KR840000769B1 - 환상 펩티드핵의 제조방법 - Google Patents

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환상 펩티드핵의 제조방법

제1도 A-30912 A핵의 적외부 흡수 스펙트럼.

본 발명은 다음 일반식 (Ⅰ)의 환상 펩티드핵 및 그의 산부가염의 제조방법에 관한 것이다.

상기의 핵 및 그 염은 반-합성 항진균제 제조의 중간체로 유용하다.

상기의 핵은 다음 일반식 (Ⅱ)의 환상 펩티드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다.

상기식에서, R은 포화되거나 불포화된 지방산 측쇄이고,R¹,R²,R³및 R⁴는 하기에서 정의할 치환기이다. 지방산 측쇄 R을 효소적 처리에 의해 제거되어 환상 펩티드핵을 생성하는 방법을 발명하게되었다. 그 방법은 항생물질을 탈아실화가 거의 완결될때까지 수성매질 중에서 악티노플라나세과 미생물이 생성하는 효소에 노출시키는 것이다.

본 발명의 바람직한 방법은 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052 미생물이 생성한 효소를 사용하여 지방산 측쇄를 떼어내는 것이다. 탈아실화는 통상적으로 적절한 항생물질을 에이. 유타엔시스 배양액에 가해, 탈아실화가 완결될 때까지 배양시켜 이루어진다. 그와 같이 하여 수득한 핵을 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 분리한다. 이들핵은 재아실화되어 신규 항생물질을 생성할 수 있는 점에서 유용하다.

특히 본 발명은 다음 일반식(Ⅰ)의 환상 펩티드핵 및 그의 산부가염의 제조방법을 제공한다.

상기식에서

R¹은 H 또는 OH인데,

R¹이 H이면 R²는 H이고 R³및 R⁴는 모두 H거나 모두 OH이고,

R¹이 OH이면 R²는 H이고, R³는 OH 또는 C₁-C₆알킬옥시이고,

R⁴는 OH이거나 R²는

이고, R³및 R⁴는 모두 OH이다.

본 발명 핵의 한 태양(態樣)은 R¹,R³및 R⁴가 OH이고 R²는 H인 경우이다. 이러한 핵은 A-30912 A핵으로 알려져 있다. A-30912핵은 R이 리놀레오일, 스테아로일 또는 팔미토일이고, R¹,R²,R³및 R⁴A-30912 A핵과 같은 일반식 (Ⅱ)의 환상 펩티드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다.

일반식 (Ⅱ)의 환상 펩티드 항생물질의 R이 리놀레오일인 경우, A-30912인자 A라 하고, R이 스테아로일인 경우 테트라하이드로-A-30912인자 A라하고 R이 팔미토일인 경우 아큘리신 A라 한다.

[A-30912 인자 A]

A-30912인자 A는 A외에 인자 B,C,D,E,F 및 G도 함유하는 A-30912혼합물의 한인자이다. A-30912혼합물 및 A부터 G까지의 개별적 인자는 미국특허 제4,024,245호에 Marvin M. Hoehn 및 Karl H. Michel에 의해 기술되어 있다.

A-30912인자 A는 미국특허 제4,024,246호에 Calvin E. Higgens 및 Karl H.Michel에 의해 기술된 항생물질 A-22082와 동일하다. 미국특허 제4,024,245호 및 4,024,246호이래로, A-30912인자 A가 항생물질 에키노칸딘 B［참조:F. Beng et al., Helv Chim. Acta 57,2459-2477 (1974) 및 스위스특허 제568,386호］와 동일함이 밝혀졌다. 또한 항생물질 SL7810/F는 에키노칸딘 B [C.Keller Juslen et al., Tetrahedron Letters 1976(46), 4147-4150 및 벨기에 특허 제834,289호]와 동일함이 밝혀졌다.

Keller-Juslen등은 R이 리놀레오일이고, R¹,R³및 R⁴가 OH이고,R²가 H인 일반식 구조를 항생물질 A-30912인자 A의 구조로 제안하였다.

[테트라하이드로-A-30912인자A]

벨기에 특허 제834,289호 및 F. Benz et al.에 의해 Helv. Chim. Acta 57,2459-2477(1974)에 기술된 테트라하이드로-A-30912인자 A(테트라하이드로-SL 7810/F : 테트라하이드로에키노칸딘 B)는, R이 스테아로일이고,R¹,R³및 R⁴가 OH이고 R²가 H인 일반식 (Ⅱ)의 구조를 갖는다. 편의상 이물질은 테트라하이드로-A-30912 A라 한다.

[아클리신 A]

아클리신 A는 한주성분(아클리신 A) 및 여섯가지 부성분(아클리신 B,C,D,E,F 및 G)으로 이루어진 아클리신 혼합물의 한성분이다. 아클리신 성분은 미국특허 제3,978,210호에 K.Mizuno등에 의해 기술되어 있다. 벨기에 특허 제859,067호에 기술되어 있듯이 아클리신 A는 스테아로일 측쇄가 팔미토일로 치환된 것을 제외하고는 테트라하이드로-A-30912 A와 동일한 환상펩티드 구조를 갖는 것으로 생각된다.

[A-30912 A핵]

본 태양의 신규 환상펩티드핵, 즉 A-30912인자 A의 핵(에키노칸딘 B,SL 7810/F), 테트라하이드로-A-30912인자 A, 및 아클리신 A는 R¹,R³및 R⁴가 OH이고, R²가 H인 일반식(Ⅰ)의 구조를 갖는다. 이 핵(A-30912 A핵)은 물,디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 메탄올 같은 용매에 용해되며, 클로로포름, 톨루엔 및 디에틸에테르 같은 용매에 불용성인 백색의 무정형물질이다.

A-30912 A핵은 C₃₄H₅₁N₇O₁₅의 실험식으로 나타내며 분자량은 797.83이다. KBr디스크법으로 구한 A-30912 A핵의 적외부 흡수 스펙트럼이 제1도이다.

흡수극대는 다음과 같다 :3340브로드(OH,H-결합), 2970,2930 및 2,890(지방족 CH₅,CH₂,CH 그룹에서의 CH스트레치),1660 및 1625(수개의 카보닐 C=0), 1510-1550, 1430-1450(CH 웨그) 1310-1340, 1230-1260, 1080, 835, 650브로드, 550브로드(㎝^-1).

66% 수성 디메틸포름아미드중 A-30912 A핵의 전위차 적정으로 pka값이 약 7.35(초기 pH 7.32)인 적정가능한 그룹의 존재를 알게 된다. A-30912 A핵은 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)로 분리할수 있다. A-30912 A핵을 다음조건의 HPLC에 의해 분리할 때 대략적인 체류시간(K｀)은 11.52분이다.

[A-30912 A핵의 제조]

[기질의 제조]

본 발명의 A-30912 A핵은 A-30912인자 A, 테트라하이드로-A-30912인자 A 또는 아클리신 A로부터 제조할 수 있다. 이들 기질은 정제물로 공급하기도 하나, 반드시 정제되어야 할 필요는 없다. 따라서 A-30912인자 A가 주성분인 A-30912혼합물을, A-30192 A핵을 제조하기 위한 기질로 사용해도 된다.

[A-30912인자 A]

A-30912인자 A는 다음 균주의 심부혐기성 배양에 의해 제조할 수 있다.

1) 아스페르길루스 루룰로수스 NRRL 8113 균주:

2) 아스페르길루스 니두란스 NRRL 8112 균주 :

3) 아스페르길루스 니두란스 변종 에키눌라투스 A-32204, NRRL 38060,

4) 아스페르길루스 루룰로수스 NRRL 8039 :

5) 아스페르길루스 니두란스 변종로세우스 NRRL 11440.

에이. 니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440균주를 사용하여 A-30912인자 A를 제조할때,인자혼합물이 수득되는데, 편의상 이를 A-42355항생물질 혼합물이라 한다. A-30912인자 A가 A-12355 항생물질 혼합물의 주인자이다. A-30912인자 B,D 및 H가 그 부인자이다.

[테트라하이드로-A-30912A]

테트라하이드로-A-30912 A를 A-30912인자 A로부터 표준 수소화법에 의해 리놀레오일 측쇄의 두 개의 이중결합을 모두 환원시켜 제조한다.

[아클리신 A]

아클리신 A는 참조문헌으로 인용한 미국특허 제3,978,210호에 기술된 아스페르길루스 아클리투스 NRRL 8075균주를 배양하여 제조한다.

본 발명 핵의 다른 태양은 R¹및 R²가 모두 H이고, R³및 R⁴가 모두 OH인 경우이다. 이러한 핵을 A-30912 B핵이라 한다. A-30912 B핵은 R이 리놀레오일 또는 스테아로일이고, R¹,R²,R³및 R⁴가 A-30912 B핵과 동일한 일반식(Ⅱ)의 환상 펩티드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다.

일반식 (Ⅱ)의 환상 펩티드 항생물질의 R이 리놀레오일인 경우를 A-30912인자 B라 하고, R이 스테아로일인 경우를 테트라하이드로-A-30912인자 B라 한다.

[A-30912인자 B]

A-30912인자 B는 B외에 인자 A,C,D,E,F 및 G를 함유하는 A-30912혼합물의 한 인자이다. A-30912혼합물은 미국특허 제4,024,245호에서 Marvin M. Hoehn 및 Karl H. Michel 이 기술하고 있다. A-30912인자 B가 항생물질 에키노칸딘 C(참조 : R.Traber et al., Holv Chim. Acta. 62, 1252-1267(1979) 및 항생물질 S L 7810/F-Ⅱ(벨기에 특허 제834,289호)와 동일함이 밝혀졌다. Traber등은 R¹및 R²가 모두 H이고 R³및 R⁴가 모두 OH 이고, R이 리놀레오일인 일반식(Ⅱ)구조를 항생물질 에키노칸딘 C의 구조로 제안되었다. Traber등은 또한 항생물질 테트라하이드로에키노칸딘 C의 구조로 R¹및 R²가 모두 H이고, R³및 R⁴가 모두 OH이고, R이 스테아로일인 일반식 (Ⅱ)구조를 제안하였다.

[테트라하이드로-A-30912인자 B]

벨기에 특허 834,289호에 기술되어 있으며, Traber등이 Helv. Chim. Acta.62, 1252-1267(1979)에 기술하고 있는 테트라하이드로-A-30912인자 B(테트라하이드로-S L 7810/F-Ⅱ:테트라하이드로에키노칸딘 C)는 R¹및 R²가 모두 H이고 R³및 R⁴가 모두 OH이고, R이 스테아로일인 일반식 (Ⅱ)의 구조를 갖는다. 편의상,이를 테트라하이드로-A-30912 B로 하기로 한다.

[A-30912 B핵]

본 태양의 신규 환상펩티드핵, 즉 A-30912인자 B핵 및 테트라하이드로-A-30912 B의 핵은 R¹및 R²가 H이고 R³및 R⁴가 모두 OH인 일반식 (Ⅰ)구조를 갖는다. A-30912 B핵은 실험식 C₃₄H₅₁N₇O₁₄로 나타내며 분자량은 781.83이다.

[A-30912 B핵의 제조]

[기질의 제조]

A-30912 B핵은 A-30912인자 B또는 테트라하이드로-A-30912 B로부터 제조할 수 있다. A-30912인자 B는 그것이 함유된 항생물질 혼합물의 주성분이 아니므로, 기질로 사용하기 전에 다른 공존인자를 제거 정제해야 한다.

[A-30912인자 B]

A-30912인자 B는 다음균주의 심부혐기성 배양에 의해 제조할 수 있다.

1) 아스페르길루스 루굴로수스 NRRL 8113균주,

2) 아스페르길루스 니두란스 변종 에키놀라투스 A 32204, NRRL 3860균주

3) 아스페르길루스 루굴로수스 NRRL 8039균주,

4) 아스페르길루스 니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440균주

에이. 니드란스 변종 로세우스 NRRL 11440균주를 사용해 A-30912인자 B를 제조할 때, 인자 혼합물이 수득되는데 편의상 이를 A-42355 항생물질 혼합물이라 한다. A-30912인자 A가 그 주인자이고, A-30912인자 B,D 및 H가 부인자이다.

[테트라하이드로-A-30912 B]

테트라하이드로-A-30912 B는 표준 수소화법에 의해 리놀레오일 측쇄의 두 이중결합이 모두 환원될때까지의 반응시켜 A-30912인자 B로부터 제조한다.

본 발명의 또 다른 태양은 R¹,R²,R³및 R⁴가 각각 H인 경우이다. 이러한 핵을 A-30912 D핵이라한다. A-30912 D핵은 R이 리놀레오일 또는 스테아로일이고, R¹,R²,R³및 R⁴가 모두 H인 일반식(Ⅱ)의 환상펩티드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다.

일반식 (Ⅱ)의 환상펩티드 항생물질의 R이 리놀레오일인 경우, 이 항생물질을 A-30912인자 D라 하고, R이 스테아로일인 경우 테트라하이드로-A-30912인자 D라 한다.

[A-30912인자 D]

A-30912인자 D는 D외에도 인자 A,B,C,D,E,F 및 G를 함유하는 A-30912혼합물의 한인자이다. A-30912혼합물은 Marvin M. Hoehn 및 Karl H. Michel이 미국특허 제4,024,245호에서 기술하고 있다. A-30912인자 D는 항생물질 에키노칸딘 D [참조:R.Traber등이 Helv. Chim. Acta.62, 1252-1267(1979)] 및 항생물질 S L 7810/F-II (벨기에 특허 제834,289)와 동일함이 밝혀졌다.

Traber등은 R¹,R²,R³및 R⁴가 각각 H이고, R이 리놀레오일인 일반식(Ⅱ)구조를 항생물질 에키노칸딘 D의 구조로 제안하였다. 또한 그들은 항생물질 인테트라하이드로에키노칸딘 D의 구조로는, R¹,R²,R³및 R⁴가 각각 H이고, R이 스테아로일인 일반식 (Ⅱ)구조를 제안하였다.

편의상, 테트라하이드로-A-30912인자 D(테트라하이드로- S L 7810/F-Ⅲ; 테트라하이드로에키노칸딘 D)를 테트라하이드로-A-30912D로 하기로 한다.

[A-30912 D핵]

본 태양의 신규 환상펩티드 핵, 즉 A-30912인자 D(에키노칸딘 D, SL 7819/F-Ⅲ) 및 테트라하이드로-A-30912 D의 핵의 구조는 R¹,R²,R³,R⁴가 각각 H인 일반식 (Ⅰ)로 나타낸다. A-30912 D핵은 실험식 C₃₄H₅₁N₇O₁₂으로 나타내며 분자량은 749.83이다.

[A-30912 D핵의 제조]

[기질의 제조]

A-30912 D핵은 A-30912인자 D 또는 테트라하이드로-A-30912 D로부터 제조할 수 있다. A-30912인자 D는 그것이 제조 함유된 항생물질 혼합물의 주성분이 아니므로, 기질로 사용하기 전에 다른 공존인자를 제거 정제해야 한다.

