DD210257A5 - Verfahren zur herstellung von a-21978c-cyclopeptidderivaten - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptidderivaten mit der aus dem Formelblatt hervorgehenden Formel I,worin R,R hoch 1 und R hoch 2 unabhaengig voneinander Wasserstoff, C tief4-C tief 14-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Ctief2-C tief 19-Alkanoyl,Ctief5-Ctief 19-Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten,R hoch 3, R hoch4 und R hoch 2zusammen eine C tief 4- C 14- Alkylidengruppe darstellen joennen, mit der Massgabe,dass (I) wenigstens einer der SubstituiertenR,Rhoch1 oder eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muss, (2) wenigstens einer der Substituenten R hoch 1 oder R hoch 2 Wassserstoff oder einer Aminoschutzgruppe darstellen muss,(3) die Substituenten R,R hoch 1 und R hoch 2 zusammen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten muessen und (4), falls R hoch 1und Rhoch2 ausgewaehlt sind aus Wasserstoff o.eine Aminoschutzgruppe, der Substituent R dann nicht fuer 8-Methyldecanoyl, 10-Methyldecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C tief 10- Alkanoylgruppe des Faktors C tief 0 von A-21978 C oder die speziellen C tief 12-Alkanoylgruppen der Faktoren C tief 4 und C tief 5 von A-21978 C sein kann, oder von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen hiervon durch an sich bekannte Umsetzung eines A-21978 C- Cyclopeptidkerns der Formel I, worin die Substituenten R,R hoch 1,R hoch 2, R hoch 3, R hoch 4 und R hoch 5 jedoch gegebenenfalls Wasserstoff oder Schutzgruppen darstellen, oder der pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon mit entsprechenden Acylierungsmitteln oder Carbonylderivaten unter wahlweiser Reduktion einer Alkylidengruppe und Entfernung irgendwelcher Schutzgruppen.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung:

25 Die große Wahrscheinlichkeit und ständige Gefahr der Entwicklung antibiotikaspezifischer resistentar Stämme pathogener Mikroorganismen macht die Entwicklung neuer Antibiotika zu einem großen Bedürfnis. Vor allem Krankheitserreger innerhalb der grampositiven Arten von Staphylococcus

30 und Streptococcus sind häufig resistant gegenüber herkömmlich verwendeten Antibiotika, wie Penicillin und Erythromycin, und in diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingewiesen auf W.O. Foye, Principles of Medicinal Chemistry,. Seiten 634 bis 686 (1974).

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung neuer und besonders wirksamer Antibiotika.

1 Darlegung des Wesens der Erfindung:

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch neue A-21978C-Cyclopeptidderivate und pharmazeutisch unbedenkliche Salze hiervon gelöst, die sich als wirksame antibiotische Mittel erwiesen haben.

Diese neuen Derivate können hergestellt werden durch Umsetzung des Kerns von A-21978C, der durch Deacylierung des geeignet blockierten Komplexes von A-21978C oder irgendeines seiner geeignet blockierten Einzelfaktoren Cp, C,, C-, C-., C₄ oder C_n. erhältlich ist, mit dem gewünschten Acylierungsmittel oder einem acylierten Derivat hiervon oder, im Falle der alkylierten Derivate, durch Bildung der entsprechenden Schiff-Base und anschließende Reduktion der Iminbindung dieser Base.

Die erfindungsgemäßen A-219 7 8C-Cyclopeptidderivate haben die Formel I

HOsC ,

>H₃

rv— a

^π° H-M

.*—J

,N-H

0=»

, _π3

ι ^

0 H

HOaCT^

0 N

!! I

* ,ο

⁹^

,0

9 ϊ

Q J.

19.

worin R, R^ und R~ unabhängig voneinander Wasserstoff, C .,-C-, _d-Alkyl , gegebenenfalls substituiertes C--C, _Q-A.lkanoyl/ C_r-C,_Q-Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, R , R" und R° alle Wasserstoff sind oder (i) R und

- - 5 2

R" und/oder (ii) R* und R und/oder (iii) R und R zusammen eine C,-C,^-Alkylidengruppe darstellen können, mit der Maßgabe, daß (i) wenigstens einer der Substituenten R, R" oder R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, (2) wenigstens einer der Sub-

l ~ 2

stituenten R" oder R Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe darstellen muß, (3) die Substituenten R, R und R~ zusammen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten müssen

1 2

und (4) falls R und R ausgewählt sind aus Wasserstoff oder einer Aminoschutzgruppe, der Substituent R dann nicht für 8-iMethyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C,„-Alkanovlgruppe des Faktors C_n von A-21978C oder die speziellen C₁--Alkanoyl-

U J. Z

gruppen"der Faktoren C₁ und C_r von A-21978C sein kann, oder sind pharmazeutisch unbedenkliche Salze dieser Peptide, und diese Verbindungen sind entweder wertvolle semisynthetische antibakterielle Mittel-oder Zwischenprodukte zur Herstelluno solcher Mittel.

In der vorliegenden Beschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet, bei denen es sich großteils um herkömmliche Bezeichnungen handelt:

Ala Alanin

Asp Asparaginsäure

30 GIy Glycin

Kyn Kynurenin

Om Ornithin

Ser Serin

Thr ' Threonin

35 Trp Tryptophan

t-30C t-3utoxycarbonyi

Cbz ' Benzyloxycarbonyl

DMF Dimethylformamid

1 THF ' Tetrahydrofuran

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatcgrpahie

ι NMR . ^H-magnetische Kernresonanz

TLC DünnschichtChromatographie 5 UV Ultraviolett

Die Antibiotika A-21978C sind eng verwandte saure Peptid-. antibiotika, wie sie in 'JS-PS 4 208 403 beschrieben werden, die hiermit eingeführt wird. Wie aus US-PS 4 208 4 C 3 hervorgeht, enthält der Antibiotikumkomplex A-21978 eir.e überwiegende Komponente, nämlich den Faktor C, bei dem es sich selbst wiederum um einen Komplex aus eng verwandter. Faktoren handelt. Der Faktor C von A-21978, der als Kc-plex A-21978C 'bezeichnet wird, enthält die Einzelfaktcrer.

C_n, C₁, C-., C-,, C, und C-. Die Faktoren C₁, C- und C,

U 1 2 J 4 3 12 J

überwiegende Faktoren, während die Faktoren C^, C^ und Z. untergeordnete Faktoren darstellen. Die Struktur der Faktoren von A-219 73C geht aus der folgenden Formel II herv~:

20 ^l'^{As p}

-t

D-rtla .

f C-Ser L-Asp -1/

t 3MG

25 L-Om ^

\ L-Kvn

^G'y

L- ι hr

30 . L-ksp

L-Asp

t L-Trp

NH 35

_pM

II

- J₁J

worin 3MG für L-threo-3-Methylglutaminsäure steht und R

einen spezifischen Fettsäurerest bedeutet. Die spezifischen Reste R" der einzelnen Faktoren haben die im folgenden angegebenen Bedeutungen

5

Faktoren von A-21978C Rest R^N

C-, 8-Methyldecanoyl

C₉ 10-Methylundecanoyl

10 C₃ 10-Methyldodecanoyl

C₀ C_1Q-Alkanoyl*

C₄ C-, „-Alkanoyl*

C_r C-, --Alkanoyl*

*Die genaue Art- dieser Reste ist bis heute noch nicht bestimmt worden.

Steht man vor dem Problem einer Deacylierung eines Peptidantibiotikums, dann läßt sich nur äußerst schwer erkennen, ob es ein Enzym gibt, das man für diesen Zweck verwenden kann. Die Auffindung eines solchen Enzyms ist sogar noch schwieriger, wenn das antibiotische Substrat einen Cyclopeptidkern enthält. Enzyme verfügen über ein hohes Ausmai3 an Spezifität, und unterschiede im Peptidrest und in der Saitenkette des Substrats beeinflussen daher das Ergebnis des Versuchs einer Deacylierung. Eine Reihe von Mikroorganismen bildet darüber hinaus eine große Anzahl Peptidasen, die unterschiedliche Teile des Peptidrests angreifen. Dies führt häufig zu schwer handhabbaren Produktgemischen.

Das Enzym, durch dessen Einsatz sich die Deacylierung der Fettsäureseitenkette von der Cü-Aminogruppe von Tryptophan erreichen läßt, kann durch einen Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise durch den Mikro-Organismus Actinoplanss utahensis NRRL 12052 oder eine Variante hiervon, gebildet werden. Zur Bewerkstelligung einer solchen Deacylierung gibt man ein Antibiotikum, das ausgewählt ist aus dem Komplex von A-21978C, den Faktoren

C , C„ und

-S-

von A-21978C, dem blockierten

Komplex von A-21978C oder den blockierten Faktoren C

C₁, C_n, C-,, C. und C- von A-21978C, zu einer Kultur des Mikroorganismus. Die Angaben blockierte Faktoren von A-21978C und blockierter Komplex von A-21978C beziehen sich entweder auf Einzelfaktoren von A-21978C oder Faktorengemische (Komplex), worin die Aminogruppe von Ornithin und/oder Kynurenin mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist. Vorzugsweise ist die Aminoschutzgruppe an der o-Arni-

>0 nogruppe. von Ornithin beim jeweiligen Einzelfaktor oder beim Faktorengemisch angeordnet. Man läßt die Kultur so lange auf das Substrat einwirken, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Das dabei erhaltene entsprechende Ä-21978C-Cyclopeptid wird von der Fermentationsbrühe durch

^5 Anwendung bekannter Methoden abgetrennt.

