DD209810A5

DD209810A5 - Verfahren zur herstellung von a-21978c-cyclopeptidderivaten

Info

Publication number: DD209810A5
Application number: DD83251131A
Authority: DD
Inventors: Manuel Debono
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1982-05-21
Filing date: 1983-05-20
Publication date: 1984-05-23
Also published as: KR840005076A; RO86721B; DK220983D0; ES522561A0; ATA178383A; PH21382A; HU192955B; PT76701A; PT76701B; GR79259B; PL242096A1; FI831746L; ES8407012A1; US4399067A; RO86721A; DK220983A; FI831746A0; AT380022B; EG16042A; KR860002185B1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptidderivaten mit der aus dem Formelblatt hervorgehenden Formel I, worin R eine durch -O-R hoch 2 und X substituierte Benzoylgruppe ist, in welcher R hoch 2 fuer C tief 8 - C tief 15 - Alkyl steht und X Wasserstoff, Chlor,Brom, Iod, Nitro, C tief 1-C tief 3- Alkyl, Hydroxy, C tief 1 - C tief 3 - Alkoxy oder C tief 1 - C tief 3 - Alkylthio bedeutet und worin R hoch 1 fuer Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe steht, oder von pharmazeutish unbedenklichen Salzen hiervon durch Umsetzung eines entsprechenden Kerns von A-21978C der Formel I, worin R jedoch Wasserstoff ist, so dass sich eine freie Aminogruppe ergibt, und die beiden anderen freien Aminogruppen entweder ungeschutzt oder gegebenenfalls durch eine Schutzgruppe geschuetzt sind, oder eines entsprechenden pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon mit einem Acylierungsmittel, bei dem es sich um das der substituierten Benzoylgruppe R entsprechende freie Benzoesaeurederivat oder einen aktivierten Ester hiervon handelt. Eine bevorzugte hiernach erhaeltliche Verbindung ist N tief Trp -p -(n-Dodecyloxy) benzoyl-A-21978C.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Derivate von Cyclopeptiden, die antibiotische Eigenschaften besitzen, und auf das Verfahren zur Herstellung dieser antibiotisch wirksamen Derivate auf semisynthetischem Weg.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung;

Die große Wahrscheinlichkeit und ständige Gefahr der Entwicklung antibiotikaspezifischer resistenter Stämme pathogener Mikroorganismen macht die Entwicklung neuer Antibiotika zu einem großen Bedürfnis. Vor allem Krankheitserreger innerhalb der grampositiven Arten von Staphylococcus und Streptococcus sind häufig resistent gegenüber herkömmlich verwendeten Antibiotika, wie Penicillin und Erythromycin, und in diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingewiesen auf W. 0. Faye, Principles of Medicinal Chemistry, Seiten 684 bis 686 (1974). Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung

neuer und besonders wirksamer Antibiotika.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch neue A-^ISTec-Cyclopeptidderivate und pharmazeutisch unbedenkliche Salze hiervon gelöst, die sich als wirksame antibiotische Mittel erwiesen haben.

Diese neuen Derivate können hergestellt werden durch Umsetzung des Kerns von A-21978C, der durch Deacylierung des geeignet blockierten Komplexes von A-21978C oder irgendeines seiner geeignet blockierten Einzelfaktoren

_Q,

w C_,

C₄ oder C₅ erhältlich ist, mit

gewünschten Acylierungsmittel oder einem aktivierten Derivat hiervon.

Die erfindungsgemäßen A-21978C-Cyclopeptidderivate haben die Formel I ο NH2

HO2

HOaC^

worin R eine substituierte Benzoylgruppe der folgenden Formel ist

in welcher R für Cg-C^-Alkyl steht, und X Wasserstoff,

10 Chlor, Brom, Iod ,Nitro, C..-C_-Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃-AIkoxy oder C^C^-Alkylthio ist, und worin R Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, oder sind Salze dieser Peptide, und diese Verbindungen sind entweder wertvolle semisynthetische antibakterielle Mittel oder

Zwischenprodukte zur Herstellung solcher Mittel.

In der vorliegenden Beschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet, bei denen es sich großteils um herkömmliche Bezeichnungen handelt:

AIa = Alanin

Asp = Asparaginsäure

GIy = Glycin

Kyn = Kynurenin

Orn = Ornithin

Ser = Serin

Thr = Threonin

Trp = Tryptophan

t-BOC = t-Butoxycarbonyl

cbz = Benzyloxycarbonyl

DMF = Dimethylformamid

THF = Tetrahydrofuran

HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

NMR = Η-magnetische Kernresonanz

TLC = DünnschichtChromatographie

UV = Ultraviolett

Die Antibiotika A-21978C sind eng verwandte saure Peptidantibiotika.

Die Antibiotika A-21978C werden in US-PS 4 208 403 beschrieben, die hiermit eingeführt wird. Wie aus US-PS 4 208 403 hervorgeht, enthält der Antibiotikumkomplex A-21978 eine überwiegende Komponente, nämlich den Faktor C, bei dem es sich selbst wiederum um einen Komplex aus eng verwandten Faktoren handelt. Der Faktor C von A-21978, der als Komplex A-21978C bezeichnet wird, enthält die Einzelfaktoren C₀,C., C₂, C₃, C. und C₅. Die Faktoren C., C₂ und C_ sind überwiegende Faktoren, während die Faktoren C_Q, C. und C_ untergeordnete Faktoren darstellen. Die Struktur der Faktoren von A-21978C geht aus

15 der folgenden Formel II hervor

L-Asp

Ν»

D-AIa φ

{ D-Ser

L-Asp *

f 3MG

L-Orn *

25 ¹^ ^L;^Kyn

GIy ο

L-Thr

t L-Asp

30 L-Asp

t L-Trp

I NH

II

- 5 - _t~

worin 3MG für L-threo-3-Methylglutarriinsäure steht und R einen spezifischen Fettsäurerest bedeutet. Die spezi-

N fischen Reste R der einzelnen Faktoren haben die im

folgenden angebenen Bedeutungen:

Faktoren von A-21978C Rest R^N

C₁ 8-Methyldecanoyl

C₂ 1O-Methylundecanoyl

C₃ 1O-Methyldodecanoyl ;

10 C₀ C_i0-Alkanoyl*

C. C₁₀-Alkanoyl*

Cc C₁₉-Alkanoyl*

* Die genaue Art dieser Reste ist bis heute noch nicht bestimmt worden.

