el, azonban 6,0 pH értéken a dezacilezés lassabban következik be, körülbelül 30—36 óra alatt. A gyorsabb dezacilezés (24 óra) érdekében 6,5 pH értéken fermentálunk, ekkor nagyobb veszteség nem következik be. A kevert fermentorokban a pH értéket szenzorokkal szabályozhatjuk. Ahol ez nem praktikus, például lombikfermentorban, ott a pH-t 0,1 mólod foszfát-puffer adagolásával oldjuk meg, amit a szubsztrát adagolása előtt adunk a táptalajhoz.The fastest conversion of substrate antibiotics to the corresponding parent compound of the present invention occurs when the pH of the fermentation broth is maintained between 6.0 and 7.0. At pH = 6 or lower, deacylation is slow as the pH rises above 6.0, and both the substrate and the parent compound formed are less and less stable. Maximum stability is eaten at pH 6.0, but at pH 6.0 deacylation occurs more slowly over a period of about 30 to 36 hours. For faster deacylation (24 hours), we ferment at pH 6.5, with no major loss. The pH in the mixed fermentors can be controlled by sensors. Where this is impractical, for example in a flask fermenter, the pH is resolved by adding 0.1 M phosphate buffer, which is added to the medium prior to the addition of the substrate.
A szubsztrát adagolását követően 24 órán át, vagy tovább kell folytatnunk a fermentációt. A szubsztrát tisztasága befolyásolja a dezacilezés mértékét. Például ha 50%-osnál nagyobb tisztaságú szubsztrátot használunk, úgy az 24 órában 0,8-1,2 mg/ml antibiotikum mennyiségben dezacileződik. Ha a szubsztrát kevésbé tiszta, úgy a dezacilezés lassabban folyik.Fermentation must continue for 24 hours or more after the substrate is added. The purity of the substrate influences the degree of deacylation. For example, when a substrate with a purity greater than 50% is used, it is deacylated in an amount of 0.8 to 1.2 mg / ml of antibiotic per 24 hours. If the substrate is less pure, the deacylation proceeds more slowly.
Adagolhatunk szubsztrátot több alkalommal is. így például kis fermentorokba milliliterenként 0,30,5 mg antibiotikumot adunk 12 órás időszakonként, legalább öt alkalommal. A nagyobb fermentorokba két alkalommal milliliterenként 0,5 mg-ot juttatunk.The substrate may be dosed several times. For example, 0.30.5 mg of antibiotic is added to small fermentors at least five times per 12 hour intervals. Larger fermenters receive 0.5 mg / ml twice per ml.
A dezacilezési reakciót széles hőmérséklet-határok között véfezhetjük, például 20 °C és 45 °C között. Előnyös azonban, ha a dezacilezési hőmérséklet 25 °C és 35 °C, még előnyösebben 26 °C-ra állítjuk be, ilyenkor optimális a dezacilezés, és a legstabilabb a szubsztrát és az alapvegyület.The deacylation reaction may be carried out over a wide range of temperatures, for example between 20 ° C and 45 ° C. However, it is preferred that the deacylation temperature is adjusted to 25 ° C and 35 ° C, more preferably 26 ° C, in which case the deacylation is optimal and the substrate and parent compound are most stable.
4. Szubsztrátként előnyösen tisztított antibiotikumokat használunk. A szubkután antibiotikumoknak gombaellenes hatása van, baktériumellenes aktivitása viszont nincs. így a szubsztrát anyagabaktériumsejteket vagy spórákat hordozva fertőzheti a dezacilezési reakció alatt a fermentációs táptalajt. Ezek a fertőzések befolyásolhatják a dezacilezési reakciót, vagy a kiindulási antibiotikumok és a termékként kapott alapvegyületek stabilitását. Ezért fontos, hogy a szubsztrátokat sterilen adagoljuk. Mivel az autoklávozás során a legtöbb szubsztrát antibiotikum bomlik, előnyösen etilén-oxiddal sterilezzük a készítményeket nyomás alatti rendszerben.4. Purified antibiotics are preferably used as substrates. Subcutaneous antibiotics have antifungal activity but no antibacterial activity. Thus, the substrate, by carrying bacterial cells or spores, can infect the fermentation broth during the deacylation reaction. These infections may affect the deacylation reaction or the stability of the parent antibiotics and parent compounds obtained as a product. Therefore, it is important that the substrates are sterile administered. Since most substrate antibiotics are degraded during autoclaving, the compositions are preferably sterilized with ethylene oxide in a pressurized system.
5. A dezacilezési reakció követése5. Follow-up of the deacylation reaction
A kiindulási anyagoknak gombaellenes aktivitása van, különösen Candida albicans mikroorganizmussal szemben. Ily módon a jelenlévő szubsztrát menynyiségét C. albicans mikroorganizmussal szembeni érték-méréssel határozzuk meg. A keletkező alapvegyület vízben oldódik, biológiailag azonban inaktív. A biológiai aktivitás redukálódása ily módon gyors, és használható eszközt biztosít a dezacilezés vizsgálatára. Mérnünk kell a fermentleveket és a fermentlé alkoholos extraktumait is, mivei a szubsztrátok a tenyészlében csak gyengén oldódnak.The starting materials have antifungal activity, in particular against the microorganism Candida albicans. Thus, the amount of substrate present is determined by measuring against C. albicans. The resulting parent compound is water soluble but biologically inactive. Thus, the reduction in biological activity is rapid and provides a useful means of assaying for deacylation. We also need to measure the fermentation broths and alcoholic extracts of the fermentation broth as the substrates are only slightly soluble in the broth.
Az alapvegyület felhasználásaUse of the parent compound
Az alapvegyületek és savaddíciós sóik felhasználhatók köztes vegyületként szintetikus, gombaellenes vegyületek előállításakor. Ezen alapvegyületekből előállított, használható gombaellenes vegyületeket közöl Abbott és Fukusa (Docket No. X-5396) és a Ciklusos fieptid alapvegyületek származékai című munka Docket No. X-5595 es X-5564).The parent compounds and their acid addition salts can be used as intermediates in the preparation of synthetic antifungal compounds. Useful antifungal compounds prepared from these parent compounds are disclosed in Abbott and Fukusa (Docket No. X-5396) and in Docket No. X-5595 and X-5564, derivatives of Cyclic Feptide Base Compounds.
Az előzőek során használt alkilcsoport kifejezés egyértékű, telített, egyenes-vagy elágazó-szénláncú szénhidrogéncsoportot jelent. Az alkenilcsoport egyértékű, telítetlen, egyenes- vagy elágazó-szénláncú szénhidrogéncsoportot jelent, amely legfeljebb három kettős kötést tartalmaz. A telítetlen szénhidrogén-lánc kettős kötései cisz- vagy transz-konfigurációjúak lehetnek. A 6-24 szénatomos csoport olyan egyenesvagy elágazó-szénláncú szénhidrogéncsoportot jelent, amely 6—24 szénatomot tartalmaz.The term alkyl as used hereinbefore denotes a monovalent, saturated, straight or branched hydrocarbon group. Alkenyl means a monovalent, unsaturated, straight or branched chain hydrocarbon group having up to three double bonds. The double bonds in the unsaturated hydrocarbon chain may be in the cis or trans configuration. C 6 -C 24 is a straight-chain or branched hydrocarbon group having from 6 to 24 carbon atoms.
III általános Képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő alapvegyületet az alapvegyület ornitin-csoportjának α-amino-csoportján acilezzük, a megfelelő acil-oldallánccal. Az acilezéshez használt módszer ismert, az amidkötés kaialakításakor használatos. Az acilezési reakciót általánosságban szólva úgy végezzük, hogy az alapvegyületet a megfelelő acil-oldalláncnak megfelelő sav egy aktivált származékával reagáltatjuk.Compounds of formula III are prepared by acylating the corresponding parent compound on the α-amino group of the ornithine group of the parent compound with the corresponding acyl side chain. The method used for acylation is known and is used to form the amide bond. Generally speaking, the acylation reaction is carried out by reacting the parent compound with an activated derivative of the acid corresponding to the corresponding acyl side chain.
Aktivált származék alatt olyan származékot értünk, amely képes arra, hogy az acilezőszer karboxilcsoportját hozzákapcsolja egy primer aniinocsoporthoz, amikor a keletkező amidcsoport hozzákapcsolja az alapvegyülethez az acile-oldalláncot. Előnyös aktivált származékok és ezek előállítására, illetőleg használatuk módja a szakember számára ismert. Előnyös aktivált származékok a következők:By an activated derivative is meant a derivative which is capable of attaching the carboxyl group of the acylating agent to a primary anino group when the resulting amide group attaches the acyl side chain to the parent compound. Preferred activated derivatives and methods for their preparation and use are known to those skilled in the art. Preferred activated derivatives include:
a) savhalogenid (például (savklorid),(a) an acid halide (for example (acid chloride),
b) savanhidrid (például alkoxi-hangyasav-anhidrid, vagy aríloxi-hangyasav-anhídrid), vagy(b) acid anhydride (for example, alkoxy formic anhydride or aryloxy formic anhydride); or
c) aktivált észter (például 2,4,5-triklór-fenil-észter, N-hidroxi-benztriazol-észter, vagy N-hidroxl-szukcinimid-észter).c) an activated ester (e.g., 2,4,5-trichlorophenyl ester, N-hydroxybenzotriazole ester, or N-hydroxy succinimide ester).
Eljárhatunk oly módon is, hogy a karboxilcsoportot oly módon aktiváljuk, hogy a karbonsavat karbonll-diimiddel, gáládul N,N-dÍciklo-hexil-karbodiimiddel, vagy N,N -diizopropil-karbodiimiddel reagáltatjuk, a keletkező reaktív köztes vegyületet annak instabilitása miatt nem izoláljuk, hanem magában a reakcióelegyben reagáltatjuk a primer aminnal.Alternatively, the carboxylic acid can be activated by reacting the carboxylic acid with carbonyl diimide, such as N, N-dicyclohexylcarbodiimide or N, N-diisopropylcarbodiimide, without isolating the resulting reactive intermediate due to its instability. , but is reacted with the primary amine in the reaction mixture itself.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy ha egy adott aminosav más, acilezhető, funkcionális csoportot is tartalmaz az aminocsoporton kívül, úgy azt az aminosavnak és az alkanoil- vagy alkenoilcsoportnak az aminosavnak és az alkanoil- vagy alkenoilcsoportnak az aminosavhoz való kapcsolását biztosító reagensnek a reakciója előtt védenünk kell. Előnyös védőcsoport lehet bármely olyan csoport, amely használható a peptidek szintézisekor a funkcionális oldalláncok védelmére. Ezek a csoportok jól ismertek, az egyes védőcsoportok és vegyülethez kapcsolásuk móda a szakember számára nem okoz nehézséget (lásd jéldául Protective Groups In Organlc Chemistry, dcOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973).It will be apparent to those skilled in the art that, if a particular amino acid contains an acylable functional group other than the amino group, it is protected before the reaction of the amino acid with the alkanoyl or alkenoyl group coupling agent to the amino acid. need. A preferred protecting group may be any group which may be used to protect functional side chains during peptide synthesis. These groups are well known, and the protecting groups and the manner in which they are attached to the compound are not difficult to those skilled in the art (see, for example, Protective Groups In Organic Chemistry, dcOmie, Editor, Plenum Press, N.Y. 1973).
A III általános képletű vegyületek gátolják a betegséget okozó gombák növekedését. A találmány szerinti vegyületeket Ily módon a környezetünkben lévő felületeken növekvő gombák gátlására használhatjuk (mind antiszeptikumot), vagy kezelhetjük a vegyületekkel a gombák okozta fertőzéseket. A vegyületek gombaellenes aktivitását in vitro agardiffúziós vizsgálatokkal és agar-hígításos méréssel bizonyítjuk, vagy in vivő vizsgálatokkal Candida albicans gombával fertőzött egerekben, A III általános képletű vegyületek ugyancsak aktívak a Trichophyton mentagrophyteS mikroorganizmussal, egy dermatofita szervezette) szemben, továbbá a Saccharomyces pastorianus és á Neurospora ciassa mikroorganizmussal szemben.The compounds of formula III inhibit the growth of fungal pathogens. The compounds of the invention can thus be used to inhibit fungi growing on surfaces in our environment (all antiseptic) or to treat fungal infections with the compounds. The antifungal activity of the compounds is demonstrated by in vitro agar diffusion assays and agar dilution assays, or by in vivo assays in mice infected with Candida albicans fungi. The compounds of the formula III are also active against Trichophyton against the micro-organism.
Bizonyos vegyületek, ahogy azt a későbbiekben ismertetjük, orális adagoláskor egerekben jelentős vérszintet biztosítanak.Certain compounds, as described below, provide significant blood levels in mice upon oral administration.
Ha kutyáknak intravénás injekcióval adagoljuk naponta öt napon át teststílykilogrammra számítva 100 mg-os mennyiségben úgy az a III általános képletű vegyületet, ahol ív p-(n-oktiloxi)-benzoilcsoport, nem mutat toxicitás! jeleket, bár a szérum glutainát-piruvát-transzamlnáz aktivitásának növekedése megfigyelhető.When administered to dogs by intravenous injection at a dose of 100 mg / kg body weight per day for five days, the compound of formula III wherein ar-p- (n-octyloxy) -benzoyl is non-toxic! signals, although an increase in serum glutainate pyruvate transaminase activity is observed.
Szisztémás alkalmazáskor a III általános képletű vegyületek dózisa a használt vegyülettől, a fertőzés súlyosságától és természetétől, és a kezelt személy fizikai állapotától függ, A kezelést alacsony dózisokkal kell kezdeni, a dózisokat később addig emeljük, míg megfelelő gombaellenes hatást érünk el. A vegyületeket alkalmazhatjuk intravénásán vagy intramuszkulárisan, Injekció segítségével, ekkor steril, vizes oldatot vagy szuszpenziőt adagolunk, adott esetben különböző ismert, gyógyszerészeti szempontból elfogadható tartósítószerrel, pufferezőszerreí, oldódást elősegítő anyaggal vagy szuszpendálószerrel együtt. A készítmények tartalmazhatnak más adalékanyagokat is, például sót vagy glükózt, amelyeket az oldatok izotóniássá-alakítása érdekében adagolunk. Az adalékanyagok aránya és minősége a szakember számára ismert.'For systemic use, the dosage of the compounds of Formula III will depend on the compound employed, the severity and nature of the infection, and the physical condition of the subject. Treatment should be initiated at low dosages and subsequently increased until adequate antifungal activity is achieved. The compounds may be administered intravenously or intramuscularly by injection, in which case a sterile aqueous solution or suspension may be added, optionally together with various known pharmaceutically acceptable preservatives, buffering agents, solubilizers or suspending agents. The compositions may also contain other additives, such as salt or glucose, which are added to render the solutions isotonic. The proportions and quality of the additives are known to those skilled in the art. '
Bizonyos ÍII általános képletű vegyületek orális adagolást követően jelentős vérszintet biztosítanak, ahogy azt az 58. példa VIII. táblázatában megadjuk. A vegyületet szisztematikusan orálisan adagolhatjuk. Orálsi adagoláshoz ezeket a vegyületeket gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal, vagy hígítókkal együtt használjuk, kapszulaként, tablettaként vagy por-alakú készítményként. A vivőanyagok vagy hígitóanyagok milyensége és aránya a szakember számára ismert módon változik.Certain compounds of Formula II, after oral administration, provide significant blood levels, as shown in Example 58, Example VIII. table. The compound may be systemically administered orally. For oral administration, these compounds are used in combination with pharmaceutically acceptable carriers or diluents, as capsules, tablets or powder formulations. The nature and ratio of the carriers or diluents will be known to those skilled in the art.
Ha a III általános képletű vegyületeket vaginális Candida-fertőzés kezelésére használjuk, úgy a hatóanyagot gyógyszerészeti szempontból elfogadható, ismert, vaginális használatra alkalmas hígító anyaggal együtt adagoljuk. A vaginális adagoláshoz felhasználható készítmények előállítása a szakember számára ismert.When used to treat vaginal Candida infection, the compound of Formula III is administered in conjunction with a pharmaceutically acceptable diluent known for use in vaginal use. The preparation of compositions for vaginal administration is known to those skilled in the art.
Az alábbi példákban szemléltetjük a találmány szerinti eljárást.The following examples illustrate the process of the invention.
1. példaExample 1
Az Actinoplanes utahensis NRRL 12052 fermentációjaFermentation of Actinoplanes utahensis NRRL 12052
Az Actinoplanes utahensis NRRL 12052 mikroorganizmus tenyészetét előállítjuk és ferde agaron tartjuk fenn. A ferde agar előállításához az alábbi tápta-81Cultures of Actinoplanes utahensis NRRL 12052 were prepared and maintained on inclined agar. For the preparation of inclined agar, the following feed-81 was used
185.021 lajok egyikét használjuk:We use one of 185,021 species:
A táptalaj összetevő Mennyiség csecsemő zabliszt 60,0 g élesztő 2,5 g dikálium-hidrogén-fos.zfát 1,0 gThe medium ingredient Quantity baby oatmeal 60.0 g yeast 2.5 g dipotassium hydrogen phosphate 1.0 g
Czapek ásványi sóoldata* 5,0 ml ugar 25,0 gCzapek's Mineral Saline * 5.0 ml ugar 25.0 g
Ionmentes víz 11-re feltöltvePre-ionized water 11 filled
A táptalaj pH-ját autoklávozás előtt 5,9, ezt nátrium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk be. A pH autoklávozás után 6,7.The pH of the medium before autoclaving was adjusted to 5.9 and adjusted to 7.2 with sodium hydroxide. The pH after autoclaving is 6.7.
x = Czapek ásványi sóoldatának összetevői a következők: x = The components of the mineral salt solution of Czapek are as follows:
összetevő mennyiségingredient quantity
FeSO4.7H3O (2 ml tömény sósavban oldva) 2 g kálium-klorid 100 g magnézlum-szulfát.7 víz 100 g ionmentes víz 11-re feltöltveFeSO 4 .7H 3 O (dissolved in 2 ml concentrated hydrochloric acid) 2 g potassium chloride 100 g magnesium sulfate.7 water 100 g deionized water 11
B táptalaj összetevő burgonyadextrin élesztőkivonat enzlmatikusan hidrolizált kazeinx kuskivonat dextróz kukorícakeményítő húspepton répamelasz magnézlum-szulfát.7 víz kalcium-karbonát Czapek ásványi sóoldata agarMedium B component potato dextrin yeast extract enzymatically hydrolyzed casein x couscous extract dextrose corn starch meat peptone beet molasses magnesium sulfate.7 water calcium carbonate Czapek mineral salt agar
Ionmentes víz x “ N-Z-amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.Deionized water x 'NZ-amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ
A ferde agart beoltjuk az Actionplanes utahensis NRRL 12052 törzzsel, majd 30 °C hőmérsékleten 8-10 napon át inkubáljuk a tenyészetet. A ferde agar tenyészet felével 50 ml, alábbi összetételű vegetatív táptalajt oltunk:Inclined agar was inoculated with Actionplanes utahensis strain NRRL 12052 and incubated at 30 ° C for 8-10 days. Half of the slant agar culture was inoculated with 50 ml of vegetative medium of the following composition:
Mennyiség 5,0 g 0,5 g 3,0 g 0,5 g 12,5 g 5,0 g 5,0 g 2,5 g 0,25 g ’ 1,0 g 2,0 ml 20.0 g 11-re feltöltve összetevő előfőzött zabliszt szacharóz élesztő desztillációs maradékx dikálium-hidrogén-foszfát Czapek ásványi sóoldata Ionmentes víz ' ’ Mennyiség 20,0 g . 20,0 gQuantity 5.0 g 0.5 g 3.0 g 0.5 g 12.5 g 5.0 g 5.0 g 2.5 g 0.25 g '1.0 g 2.0 ml 20.0 g 11- filled ingredient pre-cooked oatmeal sucrose yeast distillation residue x dipotassium hydrogen phosphate mineral salt of Czapek deionized water '' Quantity 20.0 g. 20.0 g
2,5 g 5,0 g 1,0 g2.5 g 5.0 g 1.0 g
5,0 ml 11-re feltöltve.Make up to 5.0 ml with 11.