Die durch diese enzymatischem Deacylierungen erhaltenen Cyclopeptide haben die folgende Formel III

HOa

MHR'

..y..y Γ 9

] worin R' und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, oder sind Salze hiervon.

Durch Entfernung des Acylrests vom Komplex von A-21978C oder von den Einzelfaktoren C-, C-,, C-/ C-,, C_d und C- von A-21978C gelangt man zur Verbindung der Formel III, worin R und R' jeweils Wasserstoff bedeuten. Das deacylierte Molekül ist das gemeinsame Cyclopeptid, das in jedem der Faktoren des Antibiotikums A-21978C vorhanden ist. Der ]Q Einfachheit halber wird diese Verbindung als Kern von A-21978C bezeichnet.- Diese Verbindung läßt sich auch durch folgende Formel IV darstellen.

L-Asp

15 Giy

D-AIa |^y

T C—Ser

L-Asp I

T 3MG

L-Om I

20 \ L-Kyn

GIy /

L-Thr

L-Asp

25 ^f

^/3 . L-Asp

f L-Trp

MHa

IV 30

worin 3MG für L-threo-3-Methylglutaminsäure steht.

Die Verbindungen der Formel III, worin R oder R' eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben, werden hergestellt durch Deacylierung der geeignet blockierten Faktoren C₀, C₁, C₂, C₃, C₄ und C₅ des Antibiotikums A-21978C. Diese Verbindungen werden hierin der Einfachheit halber als blockierte Kerne von A-21978C bezeichnet. Diese blök-

] kiertsn Verbindungen eignen sich als Zwischenprodukte zur Herstellung bestimmter Peptide der Formel I, nämlich derjenigen Verbindungen, bei denen wenigstens einer der Sub-

1 2

stituenten R und R eine Aminoschutzgruppe bedeutet.

Man kann den Kern von A-21978C oder die blockierten Kerne von A-21978C selbstverständlich entweder in Form von freien Aminen oder von Säureadditionssalzen erhalten. Hierzu läßt sich jedes geeignete Säureadditionssalz verwenden, wo-]0 bei jedoch pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze bevorzugt sind. Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden solche Salze verstanden, die zur Chemotherapie warmblütiger Tiere brauchbar sind.

Das Verfahren zur Herstellung, des Kerns von A-21978C der Formel III wird unter Einsatz verschiedener Mikroorganismen eingehend' in der am gleichen Tage wie die vorliegende Anmeldung eingereichten Parallelanmeldung mit dem internen Aktenzeichen X-5279 beschrieben. Das bevorzugte Deacylierungssystem, nämlich Actionoplanes utahensis MRRL 12052,. ist bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern- Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, 1815, North University St., Peoria, Illinois 61604, V.St.A. hinterlegt und von dort unter der Nummer NRRL 12052 frei beziehbar. Das spätere Herstellungsbeispiel 1 zeigt die Herstellung des Kerns von Ä-21.978C durch Fermentation unter Verwendung des Komplexes von A-2197 8C als Substrat und von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 als Mikroorganismus.

Andere Kulturen von Actinoplanaceae, die sich zur Hersteilung des Kerns von A-21978C der Formel III verwenden lassen, sind ebenfalls beim Northern Regional Research Laboratory hinterlegt und von dort unter den folgenden Hin-

35 terlegungsnummern frei beziehbar:

Actinoplanes utahensis NRRL 12052

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

1 Actinoplanes sp. NRRL 8122

Actinoplanes sp. NRRL 12065

Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064

Die Wirksamkeit eines bestimmten Stammes eines Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae zur Durchführung der Deacylierung wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Hierzu beimpft man ein geeignetes Wachstumsmedium mit dem Mikroorganismus. Die Kultur wird 2 oder 3 Tage bei etwa 28³C auf einem Rotationsschuttier bebrütet. Sodann versetzt man die Kultur mit einem' der Substratantibiotika und hält den pH-Werf des Fermentationsmediums auf etwa 6,5. Die Kultur wird bezüglich ihrer Aktivität durch Untersuchung mit Micrococcus luteus überwacht, Ein Verlust an antibiotischer Aktivität ist ein Anzeichen dafür, daß der Mikroorganismus das zur Deacylierung geeignete Enzym bildet. Dies muß jedoch unter Anwendung einer der folgenden Methoden verifiziert werden: (1) Analyse durch HPLC bezüglich Anwesenheit des intakten Kerns oder (2) Reacylierung mit einer geeigneten Seitenkette, wie Lauroyl, n-Decanöyl oder" n-Dodecanoyl, zur Wiederherstellung einer Aktivität.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen, die durch Acylierung eines Kerns von A-219 78C (Verbindung der Formel III), eines Faktors von A-2T9 78C oder eines blockierten Faktors von A-21978C gebildet werden, wodurch Verbindungen mit der Cephemstruktur der

30 folgenden Formel I entstehen.

15

,CH3

HO₂C ,, «'

- 10 -

I Ii

ο«:

,0

worin R, R¹ und R unabhängig voneinander Wasserstoff, C -C-, ₄~Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C~-C,g-Alkanoyl, Cr-C_{1 Q}-Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten,

45 R" und R alle Wasserstoff sind oder

R³ und R⁴

4 5 2·

und/oder (ii) R" und R und/oder (iii) R und R' zusammen eine C ,-C-, -Alkylidengruppe darstellen können, mit der Maßgabe, daß (1) wenigstens einer der Substituenten R, R oder R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, (2) wenigstens einer dar Substituenten R oder R Wasserstoff oder eine Aminoschutz-

1

gruppe darstellen muß, (3) die Substituenten R, R und R zusammen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten müssen

1 2

und (4) falls R und R ausgewählt sind aus Wasserstoff oder einer Aminoschutzgruppe, der Substituent R dann nicht für 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, IQ-Methyldodecanoyl, die spezielle C-, „-Alkanoylgruppe des Faktors C₀ von A-21978C oder die speziellen C^-Alkanoylgruppen der Faktoren C₄ und C₅ von A-21978C, oder die Salze hiervon gebildet werden.

Die Angabe C.-C, .-Alkylidenyl bezieht sich auf eine Gruppe der Formel

R³

3 4 worin'R und R" Wasserstoff oder eine Alkylgrupoe mit 3 bis 13 Kohlenstoffatomen sind,, mit der Maßgabe, daß einer

3 4

der Substituenten R und R" eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben muß und der weiteren Maßgabe, daß die Summe

3 4

der Kohlenstoffatome in den Substituenten R und R nicht größer als 13 sein darf. Diejenigen Verbindungen, bei da~ nen einer der Substituenten R, R" oder R für C₄-C₁^-Alkylidenyl steht, werden als Schiff-Basen bezeichnet.

Die Angabe C₁-C-I₄-AIkYl bezieht sich auf eine einwertige gesättigte geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 4 bis 14 Kohlenstoffatomen. Die Verbindungen, worin

1 ?

. einer der Substituenten 'R, R oder R" für C^-C,_d~Alkyl steht, werden hergestellt durch Reduktion der entsprechen-

1 2 den Verbindungen, worin die Gruppe R, R oder R für C„-C-, .-Alkyiidenyl steht und werden hierin als reduzierte Schiff-Basen bezeichnet.

Die Angaben gegebenenfalls substituiertes C₀-C,_Q-Alkanoyl und C₁--C-|q-Alkenoyl beziehen sich auf Acylgruppen, die von Carbonsäuren abgeleitet sind, die 2 bis 19 bzw. 5 bis 19 Kohlenstoffatome enthalten. Bedeute- dia Gruppe R Alkanoyi, dann ist der Alkylteil ein einwertiger gesättigter geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest, der wahlweise eine Hydroxyl-, Carboxyl- oder C₁ -C-,-Alkoxygrup~ pe oder 1 bis 3 Halogensubstituenten ausgewählt aus Chlor, Brom oder Fluor tragen kann. Steht R für Alkenoyl, dann ist der Alkenylteil ein einwertiger ungesättigter geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest, der nicht mehr als drei Doppelbindungen enthält. Die Doppelbindungen der ungesättigten Kohlenwasserstoffkette können

τ 2

' entweder die eis- oder die trans-Konfiguration haben.

Die Angabe Aminoschutzgruppe bezieht sich auf die üblichen Aminoschutzgruppen, die mit den anderen funktioneilen Gruppen im Molekül von A—21978C verträglich sind. Bevorzugt werden solche Aminoschutzgruppen, die sich nach Acylierung der jeweiligen Verbindung leicht abspalten lassen. Beispiele für geeignete Schutzgruppen gehen aus Protective Groups in Organic Synthesis von Theodora W. Green, John Wiley and Sons, New York, 1981, Kapitel 7, hervor. Besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind t-Butoxycarbonyl und Benzoyloxycarbony1.

Als Unterklassen sind erfindungsgemäß folgende Verbindungsgruppen aus der allgemeinen Formel I bevorzugt:

(a) Die Verbindungen, worin R Alkanoyl der Formel ' O

I!

CH-, (CH₀) -C- bedeutet und η für eine ganze Zahl von 3 ,j 2 η

20 bis 17 steht;

(b) die Verbindungen, worin R Alkancyl der Formel

t!

CH-, (CH-) -C— bedeutet und η für 5 bis 14 steht; .