Steht man vor dem Problem einer Deacylierung eines Peptidantibiotikums, dann läßt sich nur äußerst schwer erkennen, ob es ein Enzym gibt, das man für diesen Zweck verwenden kann. Die Auffindung eines solchen Enzyms ist sogar noch schwieriger, wenn das antibiotische Substrat einen Cyclopeptidkern enthält. Enzyme verfügen über ein hohes Ausmaß an Spezifität, und Unterschiede im Peptidrest und in der Seitenkette des Substrats beeinflussen daher das Ergebnis des Versuchs einer Deacylierung. Eine Reihe von Mikroorganismen bilden darüberhinaus eine große Anzahl Peptidasen, die unterschiedliche Teile des Peptidrests angreifen. Dies führt häufig zu schwer handhabbaren Produktgemischen.

Das Enzym, durch dessen Einsatz sich die Deacylierung der Fettsäureseitenkette von der a-Aminogruppe von Tryptophan erreichen läßt, kann durch einen Mikororganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise durch den Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder eine Variante hiervon, gebildet werden. Zur Bewerkstelligung einer solchen Deacylierung gibt man ein Antibiotikum, das ausgewählt ist aus dem Komplex von A-21978C, den

-β-

Faktoren C_Q, C ,

C₃, C. und C₅ von A-21978C, dem

blockierten Komplex von A-2197 8C oder den blockierten

Faktoren C_Q, Cw

C₃, C₄ und C₅ von A-21978C, zu einer

Kultur des Mikroorganismus. Die Angaben blockierte Faktoren von A-21978C und blockierter Komplex von A-21978C beziehen sich entweder auf Einzelfaktoren von A-21978C oder Faktorengemische (Komplex), worin eine Aminoschutzgruppe an der δ-Aminogruppe von Ornithin beim jeweiligen Einzelfaktor oder beim Faktorengemisch angeordnet ist. Man läßt die Kultur solange auf das Substrat einwirken, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Das dabei erhaltene entsprechende A-21978C-Cyclopeptid wird von der Fermentationsbrühe durch Anwendung bekannter Methoden abgetrennt.

Die durch diese enzymatisehen Deacylierungen erhaltenen Cyclopeptide haben die folgende Formel III

HO2

/S/

0=.

CH₃ U H-f^

HOscr

worin R¹ und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, oder sind Salze hiervon.

Durch Entfernung des Acylrests vom Komplex von A-2197.8C oder von den Einzelfaktoren C₀, C₁, C₂, C_, C. und C,-von A-21978C gelangt man zur Verbindung der Formel III, worin R und R¹ jeweils Wasserstoff bedeuten. Das deacylierte Molekül ist das gemeinsame Cyclopept id, das in jedem der Faktoren des Antibiotikums A-21978C vorhanden ist. Der Einfachheit halber wird diese Verbindung als Kern von A-21978C bezeichnet. Diese Verbindung läßt sich auch durch folgende Formel IV darstellen:

D-AIa	y \ e L-Thr t L-Asp	GIy
t L-Asp t L-Orn	L-Asp I	D-Ser 3MG
\ Gl	L-Trp I NHs	L-Kyn 0

IV

worin 3MG für L-threo-3-Methylglutaminsäure steht. 35

Die Verbindungen der Formel III, worin R° oder R¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben, werden hergestellt durch Deacylierung der geeignet blockierten Faktoren C₀, C₁, C„, C_, C. und C₅ des Antibiotikums A-21978C. Diese Verbindungen werden hierin der Einfachheit halber als blockierte Kerne von A-21978C bezeichnet. Diese blokkierten Verbindungen eignen sich als Zwischenprodukte zur Herstellung bestimmter Peptide der Formel I, nämlich derjenigen Verbindungen, bei denen R eine Aminoschutzgruppe bedeutet.

Man kann den Kern von A-21978C oder die blockierten Kerne von A-21978C selbstverständlich in Form von freien Aminen oder von Säureadditionssalzen erhalten. Hierzu läßt sich jedes geeignete Säureadditionssalz verwenden, wobei jedoch pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze bevorzugt sind. Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden solche Salze verstanden, die zur Chemotherapie warmblütiger Tiere brauchbar sind.

Das Verfahren zur Herstellung des Kerns von A-21978C der Formel III wird unter Einsatz verschiedener Mikroorganismen eingehend in der am gleichen Tage wie die vorliegende Anmeldung eingereichten Parallelanmeldung mit dem internen Aktenzeichen X-5279 beschrieben. Das bevorzugte Deacylierungsenzym, nämlich Actinoplanes utahensis NRRL 12052, ' ist bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, Illinois

61604, V.St.A. hinterlegt und von dort unter der Nummer NRRL 12052 frei beziehbar. Das spätere Herstellungsbeispiel 1 zeigt die Herstellung des Kerns von A-21978C durch Fermentation unter Verwendung des Komplexes von A-21978C als Substrat und von Actinoplanes utahensis

NRRL 12052 als Mikroorganismus. Andere Kulturen von

Actinoplanaceae, die sich zur Herstellung des Kerne von A-21978C der Formel III verwenden lassen, sind ebenfalls

beim Northern Regional Research Laboratory hinterlegt und von dort unter den folgenden Hinterlegungsnummern frei beziehbar:

5 Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

Actinoplanes sp. NRRL 8122

Actinoplanes sp. NRRL 12065 Streptosporangium roseum

var. hollandensis NRRL 12064

Die Wirksamkeit eines bestimmten Stammes eines Mikroorganismus aus. der Familie der Actinoplanaceae zur Durchführung der Deacylierung wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Hierzu beimpft man ein geeignetes Wachstumsmedium mit dem Mikroorganismus. Die Kultur wird zwei oder drei Tage bei etwa 28°C auf einem Rotationsschüttler bebrütet. Sodann versetzt man die Kultur mit einem der Substratantibiotika und hält den pH-Wert des Fermentationsmediums auf etwa pH 6,5. Die Kultur wird bezüglich ihrer Aktivität durch Untersuchung mit Micrococcus luteus überwacht. Ein Verlust an antibiotischer Aktivität ist ein Anzeichen dafür, daß der Mikroorganismus das zur Deacylierung geeignete Enzym bildet. Dies muß jedoch unter Anwendung einer der folgenden Methoden verifiziert werden:

(1) Analyse durch HPLC bezüglich Anwesenheit des intakten Kerns oder (2) Reacylierung mit einer geeigneten Seitenkette, wie Lauroyl, n-Decanoyl oder n-Dodecanoyl, zur Wiederherstellung einer Aktivität.

™ Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen, die durch Acylierung eines Kerns von A-21978C (Verbindung der Formel III) gebildet werden, wodurch Verbindungen mit der Cephemstruktur der folgenden

Formel I entstehen: 35

15

NHs

V/

Hat/

.0

-H

NlH (

COsH

HOaC

20

HOaC^

25

worin R eine substituierte Benzoylgruppe der folgenden Formel ist

30

NX

35

in welcher R für Cg-C^-Alkyl steht, und X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃-AIkYl, Hydroxy, C₁-C₁-AIk- oder CCAIkYItMo ist und worin R Wassersto

oxy oder C₁-C₃-AIkYItMo ist, und worin R Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, oder die Salze hiervon gebildet werden.