[A-30912인자 D]

A-30912인자 D는 다음 균주의 심부혐기성 배양에 의해 제조할 수 있다.

1) 아스페르길루스 루굴로수스 NRRL 8113균주,

2) 아스페르길루스 니두란스 변종 에키눌라투스A 32204,NRRL 3860균주,

3) 아스페르길루스 루굴로수스 NRRL 8039 균주,

4) 아스페르길루스 니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440균주.

에이. 니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440 균주를 사용해 A-30912인자 D를 제조할 때, 인자 혼합물이 수득되는데 편의상 이를 A-42355항생물질 혼합물이라 한다. A-30912인자 A가 그 주인자이고 A-30912인자 B,D 및 H가 부인자이다.

[테트라하이드로-A-30912 D]

테트라하이드로-A-30912 D는 표준수소화법에 의해 리놀레오일 측쇄의 두 이중결합이 모두 환원될 때까지 반응시켜 A-30912인자 D로부터 제조한다.

본 발명의 또 다른 태양은 R¹및 R⁴가 모두 OH이고 R²는 H이고, R³는 C₁-C₆알킬옥시인 경우이다. 이핵을 A-30912 H-형 핵이라 한다. A-30912 H-형핵은 R이 리놀레오일 또는 스테아로일이며, R¹,R²,R³및 R⁴가 A-30912 H-형핵과 같은 일반식(Ⅱ)의 환상펩티드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다. 일반식(Ⅱ)의 R이 리놀레오일이고, R³가 메톡시인 경우 이 항생물질을 A-30912인자 H라 하며, R이 스테아로일이고, R³가 메톡시인 경우, 테트라하이드로-A-30912인자 H라 한다.

일반식 Ⅱ 의 R이 리놀레오일이고, R³가 C₂-C₆알킬옥시인 경우, 이 항생물질은 A-30912인자 H의 저급알킬옥시 동족체라 하며, R이 스테아로일이고, R³가 C₂-C₆알킬옥시인 경우는, 테트라하이드로-A-30912인자 H의 저급알킬옥시 동족체라 한다.

[A-30912인자 H]

A-30912인자 H는 H외에도 인자 A,C,D,E,F 및 G를 함유하는 A-30912 혼합물의 한인자이다. A-30912혼합물은 Marrin M.Hoehn 및 Karl. H. Michel에 의해 미국특허 제4,024,245호에 기술되어 있다. A-30912인자 H는 늦게 발견된 A-30912인자이다. A-30912인자 H는 1980년 2월 1일 출원되어 계류중인 항생물질 A-30912인자 H란 제목의 Karl. H Michel의 특허원 제117,739호에 기술되어 있는데 이특허원은 1979년 6월 8일 출원되어 포기된 특허원 제46,875호의 연속출원이다.

[A-30912인자 H의 동족체]

A-30912인자 H의 구조가 밝혀짐에 따라, A-30912인자 H의 저급알킬옥시 동족체가 유용한 생성물이라는 사실이 인식되었다. 이전에는 제조된 알킬옥시유도체가 유용한 용도를 갖는다고 인정되지 못했으며 구조결정수단으로써만 제조하였다. A-30912인자 H의 저급 C₂-C₆알킬옥시동족체를 A-30912인자 A로부터 제조한다. A-30912인자 A는 다음 균주의 배양에 의해 제조할 수 있다.

1) 아스페르길루스 루굴로수스 NRRL 8113균주,

2) 아스페르길루스 니루란스 NRRL 8112균주,

3) 아스페르길루스 니두란스 변종 에키눌라투스 A-32204, NRRL 3860균주,

4) 벨기에 특허 제834,289호에 기술된 바와 같은 아스페르길루스루글로수스 NRRL 8039균주 또는,

5) 아스페르길루스 니두란스 변종 로세우스, NRRL 11440균주.

각각의 A-30912 H핵에는 아미노기가 함유되어 있으므로, 핵은 염형태로 존재할 수 있다. 그러한 염은 중간체 및 정제목적을 위해 유용하다. A-30912 H핵의 약학적으로 무독한 염이 특히 유용한데, 최종 생성물의 정제과정이 단축되기 때문이다. “약학적으로 무독한” 염은 온혈동물에 대한 생성물의 독성을 전체로서 증가 시키지 않는 염을 말한다. A-30912 H핵의 산부가염은 무기 또는 유기산으로부터 표준반응법에 의해 생성할 수 있다.

대표적인 무기 및 유기산에는 염산, 브롬산, 요드산, 황산, 인산, 아세트산, 벤조산, 설팜산, 타타르산, 시트르산, 말레산, 숙신산, 아스코르빈산, 글리콜산, 락트산,푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 뮤스산, D-글루탐산, d-캄포산, 글루타르산, 프탈산, 라우르산,스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 신남산등이 포함된다 :

[A-30912 H핵의 제조]

[기질의 제조]

R¹및 R⁴가 모두 OH이고 R²가 H이며, R³가 메톡시인 일반식 (Ⅰ)화합물,A-30912 H핵은 A-30912인자 H 또는 테트라하이드로-A-30912 H로부터 제조할 수 있다. A-30912인자 H가 이를 함유하는 항생물질 혼합물의 주성분이 아니므로, 기질로 사용하기전에 다른 공존 항생물질인자를 제거 정제해야 한다. R¹및 R²가 모두 OH이고 R²는 H이며, R³는 C₂-C₆알킬옥시(A-30912 H동족체)인 일반식(Ⅰ)의 A-30912 H핵의 제조에 적절한 기질은, 상응하는 C₂-C₆알킬옥시 유도체를 생성시키기 위한 A-30912인자 A 또는 테트라하이드로-A-30912 A와 적절한 알콜과의 반응에 의해 제조한다. A-30912인자 A가 이를 함유한 항생물질 혼합물의 주성분이므로, 이방법은 A-30912인자 H 및 테트라하이드로-A-30912 H제조의 바람직한 방법이기도 하다.

[A-30912인자 H]

A-30912인자 H는 아스페르길루스 루굴로수스 NRRL 3113 또는 아스페르길루스 니두란스 변종 로세우스 NRRL 1440균주의 심부 혐기성 배양에 의해 제조할 수 있다.

에이 니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440균주를 사용해서 A-30912인자 H를 제조할 때, 수득된 인자 혼합물을 편의상 A-42355항생물질 혼합물로 하기로 한다. A-30912인자 A는 A-42355항생물질 혼합물의 주인자이다. A-30912인자 B,D 및 H는 A-42355합물의 부인자이다.

[A-30912 H동족체]

A-30912 H동족체는, R¹및 R⁴가 모두 OH이고, R²는 H이며, R³는 C₂-C₆알킬 옥시인 일반식 (Ⅱ)구조의 원하는 알킬옥시 유도체를 생성시키기 위해 A-30912인자 A 또는 테트라하이드로-A-30912 A와 상응하는 적절한 알콜을 반응시켜 제조한다.

이는 A-30912인자 H 및 테트라하이드로-A-30912 H를 제조하는 바람직한 방법이다. R이 스테아로일이며 R³가 C₂-C₆알킬옥시인 일반식(Ⅱ)의 A-30912 H동족체는, a) 테트라하이드로-A-30912 H를 제조하여 적절한 알콜과 반응시켜 알킬옥시 유도체를 생성하거나 b) A-30912인자 A와 적절한 알콜을 반응시켜 알킬옥시 유도체를 생성하고, 리놀레오일 측쇄의 이중결합을 환원시켜 제조할 수 있다.

[테트라하이드로 유도체]

테트라하이드로-A-30912A, 테트라하이드로-A-30912H 및 R³가 C₂-C₆알킬옥시이고, R이스테아로일인 일반식(Ⅱ) 화합물은 각각 A-30912인자 A 및 H, R³가 C₂-C₆알킬옥시이고, R이 리놀레오일인 일반식(Ⅱ)화합물로부터 표준 수소화법에 의해, 리놀레오일 측쇄의 두 이중결합이 다 환원될 때 까지 반응시켜 제조한다.

본 발명 핵의 또다른 태양은 R¹,R³및 R⁴가 OH이고, R²는 카복사미드인 경우이다. 이러한 경우를 S31794/F-1핵이라고 한다. S 31794/F-1핵은, R이 미리스토일이고, R¹,R²,R³및 R⁴가 S 31794/F-1핵과 같은 일반식(Ⅱ)의 환상펩티드 항생물질을 탈아실화하여 제조한다.

[S 13794/F-1]

본 발명의 S 31794/F-1핵은 환상펩티드 항생물질 S 31794/F-1을 탈아실화하여 수득한다. 독일공건공보 2,628,965호 및 미국특허 제4,173,629호에 기술된 항생물질 S31794/F-1은 아크로피아로포라리모니스포라 노브. 스펙. 드레이푸스 에트뮬러 NRRL 8095가 생성한 항진균 화합물이다. S. 31794/F-1은 다음과 같은 특징을 갖는다.

융점 178 내지 180℃(분해) (무정형) 또는 181 내지 183℃(분해) (결정성) :

(C,0.5, CH₃OH) 또는 +37^o(C,0.5, 메탄올) (결정성); 메탄올중에서의 UV흡수극대

,225nm(쇼울더

132)276nm(

12.8) 284nm(쇼울더) (

10.5) : 13C-NMR 스펙트럼(1.5ml의 듀데로메탄올중 190mg, 내부표준품은 테트라메틸실란)은 다음과 같다.(결정성).

추정원소분석치(고진공 100℃에서 결정성 물질을 2시간 건조한후)는 다음과 같다. (55.5 내지 56.5%, H 7.5 내지 7.7%, N, 10.5 내지 10.8%, O, 25.5 내지 26%).

S 31794/F-1은 메탄올, 에탄올, 피리딘, 디메틸설폭사이드에 잘 녹으며 물, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠 및 헥산에는 잘 녹지 않으며, 특히 칸디다 알비칸스에 대해 항진균활성이 우수하다.

항생물질 S 31794/F-1은 R이 미리스토일이고, R¹,R³및 R⁴가 OH이고, R²는 카복사미드인 일반식(Ⅱ)의 구조를 갖는 것으로 믿어진다.

[S 31794/F-1핵]

본 발명의 신규 환상펩티드핵, 즉 항생물질 S 31794/F-1의 핵은 R¹,R²,R⁴가 OH이고, R²는 카복사미드인 일반식(Ⅰ)구조를 갖는 것으로 믿어진다.

S-31794/F-1핵은 실험식 C₃₅H₅₂N₈O₁₆로 나타내며 분자량은 840.87이다.

[S 31794/F-1핵의 제조]

[기질의 제조]

본 발명의 S 31794/F-1핵은 항생물질 S 31794/F-1으로부터 제조한다.

항생물질 S 31794/F-1은 아크로피아로포라리모니스포라 NRRL 8095의 심부혐기성 배양에 의해 제조한다.

이 미생물은 Morthern Regional Research Center의 영구배양 컬렉션(permanent culture collection) (U.S.Department of Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604)의 일부이며, 명명된 NRRL 번호로 이용할 수 있다.

각각의 A-30912 H핵에는 아미노기가 함유되어 있으므로, 핵은 염형태로 존재할 수 있다. 그러한 염은 중간체 및 정제목적을 위해 유용하다.

A-30912 H 핵의 약학적으로 무독한 염이 특히 유용한데, 최종생성물의 정제과정이 단축되기 때문이다. “약학적으로 무독한”염은 온혈동물에 대한 생성물의 독성을 전체로서 증가시키지 않는 염을 말한다. A-30912 H핵의 산부가염은 무기 또는 유기산 으로부터 표준반응법에 의해 생성할 수 있다. 대표적인 무기 및 유기산에는 염산, 브롬산, 요드산, 황산, 인산, 아세트산, 벤조산, 설팜산, 타타르산, 시트르산, 말레산, 숙신산, 아스코르빈산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 뮤스산, D-글루탐산, d-캄포산, 글루타르산, 프탈산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 신남산등이 포함된다.

실리카겔/C₁₈을 흡착제로 사용하는 역상 고성능, 저압 액체 크로마토 그라피(HPLPLC)가 각 항생물질의 최종정제의 바람직한 방법이다. 여기서는 용매에 용해한 조항생물질 혼합물을, 동일용매와 평형을 이룬 칼럼상에 적용하고, 이어서 칼럼을 용매로 용출한다. 각 분획을 칸디다 알비칸스 바이오오토그래피 및/또는 UV(상대적 체류시간을 기준)에 의해 조사한다. 동일한 항생물질 인자를 함유하는 분획을 합한다. 때로는 각 인자를 순수한 형태로 수득키 위해 크로마토 그래프에 의한 추가분리 과정이 필요할 때도 있다.

A-30912 또는 A-42355의 조 항생물질 혼합물은, 예를들어 전배양액 또는 균사를 메탄올 및 클로로포름으로 추출하여 수득한다. 이를 항생물질의 크로마토그래피 용매계로는 메탄올 : 물 : 아세토니트릴 (7 : 2 : 1)이 바람직하다.

조 S 31794/F-1 항생물질은, 전배양액을 에틸아세테이트, 이소프로판올(4:1)로 추출하고, 이추출액을 크로마토 그래프하여 수득한다.

개별적 인자는 박층 크로마토그래피(TLC)로 확인할 수 있다. 흡착제로는 실리카겔이 바람직하다. 고탄소함유 실리카겔 TLC, 벤젠 : 메탄올(7:3)용매계, 칸디다 알비칸스 바이오오토그래피를 사용한 A-30912인자 A-G의 Rf값이 표 Ⅰ이다.

[표 Ⅰ]

고탄소함유 실리카겔 TLC 및 칸디다 알비칸스 바이오오토그래피를 사용한 다른 용매계에서의 A-30912인자 A,B,C,D 및 H의 대략적인 Rf값이 표 Ⅱ이다.

[표 Ⅱ]

용매계

a:메틸아세테이트:메탄올(3:2)

b:에틸아세테이트:메탄올(7:3)

c:아세토니트릴:물(95:5)

d:에틸 아세테이트:에탄올:아세트산(40:60:0.25)

A-30912인자 A,B,D 및 H는 또한 다음 조건을 이용한 HPLPLC분석에 의해서도 확인할 수 있다.

칼럼:유리, 0.8×15.0cm

패킹:뉴클레오실

1C-C₁₈(Machery-Nagel and Company), 실시예 7의 슬러리-패킹법을 사용하여 충진한다.

용 매:메탄올:물:아세토니트릴(7:2:1)

샘플량:8mcl

샘플중량:8mcg

컬럼온도:주위온도

유 속:1.8ml/min

압 력:약 200psi

검출기:222nm UV(ISCO Model 1800 Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor)

펌 프:LDC Duplex Mioipump

주 입:루프(loop)주입

이 조건하의 A-30912인자 A,B,C 및 H의 대략적인 체류시간이 표 Ⅲ이다.