A táptalaj pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,4-re állítjuk be, a táptalaj pH-ja autoklávozás után 6,8. x = National Distillers Products Co., 99 Park Ave.,The pH of the medium was adjusted to 7.4 with sodium hydroxide, and the pH of the medium after autoclaving was 6.8. x = National Distillers Products Co., 99 Park Ave.,
New York, N.Y.New York, N.Y.
A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml térfogatú, szélesszájú Erlenmeyer-lornbikban inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 72 órán át olyan körkörösen kitérő rázógépen, amely percenként 250-et forog, és amely körülbelül 5 cm-es átmérőjű kör mentén mozog.The inoculated vegetative medium is incubated in a 250 mL wide-mouth Erlenmeyer lornbik at 30 ° C for 72 hours on a rotary shaker rotating at 250 rpm and circling about 5 cm in diameter.
Ezt a vegetatív tenyészetet közvetlenül felhasználhatjuk egy második vegetatív táptalaj oltására. Egy másik kivitelezési változat szerint, és előnyösen úgy járunk el, hogy ezt későbbi felhasználásra folyékony nitrogén gőzfázisában tároljuk. A tenyészetet ilyenfajta tárolásra kis ampullákba osztjuk szét, az alábbiak szerint: mindegyik ampullába 2 ml kinőtt vegeta50 tív tenyészetét és 2 ml glicerin-laktóz-oldatot teszünk (lásd Hailey és Higgens, Preservation and Storage of Microorganism in the Gas Phase of Liquid Nitrogén, Cryobiol 10, 364-367., 1973), Az elkészített szuszpenziókat a folyékony nitrogén feletti gőzfázisban tároljuk.This vegetative culture can be used directly to inoculate a second vegetative medium. In another embodiment, and preferably, it is stored for later use in the vapor phase of liquid nitrogen. The culture is subdivided into small vials for this storage as follows: each vial contains 2 ml of an overgrown culture of vegeta50 and 2 ml of glycerol-lactose solution (see Hailey and Higgens, Preservation and Storage of Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobi). 10, 364-367 (1973). The prepared suspensions are stored in the vapor phase above liquid nitrogen.
ml ily módon tárolt szuszpenzióval 50 ml első fázisú vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele azonos az előzőekben megadott táptalaj-összetétellel. A beoltott vegetatív táptalajt a fentiek szerint tenyésztjük.ml of the suspension thus stored was inoculated with 50 ml of the first phase vegetative medium having the same composition as above. The inoculated vegetative medium is cultured as above.
Nagyobb térfogató inokulum előállítására 10 ml kinőtt első fokozatú vegetatív táptalajjal 400 ml második vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele azonos az első vegetatív táptalaj összetételével. Ezt a második inokulumot két liter térfogatú, szélesszájú Erlenmeyer-lornbikban tenyésztjük 30 °C hőmérsékleten 48 órán át olyan körkörös kitérésű rázógépen, amely percenként 250-et tér ki, kb. 5 cm átmérőjű kör mentén.To produce a larger volume of inoculum, 10 ml of overgrown first-stage vegetative medium was inoculated with 400 ml of second vegetative medium having the same composition as the first vegetative medium. This second inoculum was cultured in a two-liter, wide-mouth Erlenmeyer lornbik at 30 ° C for 48 hours on a rotary shaker rotating at 250 rpm at ca. 5 cm in diameter.
A fentiek szerint előállított, kinőtt, második vegetatív tenyészet 80Ö ml-ével 1001 steril, termelő táptalajt oltunk. A termelő táptalajt az alábbiak közül választjuk ki:80 µl of the second vegetative culture grown as above was inoculated with 1001 sterile production medium. The production medium is selected from the following:
I. táptalaj összetevő Mennyiség (g/1) mogyoróliszt 10,0 g oldnató húspepton 5,0 szacharóz 20,0 kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 dikálium-hidrogén-foszfát 1,2 magnézium-szulfát. 7 víz. 0,25 csapvíz 1 1-re feltöltveMedium I Component Quantity (g / l) Peanut Flour 10.0 g Meat Meat Peptone 5.0 Sucrose 20.0 Potassium Dihydrogen Phosphate 0.5 Dipotassium Hydrogen Phosphate 1.2 Magnesium Sulfate. 7 water. 0.25 tap water to 1 liter
Αθ táptalaj pH-ja sterilezés után 6, 9, a gterilezést 121 °C hőmérsékleten 45 percen át végezzük,PH of the utánθ medium after sterilization is 6, 9, and the gylation is carried out at 121 ° C for 45 minutes,
II. táptalajII. broth
Mennyiséa (g/1) 30,000 5,000 . 1,000 0,500 0,002 11-re feltöltve összetevő szacharóz pepton dikálium-hidrogén-foszfát kálium-klorid magnézium-szulfát. 7 víz ionmentes vízQuantity (g / l) 30,000 5,000. 1,000 0.500 0.002 11 filled ingredient sucrose peptone dipotassium hydrogen phosphate potassium chloride magnesium sulfate. 7 water deionized water
A táptalaj pH-ját hidrogén-kloriddal 7,0-ra állítjuk be, a táptalaj pH-ja sterilezés után 7,0.The pH of the medium was adjusted to 7.0 with hydrochloric acid, and the pH of the medium after sterilization was 7.0.
III. táptalaj összetevő glükóz ammónium-klorid nátrium-szulfát cink-klorid magnézium-klorid. 6 víz vas-triklorid. 6 víz mangán-diklorid. 4 víz réz-klorld. 2 víz kalcium-karbonát kálíum-dihidrogén-foszfátx csapvíz ....III. medium ingredient glucose ammonium chloride sodium sulfate zinc chloride magnesium chloride. 6 water iron trichloride. 6 water manganese dichloride. 4 Water Copper Chloride. 2 water calcium carbonate potassium dihydrogen phosphate x tap water.
x = Külön sterilezzük, és sterilen adagoljuk. x = Sterilize separately and dispense sterile.
A táptalaj sterilezés utáni pH-ja 6,6.The pH of the medium after sterilization is 6.6.
A beoltott termelő táptalajjal 165 liter össztérfogatú fermentorban fermentálunk 30 °C hőmérsékleten 42 órán át. A fermentációs táptalajt ismert keverővei keveijük, a keverő percenként 200-at fordul. A táptalajon annyi steril levegőt buborékoltatunk át, hogy az oldott oxigén koncentrációja az atmoszfériMennyiség (g/1) 20,000 3,000 2,000 0,019 0,304 0,062 0,035 0,005 6,000 0,670 11-re feltöltve dikálium-hidrogén-foszfát 2 g csapvíz 1000 ml (az eredeti pH 6,1).The inoculated production medium is fermented in a 165 L total volume fermentor at 30 ° C for 42 hours. The fermentation broth is mixed with a known mixer, the mixer turning at 200 rpm. Sterile air is bubbled through the medium so that the concentration of dissolved oxygen is at atmospheric Quantity (g / l) 20,000 3,000 2,000 0.019 0.304 0.062 0.035 0.005 6.000 0.670 11 Filled with dipotassium hydrogen phosphate 2 g tap water 1000 ml (original pH 6, 1).
* = N-Z-Case,* = N-Z-Case,
3. példaExample 3
Az A-42355 antibiotikum komplex elkülönítéseIsolation of the A-42355 antibiotic complex
4127 1, a 2. példában megadottak szerint a V. jelű termelő táptalajjal előállított teljes fermentlevet 4280 1 metanollal egy órán át alaposan keverjük,,majd szűrÍük Hyflo Super-cel (diatomaföld, Johns-Manville ’roducts Corp.), szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szűrlet pH-ját 5 n hidrogén-kloriddal 4,O-ra állítjuk be. A savas szűrletet két alkalommal azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. Egyesítjük a kloroformos extraktumokat és csökkentett nyomáson desztillálva 201-re töményítjük. A sűrítményhez 200 1 dietilétert adunk az A-42355 komplex kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, amikor szürkésfehér színű por-alakú anyagként 2775 g A-42355 komplexet kapunk.4127 1 of the whole fermentation broth prepared in Example 2 production medium V was thoroughly stirred with 4280 L of methanol for one hour and then filtered with Hyflo Super (diatomaceous earth, Johns-Manville 'roducts Corp.) in the presence of a filter aid. . The filtrate was adjusted to pH 4.0 with 5N hydrochloric acid. The acidic filtrate was extracted twice with an equal volume of chloroform. Combine the chloroform extracts and concentrate to 201 under reduced pressure. To the concentrate was added 200 L of diethyl ether to precipitate the A-42355 complex. The precipitate was collected by filtration to give 2775 g of A-42355 as an off-white powder.
4. példaExample 4
Az A-30912 A komponens izolálása A 3. példában megadottak szerint előállított A-42355 antibiotikum komplex 1 g-ját metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 7 ml-ében oldjuk. Az oldatot szűrjük és 3,7 cm belső átmérőjű 35 cm hosszúságú LP-l/Cjg szilikagéllel (reverz fázisú, 10-20 μ méretű szemcse) töltött üvegoszlop (Michel-Miller High Performance Low Pressure kromatográfiás oszlop, Ace Glass Invorporated, Vineland, NJ 08360) tetejére öntjük a szűrletet. A kromatografáló oszlopot a 10. példában megadottak szerint állítjuk elő, az oldatot szeleprendszer segítségével juttatjuk az oszlop tetejére. Az oszlopot metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének felhasználásával szuszpenzió-töltő módszerrel készítjük el, ahogy azt a 11. példában ismertetjük. Az oldószert F.M.I. szelepmentes pumpával (maximális sebesség 19,5 ml/perc) mozgatjuk, az oszlopon át, az áramlás sebessége körülbelül 9 ml/perc, az alkalmazott nyomás 0,45 atm. Minden percben elkülönítünk egy frakciót. Az antibiotikum eluálódását 280 nm-en működő UV-monitorral követjük (1SCO Model UA-5, Instrument Speciálist Co., 4700 Superioir Ave., Lincoln, Nebraska, 68504), optikai egységként ISCO Type 6-ot használunk.Isolation of Component A-30912 A 1 g of the antibiotic A-42355 complex prepared as in Example 3 was dissolved in 7 ml of a 7: 2: 1 mixture of methanol, water and acetonitrile. The solution was filtered and a glass column packed with 3.7 cm internal diameter 35 cm long LP-1 / Cjg silica gel (reverse phase, 10-20 μm particle size), Michel-Miller High Performance Low Pressure Chromatography column, Ace Glass Invorporated, Vineland, NJ. 08360) is poured onto the filtrate. The chromatographic column was prepared as described in Example 10 and the solution was applied to the top of the column using a valve system. The column was prepared using a slurry filling method using methanol: water: acetonitrile (7: 2: 1) as described in Example 11. The solvent was F.M.I. with a valveless pump (maximum flow rate 19.5 ml / min), through the column, flow rate about 9 ml / min, pressure applied 0.45 atm. A fraction is separated every minute. Elution of the antibiotic was monitored with a UV monitor operating at 280 nm (1SCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superioir Ave., Lincoln, Nebraska, 68504) using ISCO Type 6 as an optical unit.
A 112-140. frakciót egyesítjük és 20 ml vízhez adjuk. Az oldatot kétszer azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk, a kloroformos extraktumokat egyesítjük cs csökkentett nyomáson olajos desztillációs maradékig desztilláljuk. Ezt az olajat tercier-butanolban oldjuk, az oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután 524 mg A-42355 A komponenst (A-30912 A komponens, A-22082) kapunk.112-140. fraction was combined and added to 20 ml of water. The solution was extracted twice with an equal volume of chloroform, and the chloroform extracts were combined and concentrated under reduced pressure to an oily distillation residue. This oil was dissolved in tert-butanol and freeze dried to give 524 mg of component A-42355 A (component A-30912 A, A-22082).
5. példaExample 5
Az A-30912 B komponens izolálásaIsolation of Component A-30912 B
A 3. példában megadottak szerint A-42355 komplexet izolálunk, azzal a különbséggel, hogy a 285 1 térfogatú tömény kloroformos extrakturnot szilikagélből (150 1 Grace szilikagél, grade 62) készült oszlopon kromatografáljuk 2 liter/perces eluálási sebességgel. Az oszlopot 200 1 kloroformmal mossuk, az eluálást 500 1 acetonitrillel kezdjük, majd acetonitril é: víz 98:2 arányú elegyével folytatjuk 1 liter/perc sebességgel. Körülbelül 200 1 térfogatú frakciókat szedünk, és egyenként analizáljuk őket a biológiai aktivitás szempontjából. A biológiai érték-mérést agarlemezeken papírkorong módszerrel végezzük Candida albicans mikroorganizmus segítségével. A 77-103. frakciókat (1365 1) egyesítjük és csökkentett nyomáson töményítjük. A 4,5 1 térfogatú sűrítmény csapadékot tartalmaz, ezt szűréssel elkülönítjük, amiután 119 g B komponensben gazdag A-42355 komplexet kapunk. A szűrletet szárazra desztilláljuk, a desztillációs maradékot megfelelő mennyiségű metanolban oldjuk. A metanolos oldatot 10-szeres mennyiségű dietil-éterhez adjuk a B komponenst tartalmazó antibiotikum komplex kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, amiután további 24 g B komponensben gazdag szürke színű, por-alakú termékként A-42355 komplexet kapunk.The A-42355 complex was isolated as described in Example 3, except that the 285 L concentrated chloroform extract was chromatographed on a column of silica gel (150 L Grace silica gel, grade 62) at an elution rate of 2 L / min. The column was washed with 200 L of chloroform, eluting with 500 L of acetonitrile and continuing with acetonitrile / water 98: 2 at 1 L / min. Fractions of about 200 L were collected and analyzed individually for biological activity. Bioassay on agar plates was performed using the paper disk method using Candida albicans. 77-103. Fractions (1365 L) were combined and concentrated under reduced pressure. The 4.5 L concentrate contains a precipitate which is collected by filtration to give 119 g of Component B rich A-42355. The filtrate was distilled to dryness and the residue was dissolved in a sufficient amount of methanol. The methanolic solution is added to 10 times diethyl ether to precipitate the antibiotic complex containing component B. The precipitate was collected by filtration and dried to give A-42355 complex as an additional 24 g of Compound B as a gray powder.
Az így kapott, B komponensben gazdag A-42355 komplex 1,0 g-ját metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 8 ml-ében oldjuk. Az oldatot szűrjük és szeleprendszer segítségével 3,7 cm átmérőjű, és 33 cm magas Michel-Miller oszlopba töltött szilikagél tetejére juttatjuk. Az oszlopot a 10. példában megadottak szerint metanol, víz és acetonitril 7:29:1 arányú elegy ével készült 10—20 μ átmérőjű szemcsékből álló reverz fázisú LP-1/C18 szilikagélből készítjük. A szuszpenzió feltöltését a 11. példában megadottak szerint végezzük. Az oldószert 0,45 atm nyomás mellett percenként 10 ml-es sebességgel áramoltatjuk F.M.I. pumpa segítségével. Minden percben egy frakciót szedünk. Az antibiotikum eluálódását a 15. példában megadottak szerint 280 nm-en regisztráló UV-monitorral követjük. A 102—110. frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson olajos-desztillációs maradékig desztilláljuk. Kevés tercier-butanolban oldjuk az olajat, majd az oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután 22 mg A-30912 B komponenst kapunk.1.0 g of the resulting Component B-rich A-42355 complex is dissolved in 8 ml of a 7: 2: 1 mixture of methanol, water and acetonitrile. The solution was filtered and applied through a valve system to a top of a 3.7 cm diameter and 33 cm high Michel-Miller column filled with silica gel. The column was methanol: water: acetonitrile 7 as described in Example 10 is prepared consisting of 10-20 μ diameter particles made by reverse phase 1 mixture of LP-1 / C18 silica gel: 29th The suspension was charged as described in Example 11. The solvent was flushed at a rate of 0.45 atm at a flow rate of 10 mL / min using an FMI pump. One fraction is collected every minute. The elution of the antibiotic was monitored using a UV monitor at 280 nm as in Example 15. 102-110. fractions were combined and distilled under reduced pressure to an oil-distillation residue. Dissolve the oil in a small amount of tert-butanol and freeze-dry to give 22 mg of Compound A-30912.
6. példaExample 6
Az A-30912 D komponens izolálása db 3800 1-es és 4007 1-es fermentációból származó, tömény kloroformos extrakturnot állítunk elő a 3. példában megadottak szerint, a sűrítményeket egyesítjük és szilikagélből készült kromatografáló oszlopon kromatografáljuk (Grace, grade 62). Kloroformmal mossuk azoszlopot,majd acetonitrillel és acetonotril és víz 98:2 arányú elegyével eluáljuk. Körülbelül 200 1 térfogatú frakciókat gyűjtünk és agarlemezen papírkorong módszerrel Candida albicans mikroorganizmussal vizsgáljuk a biológiai aktivitásukat. Az aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük, majd 850 1 térfogatú oldatot csökkentett nyomáson desztilláljuk. A 0,7 1 térfogatú sűrítményt 10-szeres térfogatú dietil-éterhez adjuk, a D komponensben gazdag A-42355 komplex kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, szárítjuk, amiután 32 g D komponensben gazdag, szürke por-alakú anyagként A42355 komplexet kapunk.Isolation of Component A-30912 D was prepared using concentrated chloroform extracts from 3800 L and 4007 L fermentations as in Example 3, and the concentrates were combined and chromatographed on a silica gel chromatography column (Grace, grade 62). Wash the column with chloroform and elute with acetonitrile and 98: 2 acetonitrile / water. Fractions of about 200 L were collected and assayed for biological activity using Candida albicans micro paper on an agar plate. The fractions containing the activity were combined and the 850 L solution was distilled under reduced pressure. The 0.7 L concentrate was added to 10 times the volume of diethyl ether to precipitate the component D rich A-42355 complex. The precipitate was collected by filtration and dried to give 32 g of Compound D as a gray powder A42355.