In der substituierten Benzoylgruppe können die Funktionen

" 2

-C- und -OR am Benzolring selbstverständlich in ortho-, meta- oder para-Stellung zueinander orientiert sein. Die j para-Orientierung ist für diese Gruppen bevorzugt. Der Substituent X kann an jeder verfügbaren Stellung des Benzolrings vorhanden sein, die nicht von diesen beiden Gruppen besetzt ist.

Unter der Angabe Alkyl werden vorliegend sowohl geradkettige als auch verzweigte Kohlenwasserstoffketten verstanden.

Die Angabe Aminoschutzgruppe bezieht sich auf die üblichen Aminoschutzgruppen, die mit den anderen funktionellen Gruppen im Molekül von A-21978C verträglich sind. Bevorzugt werden solche Aminoschutzgruppen, die sich nach Acylierung der jeweiligen Verbindung leicht abspalten

*5 lassen. Beispiele für geeignete Schutzgruppen gehen aus "Protective Groups in Organic Synthesis" von Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981, Kapitel 7, hervor. Besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind

t-Butoxycarbonyl und Benzoyloxycarbonyl. 30

Beispiele für Cq-C ^-Alkylreste, die als Substituent R

erfindungsgemäß bevorzugt sind, sind folgende:

(a) -(CH_n) CH_, worin η eine ganze Zahl von 7 2 η 3

bis 14 ist, und

(b) -(CH₉) CH(CH₀) CH-, worin r und s unabhängig

^- JL ^S J

voneinander für eine Zahl von 0 bis 12 stehen, wobei r + s jedoch nicht größer als 12 oder nicht kleiner als 5 sein dürfen.

Die Verbindungen der Formel I sind zur Bildung von Salzen befähigt, welche ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung sind. Solche Salze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung und Reinigung der Verbindungen. Pharmazeutisch unbedenkliche Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Amin- und Säureadditionssalze sind besonders brauchbar.

Die Verbindungen der Formel I haben beispielsweise fünf freie Carboxylgruppen, die Salze bilden können. Zur Erfindung gehören daher Teilsalze, Mischsalze und vollständige Salze an diesen Carboxylgruppen. Bei der Herstellung dieser Salze sollen pH-Bereiche von über 10 vermieden werden, da die Verbindungen bei solchen pH-Werten instabil sind.

Zu Beispielen für geeignete Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze von Verbindungen der Formel I gehören die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Zu geeigneten Aminsalzen von Verbindungen der Formel I gehören die Ammoniumsalze sowie die primären, sekundären und tertiären C,-C.-Alkylammonium- und Hydroxy-C^-C.-alkylammoniumsalze. Beispielhafte Aminsalze sind die durch Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, s-Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Diisopropylamin, Cyclohexylamin, Ethanolamin, Triethylamin oder 3-Araino-1-propanol gebildeten Verbindungen.

Die kationischen Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze von Verbindungen der Formel I werden unter Anwendung von Verfahren hergestellt, wie sie für die Bildung kationischer Salze üblich sind. Hierzu löst man beispielsweise die

] freie Säureform einer Verbindung der Formel I in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmem Methanol oder Ethanol und versetzt eine solche Lösung dann mit einer Lösung, die eine stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wässrigem Methanol enthält. Das auf diese Weise gebildete Salz kann durch Anwendung üblicher Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Filtration oder Verdampfung des Lösungsmittels.

In ähnlicher Weise lassen sich auch die Salze organischer Amine bilden. Zu diesem Zweck kann man beispielsweise das jeweilige gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung einer Verbindung der Formel I in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Ethanol, geben und das Lösungsmittel und den Überschuß an Amin dann durch Verdampfung entfernen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ferner auch freie Aminogruppen und können daher Säureadditionssalze bilden, die ebenfalls Teil der Erfindung sind. Zu Beispielen für geeignete Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I gehören die Salze, die durch übliche Umsetzung mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, wie mit Chlorwasserstoffsäure. Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Kampfersäure. Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulf onsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure,

30 Benzoesäure oder Zimtsäure.

Die Verbindungen der Formel I werden hergestellt durch Acylierung einer Verbindung der Formel III unter Anwendung von Methoden, wie sie zur Bildung einer Araidbindung üblich sind. Diese Acylierung wird im allgemeinen durchgeführt, indem man die jeweilige Verbindung mit einem aktivierten Derivat der substituierten Benzoesäure (Formel V) umsetzt, die der gewünschten Acylgruppe (R)

- 14 1 entspricht:

HOC—j- -!j—O-R^

VC

ν ^;

Hierin haben X und R die bereits oben erwähnten Bedeutungen .

Zu Beispielen für Verbindungen der Formel V gehören folgende: p-(n-Octyloxy)benzoesäure, ρ-(n-Decyloxy)benzoesäure, p-(n-Dodecyloxy)benzoesäure, ρ-(n-Pentadecyloxy)-benzoesäure, m-Chlor-p-(n-dodecyloxy)benzoesäure, p-Chlor-m-(n-decyloxy)benzoesäure, m-(n-Dodecyloxy)-pmethylbenzoesäure, m-Methoxy-p-(n-octyloxy)benzoesäure und m-Hydroxy-p-(η-pentyloxy)benzoesäure.

Unter einem aktivierten Derivat wird ein Derivat verstanden, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels reaktionsfähig macht für eine Kupplung mit der primären Aminogruppe unter Bildung der Amidbindung, die die Seitenkette mit dem Kern verbindet. Geeignete aktivierte Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden zu ihrer Anwendung als Acylierungsmittel für ein primäres Amin sind dem Fachmann geläufig. Bevorzugte aktivierte Derivate sind

(a) Säurehalogenide, wie Säurechloride, (b) Säureanhydride, on

wie Alkoxyameisensäureanhydride oder Aryloxyameisensäureanhydride, oder (c) aktivierte Ester, wie 2,4,5-Trichlorphenylester, N-Hydroxybenztriazolester oder N-Hydroxysuccinimidester. Zu anderen Methoden für eine Aktivierung der Carboxylfunktion gehören eine Umsetzung der Carbon-

säure mit einem Carbonyldiimid, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N'-Diisopropy]carbodiimid, unter Bildung eines reaktionsfähigen Zwischenprodukts, das infolge seiner Instabilität nicht isoliert wird. Eine solche

Umsetzung mit dem primären Amin wird direkt im Reaktionsgemisch durchgeführt.

Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß sich die Verbindungen der Formel I unter Anwendung selektiver Acylierungsverfahren und Einsatz von Aminoschutzgruppen herstellen lassen. Verwendetman beispielsweise eine Verbindung der Formel III, worin R¹ und R Wasserstoff bedeuten, als Ausgangsmaterial, dann kann es sowohl an der ct-Aminogruppe von Tryptophan als auch an der 6-Aminogruppe von Ornithin zu einer Acylierung kommen, so daß N_, , N₀ -Diacylderivate gebildet werden. Die Herstellung von Derivaten, die an der α-Aminogruppe von Tryptophan monoacyliert sind, erfolgt daher vorzugsweise durch Acylierung einer Verbindung der Formel III, in welcher die δ-Aminogruppe von Ornithin (nämlich die Stellung R ) durch eine Aminoschutzgruppe blockiert ist. Solche Ausgangsmaterialien werden vorzugsweise hergestellt, indem man den Faktor A-21978C vor seiner Deacylierung an dieser Stellung blockiert. Die Aminogruppe von Kynurenin (nämlich die Stellung R¹ in der Formel III) ist die von den drei freien Aminogruppen im Kern von A-21978C am wenigsten reaktionsfähige Gruppe. Eine Acylierung der Stellung R der Formel I erfordert daher gewöhnlich keine Blockierung

25 der Aminogruppe von Kynurenin.

Aus dem folgenden Reaktionsschema I gehen allgemeine Verfahren für die Herstellung von Verbindungen der Formel I hervor. In diesem Reaktionsschema haben die

enthaltenen Symbole folgende Bedeutungen:

[*] = Rest von A-21978C

N = a-Aminogruppe von Tryptophan

N = 6-Aminogruppe von Ornithin

N = Aromatische Aminogruppe von Kynurenin

R = Angegebene Substituenten der Formel I R^ = Acylgruppe des natürlichen Faktors

B = Aminoschutzgruppe

Acyl = Acylierungsstufe

Deacyl = Deacylierungsstufe

Block = Acylxerung mit einer Aminoschutzgruppe

Deblock = Entfernung einer ?iminoschutzgruppe

Im Reaktionsschema I entsprechen die N -Monoacylderivate von A-21978C der allgemeinen Formel III.

α>-P

OJ Q

U co r^ σι

CN

O (O O C O

Ö O

tr

-Pcn

ie S α)

ο ω co C O•Η+>

λ; <ΰQ) Oi

ω ο cc -ζ. μ

Ω ²\ I /²

2:

I *

ro 0) Q

H H H

CC O Oi

Acy

2°

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I stellt die Methode über einen aktiven Ester dar. Hierzu wird vor allem der 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten Seitenkettensäure (Formel V) als Acylierungsmittel verwendet. Bei diesem Verfahren setzt man eine überschüssige Menge des aktiven Esters mit dem Kern bei Raumtemperatur in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel um, wie DMF, THF, Diethylether oder Dichlormethan. Die Umsetzungszeit ist nicht kritisch, obgleich eine Reaktionszeit von etwa 24 bis 120 Stunden bevorzugt ist. Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt, beispielsweise durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Siliciumdioxidgel-C^-Umkehrphasenharz als stationäre Phase und eines Gemisches aus I^O/CH-OH/CH^CN als Lösungsmittelsystem.

Die 2,4,5-Trichlorphenylester werden hergestellt durch Behandlung der Seitenkettensäure (Formel V) mit 2,4,5-Trichlorphenol in Anwesenheit eines Kupplungsmittels, wie N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid. Andere Methoden zur Herstellung der aktiven Ester liegen im Rahmen des fachmännischen Könnens.

**> Die substituierten Säuren der Formel V und die aktivierten Derivate hiervon sind entweder bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Die Alkoxybenzoesäuren lassen sich am besten ausgehend von einer geeigneten Hydroxy-

benzoesäure herstellen, indem man ein entsprechendes Alkylhalogenid mit dem Dinatriumsalz der jeweiligen Hydroxybenzoesäure umsetzt. Die für diese Verfahren als Ausgangsmaterialien benötigten Hydroxybenzoesäuren und substituierten Derivate hiervon sind entweder bekannte Verbindungen

oder können in an sich bekannter Weise hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen A-2197 8C-Cyclopeptide können als antibakterielle Mittel entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Die Verbindung von A-21978C wird gewöhnlich natürlich zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel verabfolgt.

Die Verbindungen lassen sich intravenös oder intramuskulär verabreichen, indem man sie in Form einer sterilen wässrigen Lösung oder Suspension injiziert, der gewünschtenfalls verschiedene herkömmliche pharmazeutisch unbedenkliche Konservierungsmittel, Pufferungsmittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel zugesetzt worden sind. Zur Bildung isotonischer Lösungen können auch andere Zusätze zugegeben werden, wie Kochsalz oder Glukose.

Menge und Art solcher Zusätze bewegen sich im Rahmen des fachmännischen Könnens.

Für eine orale Anwendung kann man die Verbindungen in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern oder Hilfsstoffen in Form von Kapseln, Tabletten oder Pulvern anwenden. Menge und Art solcher Träger oder Hilfsstoffe liegen im Rahmen des fachmännischen Könnens.

Die Dosis einer Verbindung von A-21978C ist abhängig von einer Reihe von Überlegungen, wie beispielsweise der jeweils zu verwendenden Verbindung sowie der Art und Stärke der zu behandelnden Infektion. Die für eine Verabreichung geeigneten Dosierungsbereiche und Dosierungseinheiten lassen sich unter Zugrundelegung der MIC-Werte ™ und ED ₀-Werte sowie der Toxizitätsdaten in Verbindung mit anderen Faktoren ermitteln, wie der Pharmakokinetik, den Merkmalen des Patienten oder Wirts und dem für die Infektion verantwortlichen Mikroorganismus.

• Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert, welche nicht als beschränkend aufzufassen sind.

Herstellungsbeispiel 1

Herstellung des Kerns von A-21978C 10

A. Fermentation von Actinoplanes utahensis

Man stellt eine Vorratskultur von Actinoplanes utahensis

NRRL 12052 her und hält diese auf einer Agarschräge. Zur

'5 Herstellung der Schräge verwendet man eines der folgenden Medien:

Medium A	Bestandteile	Menge
Vorgekochtes Hafermehl	60,0 g
Hefe	2,5 g
K₂HPO₄	1/0 g
Czapek-Mineralmischung*	5,0 ml
Agar	25,0 g
Deionisiertes Wasser c	i.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert vor dem Autoklavieren beträgt etwa 5,9. Er

wird durch Zugabe von NaOH auf pH 7,2 eingestellt. Nach dem Autoklavieren liegt der pH-Wert bei etwa 6,7.