[표 Ⅲ]

[효소의 제조]

1. 생성 미생물

본 발명 항생물질의 탈아실화에 유용한 효소는 악티노플라나세과의 일부 미생물, 바람직하게는 악티노-플라나세유타엔시스 NRRL 12052세균에 의해 생성된다.

이 효소는 페니실린의 탈아실화에 사용된 효소와 동일한 효소일 수도 있다. 여기에 관한 연구가 미국특허 제3,150,059호에 Walter J. Klein Schmidt, Walter E. Wright, Frederick W.Kavanagh 및 William M.Stark에 의해 기술되어 있다.

이 효소를 제조하기 위한 바람직한 에이. 유타엔시스 NRRL 12052배양법이 제조실시예 1에 기술되어 있지만, 이분야 전문가라면 다른 방법도 가능하다는 것을 이해할 것이다.

악티노 플라나세과는 악티노마이세탈레스목의 한과로 비교적 최근에 알려졌다.

Dr.John N.Couch에 의해 가장 먼저 J.Elisha Mitchell Sci.Soc. 71 148-155(1955)에 기술되었다. 이 과 및 그의 속 미생물의 특징은 Bergcys Manual of Determinative Bactriolgy 8판에 기술되어 있다. (R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, The Willans ＆ WillkinsCo., Baltimore, Md., 1974,706-723)현재 열 개의 속으로 분류되고 있다.

I. 악티노플레인스(대표적인 속이며 이제까지 가장 흔한 속이다); Ⅱ. 스피릴로스포라; Ⅲ.스트렙토스포랑기움; Ⅳ. 아모르포스포랑기움; Ⅴ.암풀라리엘라; Ⅵ.필라멜리아; Ⅶ. 플라노모노스포라; Ⅷ.플라노비스포라; Ⅸ.딕틸로스포랑기움; Ⅹ.기타사토아.

현재 분리되어 특징지어진 일부 종 및 변종은 다음과 같다.

악티노플레인스필리피넨시스. 악티노플레인스아르메니아쿠스, 악티노플레인스유타엔시스 및 악티노플레인 스미조리엔시스, 스피릴로스포라알비다, 스트렙토스포랑기움로세움. 스트렙토스포랑기움불가레, 스트렙토스포랑기움로세움변종홀란덴시스, 스트렙토스포랑기움알붐, 스트렙토스포랑기움비리디알붐, 아모르포스포랑기움아우란티콜로르, 암풀라리엘라로바타, 암풀라리엘라디기타타, 필리멜리아테레바사, 필라멜리아아눌라타, 플라노모노스포라파론토스포라, 플라노모노스포라베네주엘렌시스, 푸라노비스포라, 롱기스포라, 플라노비스포라로세아, 닥틸로스포랑기움아우란티아쿱 및 닥틸로스포랑기움타일란덴세.

본 발명에 유용한 바람직한 효소원은 악티노플레인스속이다. 악티노플레인스속에서, 악티노플레인스유타엔시스종이 특히 바람직하다.

대표적인 종의 배양물은 전술한 주소의 Northern Regional Research Center로부터 다음과 같은 가입번호고 이용할 수 있다.

악티노플레인스유타엔시스 NRRL 12052

악티노플레인스미조리엔시스 NRRL 12053

악티노플레인스종 NRRL 8122

악티노플레인스종 NRRL 1206

스트렙토스포랑기움 로세움 변종 홀란덴시스 NRRL 12064

에이. 유타엔시스 NRRL 12052 American Type Culture Collection (ATCC)에 공탁된 모배양에서 유도된 것이다. (12301 Parklawn Drive, Rockville Md, 20852)(에이. 유타엔시스 ATCC 14539)에이. 유타엔시스 ATCC 14593 배양물도 효소원으로 사용할 수 있다.

에이. 미조리엔시스 NRRL 12053 ATCC에 공탁된 배양으로부터 유도된 것이며(에이. 미조리엔시스 ATCC 14538) 또 다른 효소원이 된다.

본 발명의 탈아실화를 수행하는데 있어 악티노플라나세과의 특정균주의 효과는 다음방법으로 측정한다. 적절한 생장배지에 미생물을 접종한다. 배양액을 약 28℃에서 2일 또는 3일간 회전진탕기상에서 배양한다. 기질항생물질중 한가지를 배양액에 가한다. 발효배지의 pH를 약 6.5로 유지한다. 칸디다알비칸스 시험범에 의해 배양액의 활성을 조사한다.

이 방법은 E항에 기술되어 있다. 항생물질 활성의 소실은 미생물이 탈아실화에 필요한 효소를 생성하는 것을 나타낸다. 이는 다음의 한방법으로 입증할 수 있다.

1) HPLC에 의한 완전한 핵의 존재 확인 또는 2) 활성을 회복시키기 위한 적절한 측쇄의 재아실화.

2. 효소생성 조건

효소생성은 악티노플라나세의 생장에 만족스런 조건하에 즉 25내지 300℃의 온도 및 pH 5.0내지 8.0에서 진탕 및 통기시킬 때 이루어진다. 배양배지는 a) 슈크로스, 글루코스, 글리세롤등과 같은 동화성 탄소원, b)펩톤, 우레아, 암모늄 설패이트등과 같은 질소원, c) 용성 인산염 같은 인산염원, d) 미생물의 생장을 촉진시키는데 유효하다고 밝혀진 무기염을 함유해야 한다. 성장주기가 시작된후 40내지 60시간이내에 일반적으로 유효량의 효소가 수득되며, 유효성장이 이루어진 얼마후까지 지속된다. 생성된 효소량은 미생물 종에 따라 달라지며 성장조건의 차이에 영향을 받는다.

이 분야 전문가에게는 분명한 바와 같이 효소를 생성하는 악티노풀레인스 유타엔시스 NRRL 12052 같은 미생물은 변이를 일으키게 한다. 예를들어 자외선, X-선, 고주파, 방사선 및 화학약품같은 여런공지된 돌연변이 유발원처리에 의해 이들 균주의 인공변이체 및 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 악티노플라나세로부터 수득되고 효소를 생성하는 모든 천연 및 인공변이체 및 돌연변이체는 본 발명에 사용할 수 있다.

C. 탈아실화조건

최소한 48시간 배양한후. 악티노플라나세 배양액에 기질을 가하는 것이 바람직하다. 전환배지중 기질농도는 광범위하게 변할 수 있다. 그러나 효소의 이용률을 최고로 하고 24시간내에 탈아실화를 거의 완결시키려면, 기질농도를 약 0.5내지 0.1㎎/㎖로 한다.

저농도를 사용할 수도 있으나, 이때는 효소 이용률이 최고에 이르지 못하며 고농도 경우에는 발효시간을 연장하지 않는한 기질의 탈아실화가 완전히 이루어지지 않는다.

기질항생물질의 본 발명의 상응하는 핵으로의 전환은, 발효배지의 pH를 6.0내지 7.0으로 유지할 때 가장만족스럽게 이루어진다. pH 6이하에서는 탈아실화가 서서히 이루어지며,pH 6.0이상에서는 생성된 기질 및 핵이 점점 불안정해진다.

pH 6.0일 때 안정성이 가장 높다 : 그러나 pH 6.0에서는 탈아실화속도가 떨어진다(약 3내지 36시간). 큰 손실없이 탈아실화를 좀더 신속히 진행시키려면(약 24시간) pH 6.5가 바람직하다. 교반 발효기의 pH는 센서(Sensor)조절기로 조절한다. 플라스크발효기 같이 이러한 방법이 적절하지 못한 경우는 기질을 가하기전에 0.1M인산염 완충액을 배지에 가해 pH를 조절할 수 있다.

기질을 가한후, 배양액을 24시간이상 배양한다. 기질의 순도가 탈아실화속도에 영향을 미치게된다. 예를들어, 순도가 50%이상인 기질은 24시간이내에 0.8내지 1.2㎎/㎖의 속도로 탈아실화된다. 저순도의 기질을 사용하면, 탈아실화 속도가 감소된다.

기질은 수회에 걸쳐 공급할 수 있다. 예를들어 소탱크에서는 0.3내지 0.5㎎/㎖dml 항생물질을 12시간 간격으로 최소 5회 가할 수 있고, 대탱크의 경우에는 0.7㎎/㎖의 항생물질을 2회 공급할 수 있다. 탈아실화가 이루어질 수 있는 온도범위는 광범위한데 예를들면 약 20내지 45℃이다. 그러나 약 25내지 30℃가 바람직하며, 탈아실화속도 및 기질 및 핵의 안정성을 고려할 때 약 26℃가 가장 바람직하다.

D. 기질

기질로 순수하게 정제된 항생물질을 사용하는 것이 바람직하다. 기질 항생물질은 항진균 활성을 갖고 있으나 항균활성은 나타내지 않는다. 따라서 기질물질 중에는 탈아실화 발효배지중에서 생장할 수 있는 세균 세포 또는 포자가 잠복해 있을 수 있다.

그런 오염원은 탈아실화반응 또는 출발 항생물질의 안정성 또는 생성물 핵에 영향을 줄 수 있다. 따라서 기질을 멸균하는 것이 중요하다. 그런데 가압멸균에 의해 대부분의 기질항생물질이 파괴되므로, 가압계 중에서 에틸렌옥사이드로 처리하여 제제를 멸균하는 것이 바람직하다.

E. 탈아실화

출발물질은 칸디다 알비칸스에 대해 특히 활성을 나타내는 항진균 항생물질이다. 이러한 이유로 씨이.알비칸스를 사용하는 시험법이 존재하는 기질의 양을 측정하는데 바람직하다. 생성된 핵은 수용성이나 생물학적으 감는 불활성이다. 따라서 생물학적 활성의 산소는 탈아실화의 신속한 추정시험법이 된다.

육즙 샘플 및 발효고체의 알콜성 추출물 모두에 대해 시험해야 되는데, 기질은 육즙에 단지 약간만 녹기 때문이다.

F. 휴지세포의 사용

탈아실화의 다른 방법으로는 배양배지로부터 악티노플라기세 세포를 제거하여, 이를 완충용액에 재현탁시켜 C항에 기술된 바와 같이 탈아실화 시키는 것이다. 이 방법을 사용할 때, 효소적으로 활성을 나타내는 균사를 재사용할 수 있다. 예를들어 에이. 유타엔시스 NRRL 12052균사는 냉장(4내지 8℃)하거나 냉동 상태(-20℃)로 1개월 이상 저장해도 데아실라제 활성을 유지한다. 0.1M인산염 완충액이 바람직하다.

G. 고정된 효소

탈아실화의 또다른 방법은 이 분야에 공지된 방법으로 효소를 고정하는 것이다. (참조 : 예를들어, “Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins”Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plemus Press, New York, 1977; vol 1).

고정된 효소를 칼럼에(또는 그외 적절한 형태의 반응기)사용하여 탈아실화시킬 수 있다.

또한 미생물 자체를 고정하여 탈아실화반응에 촉매로 사용할 수도 있다.

핵의 효용성

핵 및 그의 산부가염은 합성 항진균 화합물제조의 유용한 중간체이다. 이들 핵으로부터 제조한 유용한 항진균 화합물은 본 특허원과 동일날짜에 출원되어 계류중인 X-5396(Bernard J.Abbottand David S.Fukuda), X-5595 및 X-5564(Manuel Debono)에 기술되어 있는데, 상기 특허원의 명칭은 환상 펩티드핵의 유도체이다.

상기 언급한 특허원에 따르면, “알킬”은 일가의 포화된 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소라디칼을 의미한다. “알케닐”은 이중결합이 세 개이하인 일가의 불포화된 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 라디칼이다. 불포화 탄화수소쇄의 이중결합은 시스 또는 트랜스 배위이다. “C₆-C₂₄”는 탄소수 6내지 24인 탄화수소(직쇄 및 측쇄포함)이다.

일반식 Ⅲ화합물은, 핵의 오르니틴 부분의 a-아미노그룹을 적절한 아실측쇄로 통상적 방법에 의해 아실화하여 아미드 결합을 생성시켜 제조한다. 일반적으로 아실화는 목적 아실측쇄 그룹에 상응하는 산의 활성화 유도체와 핵을 반응시켜 이루어진다.

“활성화 유도체”는 아실화제의 카복실기가 1급 아미노 그룹과의 커플링 반응에 반응성을 나타내, 아실측쇄와 적절한 핵을 연결하는 아미드 결합을 생성하는 유도체를 말한다. 적절한 활성화 유도체, 그 제조 방법 및 1급아민에 대한 아실화제로써의 사용법은 이 분야 전문가에게 공지되어 있다.

바람직한 활성화 유도체는 다음과 같다 :

(a) 산할라이드(예:산염화물), (b) 산무수물 (예: 알콕시 포름산 무수물 또는 아릴옥시포름산 무수물)또는 (c) 활성화 에스테르(예 : 2,4,5- 트리클로로페닐 에스테르). 카보닐기를 활성화하는 다른 방법은 카복실산과 카보닐 디이미드를(예: N, N-디시클로헥실 카보디이미드 또는 N,N-디이소프로필 카보디이미드 반응시켜 반응성 중간체를 생성하고, 이는 불안정하므로 분리하지 않고 1급아민과 그대로 반응시키는 것이다.

만일 아미노산이 아미노 그룹이 아닌 아실화될 수 있는 그룹을 함유하면, 그런그룹은 N-알카노일 또는 N-알케노일 그룹을 생성시키기 위한 작용제와 아미노산을 반응시키기 전에 보호하여야 한다. 보호 그룹으로는 펩티드합성에서 측쇄작용기의 보호에 유용하다고 공지된 그룹이면 어느 것이나 적절하다. 그런 그룹은 널리 공지되었으며 그 선택 및 사용법은 이 분야 전문가라면 용이할 것이다. [ 참조 : 예를들면 Protective Groups In Organic Chemistry “M.McOmic Editor, Plenum Press N.Y.1973]

일반식 Ⅲ화합물은 병원성 진균의 생장을 억제하므로 주위환경의 진균생장을 억제하거나 진균에 의한 감염을 치료하는데 유용하다. 특히 칸디다알비칸스에 대해 활성이 있으므로, 칸디다 감염증 치료에 특히 유용하다. 화합물의 활성은 표준 미생물학적 시험법으로 평가할수 있는데, 여기에는 평면-한천법, 디스크-확산법 또는 한천-희석법 같은 시험관내 시험 또는 씨이. 알비칸스에 감염된 마우스를 이용한 생체내 시험법이 있다.

본 발명 화합물은 또한 트리코피톤, 멘타그로피트(피부사상균)사카로마이세스 파스토리아누스 및 뉴로스포라크라사에 대해서도 활성을 나타낸다.