Az így előállított D komponensben gazdag A42355 komplex 1,0 g-ját metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 5 ml-ében oldjuk. Az oldatot szűrjük és szeleprendszer segítségével 3,7 cm belső átmérőjű, és 30 cm hosszú Michel-Miller oszlopban lévő szilikagél tetejére juttatjuk, szele prehdszer segítségével. Az oszlopot a 10. példában megadott módon előállított 10-20 μ szemcseméretű reverz fázisú LP-1/Cj8 szilikagéllel készítjük. A töltést all. példában megadott módon, szuszpenzió-töltő módszerrel végezzük metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének segítségével. Az oldószert 8 ml/perces sebes111.0 g of the Compound D rich A42355 complex thus prepared is dissolved in 5 ml of a 7: 2: 1 mixture of methanol, water and acetonitrile. The solution was filtered and applied through a valve system to a top of silica gel having an internal diameter of 3.7 cm and a length of 30 cm in a Michel-Miller column with a wind chill. 10-20 μ particle size reversed phase LP-1 / C The column was prepared as described in Example 10 from 8 made of silica. Charging all. The suspension was carried out as described in Example 1, using a slurry filling method using methanol: water: acetonitrile (7: 2: 1). The solvent was injected at a rate of 8 ml / min11
-101 séggel mozgatjuk az oszlopon tá 0,2 atm nyomáson, F.M.I. pumpa segítségével. Minden második percben elkülönítünk egy frakciót. Az antibiotikum eluálódását 280 nm-en működő UV-monitorral követjük (1SC0 Model UA-5) ISCO Type 6 optikai egységgel. A 96-108. frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson olajos-desztillációs maradékig desztilláljuk. Az olajat kevés tercier-butanolban oldjuk, az oldatot fagyasztva szárítjuk, ezután 89 mg A-30912 D komponenst kapunk.Move the column at -101 at 0.2 atm, F.M.I. pump. A fraction was separated every second minute. Elution of the antibiotic is monitored with a UV monitor operating at 280 nm (1SC0 Model UA-5) with an ISCO Type 6 optical unit. 96-108. fractions were combined and distilled under reduced pressure to an oil-distillation residue. The oil was dissolved in a small amount of tert-butanol and freeze-dried to give 89 mg of Compound A-30912.
7. példaExample 7
Az A-30912 H komponens izolálásaIsolation of component A-30912 H
A 2. és 3. példában megadottak szerint előállított A-42355 antibiotikum komplex 5,0 g-ját 35 ml alábbi elegyben oldjuk: metanol:víz:acetonitril 7:2:1 arányú elegye. Az oldatot szűrjük és 3,7 cm belső átmérőjű, és 42 cm magas Michel-Miller kromatografáló oszlop tetejére töltjük, oszloprendszer segítségével. Az oszlopot metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyével a 10. példában megadott módon készült LP-1/Ci8 reverz fázisú, 10—20 μ szemcseméretű szilikagéllel töltjük, a 11. példában megadottak szerint eljárva. Az oluószert 0,5 atm nyomáson 13 ml/perc sebességgel áramoltatjuk F.M.I. szelepmentes pumpa segítségével. Két percenként különítünk el egy frakciót. Az antibiotikum eluálódását 280 nm-en működő UV-fotométerrel követjük, ahogy azt a 19. példa5.0 g of the A-42355 antibiotic complex prepared as described in Examples 2 and 3 are dissolved in 35 ml of a 7: 2: 1 mixture of methanol: water: acetonitrile. The solution was filtered and loaded onto the top of a Michel-Miller chromatographic column, 3.7 cm internal diameter and 42 cm high, using a column system. The column was methanol: water: acetonitrile, 7: 2: 1 mixture of filling is made as described in Example 10, a LP-1 / Cl 8 reverse phase, particle size 10-20 μ silica gel by the procedure described in Example 11. The solvent was flushed at 0.5 atm at 13 mL / min using an FMI valveless pump. A fraction is separated every two minutes. Elution of the antibiotic was monitored by a 280 nm UV photometer as in Example 19
C. pontjában megadjuk. A 112-132. frakciókat öszszegyűjtjük, és összeöntjük egy második, hasonló módon levégzett tisztítás 106—117. frakciójával. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson olajos-desztillációs maradékig pároljuk. Az olajos anyagot kevés tercier-butanolban oldjuk, és fagyasztva szárítjuk, amiután 173 mg A-30912 H komponenst kapunk.C. 112-132. fractions were collected and pooled for a second purification in a similar fashion. fraction thereof. The combined fractions were evaporated under reduced pressure to an oil-distillation residue. The oily substance was dissolved in a small amount of tert-butanol and freeze-dried to give 173 mg of component A-30912H.
150 mg nyers A-30912 H komponenst metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 8 ml-ében oldunk, a kapott oldatot szűrjük, és a fentiek szerint eljárva 2,0 cm belső átmérőjű, és 32 cm magas üvegoszlopon lévő szilikagél tetejére töltjük. Az oldószert 0,3 atm nyomáson 8 ml/perc sebességgel áramoltatjuk, 3 percenként különítve el egy-egy frakciót. Az antibiotikum eluálódását 280 nm-en figyeljük. Egyesítjük a 17. és 18. frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk, amiután olajos desztillációs maradékot kapunk. Ezt az anyagot kevés tercier-butanolban oldjuk, és fagyasztva szárítjuk, amiután 29 mg A-30912 H komponenst kapunk.Dissolve 150 mg of crude Compound A-30912 H in 8 ml of a 7: 2: 1 mixture of methanol, water and acetonitrile, filter, and proceed as above on a silica column of 2.0 cm internal diameter and 32 cm high on a glass column. top it. The solvent was flushed at 0.3 atm at 8 mL / min, separating each fraction every 3 minutes. The elution of the antibiotic is monitored at 280 nm. Fractions 17 and 18 were combined and distilled under reduced pressure to give an oily residue. This material was dissolved in a little tert-butanol and freeze dried to give 29 mg of Compound A-30912H.
8. példaExample 8
Az S 31794/F-l antibiotikum előállításaPreparation of antibiotic S 31794 / F-1
Az S 31794/F-l antibiotikumot az Acrophialophora limonispora NRRL 8095 mikroorganizmus süllyesztett, keverés, rázatás és/vagy levegőztetés közbeni tenyésztésével állítjuk elő 3 és 8, előnyösen 5 és 7 közötti pH-η, 15 °C és 30 °C, előnyösen 18—27 °C közötti hőmérsékleten. A tenyésztést 48 óra és 360 óra, előnyösen 120 óra és 288 óra közötti időn át végezzük.The antibiotic S 31794 / F1 is prepared by submerged culturing of the Acrophialophora limonispora NRRL 8095 under agitation, agitation and / or aeration at pH 3 to 8, preferably 5 to 7, 15 to 30, preferably 18 to 27. ° C. The culturing is carried out for 48 hours to 360 hours, preferably 120 hours to 288 hours.
Az S 31794/F-l antibiotikum izolálására 90 1 tenyészlevet etil-acetát és izopropanol 4:1 arányú elegyének 90 l-ével kezelünk és 30 percen át szobahőmérsékleten homogenizálunk. Elkülönítjük a szerves fázist, és csökkentett nyomáson, 40 °C hőmérsékleten desztilláljuk. A desztillációs maradékot 10-szeres mennyiségű szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást metanol és kloroform 5:95 ésTo isolate antibiotic S 31794 / F-1, 90 L of culture broth was treated with 90 L of ethyl acetate: isopropanol (4: 1) and homogenized for 30 minutes at room temperature. The organic phase was separated and distilled under reduced pressure at 40 ° C. The distillation residue was chromatographed on a column of silica gel (10x) eluting with methanol: chloroform 5:95;
40:60 közötti arányú elegyével végezzük. A gombaellenes aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük és 100-szoros mennyiségű Sephadex LH-20 gyantán kromatografáljuk, az eluálást metanollal végezve. Az oszlopról lejövő, gombaellenes aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük és 100-szoros mennyiségű, 0,05-0,2 mm szemcseméretű szilikagélből készült oszlopon, az eluálást kloroform, metanol és víz 71:25:4 arányú elegyével végezve újra-kromatografáljuk. Az eluálódó frakciók közül azokat, amelyek gombaellenes hatással rendelkeznek, összegyűjtjük, és csökkentett nyomáson desztilláljuk, miután desztillációs maradékként nyers S 31794/F-l antibiotikumot kapunk. Ezt a terméket kevés metanolban oldjuk, és dietil-éterrel kicsapjuk, amiután fehér színű, amorf, por-alakú anyagként 178-180 °C közötti hőmérsékleten bomlás közben olvadó S 31794/F-2 antibiotikumot kapunk. Ezt 25 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, csökkentett nyomású térben szárítjuk. A terméket 10-szeres mennyiségű etil-acetát, metanol és víz 80:12:8 arányú eíegyéből kikristályosítjuk, amiután csökkentett nyomású térben 20 °C hőmérsékleten szárítjuk a kristályokat, így 181 —183 °C hőmérsékleten bomlás közben olvadó, kristályos S 31794/F-l antibiotikumot kapunk.40:60. Fractions with antifungal activity were collected and chromatographed on 100x Sephadex LH-20 resin, eluting with methanol. Fractions from the column having antifungal activity were collected and re-chromatographed on 100 column silica gel (0.05-0.2 mm) eluting with chloroform: methanol: water (71: 25: 4). Among the eluting fractions, those having antifungal activity were collected and distilled under reduced pressure to give the crude antibiotic S 31794 / F-1 as a distillation residue. This product was dissolved in a small amount of methanol and precipitated with diethyl ether to give antibiotic S 31794 / F-2 as a white amorphous powder, m.p. 178-180 ° C. It is dried at 25 ° C to 30 ° C under reduced pressure. The product was crystallized from 10 times ethyl acetate: methanol: water (80: 12: 8) and then dried under reduced pressure at 20 ° C to give crystalline S 31794 / Fl, melting at 181-183 ° C. antibiotic.
9. példaExample 9
Az S 31794/F-l antibiotikum izolálásaIsolation of antibiotic S 31794 / F-1
A 8. példában megadott módon előállított, nyers S 31794/F-l antibiotikumot Sphadex gyantával végzett kromatográfia után szeleprendszer segítségével Michel-Miller oszlopban lévő szilikagélre juttatjuk. Az oszlopot a 10. példában megadottak szerint előállított LP-l/Cjg reverz fázisú, 10-20 μ szemcseméretű szilikagélből készítjük, a szuszpendálást kloroform, metanol és víz 71+25:4 arányú elegyében végezzük. All. példában megadottak szerint végezzük az oszlop feltöltését. Az oldószert az oszlopon F.M.I. szelepmentes pumpával áramoltatjuk. Az antibiotikum eluálódását 280 nm-en működő UV-monitorral követjük. A gombaellenes aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor desztillációs maradékként megkapjuk az S 31794/F-l antibiotikumot.The crude antibiotic S 31794 / F-1, prepared as described in Example 8, is chromatographed on a Michel-Miller column using a valve system after chromatography on Sphadex resin. The column was prepared from LP-1 / Cjg reverse phase silica gel 10-20 μg, prepared as in Example 10, and suspended in chloroform / methanol / water (71 + 25: 4). All. The column was filled in as described in Example 1-1. The solvent on the column was F.M.I. with a valveless pump. Elution of the antibiotic is monitored with a UV monitor operating at 280 nm. Fractions with antifungal activity were pooled and distilled under reduced pressure to yield antibiotic S 31794 / F-1 as the distillation residue.
10. példaExample 10
A szilikagél/Cj s reverz fázisú gyanta előállításaPreparation of the silica gel / C and reverse phase resin
1. lépés: hidrolízisStep 1: Hydrolysis
LP-1 szilikagélt (1000 g, Quantum Corp., most Whatman) adunk 1650 ml tömény kénsav és 1650 ml tömény salétromsav elegyéhez, amit 5 literes kerekaljú, gömblombikba töltünk, és megfelelő szuszpenzió előállításához rázunk, 16 órán át gőzfürdőben melegítjük a szuszpenziót, a lombikhoz vízhűtővel ellátott kondenzálócsövet kapcsolunk.LP-1 silica gel (1000 g, Quantum Corp., now Whatman) was added to a mixture of 1650 mL of concentrated sulfuric acid and 1650 mL of concentrated nitric acid, placed in a 5 L round bottomed flask and shaken for 16 hours to obtain a suitable suspension. a condenser tube with a water cooler is connected to the flask.
Jégfürdőben lehűtjük az elegyet, és óvatosan szűrjük üvegszűrőn át. Ionmentes vízzel addig mossuk a szilikagélt, míg pH-ja semleges lesz. Ezután 4 liter acetonnal mossuk és csökkentett nyomású térben, 100 °C hőmérsékleten 2 napon át szárítjuk.Cool the mixture in an ice bath and carefully filter through a glass filter. Wash the silica gel with deionized water until the pH is neutral. It is then washed with 4 L of acetone and dried in a vacuum at 100 ° C for 2 days.
2. lépés: az első szililezésStep 2: First silylation
Az első lépésben kapott száraz szilikagélt gömblombikba töltjük és 3,5 1 toluolban szuszpendáljuk. 2 órán át gőzfürdőben melegítjük a szuszpenziót, a visszamaradt víz azeotrop desztíllációjára. 321 ml oktadexil-triklór-szilánt (aldirch Chemival Company) adunk hozzá, majd 16 órán át enyhe kevergetés mellett 60 °C hőmérsékleten visszacsepegő hűtő alatt reagál12The dry silica gel obtained in the first step was filled into a round-bottomed flask and suspended in 3.5 L of toluene. The suspension is heated in a steam bath for 2 hours for azeotropic distillation of the remaining water. 321 ml of octadexyl trichlorosilane (aldirch Chemival Company) was added and the reaction was stirred at 60 ° C under gentle stirring for 16 hours12
-111 tatjuk. Ügyeljünk arra, hogy a keverő ne élje el a gömblomik alját. Ez megakadályozza a szilikagél részecskék összeállítását.-111 here. Make sure that the mixer does not touch the bottom of the ball joints. This prevents the assembly of silica gel particles.
Hűlni hagyjuk a szuszepnziót. Ezután összegyűjtjük a szililezett szilikagélt, 3 1 toluollal, majd 3 1 acetonnal mossuk, és 16—20 órán át levegőn szárítjuk. 3,5 1 acetonitril és víz 1:1 arányú elegyében szuszpendáliuk a száraz szilikagélt, szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, szűrjük, 3 1 acetonnal mossuk, majd levegőn egy éjszakán át szárítjuk.Allow the suspension to cool. The silylated silica gel is then collected, washed with 3 L of toluene, then with 3 L of acetone and air-dried for 16 to 20 hours. The dry silica gel was suspended in 3.5 L acetonitrile / water (1: 1), stirred at room temperature for 2 hours, filtered, washed with 3 L acetone and air-dried overnight.
3. lépés: a második szililezésStep 3: Second silylation
Az első szililezés ismertetésekor megadott eljárást ismételjük meg 200 ml oxadecil-triklór-szilánnal. A szuszpenziót 2 órán át 60 °C hőmérsékleten visszacsepegő hűtő alatt melegítjük, miközben óvatosan keverjük. A végterméket szűréssel elkülönítjük, 3 1 toluollal, majd 6 1 metanollal mossuk, 50 °C hőmérsékleten 16—20 órán át csökkentett nyomsú térben szárítjuk.Repeat the procedure described for the first silylation with 200 ml of oxadecyl trichlorosilane. The suspension was heated at 60 ° C under reflux for 2 hours while stirring gently. The final product was collected by filtration, washed with 3 L of toluene, then 6 L of methanol, and dried at 50 ° C for 16 to 20 hours under reduced pressure.
11. példaExample 11
A Meichel-Miller oszlopok szuszpenzióval való megtöltéseSuspension of Meichel-Miller columns
Általános információkGeneral Information
A. Az analitikai vagy preparatív oszlopokat tölthetjük meg az alábbi eljárással.A. Analytical or preparative columns may be filled using the following procedure.
B. Szilikagélt vagy szilikagél reverz fázisú töltőanyagot használunk (például Quantum LP-1,10-20 μ részecskenagyság, LiChroprep RP-8 és RP-18, részecskengyaság 25-40 μ).B. Use silica gel or silica gel reversed phase filler (e.g. Quantum LP-1.10-20 μ particle size, LiChroprep RP-8 and RP-18, particle size 25-40 μ).
Használhatunk azonban más szilikagéleket is, például Shandons ODS Hypersil, részecskenagyság 5 μ, de másokat is. 'However, other silica gels, such as Shandons ODS Hypersil, particle size 5 μ, may be used, but also others. '
C. A szuszpenzióval való feltöltést általában 0,8 atmoszféránál kisebb nyomáson, és 5 ml és 40 ml/ perc közötti folyadékáramlás mellett végezzük, az áramlási sebesség az oszlop nagyságától függ. A feltöltés közben alkalmazott nyomásnak meg kell haladnia a tényleges elkülönítés alatt alkalmazott nyomást, a többletnyomás 0,1-0,2 atm kell, hogy legyen. A többletnyomással elérjük, hogy a kromatográfia alatt az adszorbens nem tömörödík tovább.C. The suspension is generally filled at a pressure of less than 0.8 atmospheres and with a flow rate of between 5 ml and 40 ml / min, the flow rate depending on the size of the column. The pressure applied during filling should be greater than the pressure used during actual separation, with an excess pressure of 0.1-0.2 atm. The additional pressure ensures that the adsorbent is no longer a bulk charge during chromatography.
D. A nyomásban létrejövő gyors csökkenés töréseket vagy csatornákat alakíthat ki a töltőanyagban, ez nagymértékben csökkenti az oszlop hatékonyságát. Ezért fontos, hogy a nyomást lassan csökkentsük 0ra, még akkor is, ha a pumpát kikapcsoljuk.D. Rapid drop in pressure can create fractures or channels in the filler, greatly reducing the efficiency of the column. Therefore, it is important that the pressure is slowly reduced to 0, even if the pump is turned off.
E. A megfelelő nagyságú oszlopok a következők: (Ace Glass Cat. No., nem töltött), No. 5795-04, 12 ml. No. 5795-10, 110 ml, No. 5796-16, 300 ml, No. 5795-24,635 ml, és nO. 5796-34,34 ml.E. Columns of suitable size are as follows (Ace Glass Cat. No., Unfilled), No. 5795-04, 12 ml. No. 5795-10, 110 ml, No. 5796-16, 300 ml, No. 5795-24,635 ml, and nO. 5796-34.34 ml.