* Die Czapek-Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile -.. Mencre

35 *-

FeSO₄-7H₂O (gelöst in 2 ml konz HCl) 2 g

KCl 100 g

MgSO₄-7H₂O 100 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Medium B

Bestandteile

Kartoffeldextrin Hefeextrakt Enzymhydrolysat von Casein* Rinderextrakt Glucose Maisstärke Flei schpepton Rohrzuckermelasse MgSO₄"7H₂O

CaCO₃

Czapek-Mineralmischung Agar Deionisiertes Wasser

Menge

q. s,

5,0	g	g
0,5	g	ml
3,0	g	g
0,5	g	auf 1 Liter
12,5	g
5,0	g
5,0	g
2,5	g
0,25 g
1,0
2,0
20,0

* N-Z-Amin A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ, 20 V.St.A.

Die Schräge wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 12052 inokuliert und die inokulierte Schräge etwa 8 bis 10 Tage bei 30⁰C inkubiert. Unter Verwendung von etwa der Hälfte des Schrägenwachstums inokuliert man dann 50 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung:

Bestandteile

Vorgekochtes Hafermehl Saccharose

Hefe ,

Getrocknete Kornschlempe* K₂HPO₄

Czapek-Mineralmischung Deionisiertes Wasser

q.s,

Menqe

20,0 g 20,0 g 2,5 g 5,0 g 1,0 g 5,0 ml auf 1 Liter

Das Ganze wird mit NaOII auf pH 7,4 eingestellt, wobei der pH-Wert nach Autoklavieren bei etwa 6,S liegt.

* National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, NY, V.St.A.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben etwa 72 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der sich in einem Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm mit 250 U/min bewegt.

Das inkubierte vegetative Medium kann direkt zur Inokulierung eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Wahlweise und vorzugsweise bewahrt man dieses vegetative Medium bis zu einem späteren Gebrauch auf, indem man die Kultur in einer Dampfphase aus flüssigem Stickstoff hält. Für eine solche Aufbewahrung füllt man die Kultur in folgender Weise in eine Anzahl kleiner Fläschchen ab: In jedes Fläschchen gibt man 2 ml inkubiertes vegetatives Medium und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung (Cryobiol 10, 364 bis 367 (1973)). Die so gebildeten Suspensionen werden in einer Dampfphase aus flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

ο Unter Verwendung einer in dieser Weise hergestellten aufbewahrten Suspension (1 ml) beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe, welches die oben beschriebene Zusammensetzung hat. Das inokulierte vegetative Medium der ersten Stufe wird dann in der oben beschriebenen Weise inkubiert.

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum inokuliert man 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe,

das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium der ersten Stufe hat, mit 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums der ersten Stufe. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 fassenden Erlenmeyer-Weithals-

kolben etwa 48 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der unter einem Bogen von 5 cm Durchmesser mit 250 U/min bewegt wird.

Mit dem in der oben beschriebenen Weise hergestellten inkubierten vegetativen Medium der zweiten Stufe (80 ml) inokuliert man dann 10 1 eines der folgenden sterilen Produktionsmedien:

Medium I

Bestandteile

Erdnüßmehl

|5 Lösliches Fleischpepton Saccharose

Menge	(g/D
10,0
5,0
20,0
0,5
1,2
0,25
auf 1 :
Liter

MgSO₄-7H₂O Leitungswasser q.s,

Dieses Medium hat nach 45 Minuten langer Sterilisation durch Autoklavierung bei 121°C unter einem Druck von etwa 1,1 bis 1,3 bar einen pH-Wert von etwa 6,9. 25

Medium II

Bestandteile Menge (g/l)

Saccharose 30,0

Pepton 5,0

K₂HPO₄ 1,0

KCl 0,5

MgSO₄-VH₂O 0,5

PeSO_₄-7H₂O 0,002 Deionisierte.s Wasser q.s* auf 1 Liter

- 23 -

Das Ganze wird mit HCl auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, wobei der pH-Wert nach Autoklavierung bei etwa 7,0 liegt.

	Medium III	Menge (g/l)
Bestandteile		20,0
Glucose		3,0
NH₄Cl		2,0
Na₂SO₄		. 0,019
ZnCl₂		0,304
MgCl₂'6H₃O		0,062
FeCl₃-6H₂O		0,035
MnCl₂-4H₂O		0,005
CuCl₂-2H₂O		6,0
CaCO₃		0,67
KH₂PO₄*		σ.s. auf 1 Liter
Leitungswasser

* Getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Am Ende liegt der pH-Wert bei etwa 6,6

25

Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 14 1 fassenden Fermentationsgefäß etwa 66 Stunden bei einer Temperatur von etwa 30⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mittels herkömmlicher Rührer bei ™ einer Geschwindigkeit von etwa 60 0 U/min gerührt und mit steriler Luft so belüftet, daß die gelöste Menge an Sauerstoff auf über 30 % an Luftsättigung bei atmosphärischem Druck gehalten wird.

- 24 1 ^Β· Deacylierung von A-21978C

Man fermentiert Actinoplanes utahensis unter Anwendung des im Abschnitt A beschriebenen Verfahrens und Einsatz des Mediums A für die Schräge und des Produktionsmediums I, wobei man das Produktionsmedium etwa 67 Stunden inkubiert. Das Fermentationsmedium versetzt man mit rohem Komplex von A-21978C (100 g), der gemäß US-PS 4 208 403 hergestellt wird.

Die Deacylierung des Komplexes von A-21978C wird durch Untersuchung gegenüber Micrococcus luteus überwacht. Man läßt die Fermentation bis zur vollständigen Deacylierung weiterlaufen, die sich durch ein Verschwinden der Aktivität gegenüber Micrococcus luteus äußert, was nach einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden der Fall ist.

C. Isolierung des Kerns von A-21978C

Die in der im Abschnitt B beschriebenen Weise erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (20 1) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.) filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das erhaltene Filtrat wird durch eine Säule geführt, . . die 1,5 1 HP-20-Harz enthält (DIAION Hochporöses Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japan). Der dabei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann zur Entfernung restlicher filtrierter Brühe mit deionisiertem Wasser (10 1) gewaschen. Das dabei anfallende Waschwasser wird ebenfalls verworfen. Sodann eluiert man die Säule mit Gemischen aus Wasser und Acetonitril (jeweils 10 1 in Verhältnissen von 95 : 5, 9 : 1 und 4 : 1),

35 wobei man Fraktionen von jeweils 1 1 auffängt.