일부 화합물(실시예 19의 표 Ⅷ에 기술됨)은 마우스에 경구투여할 때 높은 혈증농도를 나타낸다. R⁵가 p-(n-옥틸옥시)벤조일인 일반식 Ⅱ화합물을 개에게 1일에 100㎎/㎏으로 5일간 정맥주사 할 때, 혈청 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제(SGPT)농도가 일시적으로 증가되나, 현저한 독성은 나타나지 않는다.

실제 사용할 때, 일반식 Ⅲ화합물의 용량은 사용된 화합물, 감염의 정도 및 종류, 환자의 상태에 따라 변화된다. 치료는 저용량에서 시작해야 하며, 원하는 항진균효과를 볼때까지 용량을 증량한다. 본 발명 화합물은 무균수용액 또는 현탁제 형태로 정맥 또는 근육주사할 수 있는데, 필요하면 주사액에 통상적인 방부제, 완충제, 용해제 또는 현탁제를 가할 수 있다. 등장성 용액을 제조하기 위해 식염수 또는 글루코스 같은 다른 첨가제를 가하기도 한다. 그런 첨가제의 비율 및 종류는 이 분야 전문가에게는 공지되어있다. 일반식 Ⅲ화합물 일부는 경구투여시 높은 혈중농도를 나타내므로(참조: 실시예 19, 표 Ⅷ)경구투여할수 있다. 경구용으로, 그런 화합물을 약학적으로 무독한 담체 또는 부형제와 혼합해 캡슐제, 정제 또는 산제의 형태로 투여할 수 있다. 그런 담체 또는 부형제의 종류 및 비율은 이 분야 전문가에 공지되어 있다. 칸디다성 질염의 치료에 사용할 때, 일반식 Ⅱ화합물을 약학적으로 무독한 질내 용도에 적절한 통상적 부형제와 혼합해 투여할 수 있다. 질내투여를 위한 제형은 이 분야 전문가에 공지되어 있다.

본 발명의 공정을 상세히 설명키 위해 다음 실시예를 제공한다.

[제조실시예 1]

악티노플레인스유타엔시스의 발효

악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052의 원배양액을 제조하여 사면 한천상에 유지한다. 사면제조에 사용된 배지는 다음중 하나이다.

탈이온수 적당량을 가해 1ℓ로 한다. 가압멸균하기 전의 pH는 약 5.9이며, NaOH를 가해 pH7.2로 조절한다. 가압멸균후 pH는 약 6.7이다.

* 차베크 미네랄·스토크의 조성은 다음과 같다.

* N-Z-아민 A(Humko Sheffield Chemicl, Lyndhurst N.T.)

사면한천에 악티노플레인스유타엔시스 NRRL 12052를 접종하고 접종한 사면한천을 30℃에서 8내지 10일간 배양한다. 사면한천배양물의 약 1/2을 사용하여 다음 조성의 영양배지 50ml에 접종한다.

NaOH로 pH를 7.4로 조절한다. 가압멸균후의 pH는 6.8이다.

* National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, N.Y.

접종된 영양배지는 250㎖광구 삼각 플라스크에 넣어, 30℃에서 직경이 2인치인 호를 그리며 각속도 250rpm으로 회전하는 회전진탕기상에서 약 72시간 배양한다.

이와같이 배양된 영양배지를, 제2단계 영양배지 접종에 직접 사용할 수 있다. 또한 액체질소의 증기상중에 배양액을 유지시켜 나중의 사용을 위해 저장할 수도 있는데, 이것이 바람직하다. 저장하기 위해 소바이알단위로 다음과 같이 제조한다.

각 바이알에 2㎖의 배양한 영양배지 및 2㎖의 글리세롤-락토스 용액을 넣는다.[참조 : W.A. Dailey and C.E. Higgens, Preservation and Strage of Microoor-ganisms in the gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364-367(1973)]

제조한 현탁액은 액체질소의 증기상중에 저장한다.

그와 같이 제조, 저장한 현탁액(1㎖)을 사용하여 50㎖의 제 1단계 영양배지(전술한 조성을 갖는)를 접종한다. 접종한 제1단계 영양배지를 전술한 바와같이 배양한다.

다량의 접종물을 얻기 위해 배양한 제1단계 영양배지 10㎖를 사용하여, 제1단계 영양배지와 동일한 조성을 갖는 제2단계 영양배지 400㎖에 접종한다. 2 제 2단계 배지를 2ℓ광구 삼각플라스크에 넣어, 30℃에서, 직경이 2인치인 호를 그리며 각속도 250rpm로 회전하는 회전진탕기상에서 약 48시간 배양한다.

배양한 제2단계 영양배지(800㎖)를 사용하여 다음중 하나인 멸균 증식성배지 100ℓ에 접종한다.

121℃, 16-18psi로 45분간 가압멸균한 후의 pH는 약 6.9이다.

HCl로 pH를 7.0으로 조절한다. 가압멸균후의 pH는 약 7.0이다.

수도물 적정량을 가해 1ℓ로 함.

* 각각 멸균하고 무균적으로 가한다. 최종 pH는 약 6.6이다.

접종한 증식성 배지를 165ℓ발효탱크에 넣어 약 30℃에서 약 42시간 발효시킨다. 발효배지를 200RPM의 통상적 진탕기로 교반하고 대기압에서 용존산소량이 공기포화도의 30%이상으로 유지되도록 멸균공기를 통해준다.

[제조실시예 2]

A-42355 항생물질 복합체의 제조

A. 진탕- 플라스크 발효

아스페르길루스 니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440의 배양액을 제조하며 다음 조성의 배지로 제조한 사면한천상에 유지한다.

사면한천에 아스페르길루스니두란스 변종 로세우스 NRRL 11440을 접종하고, 접종한 사면한천을 25℃에서 수일간 배양한다. 성숙한 사면배양액에 물을 가해 멸균루프로 긁어 포자를 흐트러뜨린다. 생성된 현탁액을 10㎖의 멸균 탈이온수에 현탁시킨다.

현탁된 사면생장을 1㎖를 사용하여 250㎖ 플라스크중 영양배지 55㎖에 접종한다. 영양배지의 조성은 다음과 같다.

접종한 영양배지를 25℃에서 회전형 진탕기상에서 250rpm으로 48시간 배양한다.

24시간후, 배지를 배합기(Waring type)중에서 제속으로 1분간 균질화하고 이어서 나머지 24시간동안 배양한다. 또는 접종한 영양배지로 48시간 배양하고 저속에서 15초간 균질화할 수도 있다. 이와 같이 배양한 영양배지를 사용하여 진탕-플라스크 발효배양배지를 접종하거나 제2단계 영양배지를 접종할 수도 있다.

또는 나중의 사용을 위해 액체질소 증기상중에 배양액을 유지 저장할 수도 있다. 저장목적을 위해 소바이알단위로 다음과 같이 제조한다. 영양배양액을 다음 조성의 현탁액과 용량/용량으로 혼합한다.

제조한 현탁액을 멸균한 소 나사뚜껑 튜브에 4ml씩 분배한다. 이들 튜브를 액체질소의 증기상중에 저장한다.

제조 저장한 현탁액을 사용하여 사면한천 또는 액체 종자배지에 접종할 수 있다. 사면한천을 25℃, 광조건하에 7일간 배양한다.

B. 탱크발효

다량의 접종물을 얻기 위해 배양한 제1단계 영양배지 10ml를 사용하여, 제1단계 영양배지와 동일한 조성을 갖는 제 2단계 영양배지 400ml에 접종한다. 제2단계 배지를 2ℓ광구 플라스크에 넣어, 25℃에서, 직경이 2인치인 호를 그리며 각속도 250rpm로 회전하는 회전 진탕기상에서 약 24시간 배양한다.

배양한 제2단계 영양배지(800ml)를 사용하여 다음중 하나인 멸균 증식성배지 100ℓ에 접종한다.

접종한 증식성 배지를 165ℓ 발효탱크에 넣어 25℃에서 약 7일간 발효시킨다. 발효배지에 멸균공기를 통해주고 용존산소량을 공기포화도의 약 50%로 유지한다.

C. 제3단계 영양배지

100ℓ발효에 사용되는 탱크보다 더 큰 탱크에서 발효시킬때는, 큰탱크를 접종하는데 제3단계 영양배양액을 사용하는 것이 권할만하다. 바람직한 제3단계 영양배지의 조성은 다음과 같다.

[제조실시예 3]

A-42355항생물질 복합체의 분리

증식성 배지 V를 사용하여 제조실시예 2의 방법에 의해 수득한 전발효육즙(4127ℓ)을 메탄올 (4280ℓ)과 함께 1시간동안 완전히 교반하고, 여과 보조제(Hyflo Super cel, 규조토, Johns-Manville Products Corp.)를 사용하여 여과한다. 여액의 pH를, 5N HCl를 가해 4.0으로 조절한다. 산성화된 여액을 동량의 클로로 포름으로 2회 추출한다. 클로로포름 추출물을 합해 진공농축시켜 용량을 약 20ℓ가 되도록 한다. 이 농축물을 약 200ℓ의 디에틸에테르에 가해 A-42355 복합체를 침전시킨다. 침전을 여과분리하여 2775g의 A-42355 복합체를 회백색분말로 수득한다.

[제조실시예 4]

A-30912인자 A의 분리

제조실시예 3과 같은 방법으로 제조한 A-42355 항생물질 복합체(1g)를 7ml의 메탄올 : 물 : 아세토 니트릴(7 : 2 : 1)에 용해한다. 이 용액을 여과하여 제조실시예 10과 같은 방법으로 제조한 LP-1/C₁₈실리카겔역상수지(10내지 20마이크론)를 충진한 3.7 I.D.×35cm의 유리칼럼상에 밸브계를 이용하여 루프를 통해 도입한다. [Michel-Miller High Performance LowPressure(HPLPLC) Chromatography Column, Ace Glass Incorporatod, Vineland, N.J. 08360.]

칼럼을 메탄올 : 물 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)중에서 제조실시예 11에 기술된 슬러리-충진법에 의해 충진한다. 무밸브 피스톤 구조의 F.M.I.펌프(최대용량) 19.5ml/min)를 사용하여, 약 100psi에서 9ml/min의 유속으로 용매를 칼럼을 통해 이동시키며 매분 분획을 받는다. 항생물질의 용출을 280nm에서 광학적 유니트(ISCO Type 6)가 부착된 UV모니터를 사용하여 조사한다.

(ISCO모델 UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Gncoln, Nebraska 68504)

분획 (약 112 내지 140)을 합해 20ml의 물에 가한다. 이 용액의 pH를 1N HCl로 4.0으로 조절한다. 생성된 용액을 동량의 클로로포름으로 2회 추출한다. 클로로포름 추출물을 합해 진공농축시켜 오일로 수득한다. 오일을 3급 부탄올에 용해하고, 이용액을 동결건조하여 524mg의 A-42355인자 A(A-30912인자 A-A 22082)를 수득한다.

[제조실시예 5]

A-30912인자 B의 분리

농축한 클로로포름 추출물(285ℓ)를 실리카겔칼럼(150ℓ의 Grace Silica-gel, grade 62) 상에 유속 2ℓ/min으로 크로마토그래피를 실시하는 것을 제외하고는 제조실시예 3과 같은 방법으로 A-42355복합체를 분리한다. 칼럼을 클로로포름(200ℓ)으로 세척하고 아세토니트릴(500ℓ)로 용출하고 아세토니트릴 : 물(98 : 2)로 1ℓ/min의 유속으로 계속 용출한다. 총용량이 대략 200ℓ가 되도록 분획을 모아 각각 생물학적 활성을 결정한다. 칸디다 알비칸스로 접종한 평면한천상의 페이퍼-디스크 시험으로 생물학적 결정을 실시한다. 분획 77내지 103(1365ℓ)을 모아 진공 농축한다. 농축용액(4.5ℓ)에서 생성된 침전을 여과 제거하여 119g의 인자 B-강화 A-42355 복합체를 생성한다. 여액을 농축건고 하고, 수득한 잔사를 적절량의 메탄올에 재용해한다. 매분당 한 분획을 받는다.

항생물질의 용출을 실시예 1에서와 같은 UV모니터를 사용해서 280nm에서 조사한다. 분획 102 내지 110을 모아 진공농축시켜 오일을 수득한다. 오일을 소량의 3급부탄올에 용해하여 동결건조시켜 22mg의 A-30912인자 B를 수득한다.

[제조실시예 6]

A-30912인자 D의 분리

2회의 발효공정에서 제조실시예 3과 같은 방법으로 수득한 농축 클로로포름 추출물 (3800ℓ 및 4007ℓ)을 합해 실리카겔칼럼(grace, grade 62)상에 크로마토그래프한다. 칼럼을 클로로포름으로 세척하고 아세토니트릴 및 아세토니트릴 : 물(98.2)로 용출한다. 분획의 총용량을 약 200ℓ가 되도록 합해, 칸디다 알비칸스를 접종한 한천상의 페이퍼-디스크 시험에 의해 생물학적 활성은 검정한다. 활성을 나타내는 분획(850ℓ)을 합해 진공농축한다. 농축용액(0.7ℓ)을 디에틸에테르(10배량)에 가해 인자 D-강화 A-42355복합체를 침전시킨다. 이 침전을 여과하여 건조시켜 23g의 인자 D-강화 A-42355복합체를 회색분말로 수득한다.

수득한 인자 D-강화 A-42355 복합체(1.0g)을 5ml의 메탄올 : 몰 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)에 용해한다. 이 용액을 여과하고 밸브계를 이용하여 루프를 통해 실리카겔 칼럼(3.7cm I.D.×30cm, Michel-Miller Column)상에 도입한다. LP-1/C₁₈실리카겔 역상수지 (10내지 20마이크론, 제조실시예 10과 같은 방법으로 제조)을 칼럼에 충진한다. 충진과정은 메탄올 : 몰 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)중에서 제조실시예 11에서 기술된 슬러리-충진법에 의해 이루어진다. 용매를 약 45psi에서 무밸브 피스톤 구조의 F.M.I. 펌프를 사용하여 8ml/min메탄올용액을 디에틸에테르(10배량)에 가해 인자 B-함유 항생물질 복합체를 침전시킨다. 이 침전을 여과하여 분리하고 건조시켜 24g의 인자 B-강화 A-42355복합체를 회색분말로 추가수득한다.

수득한 인자 B-강화 A-42355복합체를 8ml의 메탄올 : 물 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)에 용해한다. 이 용액을 여과하고 밸브계를 이용하여 루프를 통해 실리카겔 칼럼(3.7cm I.D.×30cm, Michel-Miller Column)상에 도입시킨다. 제조실시예 10과 같은 방법으로 제조한 LP-1/C₁₈실리카겔 역상 수지(10내지 20마이크론)를 메탄올 : 몰 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)중에서 밸브계를 이용해서 루프를 통해 칼럼에 충진시킨다. 제조실시예 11과 같은 슬러리 충진법을 사용한다. 용매를 약 100psi에서 무밸브 피스톤구조의 F.M.I. 펌프를 사용하여 유속 10ml/min으로 칼럼을 통해 이동시킨다. 2분에 한 분획씩 받는다. 항생물질의 용출을 광학적유니트(ISCO Type 6)가 부착된 UV모니터(ISCO 모델 UA-5)를 사용하여 280nm에서 조사한다. 분획 96 내지 108을 합해 진공농축시켜 오일을 생성한다. 이 오일을 소량의 3급-부탄올에 용해하고 동결건조시켜 89mg의 A-30912인자 D를 수득한다.