D. Az üvegoszlop megöltéséhez szükséges idő percektől több óráig terjedhet attól függően, hogy milyen nagyságú oszloppal dolgozunk és, hogy a kutatónak milyen gyakorlata van.D. The time it takes to kill a glass column can vary from minutes to several hours, depending on the size of the column and how the researcher is practicing.
Az alábbi lépésekből áll az oszlop feltöltése:Here's how to upload a column:
1. Az üvegoszlopot egy rezervoár oszlophoz kapcsoljuk, az utóbbi oszloptérfogata kétszerese az előzőnek. Mindkét oszlopot függőleges állásba állítjuk, a rezervoár oszlopot felülre.1. The glass column is connected to a reservoir column, the latter having twice the volume of the former. Both columns are set upright with the reservoir column on top.
2. Kimérjük a töltőanyagot (200 ml-es oszlophoz kb. 100 g).2. Weigh the filler (about 100 g for a 200 ml column).
3. Körülbelül ötszörös térfogatú oldószert adunk a töltőanyaghoz, az oldószerként 70-80% metanolt és 20-30% vizet használunk.3. Approximately five volumes of solvent are added to the filler using 70-80% methanol and 20-30% water.
4. Addig rázzuk a szuszpenziót, míg a részecskék átnedvesednek, ezután egy éjszakán át vágy tovább hagyjuk állni, a részecskék tökéletes átitadódására. Ezután a felülúszót dekantáljuk.4. Shake the slurry until the particles are wet, then leave overnight to allow the particles to completely soak. The supernatant is then decanted.
5. A gyantát megfelelő oldószerben szuszpendáljuk a rezervoár oszlop feltöltésekor. A rezervoárt feltöltjük, de előtte részben oldószerrel töltjük meg. Nagyobb mennyiségű szuszpenzió használatakor jobb eredményeket kaphatunk, ugyanakkor, ebben az esetben nagyobb rezervoár tartályt, vagy többlépéses feltöltést kell alkalmaznunk.5. The resin is suspended in a suitable solvent when the reservoir column is filled. The reservoir is filled, but partially filled with solvent. Larger volumes of slurry can give better results, but in this case a larger reservoir tank or a multi-step fill must be used.
6. Teflon dugóval lezárjuk a rezervoár tartályt (lásd a 4.131.547. számú amerikai szabadalmi leírás 1. ábráján a 3. pontot), összekötjük a pumpával, majd abban az esetben, ha Ace 13265-25 katalógusszámú pumpát vagy hasonló, oldószer-továbbító rendszert használunk, azonnal megindítjuk az oldószer áramlását, mégpedig maximális sebességggel (kb. 20 ml/p perc).6. Seal the reservoir tank with a Teflon plug (cf. Item 3 of Figure 1 of U.S. Patent 4,331,547), connect it to the pump, and, in the case of an Ace 13265-25 pump or similar, solvent transfer using a system, immediately starting the solvent flow at maximum speed (about 20 ml / min).
7. Addig folytatjuk az áramoltatást, míg az oszlop teljesen fel nem töltődik az adszorbenssel. A feltöltés közbeni nyomásnak nem szabad változnia a művelet alatt (kb. 0,8 atm a nagyobb oszlopok esetén, és 1,2 atm az analitikai oszlopok esetén. A legtöbb esetben a 0,8 atm-ánál kisebb nyomás elegendő).7. Continue the flow until the column is completely filled with the adsorbent. The filling pressure should not change during the operation (about 0.8 atm for larger columns and 1.2 atm for analytical columns. In most cases, less than 0.8 atm will suffice).
8. A nyomás maximális értékét elérve redukáljuk az áramlási sebességet, akkor a nyomás csökken.8. When the maximum pressure is reached, the flow rate is reduced and the pressure is reduced.
9. Amikor az oszlop feltöltődött az adszrobenssel, kikapcsoljuk a pumpát. A nyomást 0-ra hagyjuk esni, lekapcsoljuk a rezervoár tartályt, ezt előoszloppal helyettesítjük. Az előoszlopot oldószerrel és kevés adszorbenssel töltjük fel, és maximális nyomáson tartjuk, míg az oszlop tökéletesen feltöltődik. További információk érdekében tanulmányozzuk az általános bemutatást. A nyomást minden esetben lassan kell csökkenteni a pumpa kikapcsolását követően, ily módon elkerüljük a töltőanyag törését vagy benne csatornák kialakulását.9. When the column is filled with adsorbent, the pump is turned off. The pressure is allowed to drop to 0, the reservoir tank is shut off, and it is replaced by a pre-column. The pre-column is filled with solvent and a small amount of adsorbent and maintained at maximum pressure until the column is fully charged. For more information, study the general presentation. In all cases, the pressure should be reduced slowly after the pump has been switched off, thus avoiding breakage of the filler material or the formation of channels in it.
10. Csökkentjük a nyomást, és óvatosan lekapcsoljuk az oszlopról az előoszlopot. Spatulával 2—4 mm töltőanyagot eltávolítunk az oszlop tetejéről, és egy vagy két szűrőt helyezünk az oszlopra. A töltőanyag tetejét enyhén megnyomkodjuk, és teflon dugót helyezünk a tetejére. Hozzákapcsoljuk a pumpát az oszlophoz, nyomást biztosítunk, ami általában kevesebb, mint 0,8 atm, miközben az oszlop üvegfalán át megfigyeljük, hogy további gyanta kerül-e az oszlop tetejére. Ha további töltőanyag kerül az oszlopra — ez nagyobb oszlopok használatakor előfordul —, úgy ún. halott terek vagy csatonák keletkeznek. Ebben az esetben a 9. lépést meg kell ismételnünk.10. Decrease the pressure and carefully disconnect the pre-column from the column. Using a spatula, remove 2-4 mm filler from the top of the column and place one or two filters on the column. Lightly press the top of the filler and place a Teflon plug on top. Attach the pump to the column, providing pressure, usually less than 0.8 atm, while observing through the column glass wall whether additional resin is applied to the top of the column. If additional filler is applied to the column - this is the case when larger columns are used - so-called "columns". dead spaces or battles are created. In this case, you need to repeat step 9.
12. példaExample 12
A tetrahidro-A-30912 A előállításaPreparation of tetrahydro-A-30912A
Az A-30912 A komponenst etanolban oldjuk. Abszolút etanolban platina-oxidot redukálunk platina előállítására, amit az A-30912 A komponens katalitikus redukálásra használunk hidrogénnel és pozitív nyomás alatt. A reakciót 2-3 órán át végezzük, ezalatt teljessé válik. Szűrjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés tercier-butanolban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tetrahidro-A-30912 A-t kapunk.Component A-30912 A is dissolved in ethanol. Platinum oxide in absolute ethanol is reduced to produce platinum, which is used for the catalytic reduction of component A-30912 A with hydrogen and under positive pressure. The reaction is carried out for 2-3 hours, during which time it is complete. The reaction mixture was filtered and distilled under reduced pressure. The distillation residue was dissolved in a small amount of tert-butanol and freeze-dried to give tetrahydro-A-30912A.
13. példaExample 13
A tetrahidro-A-30912 B előállításaPreparation of tetrahydro-A-30912B
Az A-30912 B komponenst etanolban oldjuk. Abszolút etanolban platina-oxidot redukálunk platina előállítására, amit az A-30912 B komponens katalitikus redukálásra használunk hidrogénnel és pozitívComponent A-30912 B is dissolved in ethanol. Platinum oxide in absolute ethanol is reduced to produce platinum, which is used for the catalytic reduction of Component A-30912 B with hydrogen and positively.
-121 nyomás alatt. A reakciót 2-3 órán át végezzük, ezalatt teljessé válik. Szűrjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés tercier-butanolban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tetrahidro-A-30912 B-t kapunk.-121 under pressure. The reaction is carried out for 2-3 hours, during which time it is complete. The reaction mixture was filtered and distilled under reduced pressure. The distillation residue was dissolved in a small amount of tert-butanol and freeze-dried to give tetrahydro-A-30912B.
14. példaExample 14
A tetrahidro-A-30912 D előállításaPreparation of tetrahydro-A-30912 D
Az A-30912 D komponenst etanolban oldjuk. Abszolút etanolban platina-oxidot redukálunk platina előállítására, amit az A-30912 D komponens katalitikus redukálásra használunk hidrogénnel és pozitív nyomás alatt. A reakciót 2-3 órán át végezzük, ezalatt teljessé válik. Szűrjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés tercier-butanolban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tetrahidro-A-30912 D-t kapunk.Component A-30912 D is dissolved in ethanol. Platinum oxide in absolute ethanol is reduced to produce platinum, which is used for the catalytic reduction of component A-30912 with hydrogen and under positive pressure. The reaction is carried out for 2-3 hours, during which time it is complete. The reaction mixture was filtered and distilled under reduced pressure. The distillation residue was dissolved in a small amount of tert-butanol and freeze-dried to give tetrahydro-A-30912 D.
15. példaExample 15
A tetrahidro-A-30912 H előállításaPreparation of tetrahydro-A-30912 H
Az A-30912 H komponenst etanolban oldjuk. Abszolút etanolban platina-oxidot redukálunk platina előállítására, amit az A-30912 H komponens katalitikus redukálásra használunk hidrogénnel és pozitív nyomás alatt. A reakciót 2—3 órán át végezzük, ezalatt teljessé válik. Szűrjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés tercier-butanolban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tetrahidro-A-30912 H-t kapunk.Component A-30912 H is dissolved in ethanol. Platinum oxide in absolute ethanol is reduced to produce platinum, which is used for the catalytic reduction of component A-30912 H with hydrogen and under positive pressure. The reaction is complete for 2-3 hours, during which time the reaction is complete. The reaction mixture was filtered and distilled under reduced pressure. The distillation residue was dissolved in a small amount of tert-butanol and freeze-dried to give tetrahydro-A-30912H.
16. példaExample 16
A. Az A-30912 A antibiotikum komponens acilhasításaA. Acyl cleavage of the A-30912 A antibiotic component
Az 1. példában megadott módon A. utahensis mikroorganizmussal fermentálunk. Ferde agárként az A táptalajt használjuk, termelő-táptalajként pedig az I, táptalajt. A termelő-táptalajt 42 órán át inkubáljuk. A fermentációs táptalajhoz 19,7 g A-30912 A komponenst tartalmazó 340 g nyers szubsztrátot adagolunk 1,5 1 etanolban.As in Example 1, it was fermented with A. utahensis. Medium A is used as slanted agar and medium I is used as production medium. The production medium was incubated for 42 hours. To the fermentation broth is added 340 g of crude substrate containing 19.7 g of component A-30912 A in 1.5 l of ethanol.
Az A-30912 A komponens dezaciiezését oly módon követjük, hogy biológiai érték-mérést végzünk Candida albicans mikroorganizmussal. Addig folytatjuk a fermentációt, míg az acilhasítás teljes, amit a C. albicans mikroorganizmussal szembeni aktivitás megszűnése jelez.Deacylation of component A-30912 A is monitored by biological measurement with Candida albicans. The fermentation is continued until the acyl cleavage is complete, which is indicated by the loss of activity against C. albicans.
B, Az A-30912 A alapvegyület izolálásaB, Isolation of parent compound A-30912 A
Az A. pontban megadottak szerint előállított 1001 teljes fermentlevet, amely körülbelül 20 g A-30912 A komponensből előállított alapvegyületet tartalmazza, szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet (kb. 93 1) 4,5 1 HP-20 gyantát (diaion High Pórus Polymer, HP-Series, Mutsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) töltött oszlopon kromatografáljuk 200 ml/perces sebességgel. A kapott effluenst kidobjuk. Az oszlopot 8 oszlopnyi térfogató, 6,5-,75 közötti pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szennyező anyagok eltávolítására. A mosófolyadékot kiöntjük. Ezután víz és metanol 7 3 arányú elegyének 85 literével eluálunk, az eluálás sebessége 200—300 ml/perc.1001 whole fermentation broths prepared as described in A containing approximately 20 g of the parent compound prepared from component A-30912 A are filtered. The mycelium is discarded. The clear filtrate (ca. 93 L) was chromatographed on a packed column of 4.5 L HP-20 resin (Diaion High Pore Polymer, HP-Series, Mutsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) at 200 mL / min. The resulting effluent is discarded. The column was washed with 8 column volumes of deionized water, pH 6.5 to 75, to remove contaminants. The wash was discarded. It is then eluted with 85 liters of a 7: 3 mixture of water and methanol at an elution rate of 200-300 ml / min.
Az eluálást az alábbi eljárással követjük: mindegyik eluátumból 2 alikvot mintát veszünk, Az egyiket kis térfogatúra töményítjük, és savkloriddal, például miriszloil-kloriddal kezeljük. Ezt és a másik, nem kezelt mintát Candida albicans mikroorganizmussal szemben értékeljük. Ha a nem kezelt minta nem aktív, és az acilezett minta aktív, ügy a frakció A-30912 A alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 A alapvegyületet tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson desztillálva töményítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 97 g nyers alapvegyületet kapunk.Elution is followed by the following procedure: 2 aliquots of each eluate are collected, one is concentrated to a small volume and treated with an acid chloride such as myristoyl chloride. This and the other untreated sample were evaluated for Candida albicans. If the untreated sample is inactive and the acylated sample is active, fraction A-30912 A contains the parent compound. The eluates containing the parent compound A-30912 A were concentrated by distillation under reduced pressure and freeze-dried to give 97 g of crude parent compound.
C. Az A-30912 A alapvegyületet tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiával g, az előző pont szerinti előállított nyers A-30912 A alapvegyületet 300 ml alábbi összetételű elegyben oldunk: víz, acetonitril, ecetsav és piridin 96:2:1:1 arányú elegye. Az oldatot 8 cm x 80 cm méretű, 4 1 térfogatú saválló acélból készült, 25-40 μ szemcsenagyságú Lochroprep RP-18 gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinati, Ph). Az oszlop része a Chromatospec Prep 100 egységnek (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, Franciaország). Az oszlop 0,36-0,45 atm nyomáson működik, az áramlási sebesség 60 ml/perc. Oldószerként a fenti oldószert használjuk. Az anyag elkülönítését 280 nmen működő UV-monitoron követjük (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentum Specialties, Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504), ami ISCO Type 6 optikai egységgel van felszerelve. Minden percben 500 ml térfogatú frakciókat különítünk el.C. Purification of the parent compound A-30912 A by reverse-phase liquid chromatography g of the crude parent compound A-30912 A prepared in the preceding paragraph was dissolved in a mixture of water, acetonitrile, acetic acid and pyridine (96: 2: 1: 1). The solution was chromatographed on a column of Lochroprep RP-18 resin (8 cm x 80 cm, 4 L) made of acid-proof steel (MC / B Manufacturing Chemists, Inc. E / M, Cincinati, Ph). The column is part of the Chromatospec Prep 100 unit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, France). The column operates at a pressure of 0.36-0.45 atm with a flow rate of 60 ml / min. The solvent used is the above solvent. The material was monitored on a 280nm UV monitor (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) equipped with an ISCO Type 6 optical unit. Fractions of 500 ml volume were collected every minute.
A 280 nm-es hullámhosszon mért abszorpció alapján egyesítjük az A-30912 A alapvegyületet tartalmazó frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot pedig fagyasztva szárítjuk, amikor 2,6 g alapvegyületet kapunk. A kromatográfiás elkülönítési folyamat során 7—8 1 oldószerre van szükségünk.On the basis of the absorbance at 280 nm, the fractions containing the parent compound A-30912 A were combined, distilled under reduced pressure, and the residue was freeze-dried to yield 2.6 g of the parent compound. The chromatographic separation process requires 7-8 L of solvent.
D. Az A-30912 A alapvegyület jellemzőiD. Characteristics of A-30912 A parent compound
a) tapasztalatai képlet: C3 4 H51 N-jOj 5.a) Experiment: C 3 4 H 51 N 5 .
b) Molekulasúly: 797,83.b) Molecular Weight: 797.83.
c) Az anyag fehér színű, amorf, szilárd halmazállapotú vízben dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxídban, metanolban oldódik, kloroformban, toluolban és dietil-éterben oldhatatlan.c) The substance is soluble in white, amorphous, solid water, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, methanol, insoluble in chloroform, toluene and diethyl ether.
d) A kálum-bromid tablettában vizsgált infravörös , abszorpciós spektrumban az alábbi hullámhosszakon látszik elnyelési maximum: 3303, széles (hidroxilcsoport, H-kötések), 2970, 2930 és 2890 (CH, alifás metilcsoprot, metiléncsoport, CH-csoport ok), 1660 és 1625 (több karbonilcsoport), 1510-1550, 1430-1450 (CH-), 1310-1340, 1230-1260, 1080, 835 , 650, széles, továbbá 550, széles, cm4.d) The infrared absorption spectrum studied in the potassium bromide tablet exhibits absorption maxima at 3303, broad (hydroxyl group, H-bonds), 2970, 2930, and 2890 (CH, aliphatic methylpropyl group, methylene group, CH group), 1660 and 1625 (more carbonyl groups), 1510-1550, 1430-1450 (CH-), 1310-1340, 1230-1260, 1080, 835, 650, broad, and 550, broad, cm 4 .
e) a 66%-os vizes dimetil-formamidban végzett elektrometrikus titrálás szerint a vegyület 7,35 pKaértékkel jellemezhető (eredeti pH 7,32) titrálható csoportot tartalmaz.e) electrometric titration in 66% aqueous dimethylformamide contains a titratable moiety having a characteristic of 7.35 pK a (original pH 7.32).
f) A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatkor kapott retenciós idő (K*): 11,52 perc. Ezt az alábbi rendszerben mértük:(f) Retention time (K *) of HPLC: 11.52 minutes. This was measured using the following system:
oszlop: 4 x 300 mm töltőanyag: szilikagél/C, 8 ammónium-acetát és acetonitril, továbbá víz 1:2:97 arányú elegye áramlási sebesség: 3 ml/perc nyomás: 100 atm detektor: változatható hullámhosszúságú ultraibolya detektor, 230 mm érzékenység: 0-0,4 A.U.F.S.column: 4 x 300 mm filler: silica gel / C, 8: ammonium acetate: acetonitrile, water: 1: 2: 97 flow rate: 3 ml / min pressure: 100 atm detector: variable wavelength ultraviolet detector, 230 mm sensitivity: 0-0.4 AUFS
17. példaExample 17
A 16. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 A-t használunk, előállítjuk az A-30912 A alapvegyületet.In the same manner as in Example 16, except that tetrahydro-A-30912 A is used as a substrate, the parent compound A-30912 A is prepared.
-131-131
18. példaExample 18
A 16. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként aculeacin A-t használunk, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 A alapevegyületet.Proceeding as in Example 16, except that aculeacin A is used as a substrate, the parent compound A-30912A is prepared and purified.