(c) die Verbindungen, worin R Alkanoyl der Formel

CH O

CH-, (CH-) CH(CH_n) -C— ist und die Indizes η sowie m 3 2 η 2 m

jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 14 darstellen, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf, und mit der weiteren Maßgabe, daß, falls η für 0 steht, m nicht 8 sein kann, und, falls η für 1 steht, m nicht 6 oder 8 sein kann; 35

(d) die Verbindungen, worin R für eis- oder trans—Alkenyl der Formel O

CH₃(CH₂)_nCH = CH(CH₂) -C- bedeutet und η sowie m je-

"! weils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 14 sind, mit der Maßgabe, daß η -ί- m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf;

(e) die Verbindungen, worin R für eis— oder trans—Alkenyl der Formel 0

Il

CH- = CH(CR-)-C- steht und η eine ganze Zahl von 4 bis 15 ist;

10 (f) die Verbindungen, worin R für Alkyl der Formel

CH₀(CH_n) — steht und η eine ganze Zahl von 5 bis 12 j Z η ^Ό

ist;

(g) die Verbindungen, worin R folgende Bedeutungen hat: O

CH₃(CH₂J₅-C-

O CH

3 ^v 2' 6

Cn, (CH₉) -,-C-

CH, (CH_)_Q-C-O

Il

Il

1)

CH₂=CH-(CH₂J₈-C 30 O

O CH₃(CH₂)₁₂-C-

O ³⁵ CH₃-(CH₂)₃-CH=CH-(CH₂)₇-C

O CH₃(CH₂)₁₃-C-

CH₁CK₀CK(CP' )-(CH₀) .-C

CH₃(CH₂J₆-

CH₃(CK₂) CH= 10

CH₃(CH₂J₉-

CK₃(CH₂J₈CH=

Die Verbindungen der Formel I sind zur Bildung von Salzen befähigt, welche ebenfalls Teil dieser Erfindung sind. Solche Salze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung und Reinigung der Verbindungen. Pharmazeutisch unbedenkli— ehe Alkalimetall—, Erdalkalimetall—, Amin— und Säureaddi— tionssalze sind besonders brauchbar.

Die Verbindungen der Formel I haben beispielsweise 5 freie Carboxylgruppen, die Salze bilden können. Zur Erfindung gehören daher Teilsalze, Mischsalze und vollständige Salze an diesen Carboxylgruppen. Bei der Herstellung dieser Salze sollen pH—Bereiche von über 10 vermieden werden, da die Verbindungen bei solchen pH—Werten instabil sind.

zu Beispielen für geeignete Alkalimetall— und Erdalkalimetallsalze von Verbindungen der Formel I gehören die Natrium—, Kalium—, Lithium—, Cäsium—, Rubidium—, Barium—, Calcium— und Magnesiumsalze. Zu geeigneten Aminsalzen von Verbindungen der Formel I gehören die Ammoniumsalze sowie.

3-5 die primären, sekundären und tertiären C-, -C^-Alkylammonium- und Hydroxy—C₀-C^-alkylammoniumsalze. Beispielhafte Aminsalze sind- die durch Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit Ammoniumhydroxid,- Methylamin, s-Butylamin, Isopropyl-

amin, Diethylamin, Diisopropylamin, Cyclohexylamin, Ethanolamin, Triethylamin oder 3-Amino-l-propanol gebildeten Verbindungen.

Die kationischen Alkalimetall— und Erdalkalimetallsalze von Verbindungen der Formel I werden unter Anwendung von Verfahren hergestellt, wie sie für die Bildung kationi— scher Salze üblich sind. Hierzu löst man beispielsweise die freie Säureform einer Verbindung der Formel I in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmem Methanol oder Ethanol, und versetzt eine solche Lösung dann mit einer Lösung, die eine stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wäßrigem Methanol enthält. Das auf diese Weise gebildete Salz kann durch Anwendung üblicher Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Filtration oder Verdampfung des Lösungsmittels. Eine bequeme Methode zur Herstellung von Salzen besteht im Einsatz von Ionenaustauscher harz en .

In ähnlicher Weise lassen sich auch die Salze organischer Amine bilden. Zu diesem Zweck kann man beispielsweise das jeweilige gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung einer Verbindung der Formel I in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Ethanol, geben und das Lösungsmittel und den

25 Überschuß an Amin dann durch Verdampfung entfernen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ferner auch freie Aminogruppen und können daher Säureadditionssalze bilden, die ebenfalls Teil der Erfindung sind. Zu Bei— spielen für geeignete Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I gehören die Salze, die durch übliche umsetzung mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, wie mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citro— nensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitin— säure, Cholsäure, Pamoasäure, Muconsäure, D—Glutaminsäure, d—Kamphersäure , Glutarsäure ,Glykolsäure,Phthalsäure,Weinsäure, Laurinsäure,Stear±nsäure,Salycilsäure,Methansulfonsäure,Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Pi-

- 16 1 crinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.

Die Verbindungen der Formel I, worin R, R oder R für Alkanoyl, Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe stehen, werden hergestellt durch Acylierung eines Faktors von A-21978C, eines blockierten Faktors von A-21978C, einer Verbindung der Formel III oder einer entsprechenden Verbindung der Formel III, die an der <χ—Aminogruppe von Tryptophan blockiert ist, mit der gewünschten Alkanoyl— ']0 oder Alkenoylseitenkette unter Anwendung von Methoden, wie sie zur Bildung einer Amidbindung herkömmlich sind. Diese Acylierung wird im allgemeinen durchgeführt, indem man die jeweilige Verbindung mit einem aktivierten Derivat der Alkancarbonsäure oder Alkencarbonsäure, die der

1 ^

gewünschten Seitenkettengruppe (R, R oder R ) entspricht,

umsetzt. Unter einem aktivierten Derivat wird ein Derivat verstanden, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels reaktionsfähig macht für eine Kupplung mit der primären Aminogruppe unter Bildung der Amidbindung, die die Seiten— kette mit dem Kern verbindet. Geeignete aktivierte Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden zu ihrer Anwendung als Acylierungsmittel für ein primäres Amin sind dem Fachmann geläufig. Bevorzugte aktivierte Derivate sind (a) Säurehalogenide, wie Säurechlorid, (b) Säureanhydride,

25 wie Alkoxyameisensäureanhydrid

oder (c) aktivierte Ester, wie 2,4,5—Trichlor— phenylester. Zu anderen Methoden für eine Aktivierung der Carboxylfunktion gehören eine Umsetzung der Carbonsäure mit einem Carbonyldiimid, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodi— imid oder N,N'—Diisopropylcarbodiimid, unter Bildung eines reaktionsfähigen Zwischenprodukts, das infolge seiner Instabilität nicht isoliert wird. Die Umsetzung mit dem primären Amin wird in einem solchen Fall direkt im Reaktions— gemisch durchgeführt.

Es ist für den Fachmann selbstverständlich, da.ß sich die Verbindungen der Formel I unter Anwendung selektiver Acy— lieriangsverfahreri und Einsatz von Aminoschutzgruppen her—

stellen lassen. Verwendet man beispielsweise eine Verbindung der Formel III, worin R' und R Wasserstoff bedeuten, als Ausgangsmaterial, dann kann es sowohl an der c6—Amino— gruppe von Tryptophan als auch an der 6—Aminogruppe von Ornithin zu einer Acylierunq kommen, so daß M , N_n —

i rp - urn

Diacylderivate gebildet werden. Die Herstellung von Derivaten, die an der cc—Aminogruppe von Tryptophan monoacy— liert sind, erfolgt daher vorzugsweise durch Acylierung einer Verbindung der Formel III, in welcher die δ—Amino—

0 gruppe von Ornithin (nämlich die Stellung R ) durch eine Aminoschutzgruppe blockiert ist. Solche Ausgangsmaterialien werden vorzugsweise hergestellt, indem man den Faktor A-21978C vor seiner Deacylierung an dieser Stellung .blokkiert. Die aromatische Aminogruppe von Kynurenin ist die von den drei freien Aminogruppen in Kernform A—21978C am wenigsten reaktionsfähige Gruppe. Sine Acylierung von Kynurenin erfordert daher eine geeignete Blockierung der Aminogruppen von Tryptophan und Ornithin, während eine Acylierung an den Substituenten R oder R gewöhnlich keine Blockierung der Aminogruppe von Kynurenin erforderlich macht.

Aus den Reaktionsschemen x, il und III gehen allgemeine Verfahren für die Herstellung von Verbindungen der Formel I hervor, worin einer der Substituenten R, R oder R für Alkanoyl, Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe steht. In diesen Reaktionsschemen haben die enthaltenen Symbole folgende Bedeutungen:

30 /*7 = Rest von A-21978C

N = ^σ— Aminogruppe von Tryptophan

N_n = δ—Aminogruppe von Ornithin

N„ = Aromatische Aminoarupoe von Kynurenin

12 "

R, R , R = Angegebene Substituenten

35 R = Acylgruppe des natürlichen Faktors

B, B = Aminoschutzgruppen

Acyl = Acyl ierungs stuf e

Deacyl = Deacylierungsstufe

-IS-

] Block = Acylierung mit einer Aminoschutzgruppe Deblock = Entfernung einer Aminoschutzgruppe

Im Reaktionsschema l sind die N —Monoacylderivate von A-21978C durch die allgemeine Formel III dargestellt, während die N , N —Diacylderivate von A—21978C der allgemeinen Formel IV entsprechen. Die N , N —Diacylderivate, worin die N_ —Acy!gruppe die des natürlichen Faktors A—21978C ist, entsprechen der allgemeinen Formel 10. VIII.-

Ul

to Cn

K) O

LTi

Reaktionsscheina I

Herstellung von N,_n —Monoacyl— und N_1n , N_ —Diacyl—A—21978C—Derivaten

_ Trp ^ !££IilQ£DI

Acyl

K a

0 \%

DeacyI

/V¹¹Vi

DeacyI

HJI II K a

A¹¹,

-) [*]—N₀HQ

VI

Nl₁J

XIX^

Acyl \

1*1-

IV

Deb lock

VII

' Im Reaktionsschema II sind die N_T , N —Diacy!derivate von ft—21978C durch die allgemeine Formel X dargestellt.