[제조실시예 7]

A-30912인자 H의 분리

제조실시예 3과 같은 방법으로 제조한 A-42355 항생물질 복합체(5.0g)를 35ml의 메탄올 : 물 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)에 용해하고, 생성된 용액을 여과하여 3.7cm I.D.×42cm 유리칼럼(Michel-Miller Column)상에 밸브계를 이용하여 루프를 통해 도입한다. LP-1/C₁₈실리카겔 염상수지(10내지 20마이크론)를 메탄올 : 몰 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)중에서 제조실시예 11과 같은 방법으로 칼럼에 충진시킨다.

용매를 약 120psi에서 무밸브 피스톤구조의 펌프를 사용하여 13ml/min의 유속으로 칼럼을 통해 이동시키고, 매 2분당 한 분획을 받는다. 항생물질의 용출을 280nm에서 UV로 조사한다. 분획 112 내지 132를 유사한 두번째 정제과정에서 수득한 분획 106내지 117과 합한다. 합한 분획을 진공농축시켜 오일을 생성한다. 이 오일을 소량의 3급-부탄올에 용해하고 동결건조시켜 173mg의 조 A-30912인자 H를 수득한다.

조 A-30912인자 H (150mg)를 8ml의 메탄올 : 물 : 아세토니트릴(7 : 2 : 1)에 용해하고, 이 용액을 여과하여 상술한 바와같이 2.0cm I.D.×32cm 유리칼럼상에 도입한다. 용매를 약 80psi에서 8ml/min의 유속으로 칼럼을 통해 이동시키고 매 3분당 한분획을 받는다. 항생물질의 용출을 280nm에서 조사한다. 분획 17 및 18을 합해, 진공농축시켜 오일을 수득한다. 오일을 소량의 3급-부탄올에 용해하고 동결건조시켜 29mg의 A-30912인자 H를 수득한다.

[제조실시예 8]

[항생물질 S 31794/F-1의 제조]

항생물질 S 31794/F-1을, pH 3내지 8, 바람직하게는 5 내지 7, 15내지 30℃, 바람직하게는 18내지 27℃에서 교반, 진탕 및/또는 통기조건에서, 아크로피아로포라 리모니스포라 NRRL 8095를 48내지 360시간, 바람직하게는 120내지 288시간 심부배양하여 제조한다.

배양육즙(90ℓ)을 에틸아세테이트 : 이소프로판올(4 : 1, 90ℓ)로 처리하고 실온에서 30분간 균일화하여 항생물질 S 31794/F-1을 분리한다. 유기상을 분리하여 약 40℃진공하에 증발시킨다. 수득한 잔사를 CHCl₃: CH₃OH(95 : 5 내지 60 : 40)를 사용하여 10배량의 실리카겔상에서 크로마토그라프를 실시한다. 항진균 활성을 나타내는 분획을 합해 100배량의 “세파덱스 LH-20”상에서 메탄올을 사용하여 크로마토그래프를 실시한다. 항진균 활성을 나타내는 분획을 합해 100배량의 실리카겔(0.05내지 0.2mm)상에서 CHCl₃: CH₃OH : H₂O(71 : 25 : 4) 용매계를 사용하여 재크로마토그래프한다. 항진균 활성을 나타내는 용출분획을 합해 진공증발시켜 조 항생물질 S 31794/F-1을 수득한다.

이 생성물을 소량의 메탄올에 용해하고 디에틸에테르로 침전시켜 25내지 30℃고진공에서 건조한후 융점이 178내지 180℃(분해)인 백색 무정형분말로 S-31794/F-1을 수득한다. 10배량의 에틸아세테이트 : 메탄올 : 물(80 : 12 : 8)로부터 결정화하고 20℃고진공에서 건조한후 융융이 181내지 183℃(분해)인 결정성 S 31794/F-1을 수득한다.

[제조실시예 9]

[항생물질 S 31794/F-1의 분리]

세파덱스상에서 크로마토그래프한후에 제조실시예 8과 같은 방법으로 수득한 조항생물질 S 31794 F-1을 밸브계를 이용해 루프를 통해 실리카겔칼럼(Michel-Miller Column)상에 도입한다. 제조실시예 10과 같은 방법으로 제조한 LP-1/C₁₈실리카겔 역상수지(10내지 20마이크론)를 클로로포름 : 메탄올 : 물(71 : 25 : 4)중에서 밸브계를 이용하여 루프를 통해 칼럼에 충진한다. 제조실시예 11에 기술된 슬러리 충진법을 이용한다. 용매를 무밸브 피스톤 구조의 F.M.I. 펌프를 사용하여 칼럼을 통해 이동시킨다. 항생물질의 용출을 UV모니터를 사용해서 280mm에서 조사한다. 항진균활성을 나타내는 분획을 합해 진공농축시켜 항생물질 S 31794 F-1을 수득한다.

[제조실시예 10]

[실리카겔/C₈₁역상수지의 제조]

[제1단계 : 가수분해]

LP-1실리카겔(Whatman사 (Quantum Corp.에서 바뀜) 제품(1000g)을 5ℓ둥근바닥 플라스크중 농황산(1650ml) 및 농질산(1650ml)의 혼합물에 가하고 진탕하여 적합한 현탁액을 생성한다. 혼합물을 플라스크에 부착된 물재킷 냉각기(water-jacketod conderser)증기욕상에서 철야(16시간)가열한다.

혼합물을 빙욕에서 냉각하고 소결-유리여두를 사용하여 주의해서 여과한다. 실리카겔을 탈이온수로 세척하여 pH가 중성이 되도록 한다. 이어서 실리카겔을 아세톤(4ℓ)으로 세척하고 100℃진공하에 2일간 건조한다.

[제2단계 : 제1차 실릴화]

제1단계의 건조실리카겔을 둥근바닥 플라스크로 옳기고 톨루엔(3.5ℓ)중에 현탁시킨다. 플라스크를 증기욕상에서 2시간 가열하여 잔류하는 소량의 물을 함께 비등시켜 제거한다. 옥타데실트리클로로실란(321ml, Aldrich Chemical Company)을 가하고, 반응혼합물을 약 60℃에서 천천히 기계적으로 교반하여 철야(16시간) 환류한다. 교반기가 프라스크 바닥 가까이 이르지 않도록 주의해야 하는데, 실리카겔입자가 분쇄되는 것을 막기 위함이다.

혼합물을 냉각시킨다. 실린화 실리카겔을 합해 톨루엔(3ℓ) 및 아세톤(3ℓ)으로 세척하고 철야(16내지 20시간) 기건(air-dry)시킨다. 건조 실리카겔을 5ℓ플라스크중 3.5ℓ의 아세토니트릴 : 물(1 : 1)중에 현탁시키고 실온에서 주의하여 2시간교반하고 여과하여 아세톤(3ℓ)으로 세척하고 철야 기건시킨다.

[제2단계 : 제2차 실릴화]

제1차 실릴화의 과정을 200ml의 옥타데실 트리클로로실란을 사용하여 반복한다. 현탁액을 주의하여 교반하며 60℃에서 2시간 환류시킨다. 최종생성물을 여과하여 회수하고 톨루엔(3ℓ) 및 메탄올(6ℓ)로 세척하고 50℃에서 철야 16내지 20시간 진공 건조한다.

[제조실시예 11]

[Michel-Miller칼럼의 슬러리 충진법]

일반적 사항

A. 분석용 또는 정제용 칼럼은 이 방법에 의해 충진할 수 있다.

B. 충진물로는 실리카겔 및 실리카겔 역상수지 충진물 (예 : Quantum LP-1, 입자크기 10내지 20마이크론:Lichroprep., RP-8 및 RP-18, 입자크기 25내지 40마이크론(이 바람직하다. 다른형의 수지뿐아니라, 다른 실리카겔(예 : Shandons ODS Hypersil입자크기 5마이크론)도 이방법에 의해 만족스럽게 충진된다.

C. 일반적으로, 이 충진법에는 200psi미만의 압력 및 5내지 40ml/min의 유속이 필요하며 이는 칼럼용량 및 크기에 좌우된다. 충진압은 실제 분리과정중에 사용되는 입력되는 30내지 50psi 높아야 한다. 이와같이 해야 분리공정도중에 흡착제가 더이상 압축되지 않는다. 이 방법으로 역상실리카겔을 충전한 칼럼은 효율의 저하없이 수년간을 사용할 수 있다.

D. 압력의 돌연한 감소로 인해 충진물중에 균열(Crack) 또는 홈(channel)이 생성될 수 있으며, 이는 칼럼효율을 크게 저하시킨다. 따라서, 펌프를 중단시켰을 때는 압력을 서서히 제로로 떨어뜨리는 것이 중요하다.

E. 칼럼의 대략적 용량(Ace glass Cat. No., 미충진) : 5795-04, 12ml, 5795-10, 110ml, 5795-16,300ml, 5795-24, 635ml, 5796-34,34ml.

F. 유리칼럼을 충진하는데 드는 시간은 수분내지 수시간에 이르며, 칼럼의 크기 및 사용자의 경험에 달려있다.

상세한 조작법

1. 유리칼럼을 커플링에 의해 저장칼럼과 연결한다.(저장칼럼의 용량은 유리칼럼의 2배가 되어야한다) 두 칼럼을 수직이 되도록 장치한다(저장칼럼이 위로 가도록).

2. 충진물을 평량한다. (200ml칼럼의 경우, 약 100g).

3. 약 5배량의 용매를 충진물에 가한다. 용매로는 70내지 80%, 메탄올 및 20내지 30%물의 혼합믈을 사용한다.

4. 모든 입자가 침윤될 때까지 잘 진탕하고, 철야 또는 그이상 정치시켜 용매에 의한 입자의 침지(Soaking)가 완료되도록 한다. 상동액을 경사한다.

5. 수지와 저장칼럼에 채울 충분량의 용매를 슬러리화하여, 저장칼럼중에 신속하게 붓는다.

주의 : 슬러리를 붓기전에 칼럼을 동일용매로 먼저 채워야 하며, 저장칼럼은 부분적으로 채워야 한다. 슬러리양은 늘려도, 만족스런 결과가 얻어질 수 있지만 (a)충진과정중에서 더 큰 저장칼럼 또는 (b) 몇배의 저장칼럼 충진물이 필요하게 된다.

6. 저장칼럼 바로 아래를 테프론 마개로 밀봉한다. (미국특허 제4,131,547호의 제1도, 마개번호 3참조) 펌프에 연결한다. Ace Cat. No. 13265-25펌프 또는 유사한 용매-전달계를 사용할 때는 즉시 최대유속으로 용매를 펌프질하기 시작한다(약 20ml/min).

7. 칼럼에 흡착제가 완전히 채워질때까지 계속한다. 이과정도중에 압력은 칼럼의 최대허용치를 초과해서는 안된다(큰 칼럼의 경우에는 약 200psi, 분석용 칼럼의 경우에는 300psi) 대부분의 경우, 200psi미만의 압력이면 충분하다.

8. 압력이 최대한도치를 초과할때는, 유속을 감속시킨다. 이와같이 하면 압력이 감소하게 된다.

9. 칼럼을 흡착제로 다 채운후, 펌프를 중단시킨다. 압력을 제로로 떨어뜨린다. 저장칼럼을 분리하고, 예비-칼럼으로 바꾼다. 용매 및 소량의 흡착제로 예비-칼럼을 채우고, 칼럼이 완전히 충진될때까지 최대압력으로 펌프질한다. 펌프를 중단한후에는 언제나 압력을 서서히 감소시킨다. 이와 같이 해야 충진물중에 균열 또는 홈이생기는 것을 막을 수 있다.

10. 압력을 감소시키고 예비-칼럼을 주의해서 분리한다. 소스파툴라로 칼럼 상단부터 수mm (2내지4)의 충진물을 걷어내고, 칼럼 상단에 여지를 하나 또는 둘 놓고, 부드럽게 충진물 상부를 내리누르고, 칼럼상단을 테프론 마개로 밀봉한다. 칼럼을 펌프에 연결하고, 가압(보통 200psi 미만)하고 수지가 계속 충진되는지 칼럼상단의 유리벽을 통해 관찰한다. 만일 충진물이 계속 가라 앉으면 (큰 칼럼의 경우에 일어날 수 있다) 무효공간(dead space) 또는 홈이 생기에 되며, 9단계 과정을 반복해야 된다.

[제조실시예 12]

[테트라하이드로-A-30912A의 제조]

A-30912인자 A를 메탄올에 용해한다. 무수에탄올중에서 P_tO₂는 환원되어 P_t를 생성하는데, 이를 촉매로 사용하여 가압하에 반응이 완결될때까지 (약 2내지 3시간) 수소화하여 A-30912인자 A를 촉매적으로 환원시킨다. 반응혼합물을 여과하여 진공농축 시킨다. 잔사를 소량의 3급 A-부탄올에 용해하여 동결 건조시켜 테트라하이드로-A-30912A를 수득한다.

[제조실시예 13]

[테트라하이드로-A-30912B의 제조]

A-30912인자 B를 메탄올에 용해한다. 무수에탄올중에서 P_tO₂는 환원되어 P_t를 생성하는데, 이를 촉매로 사용하여 가압하에 반응이 완결될때까지 (약 2내지 3시간) 수소화하여 A-30912인자 B를 촉매적으로 환원시킨다. 반응혼합물을 여과하여 진공농축 시킨다. 잔사를 소량의 3-급부탄올에 용해하여 동결 건조시켜 테트라하이드로-A-30912B를 수득한다.

[제조실시예 14]

[테트라하이드로-A-30912D의 제조]

A-30912인자 D를 메탄올에 용해한다. 무수에탄올중에서 P_tO₂는 환원되어 P_t를 생성하는데, 이를 촉매로 사용하여 가압하에 반응이 완결될때까지 (약 2내지 3시간) 수소화하여 A-30912인자 D를 촉매적으로 환원시킨다. 반응혼합물을 여과하여 진공농축 시킨다. 잔사를 소량의 3급-부탄올에 용해하여 동결건조시켜 테트라하이드로-A-30912D를 수득한다.

[제조실시예 15]

[테트라하이드로-A-30912H의 제조]

A-30912인자 H를 메탄올에 용해한다. 무수에탄올중에서 P_tO₂는 환원되어 P_t를 생성하는데, 이를 촉매로 사용하여 가압하에 반응이 완결될때까지 (약 2내지 3시간) 수소화하여 A-30912인자 H를 촉매적으로 환원시킨다. 반응혼합물을 여과하여 진공농축시킨다. 잔사를 소량의 3급-부탄올에 용해하여 동결 건조시켜 테트라하이드로-A-30912H를 수득한다.