19. példaExample 19
A. Az A-30912 B alapvegyület komponens dezacilezéseA. Deacylation of the parent compound component A-30912B
Az 1. példában megadottak szerint eljárva, az I. termelő táptalajt használva, az A. utahensis fermentációját végezzük el. A tenyészetet 48 órán át inkubáljuk, majd metanolban oldott A-30912 B komponenst adunk a tenyészethez.Following the procedure of Example 1, fermentation of A. utahensis was carried out using production medium I. The culture was incubated for 48 hours and then methanol-dissolved A-30912B was added to the culture.
Az A-30912 B komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez.Deacylation of Component A-30912 B was followed by paper disk measurement with Candida albicans or Neurospora crassa. Fermentation is continued until the deacylation is complete, which is indicated by the loss of biological activity.
B. Az A-30912 B alapvegyület izolálásaB. Isolation of parent compound A-30912B
Az előző A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Porous Polymer, ΗΡ-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az effluenst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatúra töményítjük és savkloridot, például mirisztoíl-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-mérjük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a frakció A-30912 B alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 B alapvegyületet tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet.Filter the entire fermentation broth prepared as described in A above. The mycelium is discarded. The clear filtrate was chromatographed on a column of HP-20 resin (Diaion High Porous Polymer, Series-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). The effluent is discarded. The column is then washed with 8 column volumes of deionized water of pH 6.5-7.5 to remove the filtered fermentation broth. The wash was discarded. The column was then eluted with water / methanol (7: 3). The elution is followed as follows: two aliquots of each fraction are taken. One sample is concentrated to a small volume and acid chloride, such as myristyl chloride, is added. This sample and the other, i.e. untreated, are weighed against Candida albicans. If the untreated sample is inactive and acylated, the fraction contains parent compound A-30912B. The eluates containing the parent compound A-30912 B were distilled under reduced pressure and the low volume concentrate was freeze-dried to give the crude parent compound.
C. Az A-30912 B alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiávalC. Purification of parent compound A-30912 B by reverse phase liquid chromatography
A B. pontban kapott nyers A-30912.B alapvegyületet víz, acetonitril és ecetsav, továbbá piridin 96:1: :1:1 arányú elegyében oldjuk. Az oldatot Lichroprep RP-18 gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk. A gyanta szemcsemérete 25-40g(MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, Óh). Az oszlop része egy Chromatospec Prep 100 egységének (Jobin Yvon, 16—18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, Franciaország). Az oszlopot 3,5-0,45 atm nyomáson működtetjük, az átfolyási sebesség 60 ml/perc. Oldószerként a fenti oldószer-elegyet használjuK. A vegyületek elkülönítését 280 nm hullámhosszon működő UV-monitorral követjük (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504), amely ISCO Type 6 típusú optikai egységgel van felszerelve.The crude base compound A-30912B obtained in B. is dissolved in a mixture of water, acetonitrile and acetic acid and pyridine 96: 1: 1: 1. The solution was chromatographed on a column packed with Lichroprep RP-18 resin. The resin has a particle size of 25-40 g (MC / B Manufacturing Chemists, Inc. E / M, Cincinnati, OH). The column is part of a unit of a Chromatospec Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, France). The column is operated at a pressure of 3.5-0.45 atm, with a flow rate of 60 mL / min. The solvent mixture used is the above solvent mixture. Compound isolation was monitored by a UV monitor operating at 280 nm (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) equipped with an ISCO Type 6 optical unit.
A 280 nm-es hullámhosszúságon mért abszorpció alapján egyesítjük az A-30912 B alapvegyületet tartalmazó frakciókat, az elegyet csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a tisztított A 30912 B alapvegyületet.On the basis of the absorbance at 280 nm, the fractions containing the parent compound A-30912 B were combined, the mixture was distilled under reduced pressure and the distillation residue was freeze-dried to give the purified parent compound A 30912 B.
20. példaExample 20
A 19. példában megadottak szerint eljárva, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 B alapvegyületet, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 B alapvegyületet használunk.In the same manner as in Example 19, the parent compound A-30912 B was prepared and purified except that the substrate was tetrahydro-A-30912 B.
21. példaExample 21
A. Az A-30912 D komponens dezacilezéseA. Deacylation of Component A-30912 D
Az 1. példában megadottak szerint eljárva, 1. termelő-táptalajt használva fermentáljuk az A. utahensis mikroorganizmust. 48 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd kevés metanolban oldott A-30912 D komponenst adunk a tenyészethez.Proceeding as in Example 1, using the production medium 1, the A. utahensis microorganism is fermented. The culture is incubated for 48 hours and then a small amount of methanol-dissolved A-30912 component D is added to the culture.
Az A-30912 D komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez.Deacylation of Component A-30912 was monitored by paper disk measurement using Candida albicans or Neurospora crassa. Fermentation is continued until the deacylation is complete, which is indicated by the loss of biological activity.
B. Az A-30912 D alapvegyület izolálásaB. Isolation of parent compound A-30912 D
Az előző A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szüljük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Ptous Polymer, HP-Seties, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az effluenst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 73 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatra töményítjük, és savkloridot, például mirisztoil-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-mérjük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a fakció A-30912 D alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 D alapvegyületet tartalmazó elutumokat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet.The whole fermentation broth prepared as described in A above is obtained. The mycelium is discarded. The clear filtrate was chromatographed on a column of HP-20 resin (Diaion High Ptous Polymer, HP-Seties, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). The effluent is discarded. The column is then washed with 8 column volumes of deionized water of pH 6.5-7.5 to remove the filtered fermentation broth. The wash was discarded. The column is then eluted with a 73% water / methanol mixture. The elution is followed as follows: two aliquots of each fraction are taken. One sample is concentrated to a small volume and acid chloride such as myristoyl chloride is added. This sample and the other, i.e. untreated, are weighed against Candida albicans. If the untreated sample has no activity and the acylated one, the faction contains parent compound A-30912 D. The eluates containing the parent compound A-30912 D were distilled under reduced pressure and the low volume concentrate was freeze-dried to give the crude parent compound.
C. Az A-30912 D alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiávalC. Purification of parent compound A-30912 D by reverse-phase liquid chromatography
Az A-30912 D alapvegyületet, amelyet a B. pontbán nyers alakban kapunk meg, a 19. példában megadottak szerint tisztítunk.The parent compound A-30912 D, obtained in crude form B, was purified as described in Example 19.
A 280 nm hullámhosszon mért abszorpció alapján kiválasztjuk az A-30912 D alapvegyületet tartalmazó frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tiszta A-30912 D alapvegyületet kapunk.On the basis of the absorbance at 280 nm, the fractions containing the parent compound A-30912 D were selected, distilled under reduced pressure and freeze-dried to yield pure A-30912 D parent compound.
22. példaExample 22
A 21. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 B-t használunk, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 D alapvegyületet.By proceeding as in Example 21, except that tetrahydro-A-30912 B is used as a substrate, the parent compound A-30912 D is prepared and purified.
23. példaExample 23
A. Az A-30912 H antibiotikum komponens dezacilezéseA. Deacylation of the A-30912 H antibiotic component
Az 1. példában megadottak szerint eljárva, I. termelő-táptalajt használva fermentáljuk, az A. utahensis mikroorganizmust. 48 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd kevés metanolban oldott A-30912 H komponenst adunk a tenyészethez.Using the same procedure as in Example 1, fermentation of A. utahensis, using production medium I, was carried out. The culture is incubated for 48 hours and then a small amount of methanolic A-30912 H component is added to the culture.
Az A-30912 H komponens dezacilezését papfrkorong módszerrel, Candida albicans vagy NeurosporaD-acylation of component H of A-30912 by paphr disks, Candida albicans or Neurospora
-141-141
185.021 crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez.185,021 with crassa microorganism. Fermentation is continued until the deacylation is complete, which is indicated by the loss of biological activity.
B. Az A-30912 H alapvegyület izolálásaB. Isolation of parent compound A-30912 H
Az előző, A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az effluenst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7 □ arányú elegyéve) eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatra töményítjük, és savkloridot, például mirisztoil-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-méijük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a frakció A-30912 H alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 H alapvegyületet tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet.Filter the entire fermentation broth obtained in (A) above. The mycelium is discarded. The clear filtrate was chromatographed on a column of HP-20 resin (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). The effluent is discarded. The column is then washed with 8 column volumes of deionized water of pH 6.5-7.5 to remove the filtered fermentation broth. The wash was discarded. Then elute the column with a mixture of water and methanol (7 □). The elution is followed as follows: two aliquots of each fraction are taken. One sample is concentrated to a small volume and acid chloride such as myristoyl chloride is added. This sample, and the other, untreated, was evaluated against Candida albicans. If the untreated sample has no activity and the acylated one, the fraction contains parent compound A-30912 H. The eluates containing the parent compound A-30912 H were distilled under reduced pressure and the low volume concentrate was freeze-dried to give the crude parent compound.
C. Az A-30912 H alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiávalC. Purification of parent compound A-30912 H by reverse-phase liquid chromatography
A B. pontban kapott nyers A-30912 H alapvegyületet a 19. példa C. pontjában megadottak szerint tisztítjuk.The crude parent compound A-30912 H obtained in (B) was purified as described in Example 19 (C).
A 280 nm hullámhosszon mért abszorpció alapián az A-30912 H alapvegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tiszta A-30912 H alapvegyületet kapunk.On the basis of the absorbance at 280 nm, the fractions containing the parent compound A-30912 H were combined, distilled under reduced pressure and freeze-dried to yield pure A-30912 H parent compound.
24. példaExample 24
A 23. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 H-t használunk, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 H alapvegyületet.In the same manner as in Example 23, except that tetrahydro-A-30912 H was used as a substrate, the parent compound A-30912 H was prepared and purified.
25. példaExample 25
A 23. példában megadottak szerint előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 H alapvegyületet, azzal a különbséggel, hogy az A-30912 H komponenst az A-30912 A komponensből állítjuk elő, az alábbi eljárás szerint:The title compound A-30912 H was prepared and purified as in Example 23, except that component A-30912 H was prepared from component A-30912 H by the following procedure:
I ml dimetil-formamidban 19,6 mg A-30912 A antibiotikum-komponenst oldunk. Az oldathoz 0,06 ml 3%-os, metanolos hidrogén-klorid oldatot adunk. A kapott oldatot egy éjszakán át szobahőmérsékleten keveijük, majd szárazra pároljuk csökkentett nyomású térben. A kapott desztillációs maradékot a 7. példában megadottak szerint nagyfelbontású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, a tisztítást reverz fázisú szilikagéllel (LP-l/Cu, a 10. példában megadottak szerint állítjuk elő), és metanol, víz és acetonitríl 7:2:1 arányú elegyével végezzük. Ily módon 1,4 mg A-30912 H komponenst kapunk (a vegvület az a II általános képletű vegyület, ahol R1 és R4 hidroxilcsoport, R3 hidrogénatom, R3 metoxicsoport, és R linoleoilcsoport).Dissolve 19.6 mg of antibiotic component A-30912 A in 1 ml of dimethylformamide. To the solution was added 0.06 ml of a 3% solution of hydrogen chloride in methanol. The resulting solution was stirred overnight at room temperature and then evaporated to dryness under reduced pressure. The resulting distillation residue was purified by high performance liquid chromatography as described in Example 7, purified by reverse phase silica gel (LP-1 / Cu, as in Example 10) and methanol: water: acetonitrile (7: 2: 1). . Thus 1.4 mg of A-30912 H is obtained (vegvület of the compound of formula II wherein R 1 and R 4 OH, R 3 is hydrogen, R 3 and methoxy, and R linoleoilcsoport).
26. példaExample 26
A. Az S 31794/F-l antibiotikum dezacilezéseA. Deacylation of antibiotic S 31794 / F-1
Az 1. példában megadottak szerint eljráva, I. ter10 meló-táptalajt használva fermentáljuk az A. utahensis mikroorganizmust. 48 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd kevés metanolban oldott S 31794/F-l komponenst adunk a tenyészethez.As described in Example 1, the microorganism A. utahensis is fermented using the working medium I. ter10. The culture is incubated for 48 hours and a small amount of S 31794 / F-1 in methanol is added.
Az S-31794/F-1 komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, mig a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez.Deacylation of the S-31794 / F-1 component was followed by paper disk measurement with Candida albicans or Neurospora crassa. Fermentation is continued until the deacylation is complete, which is indicated by the loss of biological activity.
B. Az S 31794/F-l alapvegyület izolálásaB. Isolation of parent compound S 31794 / F-l
Az előző A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az efflienst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7:3 arányú elegy ével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatra töményítjük és savkloridot, például mirisztoil-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-méijük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a frakció S 31794/F-l alapvegyületet tartalmaz. Az S 31794/F1 alapvegyületet tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet.Filter the entire fermentation broth prepared as described in A above. The mycelium is discarded. The clear filtrate was chromatographed on a column of HP-20 resin (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). The efflient is discarded. The column is then washed with 8 column volumes of deionized water of pH 6.5-7.5 to remove the filtered fermentation broth. The wash was discarded. The column is then eluted with a 7: 3 mixture of water and methanol. The elution is followed as follows: two aliquots of each fraction are taken. One sample is concentrated to a small volume and acid chloride such as myristoyl chloride is added. This sample, and the other, untreated, was evaluated against Candida albicans. If the untreated sample has no activity and the acylated one, the fraction contains the parent compound S 31794 / F-1. The fractions containing the parent compound S 31794 / F1 are distilled under reduced pressure and the low volume concentrate is freeze-dried to give the crude parent compound.
C. Az S 31794/F-l alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiávalC. Purification of parent compound S 31794 / F-1 by reverse-phase liquid chromatography
A B. pontban kapott nyers S 31794/F-l alapvegyületet a 19. példa C. pontjában megadottak szerint tisztítjuk.The crude parent compound S 31794 / F-1 obtained in B. was purified as described in Example 19 (C).
A 280 nm hullámhosszon mért abszorpció alapján egyesítjük az S 31794/F-l alapvegyületeket tartalmazó frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tiszta S 31794/F-l alapvegyületet kapunk.On the basis of the absorbance at 280 nm, the fractions containing the parent compound S 31794 / F-1 are combined, distilled under reduced pressure and freeze-dried to give pure S 31794 / F-1 parent compound.
A 16-26. példákban előállított alapvegyületek NMR-spektrumát az alábbiakban adjuk meg. Az egyes aminosav-komponenseknél kapott csúcsokat minden alapvegyületnél külön-külön adjuk meg. A mérést DMSO-dj oldószerben, 360 MHz-nél végeztük,; ben kifejezve.16-26. The NMR spectra of the parent compounds prepared in Examples 1 to 4 are given below. The peaks for each amino acid component are reported separately for each parent compound. The measurement was performed in DMSO-dj solvent at 360 MHz; expressed in.
A-30912 A alapvegyület ppmmetil-hidroxi-prolin (1) részképlet dihidroxi-ornitln (2) részképlet treonin/1 (3) részképlet treonin/2 (4) részképlet dihidroxi-homo-tirozin (5) részképlet a = 4,17,(3=4,01,7=2,33, CH3 =0,95, δ = 3,82 és 3,17.A-30912 Compound A ppmmethylhydroxyproline (1) sub-formula dihydroxy-ornithine (2) sub-formula threonine / 1 (3) sub-formula threonine / 2 (4) sub-formula dihydroxy-homothyrosine (5) sub-formula a = 4.17, (3 = 4.01.7 = 2.33, CH 3 = 0.95, δ = 3.82 and 3.17.
a = 3,22, (3 = 1,69 és 1,42, γ=3,79,δ = 5,20,ΝΗ = 7,89.a = 3.22, (3 = 1.69 and 1.42, γ = 3.79, δ = 5.20, ΝΗ = 7.89.
7,24, a = 4,64, β’7.24, a = 4.64, β '
NH 3,88, CH3 <NH 3.88, CH 3 <
1,06.1.06.
NH = 8,03, a - 4,76, β 459, CHj = l,06.NH = 8.03, α = 4.76, β 459, CHj = 1.06.
NH = 7,39,0 = 3,94, (3 =NH = 7.39.0 = 3.94, (3 =
3,90, γ = 4,18, orto = 6,99, méta = 6,66.3.90, γ = 4.18, ortho = 6.99, Meta = 6.66.
-151-151
185.021 hidroxi-prolin (6) részképlet A-30912 B aiapvep'ület metil-hidroxi-prolin (1) részképlet díhidroxi-ornitin (2) részképlet tieoniii/1 (3) részképlet trconon/2 (4) részképlet hidroxi-homotirozln (7) részképlet hidroxi-prolin (6) rcszképlet A-30912 D alapvegyület metil-hidroxi-prolin (1) részképlet ornitin (8) részképlet treonin/1 (3) részképlet trconin/2 (4) részképlet Wdroxi-homotirozln (7) részképlet hidroxi-prolin (6) részképlet A-30912 H alapvegyület metil-hidroxi-prolin (1) részképlet metoxi-hidroxi-ornitin (9) részképlet treonin/1 (3) részképlet trconin/2 (4) részképlet hidroxi-homotirozln (5) részképlet hidroxi-prolin (6) részképlet185.021 Hydroxyproline (6) Sub-Formula A-30912 B Base Methyl Hydroxyproline (1) Sub-Dihydroxy-Ornithine (2) Sub-Thiononyl / 1 (3) Sub-Form Trconone / 2 (4) Hydroxy-Homothir ) sub-formula hydroxyproline (6) formula A-30912 parent compound methyl-hydroxyproline (1) sub-formula ornithine (8) sub-formula threonine / 1 (3) sub-formula trconin / 2 (4) sub-formula Wdroxy-homothyrosine (7) -proline (6) sub-formula A-30912 H parent compound methyl hydroxyproline (1) sub-formula methoxy-hydroxy-ornithine (9) sub-formula threonine / 1 (3) sub-formula trconine / 2 (4) sub-formula hydroxy-homothyrosine (5) hydroxyproline (6)
S 31794/F-l alapvegyület metil-hidroxi-prolin (1) részképlet dihidroxi-ornitin = 4,29,0 = 2,20 és 1,84, 7 = 4,41,0 = 3,79 és 3,69.The parent compound S 31794 / F-1 is the methyl hydroxyproline (1) sub-formula dihydroxy-ornithine = 4.29.0 = 2.20 and 1.84, 7 = 4.41.0 = 3.79 and 3.69.
c = 4,15,0= 3,98,7= 2,35, CH3 =0,96, δ = 3,83 és ’ 3,22.4,15,0 3,98,7 c = 2.35, CH3 = 0.96, and δ = 3.83 '3.22.
a= 3,14,3 = 1,69 és 1,41, 7= 3,85, 5 = 5,24, NH =a = 3.14.3 = 1.69 and 1.41, 7 = 3.85, 5 = 5.24, NH =
7.98.7.98.