Die N,_, , "N_T, —Diacylderivate, worin die N —Acylgruppe

i rp i\yn irp

die des natürlichen Faktors A—21978C ist, haben die allgemeine Formel XII. Die Verbindungen der allgemeinen Formeln V, VI und VII sind ebenfalls im Reaktionsschema I beschrieben.

LO O

ro

UI

Reaktionsscheina IT

Herstellung von N_1n , N₁, —Diacyl-A—21978C-Derivaten

TrgKyn

Acyl

A^NRN

/^NT^1IRN [*] M₀HE

., ^XN_KIIR¹ 11

Deblock \

A^HRN

\l

Acyl \

N HR

Deblock \

N_KIIR¹

VI

VII

- 22 -

Im Reaktionsschema III entsprechen die N_Q —Monoacylderi— vate von Ä—21978C der allgemeinen Formel XVIII, während

die N —Monoacvlderivate von A—21978C der allgemeinen j\yn

Formel XV entsprechen und die N , N_T —Diacylderivate von A—21978C durch die allgemeine Formel XX wiedergegeben sind. Die Verbindungen der allgemeinen Formel VI werden ebenfalls in den Reaktionsschemen I und II beschrieben.

OJ O

N)

K)

Ln

Ln

Reakt ionsschenia III

Herstellung von NL —Monoacyl—, N₁. —Monoacyl— und l\L ,N_r —Diacyl— ^J Om ^J Ky η ^J Orn Kyn ^J

MB

Λ-21978C-Derivaten

,NJIB¹ Selektive NJ-IB¹

XIX

Acyl

N₁-

\|..HR XX K 1

XIII

I N JIB

N J

N_nHB

XVII

/^NT^H

XVIII

XIV

XV

Die Verbindungen der Formel I₇ bei denen eine oder mehrere Aminogruppe durch eine Alkylidengruppe (Schiff-Basen) oder eine Alkylgruppe (reduzierte Schiff-Basen) substituiert sind, können durch an sich bekannte Verfahren zur Herstel— lung von Schiff-Basen und Reduktion solcher Basen gebildet werden. Die Schiff-Basen werden demnach hergestellt durch umsetzung (Kondensation).der primären Aminogruppe von Tryptophan, Ornithin oder Kynurenin von A—21978C mit einem geeigneten Aldehyd oder Keton in einem geeigneten Lösungs— ]0 mittel. Eine Reduktion der Iminbindung der Schiff—Base unter Bildung der entsprechenden Verbindung der Formel I,

1 2

worin R, R oder R für Alkyl steht, läßt sich -durch bekannte selektive Reduktionsverfahren erreichen. Ein für diese Reaktion bevorzugtes Reduktionsmittel ist Natrium-IS cyanoborhydrid.

Unter den angewandten Bedingungen eines in vitro—Versuchs zeigen die Schiff-Basen keine antibakterielle Wirksamkeit, was möglicherweise auch auf ihre Instabilität im Versuchs— medium zurückzuführen ist. Sie eignen sich jedoch als Zwischenprodukte zur Herstellung der reduzierten Schiff—Basen. Bei Verwendung der Schiff—Base als Zwischenprodukt muß man dieses Zwischenprodukt vor der Reduktion zur Bildung der reduzierten Schiff—Base nicht isolieren.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, worin einer der Substituenten R, R oder R für Alkanoyl oder Alkenoyl steht, stellt die Methode über einen aktiven Ester dar . Die Verbindung der Formel III, worin R' für H steht und R für t-30C steht, nämlich der

A-21978C-N_ -t-BOC-Kern oder der t-BOC-Kern, ist ein beurn

sonders bevorzugtes Ausgangsmaterial für die Herstellung von Verbindungen der Formel Γ. Der 2,4,5—Trichlorpheny1— ester der gewünschten Alkan— oder Aikencarbonsäure ist als Acylierungsmittel bevorzugt. Bei diesem Verfahren setzt man eine überschüssige iMenge des aktiven Esters mit dem t—BOC-Kern bei Raumtemperatur in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel um, wie DMF, THF, Diethyl-

„ ο ς „

ether oder Dichlormethan. Die Umsetzungszeit ist nicht kritisch, obgleich eine Reaktionszeit von etwa 6 bis etwa 2 0 Stunden bevorzugt ist. Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand gereinigt. Ein besonders geeignetes Reinigungsverfahren besteht in einer Umkehrphasen—HPLC unter Verwendung von LP—1/C_n„ als stationäre Phase und eines Gemisches aus K-O/CH^OH/CH^CN/ Pyridin/HOAc als Lösungsmittel system- Die t—BOC—Gruppe v/ird durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Anisol/Tri— ethylsilan oder vorzugsweise mit Trifluoressigsäure/1,2— Ethandithiol über eine Zeitdauer von etwa 3 bis etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wird der Rückstand durch Umkehrphasen— HPLC gereinigt.

Eine andere Methode zur Acylierung stellt ein abgewandeltes Schotten-Baumann-Verfahren dar, bei welchem der unblockierte Kern mit dem Säurechlorid der gewünschten Alkancarbonsäure oder Alkencarbonsäure in einem Gemisch aus Pyridin und Wasser behandelt wird. Bei diesem Verfahren wird ein Überschuß des Säurechlorids in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, langsam zu einer Lösung des Kerns in einem Gemisch aus 90 % Pyridin und 10 % Wasser (Volumen) gegegeben. Das nichtumgesetzte Säurechlorid wird vom Reaktionsprodukt durch Extraktion in ein nichtrnischbares organisches Lösungsmittel, wie Diethylether, abgetrennt. Die abschließende Reinigung erfolgt durch Umkehrphasen-HPLC in der bereits beschriebenen Weise.

Die für die Acylierungsreaktion als Ausgangsmaterialien verwendeten Alkan- und Alkencarbonsäuren und die aktivierten Derivate hiervon, insbesondere die Säurechloride und die 2,4,5-Trichlorphenylester, sind entweder bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Die 2,4,5-Trichlorphenylester lassen sich am besten herstellen durch Behandlung des Säurechlorids der Alkancarbonsäure oder

Alkencarbonsäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von Pyridin oder durch Behandlung der freien Alkancarbonsäure oder Alkencarbonsäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Anwesenheit von N , N '-Dicyclohexyl'carbodiimid als Kupplungsmittel.

Das 2,4,5-Trichlorphenylesterderivat kann _durch Säulenchromatographie über Siliciumdioxidgel gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen A-21978C-Cyclopeptide können als antibakterielle Mittel entweder oral oder parenteral verabreicht werden, Die Verbindung A-21978C wird gewöhnlich natürlich zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel verabfolgt. Die Dosis an Verbindung von A-21978C ist abhängig von. einer Reihe von Überlegungen, wie beispielsweise der Art und Stärke der zu behandelnden besonderen Infektion. Die für eine Verabreichung geeigneten Dosierungsbereiche oder Dosierungseinheiten lassen sich unter Zugrundelegung der MIC-Werte und ED__n—Werte sowie der Toxizitätsdaten in Verbindung mit

_/ U

anderen Faktoren vom Fachmann ohne weiteres ermitteln, wie der Pharmakokinetik, den Merkmalen des Patienten oder Wirt; und dem für die Infektion verantwortlichen "Mikroorganismus.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert, welche nicht als beschränkend aufzufassen sind.

Herstellungsbeispiel 1 30

Herstellung des Kerns" von A—21978C

A. Fermentation von Actinoplanes utahensis

Man stellt eine Vorratskultur von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 her und hält diese auf einer Agarschräge. Zur Herstellung der Schräge verwendet man eines der folgenden Medien:

Medium A Bestandteile Menge

Vorgekochtes Hafermehl 60,0 g

Hefe 2,5 g

K₂HPO₄ · .1,Og

Czapek—Mineralmischung* . · 5,0 ml

Agar 25,0 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert vor dem Autoklavieren beträgt etwa 5,9.Er wird durch Zugabe von NaOH auf pH 7,2 eingestellt. Nach dem Autoklavieren liegt der pH-Wert bei etwa 6,7. 15

* Die Czapek-Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung: Bestandteile Menge

FeSO₄-7H₉O (gelöst in 2 ml konz HCl) 2 g KCl 100 g

MgSO₄-7H₂O : 1 00 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

- 2 8 _ Medium B

Bestandteile . Menge

Kartoffeldextrin · 5,0 g

Hefeextrakt 0,5 g

Enzymhydrolysat von Casein* 3,0 g

Rinderextrakt 0,5 g

Glucose -. 12,5g

Maisstärke 5 ,0 g

Fleischpepton . 5,0 g

Rohrzuckermelasse 2,5 g

MgSO₄-7H₂O 0,25 g

CaCO₃ . 1,0g.

Czapek-Mineralmischung . 2,0 ml

Agar 20,0g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

* N-Z-Amin A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst- NJ, ²⁰ ' V.St.A.