[실시예 1]

[A. A-30912인자 A의 탈아실화]

사면배지 A 및 증식성 배지 Ⅰ를 사용하고, 증식성 배지를 약 42시간 배양하여 제조실시예 1과 같은 방법으로 에이 유타엔시스를 발효시킨다. A-30912인자 A (1.5ℓ)의 에탄올에 용해된 약 19.7g의 A-30912인자 A를 함유한 340g의 조기질)를 발효배지에 가한다.

A-30912인자 A의 탈아실화를 칸디다 알비칸스에 대한 검정에 의해 조사한다. 씨이. 알비칸스에 대한 활성의 소실로 탈아실화의 완결을 확인할때까지 계속 발효시킨다.

[B. A-30912A핵의 분리]

B항에서와 같이 수득하고, 약 20g의 A-30912이자 A로부터의 핵을 함유하는 균사성 케이크를 버린다. 수득한 투명한 여액(약 93ℓ)을 4.5ℓ 전발효 육즙(100ℓ)을 여과한다. HP-20수지(DIAION High Porous Polymer HP-계열, Mitsubishi Chemical Industries Limited Tokyo. Japan)를 함유하는 칼럼을 200ml/min의 속도로 통과시킨다. 수득한 유출액을 버린다. 칼럼을 pH 6.5내지 7.5의 탈이온수로 (칼럼용량의 8배까지의 양) 세척하여 잔류하는 여과육즙을 제거한다. 이 세척수를 버리고, 물 : 메탄올(7 : 3) 용액 85ℓ을 사용하여 200내지 300ml/min의 속도로 칼럼을 용출시킨다.

다음 과정으로 용출을 조사한다. 매 용출분획에서 두 분취액을 취한다. 그중 한 분취액은 소량으로 농축하여 참조실시예 1과 같은 방법을 사용하여 미리스토일 클로라이드 같은 산염화물로 처리한다. 이 생성물 및 다른(비처리) 분취액에 대해 칸디다 알비칸스에 대한 활성을 검정한다. 만일 비처리 분취액은 활성을 나타내지 않으며, 아실화 분취액이 활성을 나타내면, 분획은 A-30912A핵을 함유한다. A-30912A핵을 함유하는 용출액을 소량으로 진공농축시켜, 동결건조하여 약 97g의 조액을 수득한다.

[C. 역상액체 크로마토그라피에 의한 A-30912A핵의 정제]

B항과 같은 방법으로 수득한 조 A-30912A 핵(25g)을 200ml의 물 : 아세토니트릴 : 아세트산 : 피리딘 (96 : 2 : 1 : 1)에 용해한다. 이용액을 Lichroprep RP-18, (입자크기 25내지 40마이크론) (MC/A Manuqacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH)로 충진한 4ℓ스텐레스강철 칼럼(8cm 80cm)상에 크로마토그래프 한다. 칼럼은 Chromatospac Prep 100유니트의 일부이다. (Jobin Yvon, 16-18 Ruedu Cana19 1160 Longjumeau, France). 칼럼을 90내지 100psi에서 작동시키고, 동일용매를 사용하여 유속이 약 60ml/min가 되도록 한다. 광학적 유니트(ISCO Type 6)가 부착된 UV모니터(ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504)를 사용하여 280mm에서 분리를 조사한다. 매분 분획을 받는데, 용량은 약 500ml가 된다.

280mm에서의 흡광도를 기준하여 A-30912A핵을 함유하는 분획을 합해 진공증발시키고 동결건조하여 2.6g의 핵을 수득한다. 크로마토그라피에 의한 분리를 완결짓는데 필요한 용매량은 7내지 8ℓ이다.

[DA30912A핵의 특징]

(a) 실험식 : C₃₄H₅₁N₇O₁₅

(b) 분자량 : 797.83

(c) 백색 무정형고체로, 물, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 메탄올에 용해하며 클로로포름, 톨루엔 및 디에틸에테르에 불용성이다.

(d) 적외부 흡수 스펙트럼(KBr 디스크)은 다음에서 흡수극대가 나타난다.

3340브로드(OH, H-결합); 2970,2930 및 2890 (CH스트레치, 지방족 CH₃,CH₂, CH그룹) 1660 및 1625(수개의 카보닐 C-0); 1510-1550; 1430-1450 (CH웨그) : 1310-1340,1230-1260,1080,835,650, 브로드 및 550브로드(cm^-1)

(e) 66%수성 디메틸포름아미드중 전위차 적정결과 pKa값이 약 7.35(초기 pH 7.32)인 적정가능그룹의 존재를 확인한다.

(f) HPLC체류시간 (K′) : 11.52분 조건은 다음과 같다.

[실시예 2]

A-30912A핵을, 기질로 테트라하이드로-A-30912A를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 방법으로 제조정제한다.

[실시예 3]

아큘리신 A를 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 방법으로 A-30912A핵을 제조정제 한다.

[실시예 4]

[A. A-30912인자 B의 탈아실화]

증식성 배지 Ⅰ을 사용하여 제조실시예 1과 같은 방법으로 에이 유타엔시스를 발효시킨다. 약48시간 배양한 후, 소량의 메탄올에 용해한 A-30912인자 B를 발효배지에 가한다.

A-30912인자 B의 탈아실화를 칸디다 말비칸스 또는 뉴로스포라 크라사에 대한 페이퍼-디스크 검정에 의해 조사한다. 탈아실화의 완결을 활성의 소실로 확인할때까지 발효를 계속한다.

[B. A-30912B핵의 분리]

A항과 같은 방법으로 수득한 전발효육즙을 여과한다. 균사성 케이크를 버리고 수득한 투명한 여액을 HP-20수지를 함유하는 칼럼을 통과시킨다. 수득한 유출액을 버린다.

칼럼을 pH 6.5내지 7.5의 탈이온수로 (칼럼 용량의 8배까지의 양) 세척하여 잔류하는 여과육즙을 제거한다. 이 세척수를 버리고, 물 : 메탄올(7 : 3) 용액을 사용하여 200내지 300ml/min의 속도를 칼럼을 용출시킨다.

다음 과정으로 용출을 조사한다. 매용출분획에서 두분취액을 취한다. 그중 한 분취액은 소량으로 농축하여, 참조실시예 1과 같은 방법을 사용하여 미리스토일 클로라이드 같은 산염화물로 처리한다. 이 생성물 및 다른(비처리) 분취액에 대해 칸디다 알비칸스에 활성을 검정한다. 만일 비처리 분취액은 활성을 나타내지 않으며 아실화 분취액이 활성을 나타내면, 분획은 A-30912B핵을 함유한다. A-30912B핵을 함유하는 용출액을 소량으로 진공농축시켜 동결건조하여 조핵을 수득한다.

[C. 역상액체 크로마토그라피에 의한 A-30912B핵의 정제]

B항과 같은 방법으로 수득한 조 A-30912B핵(25g)을 30ml의 물 : 아세토니트릴 : 야세트산 : 피리딘(96 : 2 : 1 : 1)에 용해한다. 이 용액을 Lichroprep RP-18(입자크기 25 내지 40마이크론)(MC/B Manufacturing Chemists, Inc., E/M, Cincinnati, OH.)로 충진한 4ℓ 스텐레스 강철 칼럼(8cm×80cm)상에 크로마토그래프한다. 칼럼은 Chromatospac Prep 100 유니트의 일부이다(Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, France). 칼럼을 90 내지 100psi에서 작동시키고 동일용매를 사용하여 유속이 약 60ml/min가 되도록 한다.

광학적 유니트(ISCO Type 6)가 부착된 UV 모니터(ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504)를 사용하여 280nm에서 분리를 조사한다.

280nm에서의 흡광도를 기준하여 A-30912B핵을 함유하는 분획을 합해 진공증발시키고 동결건조하여 순수한 A-30912B핵을 수득한다.

[실시예 5]

테트라하이드로-A-30912B를 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4와 같은 방법으로 A-30912 B핵을 제조정제한다.

[실시예 6]

[A. A-30912 인자 D의 탈아실화]

증식성 배지Ⅰ을 사용하여 제조실시예 1과 방법으로 에이·유타엔시스를 발효시킨다. 약 48시간 배양한 후 소량의 메탄올에 용해한 A-30912 인자 D를 발효배지에 가한다.

A-30912 인자 D의 탈아실화를, 칸디다 알비칸스 또는 뉴로스포라 크라사에 대한 페이퍼-디스크 검정에 의해 조사한다. 탈아실화의 완결을 활성의 소실로 확인활때까지 발효를 계속한다.

[B. A-30912D핵의 분리]

A항과 같은 방법으로 수득한 전발효육즙을 여과한다. 균사성 케이크를 버리고, 수득한 투명한 여액을 Hp-20 수지를 함유하는 칼럼을 통과시킨다. 수득한 유출액을 버린다. 칼럼을 pH 6.5 내지 7.5의 탈이온수(칼럼용량의 8배까지의 양)로 세척하여 잔류하는 여과육즙을 제거한다. 세척수는 버린다. 칼럼을 물 : 메탄올(7 : 3) 용액으로 용출한다.

다음 과정으로 용출을 조사한다 :

매용출분획에서 두 분취액을취한다. 한 분취액은 소량으로 농축하고 참조실시예 1과 같은 방법을 사용하여 미리스토일 클로라이드 같은 산염화물로 처리한다. 이 생성물 및 다른(비처리) 분취액을 칸디다알비칸스에 대한 활성에 대해 검정한다. 만일 비처리 분취액은 활성을 나타내지 않고, 아실화 분취액이 활성을 나타내면, 분획은 A-30912 D핵을 함유하고 있는 것이다. A-30912 D핵을 함유하는 용출액을 소량으로 진공농축시키고 동결건조시켜 조핵을 수득한다.

[C. 역상액체 크로마토그래프에 의한 A-30912 D핵의 정제]

B항과 같은 방법으로 수득한 조 A-30912 D핵을 실시예 4의 C항의 방법에 따라 정제한다.

280mm에서의 흡광도를 기준해서, A-30912 D핵을 함유하는 분획을 합해, 진공증발시키고 동결건조하여 순수한 A-30912 D핵을 수득한다.

[실시예 7]

테트라하이드로-A-30912D를 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6과 같은 방법으로 A-30912D핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 8]

[A. A-30912 인자 H의 탈아실화]

증식성배지 I을 사용하여 제조실시예 1과 방법으로 에이·유타엔시스를 발효시킨다. 약 48시간 배양한후, 소량의 메탄올에 용해한 A-30912 인자 H를 발효배지에 가한다.

A-30912 인자 H의 탈아실화를 칸디나 알비칸스 또는 뉴로스포라 크라사에 대한 페이퍼-디스크 검정에 의해 조사한다. 탈아실화의 완결을 활성의 소실로 확인할 때까지 발효를 계속한다.

[B. A-30912H핵의 분리]

A항과 같은 방법으로 수득한 전발효육즙을 여과한다. 균사성 케이크를 버리고, 수득한 투명한 여액을 Hp-20 수지를 함유하는 칼럼을 통과시킨다. 수득한 유출액을 버린다. 칼럼을 pH 6.5 내지 7.5의 탈이온수(칼럼용량 8의 배까지의 양)로 세척하여 잔류하는 여과육즙을 제거한다. 세척수는 버린다. 칼럼을 물 : 메탄올(7 : 3) 용액으로 용출한다.

다음 과정으로 용출을 조사한다:

매용출분획에서 두 분취액을 취한다. 한 분취액을 소량으로 농축하고 참조실시예 1과 같은 방법을 사용하여 미리스토일 클로라이드 같은 산염화물로 처리한다. 이 생성물 및 다른(비처리) 분취액을 칸디다 알비칸스에 대한 활서에 대해 결정한다. 만일 비처리 분취액은 활성을 나타내지 않고, 아실화 분취액이 활성을 나타내면, 분획은 A-30912 H핵을 함유하고 있는 것이다. A-30912 H핵을 함유하는 용출액을 소량으로 진공농축시키고 동결건조시켜 조핵을 수득한다.

[C. 역상-액체 크로마토그래프에 의한 A-30912 H핵의 정제]

B항과 같은 방법으로 수득한 조 A-30912 H핵을 실시예 4의 C항의 방법에 따라 정제한다.

280nm에서의 흡광도를 기준해서, A-30912 H핵을 함유하는 분획을 합해, 진공증발시키고 동결건조하여 순수한 A-30912 H핵을 수득한다.

[실시예 9]

테트라하이드로-A-30912H를 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법으로 A-30912 H핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 10]

A-30912 인자 H를 다음 방법을 사용하여 A-30912 인자 A로부터 제조하는 것을 제외하고는 A-30912 인자 H핵을 실시예 8과 같은 방법으로 제조 및 정제한다:

항생물질 A-30912 인자 A(19.6mg)를 디메틸포름아미드(1ml)에 용해한다. 산성 메탄올(3% HCl, 0.06ml)을 이 용액에 가한다. 생성된 용액을 실온에서 철야 교반하고 진공하에 증발건고한다. 수득한 잔사를 역상 실리카겔(LP-1/C18, 제조실시예 10과 같은 방법으로 제조) 및 용출용매로는 CH₃OH : H₂O : CH₃CN(7 : 2 : 1)을 사용하여 제조실시예 7과 같은 방법으로 HpLpLc를 실시하여 1.4mg의 A-30912인자 H(R¹및 R⁴모두 하이드록시이고, R²는 수소이고, R³는 메톡시이며, R은 ) 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물)를 수득한다.

[실시예 11]

R³가 에톡시이고 R이 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 R³가 에톡시인 구조식 Ⅰ의 A-30912H-형 핵을 실시예 8의 방법으로 제조 및 정제한다. 기질은 실시예 10에서 사용된 방법에 의해 제조한다.

[실시예 12]

R³가 n-프로폭시이고, R이 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 R³가 n-프로폭시이 구조식 Ⅰ의 A-30912H-형 핵을 실시예 8의 방법으로 제조 및 정제한다. 기질은 실시예 10에서 사용된 방법에 의해 제조한다.

[실시예 13]

R₃가 이소부톡시이고, R이 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 R³가 이소부톡시인 구조식 Ⅰ의 A-30912H-형 핵을 실시예 8의 방법으로 제조 및 정제한다. 기질은 실시예 10에서 사용된 방법에 의해 제조한다.

[실시예 14]

R³가 n-텐틸옥시이고, R은 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법으로 R³가 n-펜틸옥시인 구조식 Ⅰ의 A-30912 H핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 15]

R³가 n-헥실옥시이고, R은 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법으로 R³가 n-헥실옥시인 구조식 Ⅰ의 A-30912 H핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 16]

R³가 에톡시이고, R은 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법으로 R³가 에톡시인 구조식 Ⅰ의 A-30912 H핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 17]

R³가 2-에틸-1-부톡시이고, R은 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법으로 R³가 2-에틸-1-부톡시 구조식 Ⅰ의 A-30912 H핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 18]

R³가 3-메틸-1-부톡시이고, R은 리놀레오일인 일반식 Ⅱ 화합물을 기질로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9과 같은 방법으로 R³가 3-메틸-1-부톡시인 구조식 Ⅰ의 A-30912 H핵을 제조 및 정제한다.