NH = 7,30,0=4,65,0= 3,87,NH = 7.30.0 = 4.65.0 = 3.87,
CH3 = 1,05.CH 3 = 1.05.
NH = 8,18,a= 4,75,0= 4,46,NH = 8.18, a = 4.75.0 = 4.46,
CH3=0,99.CH 3 = 0.99.
NH = 7,82,0 = 4,17,0=NH = 7.82.0 = 4.17.0 =
3.99, = 4,36, δ = 3,96 és 3,57. a = 4,28, 0 = 2,18 és 1,90, 7 = 4,36, o = 3,96 és 3,57, = 4,14,0 = 3,98,7 = 2,29, CH3 =0,94, δ = 3,80és 3,22.3.99, = 4.36, δ = 3.96, and 3.57. a = 4.28, 0 = 2.18 and 1.90, 7 = 4.36, o = 3.96 and 3.57, = 4.14.0 = 3.98,7 = 2.29, CH 3 = 0.94, δ = 3.80 and 3.22.
= 3,16,0 = 1,04 és 1,79, 7= 1,60, δ = 3,33 és 2,87, NH = 7,70,= 3.16.0 = 1.04 and 1.79, 7 = 1.60, δ = 3.33 and 2.87, NH = 7.70,
NH = 7,44,0 = 4,69,0 = 4,06,NH = 7.44.0 = 4.69.0 = 4.06,
CH3 = 1,03.CH 3 = 1.03.
NH = 7,85,0 = 4,66,0= 4,42,NH = 7.85.0 = 4.66.0 = 4.42,
CH3 = 1,04.CH 3 = 1.04.
NH = 8,04,0=4,12,0 = 4,06, = 2,57 és 2,48, orto = 6,92, méta = 6,63. 0=4,34, 0=2,19 és 1,93, 7= 4,40, = 3,98 és 3,64.NH = 8.04.0 = 4.12.0 = 4.06, = 2.57 and 2.48, ortho = 6.92, Meta = 6.63. 0 = 4.34, 0 = 2.19 and 1.93, 7 = 4.40, 3.98 and 3.64.
0=4,21,0=4,03,7 =0 = 4,21,0 = 4,03,7 =
2,31, CH3 =0,96, δ =3,85 és 3,22. 0=3,12,0= 1,69 és 1,42, 7=3,97, ö = 5,03,0CH3 = 3,20,2.31, CH 3 = 0.96, δ = 3.85 and 3.22. 0 = 3,12,0 = 1,69 and 1,42, 7 = 3,97, δ = 5,03,0 CH 3 = 3,20,
NH = 7,95,NH = 7.95,
NH = 7,15, α = 4,61, 0 = 3,83,NH = 7.15, α = 4.61, O = 3.83,
CH3 = 1,08.CH 3 = 1.08.
NH = 8,24,0 = 4,79,0= 4,51,NH = 8.24.0 = 4.79.0 = 4.51,
CH3 = l,03.CH 3 l = 03.
NH = 7,46,0 = 3,94,0= 3,77,7 = 4,27, orto = 6,95, méta =6,65. o =4,25,0= 2,19 és 1,86, 7 = 4,42, = 3,87 és 3,67.NH = 7.46.0 = 3.94.0 = 3.77.7 = 4.27, Ortho = 6.95, Meta = 6.65. o = 4.25.0 = 2.19 and 1.86, 7 = 4.42, = 3.87 and 3.67.
= 4,23,0 = 3,98,7 = 2,32, CH3 = 0,94, δ = 4,05 és 3,12. aNH = 8,18,0 = 4,22,0 =4,23,0 3,98,7 = = = 2,32, CH3 = 0.94, δ = 4.05 and 3.12. aNH = 8.18.0 = 4.22.0 =
1,75 és 1,75, (2) részképlet 0-hidroxi-glutamÍn (10) részképlet treonin (4) részképlet dihidroxi-homotirozin (5) részképlet = 3,73, δ = 4,95, NH = 8,05.1.75 and 1.75, (2) sub-formula 0-hydroxyglutamine (10) sub-formula threonine (4) sub-formula dihydroxy-homothyrosine (5) sub-formula = 3.73, δ = 4.95, NH = 8.05.
NH = 7,19, a = 4,85,0 = 4,16,7=2,45 és 2,25,-CO-NH2 = 7,29és 6 78NH = 7.19, a = 4.8-5.0 = 4,16,7 = 2.45 and 2.25, -CO-NH 2 = 6 78 7,29és
NH = 8,23, α = 4,75, β = 4,34 CH3 = 1,06.NH = 8.23, α = 4.75, β = 4.34 CH 3 = 1.06.
NH = 7,40, a = 3,97, 0 =NH = 7.40, a = 3.97, 0 =
3,97,7=4,13, orto = 7,00, méta = 6,66, fenol % 9,29.3.97,7.7 = 4.13, Ortho = 7.00, Meta = 6.66, Phenol 9.29.
hidroxi-prolin O = 4,33, 0= 1,85 és 2,22, = 4,40, (6) részképlet δ 3,72 és 3,72.hydroxyproline O = 4.33, O = 1.85 and 2.22, 4.40, (6) sub-formula δ 3.72 and 3.72.
Az alábbiakban ismertetjük a III általános képletű vegyületek előállítását az ún. aktív észter módszerrel. Az eljárás során olyan III általános képletű vegyületet állítunk elő, ahol Rs egy CH+CHj)] ^képletű csoport, továbbá, ahol R‘, R2, R3 és R4 az előállítandó alapvegyületben megadottak. A 27—47. példákban leírt eljárások nem tartoznak a találmány körébe.The following describes the preparation of the compounds of the general formula III using the so-called. by the active ester method. The process provides a compound of Formula III wherein R s is CH + CH 3) 4, and wherein R 1, R 2 , R 3 and R 4 are as defined in the parent compound to be prepared. 27-47. The methods described in Examples 1 to 4 are not within the scope of the invention.
27. példaExample 27
A 2,4,5-trikIór-fenil-tridekanoát előállításaPreparation of 2,4,5-trichlorophenyltridecanoate
650 ml metilén-kloridban 12,5 g n-tridekanoánsavat (Sigma Chemical CO.) 11,5 g 2,4,5-triklór-fenolt és 12,0 g Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimidet oldunk. 16 órán át szobahőmérsékleten keveijük a reakcióelegyet. Ezután szűrjük és csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk, amiután desztillációs maradékként 22 g 2,4,5-triklór-fenil-tridekaiioátot kapunk. A termék szilikagéllel (Woelm) és eluálószerként toluollal kivitelezett oszlopkromatográfiával tisztítjuk. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk, és rövidhullámhosszú ultraibolya fényben detektáljuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk.In 650 ml of methylene chloride was dissolved 12.5 g of n-tridecanoic acid (Sigma Chemical CO.), 11.5 g of 2,4,5-trichlorophenol and 12.0 g of Ν, il'-dicyclohexylcarbodiimide. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. It was then filtered and distilled to dryness under reduced pressure to give 22 g of 2,4,5-trichlorophenyltridecalate as a distillation residue. The product was purified by column chromatography on silica gel (Woelm) and toluene as eluent. The fractions were examined by thin layer chromatography and detected under shortwave ultraviolet light. The pure product fractions were collected and distilled to dryness under reduced pressure.
28. példaExample 28
Az A-30912 A alapvegyület acilezése 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoáttalAcylation of parent compound A-30912 A with 2,4,5-trichlorophenyl-n-tridecanoate
600 ml dimetil-formamidban 6,0 g 2,4,5-triklór-fenil-tridekanoátot és 4,5 g A-30912 A alapvegyületet oldunk, az oldatot 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Csökkentett nyomáson desztilláljuk az elegyet, amiután desztillációs maradékként 12 g terméket kapunk. Ezt 500 ml metilén-kloridban szuszpendáljuk, majd 45 perc múlva szűrjük a szuszpenziót. A szürletet kiöntjük. A kapott szilárd halmazállapotú terméket 500 ml metanollal extraháljuk, szűrjük a metanolos extraktumot és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amiután 5,0 g nyers terméket kapunk.Dimethylformamide (600 ml) was dissolved in 2,4,5-trichlorophenyltridecanoate (6.0 g) and parent compound A-30912A (4.5 g), and the solution was stirred at room temperature for 16 hours. Distillation under reduced pressure gave 12 g of product as a distillation residue. This is suspended in 500 ml of methylene chloride and after 45 minutes the suspension is filtered. The filtrate is discarded. The resulting solid was extracted with 500 mL of methanol, filtered through methanol extract and distilled under reduced pressure to give 5.0 g of crude product.
A nyersterméket reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, az alábbiak szerint: 1 g nyers terméket 5 ml metanolban oldunk, az oldatot 2 és 1/2-szer 65 cm méretű saválló oszlopban lévő LP-l/CiS gyantára injektáljuk (lásd a 10. és 11. példákat). Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 33 4 arányú elegyével eluáljuk. Az eluálást 40-60 atm nyomáson végezzük, az áramlási sebesség 11-12 ml/perc, amit LDC pumpával (Milton-Roy) biztosítunk. Az effluenst 280 nm-en vizsgáljuk ultraibolya detektorral (ISCO UA-5). Minden második percben elkülönítünk egy frakciót (21-24 ml). Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csök17The crude product was purified by reversed phase high performance liquid chromatography as follows: Dissolve 1 g of the crude product in 5 ml of methanol and inject 2 and 1/2 times the LP-1 / C 1 S resin in a 65 cm acid resistant column. and Examples 11). The column was eluted with a 4: 4 mixture of water, methanol and acetonitrile. Elution is carried out at a pressure of 40-60 atm, with a flow rate of 11-12 ml / min provided by an LDC pump (Milton-Roy). The effluent was examined at 280 nm with an ultraviolet detector (ISCO UA-5). A fraction (21-24 mL) was collected every other minute. The fractions containing the product to be prepared were collected and reduced
-161 kenteit nyomáson szárazra desztilláljuk. Ily módon 550 mg terméket kapunk. A fenti kromatoráfiás tisztítást négyszer megismételjük, amiután további négy terméket kapunk: ezek súlya: 620 mg, 520 mg, 670 mg és 490 mg. összsúlyuk 2,8 g.-161 centrifuges are distilled to dryness under pressure. 550 mg of product are obtained. The above chromatographic purification was repeated four times to give four more products: 620 mg, 520 mg, 670 mg and 490 mg. their total weight is 2.8 g.
A fenti eljárást követve 40 g A-30912 A alapvegyületet reagáltatunk 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoáttal, amiután 2,6 g tiszta előállítandó terméket kapunk. A két kísérletből származó készítményeket egyesítjük, így 5,4 g termékhez jutunk. A meződeszorpciós tömegspektrometriával vizsgált iontömeg (M + Na+): 1016. (Elméleti: 1016). Az analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás (C18, Micro Bondapak, Waters Co.) szerint (eluálás víz, metanol és acetonitril 2:1:2 arányú elegyével) a termék egy csúcsot mutat.Following the above procedure, 40 g of the parent compound A-30912 A is reacted with 2,4,5-trichlorophenyl n-tridecanoate to give 2.6 g of pure product. The preparations from both experiments were combined to give 5.4 g of product. Field Mass Desorption Mass Spectrometry (M + Na + ): 1016. (Theoretical: 1016). Analytical HPLC (C 18 Micro Bondapak, Waters Co.) by (eluted with water: methanol: acetonitrile, 2: 1: 2 mixture of a) the product shows a single peak.
27. példaExample 27
Az A-30912 B alapvegyület acilezése 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoáttalAcylation of parent compound A-30912 B with 2,4,5-trichlorophenyl-n-tridecanoate
200 ml dinietii rormamidban 3,3 mmól 2,4,5-triklór-feiiil-n-trjdekanoátot és 1 mmól A-30912 B alapvegyületet oldunk. 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. Az oldószer eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az elegyet, a desztillációs maradékot 300 ml metilén-kloridban szuszpendáljuk és 45 perc múlva szűrjük. A szűrletet kiöntjük. A szilárd halmazállapotú terméket 300 mi metanollal extraháljuk, a metanolos extraktumot szűrjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor desztillációs maradékként megkapjuk a nyers'terriiéket.3.3 mmol of 2,4,5-trichlorophenyl-n-triadecanoate and 1 mmol of parent compound A-30912 B are dissolved in 200 ml of dimethylformamide. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, the residue was suspended in 300 ml of methylene chloride and filtered after 45 minutes. The filtrate was discarded. The solid product was extracted with methanol (300 mL), the methanolic extract was filtered and distilled under reduced pressure to give the crude product as a distillation residue.
A nyersterméket nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, az alábbiak szerint:The crude product was purified by high performance liquid chromatography as follows:
g terméket 5 ml metanolban oldunk;az oldatot 2,5 x 65 cm méretű, saválló acélból készült oszlopban lévő LP-1/Ci8 gyanta tetejére injektáljuk (lásd a 10. és 11. példát). Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 33:4 arányú elegyével eluáljuk. Az eluálást 40 60 atm-n végezzük, 11-12 ml/perc áramlási sebességgel, amit LDC pumpával (Milton-Roy) biztosítunk. A effleunst ultraibolya detektorral (ISCO UA-5) vizsgáljuk 280 nm hullámhosszon. Minden második percben különítünk el egy frakciót (21-24 ml). Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson desztillálva megkapjuk az előállítandó vegyületet. A tiszta terméket vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk, reverz fázisú Clg lemezeken (Whatman KCja), a futtatást víz, metanol és acctonitril 1:2:2 térfogatarányú elegyével végezzük, A futtatást követően a lemezeket a termék előhívására ultraibolya fényben vizsgáljuk.The product is dissolved in 5 ml of methanol and injected onto the top of an LP-1 / C18 resin in a 2.5 x 65 cm column made of stainless steel (see Examples 10 and 11). The column was eluted with 33: 4 water: methanol: acetonitrile. Elution was carried out at 40 to 60 atm, with a flow rate of 11-12 ml / min provided by an LDC pump (Milton-Roy). The effleun was examined with an ultraviolet detector (ISCO UA-5) at 280 nm. A fraction (21-24 mL) was collected every second minute. The fractions containing the product to be prepared are collected and distilled under reduced pressure to give the product to be obtained. The pure product was analyzed by thin layer chromatography on reversed-phase Ig plates (Whatman KCl), eluted with water, methanol: acetonitrile (1: 2: 2). After run, the plates were examined under ultraviolet light to induce the product.
30. példaExample 30
Az A-30912 D alapvegyület acilezése 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoáttalAcylation of parent compound A-30912 D with 2,4,5-trichlorophenyl-n-tridecanoate
200 ml dimetil-formamidban 3,3 mmól 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoátot és 1 mmól A-30912 D alapvegyületet oldunk, az oldatot 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot 300 ml metilén-kloridban szuszpendáljuk. 45 perc múlva szűrjük a szuszpenziót. A szűrletet kiöntjük. A visszamaradó, szilárd halmazállapotú terméket 300 ml metanollal extraháljuk, az extraktumot szűrjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amiután megkapjuk a nyersterméket.In dimethylformamide (200 mL) was dissolved 2,3 mmol of 2,4,5-trichlorophenyl n-tridecanoate and 1 mmol of parent compound A-30912 D, and the solution was stirred at room temperature for 16 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure and the residue was suspended in 300 ml of methylene chloride. After 45 minutes, the suspension is filtered. The filtrate was discarded. The residual solid was extracted with methanol (300 mL), filtered and distilled under reduced pressure to give the crude product.
A nyersterméket a 29. példában megadottak szerint eljárva, reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk,The crude product was purified by reversed-phase high performance liquid chromatography as described in Example 29.
31. példaExample 31
Az A-30912 H alapvegyület acilezése 2,4,5-triklór-fenil -n-tridekanoáttalAcylation of parent compound A-30912 H with 2,4,5-trichlorophenyl-n-tridecanoate
200 ml dimetil-formamidban 3,3 mmól 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoátot és 1 mmól A-30912 H alapvegyületet oldunk, az oldatot 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot 300 ml metilén-kloridban szuszpendáljuk. 45 perc múlva szűrjük a szuszpenziót. A szűrletet kiöntjük. A visszamaradó, szilárd halmazállapotú terméket 300 ml metanollal extraháljuk, az extraktumot szűrjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amiután megkapjuk a nyersterméket.In dimethylformamide (200 mL) was dissolved 2,3 mmol of 2,4,5-trichlorophenyl n-tridecanoate and 1 mmol of parent compound A-30912 H and the solution was stirred at room temperature for 16 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure and the residue was suspended in 300 ml of methylene chloride. After 45 minutes, the suspension is filtered. The filtrate was discarded. The residual solid was extracted with methanol (300 mL), filtered and distilled under reduced pressure to give the crude product.
A nyersterméket a 37. példában megadottak szerint eljárva, reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk.The crude product was purified by reversed phase high performance liquid chromatography as described in Example 37.
32. példaExample 32
Az S 31794/F-l alapvegyület acilezése 2,4,5-triklór-fenil-n-tridekanoáttalAcylation of parent compound S 31794 / F-1 with 2,4,5-trichlorophenyl-n-tridecanoate
200 ml dimetil-formamidban 3,3 mmól 2,4,5-triklór-fenii-n-tridekanoátot és 1 mmól S 31794/F-l alapvegyületet oldunk, az oldatot 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot 300 ml metilén-kloridban szuszpendáljuk. 45 perc múlva szűrjük a szuszpenziót. A szűrletet kiöntjük. A visszamaradó, szilárd halmazállapotú terméket 300 ml metanollal extraháljuk, az extraktumot szűrjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amiután megkapjuk a nyersterméket.3.3 mmol of 2,4,5-trichlorophenyl n-tridecanoate and 1 mmol of parent compound S 31794 / F-1 are dissolved in 200 ml of dimethylformamide and the solution is stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was removed by distillation under reduced pressure and the residue was suspended in 300 ml of methylene chloride. After 45 minutes, the suspension is filtered. The filtrate was discarded. The residual solid was extracted with methanol (300 mL), filtered and distilled under reduced pressure to give the crude product.
A nyersterméket a 29. példában megadottak szerint eljárva, reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk.The crude product was purified by reversed phase high performance liquid chromatography as described in Example 29.
A Debono Ι-származékok előállításaPreparation of Debono Ι derivatives
Az alábbiakban ismertetjük azoknak a III általános képletű vegyületeknek az előállítását, ahol Rs egy IV képletű csoport. Ezzel szemléltetjük a III általános képletű Debono I-vegyületek előállításának módszerét.The preparation of compounds of formula III wherein R s is a group of formula IV is described below. This illustrates a method for preparing Debono I compounds of formula III.