Die Elution wird papierchromatographisch unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15 : 10: 3 : 12) und Detektion der Verbindungen durch UV-Fluoreszenz überwacht. In diesem System haben die Faktoren von A-21978C einen R_f-Wert von etwa 0,56, während der Kern von A-21978C einen R_f-Wert von etwa 0,32 aufweist. Das Produkt läßt sich ferner auch durch analytische HPLC unter Einsatz von Siliciumdioxidgel-C.. ~ und eines Lösungsmittelsystems aus Wasser und Methanol (3:1) das 0,1 % Ammoniumacetat enthält, und Detektion des Kerns mit einem UV-Monitor bei 254 nm überwachen.

Die Fraktionen, die den Kern enthalten, werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Acetonitrils eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 40,6 g halbgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

20 D. Reinigung des Kerns von A-21978C

Man löst den gemäß obigem Abschnitt C erhaltenen halbgereinigten Kern von A-21978C (15 g)in75 ml eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (82 : 10 : 8), das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält. Die Lösung wird.in eine 4,7 χ 192 cm messende Säule gepumpt, die 3,33 1 Siliciumdioxidgel-C. ο enthält (Quantum LP-1, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N.J. 07006, V.St.A.). Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelsystem entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 350 ml gesammelt. Die Auftrennung wird bei 280 nm mit einem UV-Monitor überwacht. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung der Lösungs-

^OJ mittel eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 5,2g gereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

- 26 1 E. Eigenschaften des Kerns von A-21978C

Der Kern von A-21978C hat folgende Eigenschaften:

5 (a) Form: Weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV-Licht fluoresziert

(b) Empirische Formel: C₆»H N_l6O₂₆ 10 (c) Molekulargewicht: 1466

Cd) Löslichkeit: Löslich in Wasser

(e) Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) zeigt 15 Absorptionsmaxima bei:

3300 (breit), 3042 (schwach), 2909 (schwach), 1655 (stark), 1530 (stark), 1451 (schwach),

1399 (mittel), 1222 (mittel), 1165 (schwach),

1063 (schwach) und 758 (mittel bis schwach) cm 20

(f) Das UV-Absorptionsspektrum in Methanol zeigt Maxima bei 223 nm ( £= 41482) und 260 nm

(S =8687).

(g) Die elektrometrische Titration in 66%-igem

wässrigem Dimethylformamid ergibt die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit pK -

Si

Vierten von etwa 5,2,6,7, 8,5 und 11,1 (anfänglicher pH = 6,12).

_ 2 7 —

^ Herstellungsbeispiel 2

Anderes Verfahren zur Herstellung des Kerns von A-21978C

Der Kern von A-21978C wird nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren mit Ausnahme bestimmter Änderungen im Abschnitt B hergestellt. Die Kultur von Actinoplanes utahensis wird zuerst etwa 48 Stunden inkubiert. Das Substrat ist ein halbgereinigter Komplex von A-21978C (50 g). Nach Zusatz des Substrats wird etwa 16 Stunden inkubiert. Die filtrierte Brühe wird durch eine Säule geführt, die 3,1 1 HP-20-Karz enthält. Die Säule wird mit 10 Volumina Wasser gewaschen und dann mit einem Gemisch aus Wasser und Acetonitril (95 : 5) eluiert. Die Elution wird wie beim Herstellungsbeispiel 1 überwacht. Nach Sammeln von 24 1 Eluat wird weiter unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches" aus Wasser und Acetonitril (9 : 1) eluiert. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden mit diesem Lösungsmittel- gemisch eluiert. Die dabei anfallenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung von Acetonitril eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 24,3 g halbgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

Dieser halbgereinigte Kern von A-21978C (24,3 g) wird in Wasser (400 ml) gelöst. Die Lösung wird in eine 4,7 χ 192 cm messende Stahlsäule gepumpt, die 3,33 1 SiIiciumdioxidgel-C.o (Quantum LP-1) enthält, das in einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (8 :1 : 1)

^ou zubereitet ist, welches 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einem Druck von etwa 136 bar entwickelt, wobei man Fraktionen mit jeweils 350 ml sammelt. Die Elution wird durch UV-Licht bei 280 nm

überwacht. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung der Lösungsmittel eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 14 g hochgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

- 28 ' 1·- Herstellungsbeispiel· 3

Herstellung der Faktoren C₂ und C von N_n -t-BOC-A-21978C :

5 . ' . . '.

Ein gemäß US-PS 4 208 403 hergestelltes Gemisch der Faktoren C₂ und C₃ von A-21978C (10 g) wird unter Beschallung (200 mg/ml) in Wasser (50 ml) gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird von 4,05 durch Zugabe von 5n NaOH (3,6 ml) auf 9,5 eingestellt. Man gibt Di-tbutyldicarbonat (3,0 ml) zu und rührt das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch manuelle Zugabe von 5n NaOH (6,5 ml werden innerhalb von 2 Stunden zugesetzt)

15 auf 9,5 gehalten.

Die Reaktion wird periodisch durch TLC über Siliciumdioxidgel unter Anwendung eines Lösungsmittelsystems : aus CH₃CN und HO (7 : 3 und 8 : 2) und Detektion durch 20 UV-Licht überwacht.

.':.· Nach etwa 10 Minuten trübt sich die Reaktionslösung : rasch ein und erhöht sich der Verbrauch an Base. Nach

. etwa 30 Minuten erniedrigt sich die Geschwindigkeit der oc . '

•^J Erhöhung der Eintrübung und des Verbrauchs an Base, was die Beendigung der Reaktion anzeigt. Unabhängig davon ,wird die Reaktion zur Sicherstellung ihrer Beendigung jedoch noch weitere 90 Minuten fortgeführt. Am Ende der zweistündigen Umsetzungszeit wird das Reaktionsmaterial

sofort lyophilisiert, wodurch man zu 12,7 g der Faktoren

C₀ und C, von KL· -t-BOC-A-21978 crelanqt. 2 3 Orn

.. ; Unter Anwendung ähnlicher Verfahren führt man auch zwei.

Reaktionen mit 10g Material und eine Reaktion mit 30 g

Material durch. Bei jeder dieser Reaktionen beträgt die

' ! Umsetzungszeit nur 40 Minuten. Die zwei Versuche mit 10 g' Material führen zu 11,9 g bzw. zu 12,1 g Produkt. Die Umsetzung mit 30 g Material ergibt 35,4 er Produkt.

Herstellungsbeispiel 4

Herstellung des Kerns von A-21978C-N _n~t-BOC

A. Fermentation von Actinoplanes utahensis

Man fermentiert Actinoplanes utahensis nach dem im Herstellungsbeispiel 1 unter Abschnitt A beschriebenen Verfahren unter Verwendung des schrägen Mediums A und des Produktionsmediums I, wobei man das Produktionsmedium etwa 66 Stunden inkubiert.