[실시예 19]

[A. 항생물질 S-31794/F-1의 탈아실화]

증식성 배지 I을 사용하여 제조실시예 1과 같은 방법으로 에이ㆍ유타엔시스를 배양한다. 약 48시간 배양한후, 소량의 메탄올에 용해한 항생물질 S-31794/F-1을 발요배지에 가한다.

S-31794/F-1의 탈아실화를 칸디다 알비칸스에 대한 페이퍼 디스크 검정으로 조산한다. 탈아실화의 완결이 활성의 소실로 나타날때까지 계속 발효시킨다.

[B. S-31794/F-1핵의 분리]

A항과 같은 방법으로 수득한 전발효육즙을 여과한다. 균사성 케이크를 버리고, 수득한 투명한 여액을 Hp-20 수지(DIAION High Porous Polymer HP-계열, Mitoutishi Chemical Industris Limited, Tokyo, Japan)를 채운 칼럼을 통과시킨다. 수득한 유출액을 버리고, pH 6.5 내지 7.5인 탈이온수(칼럼용량의 8배까지의 양)로 칼럼을 세척하여 잔류하는 여과육즙을 제거한다. 세척수를 버리고, 물 : 메탄올(7 : 3) 용액으로 칼럼을 용출한다. 다음 방법으로 용출을 조사한다. 매용출분획으로부터 두 분취액을 취한다. 한 분취액은 소량으로 농축하여 참조실시예 1과 같은 방법으로 미리스토일 클로라이드 같은 산염화물로 처리한다. 이 생성물 및 다른(비처리) 분취액을 칸디다 알비칸스에 대한 활성에 대해 검정한다. 말약 비처리 분취액은 활성을 나타내지 않고 아실화 분취액이 활성을 나타내면, 분획에는 S-31794/F-1핵이 함유되어 있다. S-31794/F-1핵을 함유하는 용출물을 소량으로 진공농축하고 동결건조하여 조핵을 수득한다.

[C. 역상액체 크로마토그래피에 의한 S-31794/F-1핵의 정제]

B항과 같은 방법으로 수득한 조 S-31794/F-1핵을 실시예 4의 C항의 방법에 따라 정제한다.

280nm에서의 흡광도를 기준해서, S-31794/F-1핵을 함유하는 분획을 합해 진공증발시켜 동결건조하여 순수한 S-31794/F-1핵을 수득한다.

[애보트 및 후꾸다 유도체의 제조]

다음 과정은 “활성에스테르”법에 의해 일반식 화합물을 제조하는 것을 설명한다. 이 과정에 의해 제조한 특정화합물은 R⁵가 CH₃(CH₂)₁₁-이고 R¹, R², R³및 R⁴는 각각의 핵의 경우와 같은 일반식 Ⅲ 화합물이다.

[참조 제조실시예 1]

[2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트의 제조]

에틸렌클로라이드(650ml)중 n-트리데카노산(시그마 케미칼코)(12.5g), 2,4,5-트리클로로페놀(11.5g) 및 N,N-디사이클로헥실 카보디이미드(12.0g)의 용액을 실온에서 16시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고 진공중 건조시켜서 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트(22g)을 얻는다. 물질은 용출제로 톨루엔을 사용하여 실리카겔(보엘름)상 칼럼 크로마토그라피로 정제한다. 획분들은 검출용 단파 UV광을 사용하여 TLC로 측정된다. 정제된 생성물을 함유하는 획분들을 모아서 진공중 농축건조시킨다.

[참조실시예 1]

[2,4,5-트리클로로페닐-n-트리데카노에이트를 이용한 A-30912H핵의 아실화]

디메틸포름아미드(DMF, 600ML)중 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트(6.0g) 및 A-30912A핵(4.5g)이 함유된 용액을 실온에서 16시간동안 교반한다. 진공중 용매를 제거하여 잔사(12g)를 얻는다. 잔사를 메틸렌클로라이드(500ml)와 함께 45분간 슬리리화하고 혼합물을 여과한다. 여액을 버린다. 남아 있는 고체를 메탄올(500ml)로 추출하고 메탄올 수출물을 여과하여 진공중 농축하면 조생성물(5.0g)이 얻어진다.

조생성물은 다음과 같이 역상 HPLC로 정제한다.

메탄올(5ml)에 용해시킨 조생성물(1g)의 시료를 LP-1/C₁₈수지(실시예 25 참조)로 충진시킨 1×32인치 스테인레스 스틸 칼럼속에 주입한다. 칼럼을 3 : 3 : 4 H₂O/CH₃OH/CH₃CN을 함유하는 용매제로 용출시킨다. 용출은 이중펌프(밀톤-로이)를 사용하여 1000 내지 1500psi의 압력에서 11 내지 12ml/분의 유출속도로 수행된다. 용출액은 자외선 검출기(ISCC-UA-5)로 280mm에서 측정된다. 획분들은 2분마다 모아진다(21 내지 23ml). 원하는 생성물을 포함하는 획분들을 모아서 진공중 건조시킨다.

생성물의 수율 : 550mg

위에 설명된 크로마토그라피를 1g의 조생성물 시료로 4회 반복하여 다음과 같은 추가의 정제된 시료를 얻는다: 620mg, 520mg.

메탄올(5ml)에 용해시킨 조생성물(1g)의 시료를 LP-1/C₁₈수지(제조 11참조) 충진시킨 1×32인치 스테인레스 스틸 칼럼속에 주입한다. 칼럼을 3 : 3 : 4 H₂O/CH₃OH/CH₃CN을 함유하는 용매제로 용출시킨다. 용출은 LDC 이중펌프(밀톤-로이)를 사용하여 1000 내지 1500psi의 압력에서 11 내지 12ml/분의 유출속도로 수행된다.

용출액은 자외선 검출기(ISCC-UA-5)로 280nm에서 측정된다. 획분들은 2분마다 모아진다(21 내지 24ml). 원하는 생성물을 포함하는 획분들을 모아서 진공중 건조시켜서 표제생성물을 얻는다 : 620mg, 520mg, 670mg 및 490mg. 정제된 표제생성물의 총중량 : 2.8g

위의 조작에 따라서 4.0g의 A-30912 A핵을 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트와 반응시켜서 2.6g의 정제된 표제생성물을 얻는다. 두 제제의 물질(5.4g)을 합친다. FDMS에 의한 질량이온 : (M⁺+Na⁺) : 1016 이론치 : M⁺: Na=1016) 용출계로 2 : 1 : 2 H₂O/CH₃OH/CH₃CN을 사용한 분석용 HPLC(C₁₈마이크로 본드어팩, 워터즈 코)은 1개의 피크만을 나타낸다.

[참조실시예 2]

[A-30912B핵의 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트를 이용한 아실화]

디메틸포름아미드(DMF, 200ml)중 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트(3.3-밀리몰) 및 A-30912 B핵 1밀리몰이 함유된 용액을 실온에서 16시간 동안 교반한다. 진공중 용매를 제거시켜 잔사를 얻는다. 잔사를 메틸렌 클로라이드(300ml)와 함께 45분간 슬러리화하고 혼합물을 여과한다. 여액을 버린다. 남아있는 고체를 메탄올(300ml)로 추출하고 메탄올 추출물을 여과하여 진공중 농축시켜서 조생성물을 얻는다. 조생성물은 다음과 같이 역상 HPLC에 의해 정제된다 :

메탄올에(5ml) 용해한 조생성물(1g)을 LP-1/C₁₈수지(제조실시예 10 및 11참조)를 충진한 1-×32-인치 스텐레스 강철칼럼에 주입한다. 칼럼을 H₂O/CH₃OH/CH₃CN(3 : 3 : 4) 용매계로 용출한다. 용출은 1000 내지 1500psi에서 LDC 듀플레스 펌프(밀톤-로이)를 사용하여 11 내지 12ml/min의 유속으로 시행한다. 유출액은 UV 검출기(ISCO-UA-5)로 280nm에서 조사한다. 매2분마다 분획을 받는다(21 내지 24ml). 목적생성물을 함유하는 분획을 모아 진공건조시켜 표제생성물을 수득한다.

정제된 생성물은 역상 C₁₈플레이트(왓트만 KC₁₈) 및 1 : 2 : 2(V/V)H₂O/CH₃OH/CH₃CN를 함유하는 용매계를 사용하여 박충 크로마토그라피(TLC)로 분석된다. 전개후 플레이트를 UV라이트하에서 관찰하여 생성물을 검출한다.

[참조실시예 3]

[2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트에 의한 A-30912 D의 아실화]

디메틸포름아미드(DMF)(200ml)중 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트(2.3밀리몰) 및 A-30912 D 핵(1밀리몰) 용액을 실온에서 16시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득한다. 잔사를 메렌클로라이드(300ml)와 함께 45분 슬러리화하고, 혼합물을 여과한다. 여액을 버리고, 잔류교체를 메탄올(300ml)로 추출하고, 메탄올 추출물을 여과하고 진공농축하여 조생성물을 수득한다. 조생성물을 참조실시예 2와 같은 방법으로 역상에 의해 정제한다.

[참조실시예 4]

[2,4,5-트리클로로-페닐 n-트리데카노에이트에 의한 A-30912 H핵의 아실화]

디메틸포름아미드(DMF)(200ml)중 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트(2.3밀리몰) 및 A-30912H 핵(1밀리몰) 용액을 실온에서 16시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득한고, 이 잔사를 메틸렌 클로라이드(300ml)로 45분간 슬러리화하고, 혼합물을 여과한다. 여액을 버리고, 잔사 고체를 메탄올(300ml)로 추출하고, 메탄올 추출물을 여과하고 진공 농축하여 조생성물을 수득한다. 조생성물을 참조실시예 2와 같은 방법으로 역상 HPLC에 의해 정제한다.

[참조실시예 5]

R³가 n-프로폭시이고, R⁵기 CH₃(CH₂)₁₁-인 일반식 Ⅱ화합물을, R³가 n-프로폭시인 일반식 Ⅰ 화합물(실시예 12의 방법으로 제조)를 출발물질로 사용하여 참조실시예 4의 방법에 따라 제조한다.

[참조실시예 6]

[2,4,5-트리클로로-페닐 n-트리데카노에이트에 의한 S-31794-1핵의 아실화]

디메틸포름아미드(DMF)(200ml)중 2,4,5-트리클로로페닐 n-트리데카노에이트(3.3밀리몰) 및 S31794/F-1의 핵(1밀리몰) 용액을 실온에서 16시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득하고, 이 잔사를 메틸렌 클로라이드(300ml)로 45분간 슬러리화하고, 혼합물을 여과한다. 여액을 버리고, 잔사 고체를 메탄올(300ml)로 추출하고, 메탄올 추출물을 여과하고 진공농축하여 조생성물을 수득한다. 조생성물을 참조실시예 2와 같은 방법으로 역상 HPLC에 의해 정제한다.

[데보노그룹 Ⅰ 유도체의 제조]

R⁵가

인 일반식 Ⅱ 화합물을 제조하는 다음과정은 일반식 Ⅲ의 데보노Ⅰ 화합물의 제법을 설명한다.

[참조 제조실시예 2]

[N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산의 제조]

n-도데카노일 클로라이드(8.74g, 40밀리몰)을 피리딘(100ml)중에 P-아미노벤조산(5.5g : 40밀리몰)을 용해한 용액에 적가한다. 혼합물을 3시간 교반하고 물(3ℓ)에 붓는다. 생성된 침전을 여과하여 진공건조하여 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산(11.01g)을 수득한다.

[참조 제조실시예 3]

[N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐에스테르의 제조]

N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산(11.01g, 34.5밀리몰), 2,4,5-트리클로로페놀(7.5g, 38밀리몰 및 N, N′-디시클로헥실 카보디이미드(6.94g, 34.5밀리몰)를 메틸렌클로라이드(250ml)에 용해한다. 혼합물을 3.5시간 실온에서 교반하고 여과한다. 여액을 진공증발시켜 잔사를 수득하는데, 이를 아세토니트릴/물로부터 결정화하여 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산(12.84g)의 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르를 수득한다.

[참조실시예 7]

[A-30912 A 핵의 아실화]

A-30912 A 핵(8.16g : 10.2밀리몰 및 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산(4.72g, 10.2밀리몰)의 2,4,5트리클로로페닐 에스테르를 디메틸포름아미드(100ml)에 용해한다. 용액을 실온에서 15시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득하고 이를 디에틸에테르로 2회 세척하고 세척액을 버린다.

세척잔사를 메탄올(50ml)에 용해하고, 고정상으로 Prep Pak-500/C₁₈컬럼(Waters Associates, Inc.)을 사용하여 Prep LC/System 500 유니트(Waters Associates, Inc., Milford, Mass)에 의한 역상 HPLC로 정제한다. 칼럼을 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)으로 500psi에서 균일하게 용출시킨다. 분획을 실리카겔판 및 용매계로 H₂O/CH₃OH/CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)을 사용하여 TLC분석한다. 목적생성물을 함유하는 분획을 합해 동결건조하여 A-30912A 핵의 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조일 유도체(3.5g)을 생성한다.

[참조 실시예 8]

[A-30912 B 핵의 아실화]

A-30912 B 핵(10.2밀리몰) 및 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산의 2,4,5트리클로로페닐에스테르(0.2밀리몰)를 디메틸포름아미드(100ml)에 용해한다. 용액을 실온에서 15시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득하고 이를 디에틸에테르로 2회 세척하고, 세척액을 버린다. 세척진사를 메탄올(50ml)에 용해하고 고정상으로 Prep Pak-500/C₁₈칼럼(Waters Associates, Inc.)을 사용하여, “Prep LC/System 500” 유니트(Waters Associates, Inc., Milford, Mass)에 의한 역상 HPLC로 정제한다. 칼럼을 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)으로 500psi에서 균일하게 용출시킨다. 분획을 실리카겔판 및 용매계로 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)을 사용하여 TLC분석한다. 목적생성물을 함유하는 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 B핵의 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조일 유도체를 생성한다.

[참조 실시예 9]

[A-30912 D 핵의 아실화]

A-30912 D 핵(10.2밀리몰) 및 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산의 2,4,5트리클로로페닐에스테르(10.2밀리몰)를 디메틸포름아미드(100ml)에 용해한다. 용액을 실온에서 15시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득하고 이를 디에틸에테르로 2회 세척하고, 세척액을 버린다. 세척진사를 메탄올(50ml)에 용해하고 고정상으로 Prep Pak-500/C₁₈칼럼(Waters Associates, Inc.)을 사용하여, “Prep LC/System 500” 유니트(Waters Associates, Inc., Milford, Mass)에 의한 역상 HPLC로 정제한다. 칼럼을 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)으로 500psi에서 균일하게 용출시킨다.