Die Schräge wird mit Actino.planes utahensis TiRRL 12052 inokuliert und die inokulierte Schräge etwa 8 bis 10 Tage bei 30⁰C inkubiert. Unter Verwendung von etwa der Hälfte des

^A~> Schrägenwachstums inokuliert man dann 50 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung:

Be standteile ' Menge

^ou Vorgekochtes Hafermehl 20,0 g

Saccharose 20,0 g

Hefe 2,5 g

Getrocknete Kornschlempe* 5,0 g

K HPO 1,0g -ώ *

Czapek-Mineralmischung 5,0 ml

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Das Ganze wird mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt, wobei der pH-Wert nach Autoklavieren bei etwa 6,8 liegt.

* National Distillers Products Co., 99 Park Ave,, New York, NY, V.St.A.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben etwa 7 2 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der sich in einem Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm mit 250 U/min bewegt.

Das inkubierte vegetative Medium kann direkt zur Inokulierung eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Wahlweise und vorzugsweise bewahrt man dieses vegetative Medium bis zu einem späteren Gebrauch auf, indem man die Kultur in einer Dampfphase aus flüssi-' gern Stickstoff hält. Für eine solche Aufbewahrung füllt man die Kultur in folgender Weise in eine Anzahl kleiner Fläschchan ab: In jedes Fläschchen gibt man 2 ml inkubiertes vegetatives Medium und 2 ml einer Glycerin-Lacto.se-Lösung (Cryobiol 10,..364 bis 367 (1973)). Die so gebildeten Suspensionen werden in einer Dampfphase aus flüssigem

Stickstoff aufbewahrt. 25

Unter Verwendung einer in dieser Weise hergestellten aufbewahrten Suspension (1 ml) beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe, welches die oben beschriebene Zusammensetzung hat. Das inokulierte vege- ^ou tative Medium der ersten Stufe wird dann in der oben beschriebenen Weise inkubiert.

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum inokuliert man 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe,

das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium der ersten Stufe hat, mit 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums der ersten Stufe. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 fassenden Erlenrneyer-Weithals-

] kolben etwa 48 Stunden bei .30⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der unter einem Bogen von 5 cm·Durchmesser mit 250 U/min bewegt wird.

Mit dem in der oben beschriebenen Weise hergestellten inkubierten vegetativen Medium der zweiten Stufe (80 ml) inokuliert man dann 10 1- eines der folgenden Produktionsmedien:

Medium I

Bestandteile

Erdnußmehl 15 Lösliches Fleischpepton Saccharose KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄-7H₂O 20 Leitungswasser

Dieses Medium hat nach 45 Minuten langer Sterilisation durch Autoklavierung bei 121⁰C unter einem Druck von etwa 1,1 bis 1,3 bar-einen pH-Wert von etwa 6,9. · .

Medium II

Bestandteile . Menge (g/l)

.

Saccharose . 30,0

Pepton - 5,0

K₂HPO₄ 1/0

KCl 0,5

Menge	ig/i)
10,0
5,0
20,0
0,5
1,2
0,25
auf 1 :
Liter

MgSO₄-7H₂O - 0,5

FeSO₄-7H₂O 0,002

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Das Ganze wird mit HCl auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, wobei der pH-Wert nach Autoklavierung bei etwa 7,0 liegt.

Medium III

Bestandteile Menge (g/l)

10 Glucose 20,0

NH₄Cl ' 3,0

Na₂SO₄ . 2,0

ZnCl₂ . 0,019

MgCl₂"6H₂O ' 0,304

15 FeCl-,-6H-0 0,062

MnCl₂-4H₂O 0,035

CuCl₂'2H₂O 0,005

CaCO₃ . 6,0 KH^PO₄* 0,67

Leitungswasser q.s. auf 1 Liter

* Getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Am Ende liegt der pH-Wert bei etwa 6,6.

. ' " '

Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 14 1 fassenden Fermentationsgefäß etwa 66 Stunden bei einer Temperatur von etwa 3 0⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mittels herkömmlicher Rührer bei

^ou einer Geschwindigkeit von etwa 60 0 U/min gerührt und mit steriler Luft so belüftet, daß die gelöste Menge an Sauerstoff auf über 30 % an Luftsättigung bei atmosphärischem Druck gehalten wird.

^Β· Dgäcylierung von A-21978C

Man fermentiert Actinoplanes utahensis unter Anwendung des im Abschnitt A beschriebenen Verfahrens und Einsatz ς des Mediums A für die Schräge und des Produktionsmediums I, wobei man das Produktionsmedium etwa 67 Stunden inkubiert. Das Fermentationsmedium versetzt man mit rohem Komplex von A-21978C (100 g), der. gemäß US-PS 4 208 403 hergestellt wird.

Die Deacylierung des Komplexes von A-21978C wird durch

Untersuchung gegenüber Micrococcus luteus überwacht. Man läßt die Fermentation bis zur vollständigen Deacylierung weiterlaufen, die sich durch ein Verschwinden ]5 der Aktivität gegenüber Micrococcus luteus äußert, was nach einer Zeitdauer von etwa 2 4 Stunden der Fall ist.

C. Isolierung des Kerns von A-21978C

Die in der im Abschnitt B beschriebenen Weise erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (20 1) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.) filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das erhaltene Filtrat wird durch eine Säule'geführ die 1,5 1 HP-20-Harz enthält (DIAION Hochporöses . Polymer, HP-Serie., Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japan). Der dabei erhaltene Säulenabs tr om wird verworfen. Die Säule wird dann zur Entfernung restlicher filtrierter^:Brühe mit deionisiertem Wasser {10 1) gewaschen. Das dabei anfallende Waschwasser wird ebenfalls verworfen. Sodann eiuiert man die Säule mit Gemischen aus Wasser und Acetonitril (jeweils 10 1 in Verhältnissen von 95 : 5, 9 : 1 und 4 : 1 ) ,

35 wobei man Fraktionen von jeweils 1 1 auffängt,

Die Elution wird papierchromatographisch unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser {15 : 10 : 3 : 12} und Detektion der Verbindungen durch UV-Fluoreszenz überwacht. In diesem System haben die Faktoren von A-21978C einen R„-Wert von etwa 0,56, während der Kern von A-21978C einen fU-Wert von etwa 0,32 aufweist. Das Produkt läßt sich ferner auch durch analytische HPLC unter Einsatz von Siliciumdioxidgel-C., ~ und eines Lösungsmittelsystems aus Wasser und Methanol (3:1) das 0,1 % Amrnoniuiuacetat enthält, und Detektion des Kerns mit einem UV-Monitor bei 25 4 nm überwachen.

Die Fraktionen, die den Kern enthalten, werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Acetonitrils eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 40,6 g halbgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

20 D. Reinigung des Kerns von A-21978C

Man löst den gemäß obigem Abschnitt C erhaltenen halb— gereinigtenKern.von A-21978C (15 g)in75 ml eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (82 j 10 : 8), das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält. Die Lösung wird in eine 4,7 χ 192 cm messende Säule gepumpt, die . 3,33 1 Siliciuindioxidgel-C η enthält (Quantum LP-1 , Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N=J, 07006, V,St.A.). nie Säule wird mit dem gleichen

^ Lösungsmittelsystem entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 350 ml gesammelt. Die Auftrennung wird bei 280 nm mit einem UV-Monitor überwacht. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung der Lösungs-

^O-J mittel eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 5,2 g gereinigtem Kern von A-2197 8C gelangt.

1 E. Eigenschaften des Kerns von A-21978C

Der Kern von A-21978C hat folgende Eigenschaften:

(a) Form: Weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV-Licht fluoresziert

(b) Empirische Formel: C^₀H₀₀N, _r0~_r

QZ oZ I O /D

10 (c) Molekulargewicht: 1466

{d) Löslichkeit: Löslich in Wasser

(e) Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) zeigt "!5 . Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm~'^!) :

3300 (breit), 3042 (schwach), 2909 (schwach), 1655 (stark), 1530 (stark), 1451 (schwach), 1399 (mittel), 1222 (mittel), 1165 (schwach),

1063 (schwach) und 758 (mittel bis schwach). 20

{f) Das ÜV-Absorptionsspektrum in Methanol zeigt

Maxima bei 223 nm ( £ = 41482) und 260. nm : (S= 8687).

2-> (g) Die elektrometrische Titration in 66%-igem

wässrigem Dimethylformamid ergibt die Anwesen-• heit von vier titrierbaren Gruppen mit pK -

Werten von etwa 5,2, 6,7, 8,5 und 11,1 (anfänglicher pH = 6,12).