33. példaExample 33
Az N-(n-dodekanoi])-p-amino-benzoesav előállításaPreparation of N- (n-dodecanol) p-aminobenzoic acid
100 ml piridinben 5,5 g (40 mmól) p-amino-benzoesavat oldunk, az oldathoz cseppenként 8,74 g(40 mmól) n-dodekanoil-kloridot adunk. 3 órán át keverjük a reakcióelegyet, ezt követően 3 1 vízhez öntjük. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután 11,01 gNfn· -dodekanoil)-p-amino-benzoesavat kapunk.5.5 g (40 mmol) of p-aminobenzoic acid are dissolved in 100 ml of pyridine and 8.74 g (40 mmol) of n-dodecanoyl chloride are added dropwise. After stirring for 3 hours, the reaction mixture was poured into 3 L of water. The precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to give 11.01 g of N, N -dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid.
34. példaExample 34
Az N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoesav 2,4,5-triklór-fenil-észterének előállításaPreparation of 2,4,5-trichlorophenyl ester of N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid
250 ml metilén-kloridban 11,01 g (34,5 mmól)In 250 mL of methylene chloride, 11.01 g (34.5 mmol)
N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoesavat 7,5 g (38 mmól) 2,4,5-triklór-fenolt és 6,94 g (34,5 mmól) N,N-diciklohexil-karbodiimidet oldunk. 3,5 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, majd szűrjük. A szűrletet csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot acetonitril és víz elegycbűl kikristályosítjuk, amiután 12,84 g 2,4,5-triklór-fenil-észtert kapunk az N-(n-dodekanoil)-p-aminp-benzoesavnak.N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid was dissolved in 7.5 g (38 mmol) of 2,4,5-trichlorophenol and 6.94 g (34.5 mmol) of N, N-dicyclohexylcarbodiimide. The reaction mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours and then filtered. The filtrate was distilled under reduced pressure, and the residue was crystallized from acetonitrile / water to give 12.84 g of 2,4,5-trichlorophenyl ester for N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid.
35. példaExample 35
Az A-30912 A alapvegyület acilezéseAcylation of A-30912 A parent compound
100 ml dimetil-formamidban 8,16 g (10,2 mmól) A-30912 A alapvegyületet és,4,72 g (10,2 mmól) N18In 100 ml of dimethylformamide, 8.16 g (10.2 mmol) of the parent compound A-30912 A and 4.72 g (10.2 mmol) of N18
-171 •{n -do dekanoil) -p-amino -benzoesav-2,4,5 -triklór-fenilésztert oldunk, 15 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. Csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel mossuk. A mosófolyadékot kiöntjük. A mosott terméket 50 ml metanolban oldjuk, és nagynyomású, reverz fázisú folyadékkromatográfiával tisztítjuk Prep LC/System 500 egységgel (Waters Associates Inc., Milford, Mass.) prop Pak-500/C18 oszlopot használva (Waters Associates Inc.) stacioner fázisként. Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 2565:10 térfogatarányú elegyével eluáljuk 2 atm nyomáson. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük, szilikagél lemezeken, az eluálást víz, metanol és acetonitril 25:65:10 térfogatarányú elegy ével végezve. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 3,5 g A-30912 A alapvegyület N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoil-származékot kapunk.-171 • (n -do decanoyl) -p-amino-benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester is dissolved and the reaction mixture is stirred at room temperature for 15 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was washed twice with diethyl ether. The wash was discarded. The washed product was dissolved in 50 ml of methanol and purified by high performance reverse phase liquid chromatography on the Prep LC / System 500 unit (Waters Associates Inc., Milford, Mass.) Prop Pak-500 / C 18 column (Waters Associates, Inc.) as the stationary phase. The column was eluted with water / methanol / acetonitrile (2565: 10 v / v) at 2 atm. The fractions were monitored by thin layer chromatography on silica gel plates, eluting with water, methanol and acetonitrile (25:65:10 v / v). The product-containing fractions were combined and freeze-dried to give 3.5 g of the parent compound A-30912A N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoyl.
36. példaExample 36
Az A-30912 B alapvegyület acilezése • 100 inl dimetil-formamidban 10,2 mmól A-30912Acylation of parent compound A-30912 B in 100 µl dimethylformamide 10.2 mmol A-30912
B alapvegyületet és 10,2 mmól N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk. 15 órán át szobahőmérsékleten keveijük a reakcióelegyet. Az oldószert csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval eltávolítjuk, a desztillációs maradékot két alkalommal dietil-éterrel mossuk. A mosófolyadékot kiönijük. A mosott terméket 50 ml metanolban oldjuk és nagynyomású, reverz fázisú folyadékkromatográfiával tisztítjuk Prep LC/System 500 egységet, és Prep Pak-500/Ci8 oszlopot (Water Associates, Inc., Milford, Mass.) használva stacioner fázisként. Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 2565:10 térfogatarányú elegyével eluáljuk 2 atm nyomáson, a frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk szilikagél lemezeken, az eluálást víz, metanol és acetonitril 25:65:10 térfogatarányú elegyével végezve. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd ezt követően fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az A-30912 B alapvegyület N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoil-származékát.Basic compound B and 10.2 mmol of N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester are dissolved. The reaction mixture was stirred at room temperature for 15 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was washed twice with diethyl ether. The wash was discarded. The washed product was dissolved in 50 ml of methanol and Prep LC / System 500 units and Prep Pak-500 / Cl 8 column (Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) Was purified using high pressure as the stationary phase for reverse phase chromatography. The column was eluted with water, methanol: acetonitrile (2565: 10) at 2 atm and fractions were analyzed by silica gel plates, eluting with water: methanol: acetonitrile (25:65:10). The fractions containing the product to be prepared were combined and then freeze-dried to give the N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoyl derivative of parent compound A-30912B.
37. példaExample 37
Az A-30912 D alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound A-30912 D
100 ml dimetil-formamidban 10,2 mmól A-30912 D alapvegyületet és 10,2 mmól N-(n-dodekanoil)-pamino-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk. 15 órán át szobahőmérsékleten keveijük a reakcióelegyet. Csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott terméket 50 ml metanolban oldjuk, és reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk Prep LC/System 500 egységet (Waters Associates, Inc., Milford, Mass,), ami Prep Pak-500/Cie oszloppal (Water Associates Inc.) rendelkezik, stacioner fázisként. Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 26:65:10 térfogatarányú elegyével eluáljuk 2 atm nyomáson. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk, szilikagél lemezeket és víz, metanol és acetonitril 25:65:10 térfogatarányú elegyét használva. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az A-30912 D alapvegyület N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoil-származékát.In 100 ml of dimethylformamide was dissolved 10.2 mmol of the parent compound A-30912 D and 10.2 mmol of N- (n-dodecanoyl) aminobenzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester. The reaction mixture was stirred at room temperature for 15 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was washed twice with diethyl ether. The washings were discarded. The washed product was dissolved in methanol (50 mL) and purified by reverse phase high performance liquid chromatography on a Prep LC / System 500 (Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) Having a Prep Pak-500 / Ci e column (Water Associates Inc.). , as a stationary phase. The column was eluted with water / methanol / acetonitrile (26:65:10, v / v) at 2 atm. The fractions were analyzed by thin layer chromatography using silica gel plates and a 25:65:10 by volume mixture of water, methanol and acetonitrile. The product-containing fractions were combined and freeze-dried to give the N-n-dodecanoyl-β-aminobenzoyl derivative of parent compound A-30912 D.
38. példaExample 38
Az A-30912 H alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound A-30912 H
100 ml dimetil-formamidban 10,2 mmól A-30912A-30912 in 100 ml of dimethylformamide was 10.2 mmol
H alapvegyületet és 10,2 mmól N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzosavat oldunk. Az oldatot 15 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott terméket 50 ml metanolban oldjuk és reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk Prep LC/System 500 egységet (Waters Associates Inc,, Milford, Mass.) használva, amely Prep Pák-500)Ci& oszloppal van felszerelve stacioner fázisként. Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 25:65:10 térfogatarányú elegyével eluáljuk 2 atm nyomáson. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk szilikagél lemezeken, oldószer-elegyként víz, metanol és acetonitril 25:65:10 térfogatarányú elegyét használva. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az A-30912 H alapvegyület N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoil-származékátThe parent compound H and 10.2 mmol of N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid were dissolved. The solution was stirred at room temperature for 15 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was washed twice with diethyl ether. The washings were discarded. The washed product was dissolved in 50 ml of methanol and purified using a Prep LC / System 500 unit (Waters Associates Inc ,, Milford, Mass.) Using reverse phase high performance liquid chromatography, which is mounted as a stationary phase Prep Pak-500) C & columns. The column was eluted with water / methanol / acetonitrile (25:65:10) at 2 atm. The fractions were analyzed by thin layer chromatography on silica gel plates using a 25:65:10 by volume mixture of water, methanol and acetonitrile as solvent. The product-containing fractions were combined and freeze-dried to give the N-(n-dodecanoyl) -p-aminobenzoyl derivative of parent compound A-30912 H
39. példaExample 39
Az S 31794-F/l alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound S 31794-F / l
100 ml dimetil-formamidban 10,2 mmól S 31794/In 100 ml of dimethylformamide, 10.2 mmol of S 31794 /
F-l alapvegyületet és 10,2 mmól N-(n-dodekanoil)-p-amino-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk, 15 órán át szobahőmérsékleten keveijük a reakcióelegyet. Csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval eltávolítjuk az oldószert, a kapott desztillációs maradékot két alkalommal dietil-éterrel mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott terméket 50 ml metanolban oldjuk, és reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk Prep LC/System 500 egységet használva (Waters Associates Inc., Milford, Mass.), amely Prep Pak-500/CI8 oszloppal (Water Associates Inc.) van felszerelve stacioner fázisként. Az oszlopot víz, metanol és acetonitril 25 65:10 térfoga tara nyű elegyével eluáljuk 2 atm nyomáson. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk, szilikagél lemezeken, oldószer-elegyként víz, metanol és acetonitril 25 65:10 térfogatarányú elegyét használva. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az S 31794/F-l alapvegyület N-(dodekanoil)-p-amino-benzoil-származékát.The parent compound F1 and 10.2 mmol of N- (n-dodecanoyl) -p-aminobenzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester were dissolved and the reaction mixture was stirred at room temperature for 15 hours. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the resulting distillation residue was washed twice with diethyl ether. The washings were discarded. The washed product was dissolved in 50 ml of methanol and purified using a Prep LC / System 500 units of reverse phase high pressure liquid chromatography (Waters Associates Inc., Milford, Mass.), Which is Prep Pak-500 / C I8 column (Waters Associates Inc.) equipped as a stationary phase. The column was eluted with 65:10 (v / v) water, methanol and acetonitrile at 2 atm. The fractions were analyzed by thin layer chromatography on silica gel plates using a 65:10 by volume mixture of water, methanol and acetonitrile as solvent. The product-containing fractions were combined and freeze-dried to give the N- (dodecanoyl) -p-aminobenzoyl derivative of the parent compound S 31794 / F1.
A Debono II-származékok előállítása Az alábbiakban ismertetjük azoknak a III általános képletű vegyületeknek az előállítását, ahol R5 egy V képletű csoport. Ezzel szemléltetjük a III általános képletű vegyületek Debono Il-típusú vegyületeinek előállítását.Preparation of Debono II Derivatives The preparation of compounds of formula III wherein R 5 is a group V is described below. This illustrates the preparation of Debono type II compounds of Formula III.
40. példaExample 40
A pj(n-oktiloxi)-benzoesav előállításaPreparation of Pj (n-octyloxy) benzoic acid
120 ml 10%-os, vizes nátrium-hidroxidban 19,2 g (150 mmól) p-hidroxi-benzoesavat oldunk, az oldatot előzőleg 80 “C-ra melegített, 480 ml térfogatú dimetil-szulfoxidhoz adjuk. Az oldathoz cseppenként 28,95 g (150 mmól) n-oktil-bromidot adunk. 4 órán át szobahőmérsékleten keveijük a reakcióelegyet, amiután 1200 ml jeges vízbe öntjük. 30 ml tömény hidrogén-kloridot adunk az elegyhez, majd addig hagyjuk állni, míg a csapadékképződés teljessé válik, A csapadékot összegyűjtjük, szárítjuk és acetonitril és víz elegyéből kikristályosítjuk. A kapott vegyületDissolve 19.2 g (150 mmol) of p-hydroxybenzoic acid in 120 ml of 10% aqueous sodium hydroxide and add to 480 ml of dimethylsulfoxide, previously heated to 80 ° C. 28.95 g (150 mmol) of n-octyl bromide are added dropwise. After stirring at room temperature for 4 hours, the reaction mixture was poured into 1200 ml of ice water. Concentrated hydrochloric acid (30 ml) was added and the mixture was allowed to stand until the precipitate was complete. The precipitate was collected, dried and crystallized from acetonitrile / water. The product was obtained
-181-181
97-99 °C hőmérsékleten olvad.Melting point 97-99 ° C.
Elemanalízis Ci sH22O3-ra:Elemental analysis for Ci s H 22 O 3 :
számított: C: 71,97, H: 8,86%, mért:C. 71,72, H: 9,10%.Found: C, 71.97; H, 8.86; 71.72, H: 9.10%.
41. példaExample 41
A p-(n-oktiloxi)-benzoesav 2,4,5-triklór-fenil-észterének előállításaPreparation of 2,4,5-trichlorophenyl ester of p- (n-octyloxy) benzoic acid
200 ml metilén-kloridban 6,18 g (24,7 mmól) p-(n-oktiloxi)-benzoesavat, 5,39 g (27,2 mmól) 2,4,5-triklór-fenolt és 4,94 g (24,7 mmól) Ν,Ν -diciklohexil-karbodiimidet oldunk. 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, majd szűrjük. A szűrletet desztilláljuk, a desztillációs maradékként kapott olajat acetonitril és víz elegyéből kikristályosítjuk, amiután megkapjuk a p-(n-oktiloxi)-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert.In 200 mL of methylene chloride, 6.18 g (24.7 mmol) of p- (n-octyloxy) benzoic acid, 5.39 g (27.2 mmol) of 2,4,5-trichlorophenol and 4.94 g of ,7, Ν-Dicyclohexylcarbodiimide (24.7 mmol) was dissolved. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 hours and then filtered. The filtrate was distilled off, and the oil obtained by distillation was crystallized from a mixture of acetonitrile and water to give p- (n-octyloxy) -benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester.
Az előállított vegyület mágneses magrezonancia spektruma a következő: 4,02 (2H, t, J=3Hz), 7,0 (IH, d, .MHz), 7,23 (IH, s), 7,3 (IH, s), 8,08 (IH, d, J=4Hz).Nuclear Magnetic Resonance Spectrum of the prepared compound is 4.02 (2H, t, J = 3Hz), 7.0 (1H, d, .MHz), 7.23 (1H, s), 7.3 (1H, s) ), 8.08 (1H, d, J = 4Hz).
42. példaExample 42
Az A-30912 A alapvegyület acilezéseAcylation of A-30912 A parent compound
150 ml dimetil-formamidban 14,2 g (17,8 mmól) A-30912 A alapvegyületet és 15,32 g (35,1 mmól) p-(n-oktiloxi)-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk. 16—20 órán át keverjük a reakcióelegyet szobahőmérsékleten. Az oldószert csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk, a desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel, és kétszer metilén-kloriddal mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott maradékot 80 ml, etil-acetát és metanol 1:3 arányú elegyében oldjuk, és stacioner fázisként szilikagélt használva, nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk Prep LC/System 500 egységet használva. Az oszlopot lépésenként eluáljuk metanol és etil-acetát 1 A, illetve 23 arányú elegyével. A frakciókat szilikagél (Merck) vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk, oldószer-elegyként etil-acetát és metanol 3:2 térfogatarányú elegyét használjuk. Az A-30912 A alapvegyületet nem tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 7,13 g A-30912 A alapvegyület-p-(n-oktiloxi)-benzoil-származékot kapunk.In 150 ml of dimethylformamide, 14.2 g (17.8 mmol) of the parent compound A-30912 A and 15.32 g (35.1 mmol) of p- (n-octyloxy) benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl are added. ester. The reaction mixture is stirred for 16-20 hours at room temperature. The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was washed twice with diethyl ether and twice with methylene chloride. The washings were discarded. The washed residue was dissolved in 80 mL of ethyl acetate: methanol (1: 3) and purified by silica gel chromatography using a Prep LC / System 500 as the stationary phase. The column was eluted step by step with a mixture of methanol and ethyl acetate (1 A and 23, respectively). Fractions were analyzed by silica gel (Merck) thin layer chromatography (ethyl acetate: methanol = 3: 2, v / v). Fractions containing no parent compound A-30912 A were combined and freeze-dried to give 7.13 g of the parent compound A-30912 A, p-(n-octyloxy) -benzoyl.
♦ 23,1052 (meződeszorpciós tömegspektrometriával).♦ 23.1052 (by field desorption mass spectrometry).
43. példaExample 43
Az A-30912 B alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound A-30912 B
150 ml dimetil-formamidban 17,8 mmól A-30912 B alapevegyületet és 35,6 mmól p-(n-oktiloxi)-benzoesav-2,4,5-trikIór-fenil-észtert oldunk. Az oldatot 16—20 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel, és kétszer metilén-kloriddal mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott maradékot etil-acetát és metanol 1 3 arányú elegyének 80 ml-ében oldjuk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk szilikagélt használva stacioner fázisként Prep LC/System 500 egységet használva. Az oszlopot lépésenként eluáljuk metanol és etil-acetát 1:4, illetve 23 arányú elegyével. A frakciókat, a futtatást etil-acetát és metanol 3:2 térfogatarányú elegyével végezzük. Az A-30912 B alapvegyületet nem tartalmazó frakciókat összegyűljük es fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az A-30912 B alapvegyület p-(n-oktiloxí)-benzoll-származékát.17.8 mmol of the parent compound A-30912 B and 35.6 mmol of p- (n-octyloxy) benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester are dissolved in 150 ml of dimethylformamide. The solution is stirred for 16-20 hours at room temperature and then the solvent is distilled off under reduced pressure. The distillation residue was washed twice with diethyl ether and twice with methylene chloride. The washings were discarded. The washed residue was dissolved in 80 mL of a 1: 3 mixture of ethyl acetate and methanol and purified by high performance liquid chromatography on silica gel using a Prep LC / System 500 stationary phase. The column was eluted stepwise with methanol: ethyl acetate (1: 4 and 23, respectively). The fractions were run on a 3: 2 by volume mixture of ethyl acetate and methanol. Fractions containing no parent compound A-30912 B were collected and freeze-dried to give the p-(n-octyloxy) benzene derivative of parent compound A-30912 B.