분획을 실리카겔판 및 용매계로 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)을 사용하여 TLC분석한다. 목적생성물을 함유하는 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 D핵의 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조일 유도체를 생성한다.

[참조 실시예 10]

[A-30912 H핵의 아실화]

A-30912 H핵(10.2밀리몰) 및 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르를 디메틸포름아미드(100ml)에 용해한다. 용액을 실온에서 15시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득하고 이를 디에틸에테르로 2회 세척하고, 세척액을 버린다. 세척진사를 메탄올(50ml)에 용해하고 고정상으로 Prep Pak-500/C₁₈칼럼(Waters Associates, Inc.)을 사용하여, “Prep LC/System 500” 유니트(Waters Associates, Inc., Milford, Mass)에 의한 역상 HPLC로 정제한다. 칼럼을 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)으로 500psi에서 균일하게 용출시킨다. 분획을 실리카겔판 및 용매계로 H₂O:CH₃OH:CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)을 사용하여 TLC분석한다. 목적생성물을 함유하는 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 H핵의 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조일 유도체를 생성한다.

[참조 실시예 11]

R³가 이소부톡시인 일반식 Ⅰ화합물(실시예 13과 같은 방법으로 제조)을 출발물질로 사용하여 R³가 이소부톡시이고, R⁵가

인 일반식 Ⅲ 화합물을 참조실시예 9와 같은 방법에 따라 제조한다.

[참조 실시예 12]

[S 31794 F-1핵의 아실화]

S 31794 F-1핵(10.2밀리몰) 및 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐에스테르를 디메틸포름아미드(100ml)에 용해한다. 용액을 실온에서 16시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔사를 수득하고 이를 디에틸에테르로 2회 세척하고, 세척액을 버린다. 세척진사를 메탄올(50ml)에 용해하고 고정상으로 Prep Pak-500/C₁₈칼럼(Waters Associates, Inc.)을 사용하여, “Prep LC/System 500” 유니트(Waters Associates, Inc., Milford, Mass)에 의한 역상 HPLC로 정제한다. 칼럼을 H₂O : CH₃OH : CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)으로 500psi에서 균일하게 용출시킨다. 분획을 실리카겔판 및 용매계로 H₂O : CH₃OH : CH₃CN(25 : 65 : 10V/V)을 사용하여 TLC분석한다. 목적생성물을 함유하는 분획을 합해 동결건조하여 S-3179 F-1핵의 N-(n-도데카노일)-P-아미노벤조일 유도체를 생성한다.

[데보노그룹 Ⅱ 유도체의 제조]

R⁵가

인 일반식 Ⅲ 화합물을 제조하는 다음 과정은 일반식 Ⅲ의 데보노 Ⅱ화합물의 제법을 설명한다.

[참조 제조 실시예 4]

[P-(n-옥틸옥시)벤조산의 제조]

10% 수성 수산화나트륨(120ml)중 P-하이드록시 벤조산(19.2g, 150밀리몰) 용액을 미리 80℃로 가열한 디메틸설폭사이드(DMSO)(480ml)에 가한다. 이용액에 n-옥틸 브로마이드(28.95g, 150밀리올)을 적가한다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 교반한후 빙수(1200ml)중에 붓는다. 농염산(30ml)을 가하고 혼합물을 정치시켜 침전을 완결시킨다. 침전을 모아, 건조하고, 아세토니트릴-물로부터 결정화한다.

융점 : 97 내지 99℃

C₁₅H₂₂O₃의 분석치

계산치 : C 71.97, H 8.86

실측치 : C 71.72, H 9.10

[참조 제조실시예 5]

[p-(n-옥틸옥시)벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르의 제조]

p-(n-옥틸옥시)벤조산(6.18g, 24.7밀리몰), 2,4,5-트리클로로페놀(5.39g, 27.2밀리몰) 및 N,N′-디시클로헥실카보디이미드(4.94g, 24.7밀리몰)를 메틸렌 클로라이드(20ml)에 용해한다. 혼합물을 실온에서 18시간 교반하고 여과한다. 여액을 증발시켜 오일을 수득하고, 이를 CH₃CN : H₂O로부터 결정화하여 P-(n-옥틸옥시) 벤조산의 2,4,5-트리클로로 페닐 에스테르를 수득한다.

NMR 분석 : δ 4.02(2H, t, J=3Hz), δ 7.0(1H, d, J=4Hz), 7.23(S, 1H), 7.3(S, 1H) 8.08(d, 1H, J=4Hz).

[참조 실시예 13]

[A-30912 A핵의 아실화]

A-30912 A핵(14.2g, 17.8밀리몰) 및 P-(n-옥틸옥시)벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐에스테르(15.32g, 35.7밀리몰)을 디메틸포름아미드(500ml)에 용해한다. 용액을 실온에서 16 내지 20시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하고 잔사를 디에틸에테르로 2회, 메틸렌클로라이드로 2회 세척한다. 세척액을 버리고, 세척진사를 에틸아세테이트 : 메탄올(1 : 3, 80ml)에 용해하고 고정상으로 실리카겔를 사용하여 “Prep LC/System 500” 유니트를 이용한 HPLC에 의해 정제한다. 칼럼을 메탄올 : 에틸아세테이트(1 : 4 내지 2 : 3)용매계로 단계적으로 용출한다. 분획에 대해 에틸아세테이트 : 메탄올(3 : 2 V/V)을 용매계로 사용한 실리카겔(Merck) TLC로 분석한다. A-30912 A핵이 함유되지 않은 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 A 핵의 p-(n-옥틸옥시)벤조일 유도체를 수득한다.

수율 : 7.13g, M+23, 1052(FDMS로)

[참조 실시예 14]

[A-30912 B 핵의 아실화]

A-30912 B 핵(17.8밀리몰) 및 p-(n-옥틸옥시) 벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐에스테르(35.7밀리몰)를 디메틸포름아미드(150ml)에 용해한다. 이 용액을 실온에서 16 내지 20시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하고 잔사를 디에틸에테르로 2회, 메틸렌클로라이드로 2회 세척한다. 세척액을 버리고, 세척진사를 에틸아세테이트 : 메탄올(1 : 3, 80ml)에 용해하고 고정상으로 실리카겔를 사용하여 “Prep LC/System 500” 유니트를 이용한 HPLC에 의해 정제한다. 칼럼을 메탄올 : 에틸아세테이트(1 : 4 내지 2 : 3) 용매계로 단계적으로 용출한다. 분획에 대해 에틸아세테이트 : 메탄올(3 : 2 V/V)을 용매계로 사용한 실리카겔(Merck) TLC로 분석한다. A-30912 B핵이 함유되지 않은 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 B핵의 p-(n-옥틸옥시)벤조일 유도체를 수득한다.

[참조 실시예 15]

[A-30912 D핵의 아실화]

A-30912 D핵(17.8밀리몰) 및 p-(n-옥틸옥시) 벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐에스테르(35.7밀리몰)를 디메틸포름아미드(150ml)에 용해한다. 이 용액을 실온에서 16 내지 20시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하고 잔사를 디에틸에테르로 2회, 메틸렌클로라이드로 2회 세척한다. 세척액을 버리고, 세척잔사를 에틸아세테이트 : 메탄올(1 : 3, 80ml)에 용해하고 고정상으로 실리카겔를 사용하여 “Prep LC/System 500” 유니트를 이용한 HPLC에 의해 정제한다. 칼럼을 메탄올 : 에틸아세테이트(1 : 4 내지 2 : 3) 용매계로 단계적으로 용출한다. 분획에 대해 에틸아세테이트 : 메탄올(3 : 2 V/V)을 용매계로 사용한 실리카겔(Merck) TLC로 분석한다. A-30912 D핵이 함유되지 않은 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 D핵의 p-(n-옥틸옥시)벤조일 유도체를 수득한다.

[참조 실시예 16]

[A-30912 H핵의 아실화]

A-30912 H핵(17.8밀리몰) 및 p-(n-옥틸옥시) 벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐에스테르(35.7밀리몰)를 디메틸포름아미드(150ml)에 용해한다. 이 용액을 실온에서 16 내지 20시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하고 잔사를 디에틸에테르로 2회, 메틸렌클로라이드로 2회 세척한다. 세척액을 버리고, 세척진사를 에틸아세테이트 : 메탄올(1 : 3, 80ml)에 용해하고 고정상으로 실리카겔를 사용하여 “Prep LC/System 500” 유니트를 이용한 HPLC에 의해 정제한다. 칼럼을 메탄올 : 에틸아세테이트(1 : 4 내지 2 : 3) 용매계로 단계적으로 용출한다. 분획에 대해 에틸아세테이트 : 메탄올(3 : 2 V/V)을 용매계로 사용한 실리카겔(Merck) TLC로 분석한다. A-30912 H핵이 함유되지 않은 분획을 합해 동결건조하여 A-30912 H핵의 p-(n-옥탈옥시)벤조일 유도체를 수득한다.

[참조실시예 17]

R³가 n-헥실옥시인 일반식 Ⅰ 화합물(실시예 15의 방법에 의해 제조)을 출발물질로 사용하여 R³가 n-헥실옥시이고 R⁵가

인 일반식 Ⅲ 화합물을 참조실시예 16의 방법에 따라 제조한다.

[참조실시예 18]

[S-31794/F-1핵의 아실화]

S-31794/F-1핵(17.8밀리몰) 및 p-(n-옥틸옥시) 벤조산의 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르(35.7밀리몰)을 디메틸포름아미드(150ml)에 용해한다. 이 용액을 실온에서 16 내지 20시간 교반한다. 용매를 진공에서 제거하고 잔사를 디에틸에테르로 2회, 메틸렌클로라이드로 2회 세척한다. 세척액을 버리고, 세척진사를 에틸아세테이트 : 메탄올(1 : 3, 80ml)에 용해하고 고정상으로 실리카겔를 사용하여 “Prep LC/System 500” 유니트를 이용한 HPLC에 의해 정제한다. 칼럼을 메탄올 : 에틸아세테이트(1 : 4 내지 2 : 3) 용매계로 단계적으로 용출한다. 분획에 대해 에틸아세테이트 : 메탄올(3 : 2 V/V)을 용매계로 사용한 실리카겔(Merck) TLC로 분석한다. S-31794 F-1핵이 함유되지 않은 분획을 합해 동결건조하여 S-31794 F-1핵의 p-(n-옥탈옥시)벤조일 유도체를 수득한다.

[참조실시예 19]

일반식(Ⅲ) 화합물의 항진균활성은 시험관내 표준 디스크 확산법 및 한천희석 시험법이나 마우스를 이용한 생체내 표준시험법에 의해 입증설명될 수 있으며 이에 의해 전신 진균감염에 대해 유효도를 평가한다. 일반식(Ⅲ)의 대표적인 화합물의 항진균 시험의 결과가 다음 표 Ⅳ 내지 Ⅷ에 실려있다.

표 Ⅳ와 Ⅴ는 한천평판 디스크-확산법에 의한 참조실시예 1,7 및 13의 화합물의 생체내 시험결과를 제공한다. 표 Ⅳ에서 활성은 시험미생물의 성장 억제에 요구되는 물질의 최소억제농도(MIC) (㎍/디스크)로 측정된다. 표 Ⅴ는 한천희석법에 의한 칸디다 알비칸스 균주 다섯에 대한A 30912 A핵의 n-트리데카노일 유도체(일반식 Ⅲ, R⁵는 n-C₁₂H₂₅이다)의 생체내 시험결과를 제공한다. 표 Ⅳ에서 활성은 시험미생물 억제에 요구되는 물질의 최소억제농도(MIC, ㎍/ml)로 측정된다.

마우스에서 칸디다 알비칸스 A-26에 의해 야기되는 감염에 대한 유도체의 유효도를 평가하기 위한 생체내 시험결과가 표 Ⅶ에 주어지며 이때 활성은 ED₅₀치(시험동물의 50%를 치료하는데 요하는 용량;)mg/kg)로 측정된다.

ED₅₀치가 얻어지지 못하는 경우 활성은 유의적인 항진균효과가 관찰되는 최저용량으로 나타내진다. 이 시험에서 체중 18 내지 20g인 일군의 숫 알비노마우스(특정 병원성이 없음)를 칸디다 알비칸스 A-26으로 정맥내 감염시킨다. 동물들은 감염 24시간전 8분전 약 50뢴트겐/분으로 X-선을 조사(총용량 400)시켜서 감염시생물에 대한 면역반응을 감소시킨다. 감염 0, 4 및 24시간후에 각군의 마수스에게 시험화합물을 33% 폴리에틸렌 글리콜-물의 현탁액으로서 피하내 등급을 매긴 용량으로 투여한 각 동물에 대한 사망일자를 기록한다. 처리가 잔존시간을 유의적으로 연장하는지의 여부를 결정하기 위하여 평균 사망일의 스튜던트 t테스트 통계적 비교가 감염-특정용량수준에서 처리동물 및 10마리의 감염-비처리된 동물사이에 이루어진다.

표 Ⅷ은 실시예 1,7 및 13의 화합물의 경구투여후 흡수시험의 결과를 제공한다. 이 시험에서 마우스에게 33% PEG 400-물에 현탁시킨 시험화합물 416mg/kg의 용량으로 투여한다.

일정간격으로 안와동에서 혈액시료를 채취하여 다음과 같이 항생활성을 검정한다. 20ml의 전체혈액을 함유하는 7mm디스크를 아스페르길루스 몬테비덴시스 A 35137로 접종된 한천상에 놓는다. 30℃에서 400시간 배양후 혈액시료로부터의 억제대를 시험화합물로부터 얻어진 표준치와 비교하고 혈액시료중 화합물의 양을 계산한다.

[표 Ⅳ]

[표 Ⅴ]

[표 Ⅵ]

[표 Ⅶ]

[표 Ⅷ]

Claims (1)

1. 다음 일반식 Ⅱ의 환상 펩티드 항생물질과 악티노플라나세과 미생물이 생성한 탈아실화 효소를 수성매질중에서 접촉시키는 것을 특징으로 하여 다음 일반식 Ⅰ의 환상펩티드핵 및 그의 산부가염을 제조하는 방법.

   

   상기 식에서, R¹은 H 또는 OH인데, R¹이 H일 때, R²는 H이며, R³및 R⁴는 모두 H 또는 OH이고, R은 스테아로일 또는 리놀레오일이고, R¹이 OH일 때 R²는 H이고, R³는 OH이고, R⁴도 OH이고, R은 스테아로일, 리놀레오일 또는 팔미토일이거나, R³가 C₁-C₆알킬옥시이고, R은 스테아로일 또는 리놀레오일거나 R¹,R³,R⁴모두 OH일 때 R²는-

   

   이고, R은 미리스토일이다.

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