-JO"

1 Herstellungsbeispiel 2

Anderes Verfahren zur Herstellung des Kerns von A-21978C

Der Kern von A-21978C wird nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren mit Ausnahme bestimmter Änderungen im Abschnitt B hergestellt. Die Kultur von Actinoplanes utahensis wird zuerst etwa 48 Stunden inkubiert. Das Substrat ist ein halbgereinigter Komplex von A-21978C (50 g). Nach Zusatz des Substrats wird . etwa 16 Stunden inkubiert. Die filtrierte Brühe wird durch eine Säule geführt, die 3,1 1 HP-20-Harz enthält. Die Säule wird mit 10 Volumina Wasser gewaschen und dann mit einem Gemisch aus Wasser und Acetonitril (95 : 5) eluiert. Die Elution wird wie beim Herstellungsbeispiel 1 überwacht. Nach Sammeln von 24 1 Eluat wird weiter unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und Aceton (9:1) eluiert. Die den Kern· enthaltenden Fraktionen werden mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Die dabei anfallenden Fraktionen v/erden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung von Acetonitril eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 24,3 g halbgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

Dieser halbgereinigte Kern von A-21978C (24,3 g) wird'in Wasser {400 ml) gelöst. Die Lösung wird in eine 4,7 χ 192 cm messende Stahlsäule gepumpt, die 3,33 1 SiIiciumdioxidgel (QuantumLP-1/C, Jenthält, das in einem

IO - -

Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (8 : 1 : 1 ) ^ zubereitet ist, welches 0,2 % Essigsäure und 0,8 %

Pyridin enthält. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einem Druck von etwa 136 bar entwickelt, wobei man Fraktionen mit jeweils 350 .ml sammelt. Die Elution wird durch UV-Licht bei 280 nm ~~"~' überwacht. Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung der Lösungsmittel eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 14 g hochgereinigtem Kern von A-21978C gelangt.

1 Herstellungsbeispiel 3

Herstellung der Faktoren C~ und C-, von N -t-BOC-

A-21978C \

Ein gemäß US-PS 4. 208 403 hergestelltes Gemisch der Faktoren C_ und C- von A-21978C (10 g) wird unter Beschallung (200 mg/ml) in Wasser (50 ml) gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird von 4,0 5 durch Zugabe von 10 5n NaOH (3,6 ml) auf 9,5 eingestellt. Man gibt Di-tbutyldicarbonat (3,0 ml) zu und rührt das Reaktionsge- ' misch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch manuelle Zugabe von 5n NaOH (6,5 ml werden innerhalb von 2 Stunden zugesetzt) auf 9,5 gehalten.

Die Reaktion wird periodisch durch TLC über Siliciumdioxidgel unter Anwendung eines Lösungsmittelsystems aus CH₃CN und HO (7 : 3 und 8:2) und Detektion durch UV-Licht überwacht.

Nach etwa 10 Minuten trübt sich die Reaktionslösung rasch ein und erhöht sich der Verbrauch an Base. Nach etwa 3 0 Minuten erniedrigt sich die Geschwindigkeit der

^³ Erhöhung- der Eintrübung und des. Verbrauchs an Base, was die Beendigung der Reaktion anzeigt. Unabhängig davon wird die Reaktion zur Sicherstellung ihrer Beendigung

. jedoch noch weitere 90 Minuten fortgeführt. Am Ende der zweistündigen Umsetzungszeit wird das Reaktionsmaterial sofort lyophilisiert, wodurch man zu 12,7 g der Faktoren C₂ und C von N -t-BOC-A-21978 gelangt.

Unter Anwendung ähnlicher Verfahren führt man auch zwei Reaktionen mit 10g Material und eine Reaktion mit 30 g

Material durch. Bei jeder dieser Reaktionen beträgt die Umsetzungszeit nur 40 Minuten. Die zwei Versuche mit 10 g Material führen zu 11,9 g bzw. zu 12,1 g Produkt. Die Umsetzung mit 30'g Material ergibt 35,4 gProdukt.

1 Herstelluncsbaispiel 4

Herstellung des Kerns von Ä-2197 8C-N- -t-BCC

_ Orn

A- Fermentation von Actinoplanes utahensis

Man fermentiert Actinoplanas utahensis nach dem im Herstellungsbeispiel 1 unter Abschnitt A beschriebenen

Verfahren unter Verwendung des schrägen Mediums A und 10

des Froduktionsmediums I₇ wobei man das Produktions-

medium etwa 6 6 Stunden inkubiert.

B. Deacylierung des Komplexes von N- -t-BOC-A-219-78C

Der Komplex von A-219.7 8C-N. -t-BOC (1185'σ an rohem

Orn .

Substrat, das etwa 176 g Komplex an A-21978C enthält) wird zum Fermentationsmedium gegeben. Die Deacylierung wird wie beim Herstellungsbeispiel 1 im Abschnitt B beschrieben durchgeführt. Die Deacylierung ist aufgrund einer HPLC nach etwa 24 Stunden beendet.

C. Isolierung des Kerrs von A-21973C-N -t-BOC

Die gemäS Abschnitt 3 erhaltene Fermentationsbrühe (100 1) wird, unter Verwendung einer Filterhilfe (HyfIo. Super-Cel) filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule geführt, die 7,5 1 HP-20-Harz (DIAlON) enthält, und die Säule wird mit Wasser (38 1) gewaschen. Die Elution wird durch Siliciumdioxidgei-C g-HPLC unter UV-Detektion bei 254 nm überwacht. Mit der Waschflüssigkeit wird eine gewisse Menge an Kern eluiert. Die anschließende eigentliche Elution des Kerns wird unter Verwendung folgender Gemische aus Wasser und Acetonitril durchgeführt:

40 1 (95 : 5), 40 I {9 : 1) und 100 1 (35 : 15). Die den Kern enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch man zu 298,5 g halbgereinigtem Kern von A-2197 8C-N -t-BOC gelanat.

Orn .

D. Reinigurgdes Kerns von A-21973C-N -t-BOC

Der nach Abschnitt C erhaltene halbgereinigte Kern von A-2197 8C-N -t-BOC (30 g) wird in einem Gemisch aus Wasser und Acetonitril (9:1) gelöst, das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthält (75 ml). Die Lösung wird auf eine 4,7 χ 192 cm messende Stahlsäule gegeben, die 3,33 1 Siliciumdioxidgel (Quantum L?-1/C_1O) enthält, das

Ί ö

mit dem gleichen Lösungsmittelsystem äquilibriert worden ist. Die Säule wird unter Druck mit einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Acetonitril und Methanol (80 : 15:5) entwickelt, das 0,2 % Essigsäure und 0,3 % Pyridin enthält, wobei man Fraktionen von jeweils 350 ml .sammelt und die Detektion des Produkts durch UV-Licht bei 280 nni durchführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt'und gefriergetrocknet, wodurch man zu 18,4 g des gereinigten Kerns von A-21978C-N_Q t-BOC gelangt.

. ' '"-Der. Kern von A-21978C-N_Q -t-30C hat folgende Eigenschaften; 30

(a) Form: Weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV-Licht fluoresziert.

(b) Empirische Formel: 0,--,HNO

(c) . Molekulargewicht: 1566

(d) Löslichkeit: Löslich in Wasser

(e) Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) zeigt

Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm"''): 3345 (breit), 3065 (schwach), 2975 (schwach), 2936 (schwach), —1710 (Schulter), 1660 (stark), 1530 (stark), 1452 (schwach), 1395 (mittel), ·

1368 (schwach), 1341 (schwach), 1250 (mittel), 1228 (mittel), 1166 (mittel bis schwach) und 1 063 (schwach) .

(f) Das UV-Absorptionsspektrum in 90%-igem Ethanol

zeigt Maxima bei 220 nm (£= 42000) und 260 nm

( ε = 10600).

(g) HPLC-Verweilzeit: 6 Minuten auf einer 4,6 χ 300 mm messenden und mit Siliciumdioxidgel-C „ gefüllten Säule unter Einsatz eines Lösungsmittelgemisches aus H₂O, CH₃CN und CH₃OH. (80 : 15 : 5), das 0,2 % NH.OAc enthält, bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min unter Detektion mit UV-Licht.

Herstellungsbeispiel 5

Andere Reinigung des Kerns von A-21978C-N -t-BOC

Man löst den nach dem Herstellungsbeispiel 4, Abschnitt

C, erhaltenen halbgereinigten Kern von A-2-T9 7 8C-N -t-

Om

op, BOC (10,8 g) in Wasser und gibt die Lösung auf eine Säule, die 80 ml Amberlit IRA-6 8 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA, V-St.A. , Acetatcyclus) enthält. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und bei einer Fließge-. s'chwindigkeit von 5 ml/min der Reihe nach zuerst mit

nr 0,05n Essigsäure (1080 ml), dann mit 0,1n Essigsäure (840 ml) und schließlich mit 0,2n Essigsäure (3120 ml) eluiert, wobei man Fraktionen von jeweils 120 ml sammelt. Die Säule wird durch analytische HPLC über Siliciumdi-

oxidgel-C g überwacht, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Wasser, Acetonitril und Methanol (80 : 15 : 5) verwendet wird, das 0,2 % Ammoniumacetat enthält, und die Detektion des Produkts durch UV-Licht bei 254 mn vorgenommen wird. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Pyridin auf 5,8 eingestellt. Die Lösung wird dann unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit Wasser versetzt und die erhaltene Lösung zur Entfernung von Pyridin erneut konzentriert. Dieses Konzentrat wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 3,46 g gereinigtem Kern von A-21978C-N -t-BOC gelangt.

15 Beispiele 1 bis 16

Die Herstellung verschiedener Alkanoyl- und Alkencylderivate durch Acylierung von Verbindungen der Formel III, nämlich die Herstellung von Verbindungen aus der Formel I, geht aus der folgenden Tabelle I hervor. Die in Tabelle I angegebenen Derivate werden entweder nach der abgewandelten Schotten-Bauman-Reaktion unter Einsatz eines Säurechlorids als Acylierungsmittel (Methode A) oder nach der Methode über einen aktiven Ester unter Verwendung des 2,4,5-Trichlorphenylesters als Acylisrungsmittel (Methode B) hergestellt. Die allgemeinen Verfahren zur.Durchführung der Acylierungsreaktionen gemäß Methode A oder Methode B werden im folgenden beschrieben.