44. példaExample 44
Az A-30912 D alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound A-30912 D
150 ml dimetil-formamidban 17,8 mmól A-3091217.8 mmol of A-30912 in 150 ml of dimethylformamide
D alapvegyületet és 35,7 mmól p-(n-oktiloxl)-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk. Az oldatot 16-20 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel, és kétszer metilén-kloriddal mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott maradékot etil-acetát és metanol 13 arányú elegyének 80 ml-ében oldjuk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, szilikagélt használva stacioner fázisként Prep LC/System 500 egységet használva. Az oszlopot lépésenként eluáljuk metanol és etil-acetát 1:4, illetve 2:3 arányú elegyével. A frakciókat szilikagél (Merck) vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk, a futtatást etil-acetát és metanol 3:2 térfogatarányú elegyével végezzük. Az A-30912 D alapvegyületet nem tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az A-30912 D alapvegyület p-(n-oktiloxi)-benzoil-származékát.Basic compound D and 35.7 mmol of p- (n-octyloxyl) -benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester were dissolved. The solution was stirred for 16-20 hours at room temperature and then distilled under reduced pressure to remove the solvent. The distillation residue was washed twice with diethyl ether and twice with methylene chloride. The washings were discarded. The washed residue was dissolved in 80 mL of a 13% ethyl acetate / methanol mixture and purified by high performance liquid chromatography (silica gel, Prep LC / System 500 as stationary phase). The column was eluted stepwise with methanol / ethyl acetate 1: 4 and 2: 3, respectively. Fractions were analyzed by silica gel (Merck) thin layer chromatography (3: 2 ethyl acetate: methanol). Fractions containing no parent compound A-30912 D were collected and freeze-dried to give the p-(n-octyloxy) benzoyl derivative of parent compound A-30912 D.
45. példaExample 45
Az A-30912 H alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound A-30912 H
150 ml dimetil-formamidban 17,8 mmól A-3091217.8 mmol of A-30912 in 150 ml of dimethylformamide
H alapvegyületet és 35,7 mmól p-(n-oktiloxi)-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk. Az oldatot 16—20 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel, és kétszer metilén-kloriddal mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott maradékot etil-acetát és metanol 13 arányú elegyének 80 ml-ében oldjuk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, szilikagélt használva stacioner fázisként Prep LC/System 500 egységet használva. Az oszlopot lépésenként eluáljuk metanol és etil-acetát 1:4, illetve 23 arányú elegyével. A frakciókat szilikagél (Merck) vékony-réteg-kromatográfiával analizáljuk, a futtatást etil-acetát és metanol 3:2 térfogatarányú elegyével végezzük. Az A-30912 H alapvegyületet nem tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk az A-30912 H alapvegyület p-(n-oktiloxi)-benzoil-származékát.The parent compound H and 35.7 mmol of p- (n-octyloxy) -benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester were dissolved. The solution is stirred for 16 to 20 hours at room temperature and then the solvent is distilled off under reduced pressure. The distillation residue was washed twice with diethyl ether and twice with methylene chloride. The washings were discarded. The washed residue was dissolved in 80 mL of a 13% ethyl acetate / methanol mixture and purified by high performance liquid chromatography using silica gel using a Prep LC / System 500 as the stationary phase. The column was eluted stepwise with methanol: ethyl acetate (1: 4 and 23, respectively). The fractions were analyzed by silica gel (Merck) thin layer chromatography (3: 2 ethyl acetate: methanol). Fractions containing no parent compound A-30912 H were collected and freeze-dried to give the p-(n-octyloxy) benzoyl derivative of parent compound A-30912 H.
46. példaExample 46
Az S 31794/F-l alapvegyület acilezéseAcylation of parent compound S 31794 / F-l
150 ml dimetil-formamidban 17,8 mmól S 31794/17.8 mmol of S 31794 in 150 ml of dimethylformamide /
F-l alapvegyületet és 35,7 mmól p(n-oktiloxi)-benzoesav-2,4,5-triklór-fenil-észtert oldunk. Az oldatot 16—20 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékot kétszer dietil-éterrel, és kétszer metilén-kloriddal mossuk. A mosófolyadékokat kiöntjük. A mosott maradékot etil-acetát és metanol 13 arányú elegyének 80 ml-ében oldjuk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, szilikagélt használtva stacioner fázisként Prep LC/System 500 egységet használva. Az oszlopot lépésenként eluáljuk metanol és etil-acetát 1:4, illetve 23 arányú elegyével. A frakciókat szilikagél (Merck) vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk, a futtatást etil-acetát és metanol 3:2 térfogatarányú elegyével végezzük. Az S 31794/F-l alapvegyületet nem tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk, amiutánThe parent compound F-1 and 35.7 mmol p (n-octyloxy) benzoic acid 2,4,5-trichlorophenyl ester were dissolved. The solution is stirred for 16 to 20 hours at room temperature and then the solvent is distilled off under reduced pressure. The distillation residue was washed twice with diethyl ether and twice with methylene chloride. The washings were discarded. The washed residue was dissolved in 80 mL of a 13% ethyl acetate / methanol mixture and purified by high performance liquid chromatography using silica gel using a Prep LC / System 500 as the stationary phase. The column was eluted stepwise with methanol: ethyl acetate (1: 4 and 23, respectively). Fractions were analyzed by silica gel (Merck) thin layer chromatography (3: 2 ethyl acetate: methanol). Fractions containing no parent compound S 31794 / F-1 were collected and freeze-dried.
-191-191
185.021 megkapjuk az S 31794/E-l alapvegyület pfn-oktiloxi)-benzoi]-szárniaz.ékát.185.021 gives p-n-octyloxy) -benzoyl] -hydrous salt of parent compound S 31794 / E-1.
47. példa 5Example 47 5
A III. általános képletű vegyületek gombaellenes aktivátását in vitro standard korongdiffúziós módszerrel és agarhígításos módszerrel mutatjuk ki, továbbá in vivő standard, egereken vizsgált szisztémás, gombás fertőzések megszüntetésével. A következő, 4—8. táblázatokban megadjuk a III. általános képletű né- '0 hány vegyület gombaellenes hatásának vizsgálti eredményeit.In III. The antifungal activity of the compounds of Formula I is detected in vitro by standard disk diffusion method and agar dilution method, and by elimination of in vivo standard systemic fungal infections in mice. The following sections 4-8. Tables III. some compounds of formula (I) are tested for antifungal activity.
A IV, és V. táblázatban megadjuk a 36., 44. és 52. példákban ismertetett vegyületek agarlemezen, korongdiffúziós módszerrel kapott in vilro eredményeit.Tables IV and V show in vivo results of the compounds described in Examples 36, 44 and 52 on agar plates by disk diffusion.
A IV. táblázatban közölt adatokat úgy kaptuk, hogy a vizsgált vegyület által a mikroorganizmus növekedés-gátlása révén okozott gátlási zónák nagyságát olvassuk le mm-ben. Az V. táblázatban az aktivitást a legkisebb növekedésgátló koncentrációval határoztuk meg Gug/korong), amely azt a koncentrációt jelenti, 20 amely szükséges a vizsgált mikroorganizmus növekedés-gátlásához.The IV. The data presented in Table II are obtained by plotting the magnitude of the zones of inhibition caused by the test compound by inhibiting the growth of the microorganism in mm. In Table V, activity is determined by the lowest growth inhibitory concentration (Gug / disk), which is the concentration required to inhibit the growth of the test microorganism.
A VI. táblázat adatai a p-(n-oktiloxi)-benzoil-A-30912 A alapvegyület in vitro vizsgálati eredményeit jelenti öt Candida albicans mikroorganizmussal szemben. A vizsgálatokat agarhígításos módszerrel végez- 25 tűk. A VI. táblázat aktivitásait a legkisebb növekedésgátló koncentrációban határoztuk meg (pg/ml), ez a koncentráció szükséges a vizsgált mikroorganizmus növekedés-gátlásához.VI. The data in Table III are the results of in vitro assays of p- (n-octyloxy) -benzoyl-A-30912 A parent compound against five microorganisms of Candida albicans. The assays were performed using the agar dilution method. VI. The activities of Table II are determined at the lowest growth inhibitory concentration (pg / ml) required to inhibit the growth of the test microorganism.
A VII. táblázatban megadjuk a találmány szerinti vegyületek in vivő vizsgálat során meghatározott ha- ^0 tásosságát Candida albicans A-26 mikroorganizmussal fertőzött egerekben, ahol az aktivitást EDjn-értékben adjuk meg rnk/kg anyagmennyiség, amely ahhoz szükséges, hogy az állatok 50%-a kigyógyuljon). Ahol nem kaptuk meg az ED^-értéket, úgy az aktivitást abban θθ a legalacsonyabb dózisban adjuk meg, amely szükséges ahhoz, hogy jelentős gombaellenes hatás következzen be. A vizsgálat során hím albínó egereket használtunk, ezek patogénmentes állatok, súlyuk 18 g és 20 g között változik. A Candida albicans Α-26-tal való fertőzést intravénásán végeztük, A fertőzés előtt 24 órával az állatokat körülbelül 50 röntgen per perc sugárzásnak vetettük alá 8 percen át (összesen 400 röntgen), a fertőző organizmussal szemben fellépő immunválasz csökkentésére. A fertőzést követő 0.,4. és 24. órában mindegyik csoportnak emelkedő dózisú, vizsgálandó vegyületet adagoltunk szubkután 33%os polietilén-glikol és víz szuszpenziójában. Mindegyik állat halálát feljegyeztük. A Student-féle t-statisztikai összehasonlítást elkészítettük a pusztulásátlagos napjára vonatkozóan egy adott dózis-értéken mindegyik fertőzött és kezelt állatcsoport esetén 10 fertőzött, és nem kezelt állattal összehasonlítva annak az érdekében, hogy eldönthessük, a kezelés szignifikánsan megnöveli-e a túlélést?VII. Table I shows the in vivo efficacy of the compounds of the invention in mice infected with Candida albicans A-26, where the activity is expressed as EDjn / kg amount of material required to recover 50% of the animals. ). Where no ED ^ value is obtained, the activity is given at the lowest dose θθ necessary to produce a significant antifungal activity. Male albino mice, which are pathogen-free animals and weigh between 18 g and 20 g, were used in the study. Infection with Candida albicans Α-26 was performed intravenously. Twenty-four hours prior to infection, the animals were exposed to approximately 50 X-rays for 8 minutes (400 X total) to reduce the immune response to the infectious organism. 0, 4 after infection. and at 24 hours, each group was dosed with an increasing dose of the test compound in a 33% polyethylene glycol / water suspension subcutaneously. The deaths of each animal were recorded. Student t-statistic comparisons were made for mean daily mortality at a given dose level for each infected and treated animal group compared to 10 infected and untreated animals to determine whether treatment significantly increases survival?
A Vili. táblázatban megadjuk a találmány szerinti vegyületek orális adagolásakor megfigyelhető felszívódást. Ebben a vizsgálatban az egereket 416 mg/kg-os dózisokkal kezeltük, a vizsgált vegyületek 33%-os polietlén-glikol 400, és víz elegyében szuszpendáltuk. Bizonyos időközönként vérmintákat vettünk az orbitális szinuszból, és meghatároztuk a minták antibiotikus aktivitását. Ezt a következőképpen csináltuk: 20 pl teljes vért tartalmazó 7 ml átmérőjű korongot helyeztünk agarra, amelyet előzőleg Aspergillus montevidensis A35137 mikroorganizmussal fertőztünk. 40 órás inkubációt köveiően — az inkubáció 30 °C hőmérsékleten történt — a vérmintából adódó gátlási zónát meghatároztuk, és összehasonlítottuk a vizsgált vegyület standardja által kapott gátlási zónákkal. Ezután kiszámítottuk a vérminta hatóanyag-tartalmát.The Vili. Table IV shows the absorption observed upon oral administration of the compounds of the invention. In this study, mice were treated with doses of 416 mg / kg, the test compounds were suspended in 33% polyethylene glycol 400, and water. At intervals, blood samples were taken from the orbital sinus and the samples were determined for antibiotic activity. This was done as follows: 20 µl of whole blood disc of 7 ml diameter was placed on agar previously infected with Aspergillus montevidensis A35137. Following a 40 hour incubation at 30 ° C, the inhibition zone from the blood sample was determined and compared to the inhibition zones obtained by the test compound standard. The drug content of the blood sample was then calculated.
IV. TáblázatARC. Spreadsheet
Az A-30912 A alapvegyület-származékainak agarlemez-korong-diffúziós módszerrel — ~ meghatározott gombaellenes aktivitásaAgar plate disc diffusion assay for parent compound A-30912 A - ~ antifungal activity
A gátlási zóna nagysága mm-ben ®The size of the inhibition zone in mm ®
Példa A III általános képletű -------------—--Example The formula -------------—-- of formula III
x = Mérhető és jól elkülönülő gátlási zóna, a korong körül a mikroorganizmus újra nő. x = A measurable and well-defined inhibition zone, the microorganism growing again around the disk.
» A vizsgálatokat úgy végeztük, hogy 1 mg/ml koncentrációjú metanolos szuszpenzióba 7 mm átmérőjű korongokat merítettünk, majd ezekezet az agar felületére helyeztük.The assays were carried out by immersing discs of 7 mm diameter in a methanol suspension of 1 mg / ml and placing them on the agar surface.
Inkubációs idő: 24-48 óra, 25-37 °C hőmérsékleten.Incubation time: 24-48 hours at 25-37 ° C.
-201-201
185.021185 021
V, TáblázatV, Table
Az A-30912 A alapvegyület származékainak agarlemez-diffúziós módszerrel meghatározott gombaellenes aktivitásaAntifungal activity of derivatives of parent compound A-30912 A as determined by agar plate diffusion method
Legkisebb növéKélésgátló koncentráció (mg/koron)x Minimum growth inhibitory concentration (mg / kroon) x
x = A vegyületeket 7,5 pH-jú 0,01 mólos nátrium-borát oldatban szuszpendáljuk. A Vegyületeket úgy vizsgáljuk, hogy csúcsértékben 20 mg/korong koncentrációt érünk el, majd kétszeres hítítási sorókát készítünk mindaddig, míg a végpontot elérjük. Az inkubációs idő: 24 óra, 30 °C hőmérsékleten. x = The compounds are suspended in 0.01 M sodium borate, pH 7.5. Compounds are assayed to reach peak concentrations of 20 mg / disc and then double-folded until the end point is reached. Incubation time: 24 hours at 30 ° C.
xx = 5-izolátummal szemben. xx = 5 isolate.
VI, TáblázatTable VI
Az A-30912 A alapvegyület, ahol R5 egy V képletű csoport in vitro aktivitása Candida albicans törzsekkel szembenThe parent compound A-30912 A, wherein R 5 is the in vitro activity of a group of Formula V against Candida albicans
VII. TáblázatVII. Spreadsheet
Az A-30912 A alapvegyület származékainak terápiás aktivitása C. albicans mikroorganizmussal szemben, egérbenTherapeutic activity of derivatives of parent compound A-30912 A against C. albicans in mouse
x = Dózisterv: 40, 20 15 és 10 mg/kg, B = 80, 40, 20 és 10 mg/kg. A Dózisokat szuszpenziókat adtuk 30%-os polietilén glükol-víz-elegyben 0, 4 és 24 órával az injekció után. A vizsgált vegyületeket minden dózis-érték mellett csoportonként 6 egér kapta. A kontroll (nem kezelt egerek számra csoportonként 10. x = Dose plan: 40, 20, 15 and 10 mg / kg, B = 80, 40, 20, and 10 mg / kg. Doses were administered as suspensions in 30% polyethylene glycol-water at 0, 4 and 24 hours post injection. Test compounds were administered to each group of 6 mice at each dose level. Control (10 untreated mice per group).
xx = A kezelt állatok túlélési idejének kontrollal szembeni növekedése, amit Reed és Muench szerint határozuk meg (Amer. J. Hygiene, 27,493, 1938). xx = Increase in Survival Time of Treated Animals versus Control as determined by Reed and Muench (Amer. J. Hygiene, 27,493, 1938).
-211-211
185.021185 021
Vili, táblázatVili, table
Az A-30912 A alapvegyület származékainak vérszintje egerekben, orális adagolást követőenBlood levels of A-30912 A parent compound in mice following oral administration
határoztuk meg, a dózis 416 mg/kg, a vegyületet 33%-os polietilén-güko; 400 és víz elegyével készült szuszpenzióban adagoljuk. A vegyidet menynyiségét Aspergillus montevidensis Λ-35137 törzszsel végzett biológiai érték-méréssel határozzuk meg.the dose was 416 mg / kg, the compound was 33% polyethylene glycol; 400 and water. The amount of the compound was determined by biological measurement with Aspergillus montevidensis strain Λ-35137.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10301779A | 1979-12-13 | 1979-12-13 | |
US10326879A | 1979-12-13 | 1979-12-13 | |
US10312179A | 1979-12-13 | 1979-12-13 | |
US10331379A | 1979-12-13 | 1979-12-13 | |
US10301679A | 1979-12-13 | 1979-12-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU185021B true HU185021B (en) | 1984-11-28 |
Family
ID=27537047
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU298380A HU185021B (en) | 1979-12-13 | 1980-12-12 | Process for the preparation of cyclic hexapeptides |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
HU (1) | HU185021B (en) |
-
1980
- 1980-12-12 HU HU298380A patent/HU185021B/en unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5166135A (en) | Method for the control of pneumocystis carinii | |
CA1333150C (en) | Method for the control of pneumocystis carinii | |
US4287120A (en) | Derivatives of S31794/F-1 nucleus | |
US4293482A (en) | A-30912A Nucleus | |
CA1300536C (en) | Process for antifungal fermentation product and culture | |
US4320052A (en) | Derivatives of A-30912A nucleus | |
US4320053A (en) | Derivatives of A-30912D nucleus | |
KR840000769B1 (en) | Cyclic peptide nuclei | |
CA1183127A (en) | Process for the preparation of derivatives of cyclic peptide nuclei | |
US4293485A (en) | Derivatives of S31794/F-1 nucleus | |
CA1182812A (en) | Process for the preparation of derivatives of cyclic peptide nuclei | |
US4293491A (en) | Derivatives of A-30912H nucleus | |
US4293488A (en) | Derivatives of A-30912B nucleus | |
CA1156218A (en) | Antibiotic a-30912 factor h | |
AU8926198A (en) | Novel lantibiotic related to actagardine, and processes for the preparation and use thereof | |
US4293487A (en) | Derivatives of A-30912D nucleus | |
CA1159450A (en) | Process for the preparation of derivatives of cyclic peptide nuclei | |
HU185021B (en) | Process for the preparation of cyclic hexapeptides | |
US5891851A (en) | Antibiotic, feglymycin, processes for its preparation and its use | |
US6221844B1 (en) | Antifungal peptides from scleroderma texense | |
CA2393518C (en) | Amycomycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical | |
JPH0238600B2 (en) | ||
US20020065316A1 (en) | Citrullimycines, a process for their production and their use as pharmaceuticals | |
IE50615B1 (en) | Cyclic peptide nuclei and method of obtaining them by enzymatic deacylation of cyclic peptide antibiotics |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 |