B. Deacylierung des Komplexes von N_Q -t-BOC-A-21978C

Der Komplex von A-21978C-N _n~t-BOC (1185 g an rohem Substrat, das etwa 176 g Komplex an A-21978C enthält) wird zum Fermentationsmedium gegeben. Die Deacylierung wird wie beim Herstellungsbeispiel 1 im Abschnitt B beschrieben durchgeführt. Die Deacylierung ist aufgrund einer HPLC nach etwa 24 Stunden beendet.

25 C. Isolierung des Kernsvon A-21978C-1SL· -t-BOC

Die gemäß Abschnitt B erhaltene. Fermentationsbrühe (100 1) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel) filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule

geführt, die 7,5 1 HP-20-Harz (DIAION) enthält, und die Säule wird mit Wasser (38 1) gewaschen. Die Elution wird durch Siliciumdioxidgel-C.g-HPLC unter UV-Detektion bei 254 nm überwacht. Mit der Waschflüssigkeit wird eine gewisse Menge an Kern eluiert. Die anschließende eigentliche Elution des Kerns wird unter Verwendung folgender Gemische aus Wasser und Acetonitril durchgeführt:

40 1 (95 : 5), 40 1 (9 : 1) und 100 1 (85 : 15). Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 298,5 g halbgereinigtem Kern von A-21978C-N _n~t-BOC gelangt.

D. Reinigung des Kerns von A-21978c-N_Orn-t-BOC

Der nach Abschnitt C erhaltene halbgereinigte Kern von A-21978C-N_n -t-BOC (30 g) wird in einem Gemisch aus Wasser und Acetonitril (9:1) gelöst, das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält (75 ml). Die Lösung wird auf eine 4,7 χ 192 cm messende Stahlsäule gegeben, die 3,33 1 Siliciumdioxidgel-Cjg (Quantum LP-1) enthält, das mit dem gleichen Lösungsmittelsystem äqüilibriert worden ist. Die Säule wird unter Druck mit einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Acetonitril und Methanol (80 : 15:5) entwickelt, das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält, wobei man Fraktionen von jeweils 350 ml sammelt und die Detektion des Produkts durch UV-Licht bei 280 nm durchführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 18,4 g des gereinigten Kerns von A-21978C-N_Q t-BOC gelangt.

Der Kern von A-21978C-KL· -t-BOC hat folgende Eigenschaften: 30

(a) Form: Weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV-Licht fluoresziert.

(b) Empirische Formel: ^C67^Hqo^Ni6°28

(c) Molekulargewicht: 1566

(d) Löslichkeit: Löslich in Wasser

(e) Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) zeigt Absorptionsmaxima bei:

3345 (breit), 3065 (schwach), 2975 (schwach), 2936 (schwach) , 0*1710 (Schulter), 1660 (stark), 1530 (stark), 1452 (schwach), 1395 (mittel),

1368 (schwach), 1341 (schwach), 1250 (mittel), 1228 (mittel), 1166 (mittel bis schwach) und 1063 (schwach) cm .

(f) Das UV-AbsorptionsSpektrum in 90%-igem Ethanol

zeigt Maxima bei 220 nm (£= 42000) und 260 nm

(e = 10600).

(g) HPLC-Verweilzeit: 6 Minuten auf einer 4,6 χ 300 mm messenden und mit Siiiciumdioxidgel-C.g gefüllten Säule unter Einsatz eines Lösungsmittelgemisches aus H₂O, CH-CN und CH₃OH (80 : 15 : 5), das 0,2 % NH₄OAc enthält, bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min unter Detektion mit UV-Licht.

Herstellungsbeispiel· 5 Andere Reinigung des Kerns von A-21978C-N -t-BOC

Man löst den nach dem Herstellungsbeispiel 4, Abschnitt. C, erhaltenen halbgereinigten Kern von A-21978C-N_O -t-

ολ BOC (10,8 g) in Wasser und gibt die Lösung auf eine Säule, die 80 ml Amberlit IRA-68 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA, V.St.A., Acetatcyclus) enthält. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min der Reihe nach zuerst mit

or 0,05n Essigsäure (1080 ml), dann mit 0,1n Essigsäure (840 ml) und schließlich mit 0,2n Essigsäure (3120 ml) eluiert, wobei man Fraktionen von jeweiis 120 ml· sammelt. Die Säul·e wird durch analytische HPLC über Siliciumdi-

oxidgel-C _g überwacht, wobei ein Lösungsraittelsystem aus Wasser, Acetonitril und Methanol {80 : 15 : 5) verwendet wird, das 0,2 % Ammoniumacetat enthält, und die Detektion des Produkts durch UV-Licht bei 254 nm vorgenommen wird. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Pyridin auf 5,8 eingestellt. Die Lösung wird dann unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Das Konzentrat Wird mit Wasser versetzt und die erhaltene Lösung zur Entfernung von Pyridin erneut konzentriert. Dieses Konzentrat wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 3,46 g gereinigtem Kern von A-21978C-N -t-BOC gelangt. 1

Beispiel 1

Herstellung von N_ -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-N -t-

BOC-A-21978C-Kern

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-p-(n-dodecyloxy)-benzoat (0,9 g) und A-21978C-t-BOC-Kern (0,9 g) in 400 ml wasserfreiem Dimethylformamid wird unter einer Stickstoffatmosphäre 120 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfen unter verringertem Druck entfernt. Das zurückbleibende Material wird 2 Stunden mit einem Gemisch aus Diethylether (400 ml) und Chloroform (400 ml) gerührt. Das Produkt wird

durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet, wodurch man on ^ow zu einem hellbraunen Pulver (0,962 g) gelangt. Ein

Teil dieses Materials (0,78 g) wird in Methanol (200 ml) gelöst und durch präparative HPLC gereinigt, wozu eine Prep LC/System 500-Einheit (Waters Associates, Inc., MiIford, MA, V.St.A.) und eine Prep Pak-500-C.Q-Säule .^ (Waters Associates) als stationäre Phase verwendet wird.

Die Säule wird isokratisch betrieben, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2) verwendet wird und Fraktionen von jeweils 250 ml (eine

Fraktion pro Minute) gesammelt werden. Die gewünschte Verbindung wird in den zweiten bis sechsten Fraktionen eluiert.

Die entsprechenden Fraktionen werden auf Basis des TLC vereinigt (Umkehrphasen-C^-Siliciumdioxidgel, Entwicklung mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (3 : 3 : 4), Detektion durch Besprühung mit Van Urk-Sprühmittel) durch Bioautographie der vereinigten Fraktionen unter Anwendung einer Dünnschichtchromatographie mittels Siliciumdioxidgel, eines Lösungsmittelsystems aus Acetonitril, Aceton und Wasser (2 : 2 : 1) und Staphylococcus aureus als Detektionsorganismus ergibt sich, daß das Produkt eine einzelne bioaktive Komponente ist. Das Verfahren führt zu 0,421 g N_T -p-(n-Dodecylbxy)benzoyl-N_0rn-t-BOC-A-21978C-Kern.