Methode A (Abgewandelte Schotten-Baumann-Reaktion)

Diese Methode besteht in einer Umsetzung eines Kerns der Formel III mit dem Alkancarbonsäurechlorid oder Alkencarbonsäurechlorid, das der gewünschten Acylseitenkette entspricht.

Man löst eine Verbindung der Formel III (1,95 bis 2,16 g,

1,33 bis 1,47 mMol) oder eine Verbindung der Formel II

(409 mg, 0,2 5 mMol) in 20 0 ml eines Gemisches aus Pyridin und Wasser (9 : 1). Das Acylierungsmittel· (Lösung von bis 2 0 mMol Überschuß an Acylchlorid in 15 ml Aceton) wird tropfenweise über eine Zeitdauer von 1 bis 3 Stunden zugegeben und das Reaktionsgemisch weitere 2 bis 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung des Acetcns eingeengt. Die zurückbleibende wäßrige Schicht wird mit Wasser auf ein Volumen ]0 von etwa 2 00 ml verdünnt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Eisessig auf pH 3,0 bis 3,5 eingestellt. Die Lösung wird achtmal mit gleichen Volumina Diethylether gewaschen und dann lyophilisiert.

]5 Das rohe Acyiderivat wird durch Umkehrphasen-HPLC wie folgt gereinigt: Die Probe wird in Form einer Lösung in Wasser oder im Eluiermittelsystem (etwa 4 bis 6,5 ml) auf eine 1,6 χ 85 cm messende Säule aus rostfreiem Stahl gespritzt, die mit LP,/C,_o als Träger gefüllt ist. Die Säule

1 Io

wird mit einem Lösungsmittel system aus H-O : MeOH : CH-, CN : Pyridin : HOAc eluiert. Die Elution wird bei einem Druck von etwa 103 bis 138 bar und einer Fließgeschwindigkeit von etwa 10 bis 12 ml/min unter Anwendung einer LDC-Duplexpumpe (Milton-Roy) durchgeführt. Der Abstrom wird durch UV-Detsktion unter Verwendung eines ISCO-UA-5-Detektors bei 280 nm überwacht. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zum gewünschten Alkanoyiderivat gelangt. Das gereinigte Produkt wird durch TLC unter Verwendung von Umkehrphasenplatten (Whatman KC, ο) ^un<3 eines Lösungsmittelsystems aus H₂O:MeCH:CH₃GT:pyridin:HOAc (45:15:40:2:2) analysiert. Die Platten werden zur Detektion des Produkts unter UV-Licht beobachtet. Die Produkte werden' ferner auch durch UV-Analyse (Extinktionskoeffizienten bei 220 nm und 260 nm) und durch Aminosäureanalyse analysiert. Die Reinheit wird durch analytische ümkehrphasen-HPLC (C,_O-Microbondapak

- 1 O -

von Waters Co.) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus H-O : MeOH : CH,CN : Pyridin : HOAc und über-

wachung des Eluats mit UV-Licht bei 28 0 nm bestimmt.

Methode B (Methode über den aktiven 2,4,5-Trichxorphenyl-

ester) 5

Eine Lösung aus N -t-BOC A-21978C-Kern (1,0 g, 0,64 mMol), Ä-21978C-Kern (0,5 bis 1,0 g, 0,34 bis 0,68 mMol) oder A-21978C (9 46 mg, 0,5 8 mMol) und einem 3,5 molaren Überschuß an aktivem Trichlorphenylacylester wird in DMF (100 ml) gelöst und etwa 6 bis etwa 20 Stunden bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis zu etwa 50⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl wird mit 50 ml eines Gemisches aus Diethylether und Toluol (1 : 1) behandelt und mit Diethyl-' ether gewaschen. Die monoacylierten und diacylierten A-21978C-Kernderivate, das acylierte A-21978C-, , und der acylierte t-BOC A-21978C-Kern werden wie. oben bei der Methode A beschrieben gereinigt.

Der acylierte t-BOC-A-21978C-Kern wird unter Verwendung von 50 mg/ml eines Gemisches- aus Trifluoressigsäure, Anisol' und Triethylsilan (10 : -1 : 1) bei etwa -1O⁰C bis O⁰C über eine Zeitdauer von 3 bis 5 Minuten deblockiert. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum zu einem öl eingeengt, das man zweimal mit jeweils 20 ml Diethylether behandelt. Das rohe Acylprodukt wird, wie oben bei der Methode A beschrieben, durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und analysiert.-

Die in obiger Weise hergestellten einzelnen Verbindungen dieser' Beispiele gehen aus den folgenden Tabelle I bis VI unter Bezugnahme auf die folgende Formel I hervor.

NR³R¹

HOaC,- 9

? ΐ

Y/

Ii

HOa(Z,,

1-13

Ι

HOsC

H

H 9 !

0=<

β—♦-

H H-N

i!

2QMA11933*091322

TABELLE I

Herstellung von N ·.-Monoacylderivaten von A-21978C-Cyclopeptiden

Beispiel Nr.

10 11 12 13 14 15 16

Verbindung R

a)

CH₃(CU₂)₅C0-CH₃(CH₂)₆C0-

C0

CH₃(CH₂)_?C0-CH (CH₂)₇CO-CH₃ (CII,) ₈C0-

CH

(CH₂)₁₀C0-

CO-

co-

(CiI₂)

₂)

CH₃(ClLj)₁₃CO

(CH₂)

CO

CII₉ = CU-(CIl₂) _ßC0-CH₃(CH₀)₃CH«C

_yC0-

CH CH=CH (CIl₂) ₇C0-

Herstel- lungsme- thode	Gewic an Ke (mg)
B	1028
A	1950
B	10 00
A	2000
B	1000
A	216 0
B	10 0 0
A	10 0 0
ß	10 0 0
B	1000
B	1000
B	1000
B	1000
B	1000
B	1000
B	1000

Gewicht an Acylierungsmittel (mg)

800

3421 350 882 400 5 95 288 4 0 6 800

812 900 31 74 4 37

400

00

Reak tions zeit (h).	Zwischenprodukt HPLC-Eluierungs- mittel	Prod u [ IPLC-El uie-c . mngsmittel	35
20	55:15:30	50:15	30
3	5 0:15:35	55:15	64
24	50: 15:35	115:15	.35
2	Keine Reinigung	50:15	:35
20	Keine Reinigung	50:15	:40
5		4 5:15	.40
22	Keine Reinigung	.45:15	40
2		45:15	45
24	10:15:75	4 0:15	L e)
22d)	50:15:35	1:0:1	35
20	50:15:35	5 0:15	55e)
22d)	Keine Reinigung	35:10
18d)	Keine Reinigung	2:0:1	40
20	2 0:15:65	45:15	45
48	Keine Reinigung	40:15	50
28	3 5 : 1 5 : 5 0*	35:15

a) el)

R'

R - H;

b)

Acyl-N -t-BOC; ° Eluierungsraittel aus H O:C1I.,O11:C1LCN (V: V: V) mit einem ^TrP Om ' fiphall- an (1.? % Pvri d i η nnd 0 . '> %. HCtAr.

Gehalt an 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc

G ¹"

Reaktionstemperatur auf 5⁰C gehalten;¹" mit einem Gehalt an 1 % Pyridin und 1 % HOAc

TABELLE II

Eigenschaften der N -Monoacylderivate von A-21978C-Cyclopeptiden

	R	R1	) M"	<	P r (j u Li k	t	UV	:i c, 260niu Amax
	CH3(CH9)5C0-	H	H	0.85	Anal. IIPL.C	c. 22Onii Amax	11,400
Verbin	CH3(CH2)6C0-	11	11	0.80	niUelUny3"b	48,100	10,500
dung	CH3(CH9)7CO-	H	H	0.75	60:15:25	46,900	11,000
1	CII3(ClI2J8CO-	H	11	0.70	60:15:25	46,000	10,000
2	CH3 (ClI.,) yCO-	H	Il	0.65	45:15:40	46,500	10,400
3	C3 (CH2) 10CO-	H	H	0.59	45:15:40	46,200	9,500
4	CIL1(CIl..) .. ,CO-	H	H	0.53	45:L5:4Ü	44,000	9,800
5	ClI3 (CIl2) j 9C0-	11	II	0.42	45:15:40	48,500	9,170
6	CIL1 (CIl2).nC0-	H	11	0.34	45:15:40	48,447	9,751
7	CH3(CIl2)^CO-	H	H	0.25	50:0:49°	50,172	12,000
8	CII2=CIl-(ClI2) ßC0-	H	H	0.70	1:0:1° ^	54,000	9,200
9	CH (CH9) ClU-Cn(CII9) CO-	Il	H	0.54	39:0:60°	44,000	9 ,600
10	CIl CH CH -ClIClI (Ml· (Ml-				45:15:40	45,000
11	CH9CH=CIl (CH2) CO- ,	H	Il >	0.50	45: 15:40		11,600
12					50,000
13				45:15:40°

Die R -Werte sind ermittelt durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-TLC (Whatman KC mit Fluoreszenzindikator) und unter Verwendung eines Eluierungsinittels aus HLChCH-OI-IrCt-LCN (45:15:40), das' 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält. ^

^ Eluierungsniittel aus HO: CH₃QH: CILCN (V:V:V), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält. Mit einem Gehalt an 1% Pyridin un