Beispiel 2 20

Herstellung von N -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-A-21978C-Kern

Man löst N_Tr -p-(n-Dodecyloxy)benzoyl-N- -t-BOC-A-21978C-Kern (230 mg) in 5 ml Trifluoressigsäure, die 2 % Anisol enthält, und rührt das Ganze 5 Minuten bei 0⁰C. Die Lösung wird unter Vakuum zu einem öl eingeengt und das öl mit Et₃O (100 ml) behandelt. Die Feststoffe werden abgetrennt, an der Luft getrocknet und in Wasser

^OKJ (10 ml) aufgenommen. Der pH-Wert dieser Lösung wird durch Zusatz von Pyridin von 3,25 auf 7 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird lyophilisiert, wodurch man zu 179 mg weißem amorphem Ν_φ -ρ-(n-Dodecyloxy)benzoyl-A-21978C-Kern gelangt. Bei einer dünnschichtchromato-

graphischen Untersuchung mittels Siliciumdioxidgel unter Anwendung eines Lösungsmittelsystems aus Acetonitril, Aceton und Wasser (2 : 2 : 1) und Einsatz eines Van ürk-Sprühmittels zur Detektion ergibt sich für diese

- 34 1 Verbindung ein R_-Wert von etwa 0,78.

Beispiel 3 5

Die antibakterielle Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I kann in vitro gezeigt werden. Die bei der Untersuchung repräsentativer Verbindungen der Formel I bezüglich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit unter Anwendung des Scheibendiffusionstests auf Agar-Platten erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle I hervor. In dieser Tabelle I ist die Wirksamkeit durch die Größe (Durchmesser in mm) der beobachteten Zone gemessen, in der ein Wachstum des Mikroorganismus durch

15 die jeweils untersuchte Verbindung gehemmt wird.

co

IO

cn

Antibakterielle Wirksamkeit von Verbindungen der Formel I nach dem Scheiben-Diffusionstest auf Agarplatten

Verbindung Größe der Hemmzone (mm)

Staphylococcus Bacillus Micrococcus Bacillus aureus subtilis luteus subtilis

ATOC 6738P

ATCC 6633 ATCC 9341

ATCC 6633

p-(n-Dodecyloxy)-benzoyl

p- (n-Dodecyloxy) - t-BOC benzoyl

20 20

13 10

18 15

20 22

Die jeweiligen Verbindungen sind in Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. In die Suspension wird eine 7 mm große Scheibe getaucht, die man dann auf die Agaroberflache legt. Es wird 24 bis 48 Stunden bei 25 bis 37°C inkubiert.

(D Ui

Auf Minimalnähragar gewachsen.

— 36 —

Die bei der Untersuchung der antibakteriellen Wirksamkeit einer repräsentativen Verbindung der Formel I unter Anwendung des üblichen Agar-Verdünnungsyersuchs erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle II -hervor. In.dieser Tabelle II ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC-Werte) gemessen, nämlich durch die niedrigste Konzentration der Verbindung, die das Wachstum des Mikororganismus hemmt.

ο £ .-. ο υ.'

Antibiotische Wirksamkeit von N -ρ-(n-Dodecyloxy)benzoyl-A-21978C

Versuchsorganismen MIC-Werte

Staphylococcus aureus X1.1 1

Staphylococcus aureus V41 }

Staphylococcus aureus X400^c 2

Staphylococcus aureus S13E 1

Staphylococcus epidermidis EPH 4

Staphylococcus epidermidis EPI2 2

Streptococcus pyogenes C203 0,25

Streptococcus pneumoniae Park I 0,015

Streptococcus Gruppe D X66 2

Streptococcus Gruppe 9960 1

^a MIC in

penicillinresistenter Stamm ^c methicillinresistenter Stamm

1-3	I
(U
σ	ω
φ	»j
I—¹	I
(0
H
H

Die Cyclopeptide von A-21978C der Formel I zeigen auch in vivo eine antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen. Verabreicht man Mäusen mit den gezeigten Infektionen zwei Dosen der zu untersuchenden Verbindung, dann läßt sich eine entsprechende Wirksamkeit beobachten, die in Form der EDj-Q-Werte gemessen wird (wirksame Dosis in mg/kg, die einen Schutz von 50 % der Versuchstiere ergibt) (J. Bacteriol. 81, 233 bis 235 (1961)). Die dabei erhaltenen ED_5Q-Werte gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

8 K ο «

In vivo Wirksamkeit von N

Verbindung der Formel I^a ED,-₀-Werte

R Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes

subkutan subkutan oral

N_Tr -ρ-(n-Dodecyloxy)benzoyl 3,35 0,31 200

^a R¹ = H mg/kg χ 2

	I
CD
er	ω
(D	VO
H
H	I
(D
H H
H

Die Verbindung N_ -ρ-(n-Dodecyloxy)benzoyl-A-21978C zeigt nach intravenöser Verabreichung an Mäuse eine akute Toxizität in Form eines LD_₀-Wertes von 67,5 mg/kg,

Claims

Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von A-21978C Cyclopeptidderivaten der Formal I

Hose „ V

•π

HOa

20

HOac/

25

worin R eine substituierte Benzoylgruppe der folgenden Formel ist

30

35

in welcher R für C₀-C.--Alkyl steht, und X Wasserstoff,

ο 1 j

Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃-A^yI, Hydroxy, C₁-C₃-AIkoxy oder C-C-j-Alkylthio ist, und worin R Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,

oder von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen hiervon,

dadurch gekennzeichnet, daß man den Kern von A-21978C der Formel III

HOs

III

oder ein geeignet geschütztes Derivat hiervon, worin R¹ und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon, mit einem Acylierungsmittel der Formel V

2 oder einem aktivierten Derivat hiervon, worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin R für C₁Q-C₁--Alkyl steht, oder Salze hiervon herstellt.
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet,

daß man Verbindungen, worin R -O- für Dodecyloxy steht,

oder Salze hiervon herstellt. 20
4. Verfahren nach Punkt 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin X für Wasserstoff steht, oder Salze hiervon herstellt.
5. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin R -O- für p-(n-Dodecyloxy) steht und X Wasserstoff ist, oder Salze hiervon herstellt.
6. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch ™ gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin X Chlor, Brom oder Iod bedeutet, oder Salze hiervon herstellt.
7. Verfahren nach Punkt 1,2,3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin R eine Aminoschutzgruppe ist, oder Salze hiervon herstellt.
8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen, worin die Aminoschutzgruppe für t-Butoxycarbonyl steht, oder Salze hiervon herstellt.