TABELLE III

Herstellung von N„ -N -Diacy.l-Ä-2197.8C-Derivaten

Bei	CH3CH2	CH	R	(CH	9>
spiel	CH3CIl2	CH		(CII	2>
Nr.	CH ClI2	Cl	(CH3)	(ClI	2>
17	CIl3(CIl	9)	(CH3)
18	CH3(CH	2>	(CH3)
19	ClI3(CH	2>	6C0~
20	CIl (ClI	2>	9co-
21	CH3CH2		9C°-	(CH	2>
22	Cbz	iico-
2 3		CH(CH3)
2A
25

.CO-,CO-

,CO

R²

CH₃CO CH CO

CH₃(CH₉)₆C0-CH.J (CH₂) ₉C0-CH₃(CH₂)₉C0-CH₃ (CH₂) _nC0-

t-liOC

₁₀

CO-

Herstel-

lungsmethode

,b)

e)

Gewicht an Ausgangsmaterial (mg)

409

946

500

500

1000

1000

1000

1000 Gewicht an Acylierungs Mittel (mg)

2208

139 62

530

292 1119 1066,9

123

Reak tions zeit (h)	HPLC-Elu- ierungs-. mittel a]
1,5	45:15:40
17	95:30:75
20	45:15:40
18C)	35:25:40
24 18C) 18C)	45:15:40 2:0:3 d) 2:0:3 d)
20

Gew. an	1
Produkt	j=* cn
(mg)	I
273
365
201
60
158
366
245,9

550

Eluierungsmittel aus fI₉O:CILOH:CiLCN (V:V:V), das 0,2 %. Pyridin und 0,2 % HOAc enthält

Bernsteinsäureanhydrid, 90 % Pyridin

Die Reaktionstemperatür wird auf 5°C gehalten

Mit einem Gehalt an. 1 % Pyridin und 1 % HOAc

(t-BOC)_?/H₉O

Eigenschaften von

TABELLE IV •'r '^Norn~^DiaCYl~^A~^21978C~^Derivaten

Produkt

\/erbind.ung Nr.

CIl₃CH₂CH(CH₃) (CIl₂) ₆C0-

15 ClI CII₉ClI(CIl₃) (ClI₉) ₆C0-

16 CII₃ (ClI₉) ₆C0- :i7 ClL (ClL)..CO-

Cn₃CH₉ClI(CIl₃) (CH₉)₆C0-Cbz

H CH CO- <

H HOCO(CH₂)₂C0-

11 CIL₁(ClI₉) ,CO-3 ~ η

II CH₃ (CIl₂) _(JC0-

H Cn₃(CII₉) _nC0-

H C-ßOC

π CH₃(CH₉)_LOco-

0.69 0. 75 0.67 0.31

Anal. HPLC-Eluierungs-; mittel

45 45 45 30 45 45

15:40 15:40 15:4Ü^C 15:55 L5:40^e

15:40

NU NU

22Onm e, 260nm c Aniax

46,000 47,000 45,000 48,200

49,000 NU NU

10,400

11,000

9,000

8,000

9,000

NU NU

Die R_r-Werte sind ermittelt durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-TLC (Whatman KC Fluoreszenzindikator) und unter Verwendung eines Eluierungsmittels aus H₂OrCH₃OH

mit. -CH₃CN

,(45:15:40), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält ^DEluierungsmitteL aus H₂O₁CH₃OIIiCH₃CN (V:V:V), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält .jMit einem Gehalt an 1 % Pyridin und 1 % HOAc NU = Nicht untersucht

TABELLE V

Herstellung eines N_m ,N₁, -Diacylderivats'

Beispiel Nr.	R, R1	R2	Herstel lu ngsme- thcde	Gewicht an Ausgangsma terial (g)	Gewicht an Acylierungs- mi-ttel (g)	Realctions- zeit (h)	t-BOC-Diacyl- Zwischenpro- dukt - HPCL- Eluierungs- ndttel a	Produk HPCL-EIu- ierungs-, mittel	t Gewi-clit (mg)
26	CH3 (CH2) gCO	H	B	15	15	30	50:15:35	50:15:35	211

Siehe obiges Beispiel 28

Eluierungsmittel aus H₂OtCH₃OHrCIl₃CN (VtVtV), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält

TABELLE VI

Eigenschaften des N ,N -Diacylderivats

Anal. I]PIC- U V

\ R R¹ R² R_F ^a Eluierungs-_{b f 22Q r 2GQ}

dung Nr. f mittel λ max Λ max

21 ClUCIL)₀CO- CH₀(CIL)₀CO- H 0,66 61:15:23:1 4 1800 11500

Die Rp-Werte sind ermittelt durch Umkehrphasen-SiliciuindioxidgelTLC (Whatman KC,., mit Fluoreszenzindikator) und unter Verwendung eines Eluierungsmi ttels aus H₂OiCI-I₃OIl: CH3CN ' [45 :1 5 : 40 ), dcis 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält

^b Eluierungsmittel aus LI₂O: ClI₃OH: CH₃CN: NH₄OAc, das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält

- 50 1 Beispiel 27

Ν-,· -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern (Verbindung 4) lrp

Das folgende Verfahren zeigt die großtechnische Herstellung von Verbindungen nach der Methode über einen aktiven Ester.

A. Herstellung von 2 , 4 , 5-Trichlorphenyl-n-decano'at

Eine Lösung von Decanoylchlorid (5,6 rnl) und 2,4,5-Trichlorphenol (5,6 g) in Diethylether (1 Liter) und Pyridin (120 ml) wird 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum getrocknet. Das 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat wird über eine mit Siliciumdioxidgel gefüllte Säule (WoeIm) unter Verwendung von Toluol als Eluiermittel gereinigt. Die Fraktionen werden durch TLC überwacht, wobei man zur Detektion kurzwelliges UV-Licht verwendet. Die geeigneten Fraktionen werden zusammengefaßt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 10,4 g 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat gelangt.

B. Acylierung des N ^-t-BOC-A-21978C-Kerns mit 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat .

Eine Lösung von N_Or._n-t-BOC-A-219 7 8C-Kern (15,0 g) und 2 , 4 , 5-Tr ichlorphenyl-n-decanoat (15,0 g) in trockenem DtMF (500 ml) wird unter Stickstoffatmosphäre 25 Stunden bei Umgebungsstemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann bei·

°0 6O⁰C 5 Stunden oder so lange gerührt, bis eine TLC die Beendigung der Reaktion zeigt. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum auf etwa 200 ml eingeengt und mit 1,2 1 eines Gemisches aus Diethylether und Toluol (5 : 1) gerührt. Das Produkt wird durch Filtration abgetrennt, mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 15,05 g des.N_Tr -(n-Decanoyl)-N_Orn-t-BOC-A-21978C-Kernzwischenprodukts gelangt (Formel I mit R = n-Decanoyi, R¹ = H, R² = t-BOC).

C. Reinigung des N_Tr-_O~ ( n-Decanoyl ) -N^^-t-BOC-A-21 978C-Kerns

Das N^_r -(n-Decanoyl)-N -t-BOC-A^^TSC-Kernzwischenprodukt wird in folgender Weise gereinigt. Das Rohprodukt wird in etwa 50 ml des Eluierungsmittelsystems gelöst und dann durch HPLC unter Verwendung des Waters Prep/500-Systems gereinigt, das eine mit Umkehrphasen-C-i „-Siliciumdioxidgel als Adsorbens gefüllte Patrone enthält. Das Systern wird mit H₉OrMeOHrCH₃CN (50:15:35) eiuiert, das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält. Die Fraktionen werden durch UV-Licht bei 280 nm überwacht. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 8,5 6 g gereinigtem N -(n-Decanoyl)-N_n

1rp urn

15 t-3OC-A-21978C-Kern gelangt.

D. Abspaltung der N₀^. -t-BOC-Gruppe

Die t-BOC-Gruppe wird abgespalten durch Rühren des N (n-Decancyl)-N_OT__n-t-BOC-A-21978C-Kerns (1,47 g) in 15 ml eines Gemisches aus Trifluoressigsäure und 1,2-Ethandithiol (10 : 1) bei Umgebungstemperatur über eine Zeitdauer von 3 Minuten. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum getrocknet und der Rückstand mit Diethylether (50 ml) behandelt. Das behandelte Produkt wird mit 20 ml Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 2,59 g rohem N -(n-Decanovl)-A-21978C-Kern gelangt

^rp ^_{1 2}

(Formel I mit R = n-Decanoyl, R~ und R = H), 30 E. Reinigung des N^ -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kerns

Der rohe Ν_φ -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern wird durch Umkehrphasen-HPLC in folgender Weise gereinigt. Die Probe (2,59 g) spritzt man in Form einer Lösung in 4,0 ml H₉O : MeOH' : CH₃CN : Pyridin : HOAc (50 : 15 : 35 : 2 : 2) auf eine 2,5 χ 85 cm messende Säule aus rostfreiem Stahl, die

mit LP-l/C-, „-Adsorbens gefüllt ist. Die Säule wird mit dem 1 ο

gleichen Lösungsmittelsystem eiuiert. Die Elution wird bei

] einem Druck von 83 bis 117 bar unter einer Fließgeschwindigkeit von 10 bis 12 ml/rnin und Verwendung einer LDC-Dupiexpumpe (Milton-Roy) durchgeführt. Das Eluat wird mit einem UV-Detektor (ISCO Modell UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Avenue, Lincoln, NB 68504, V.St.A.) bei 2 80 nm überwacht. Alle 2 Minuten werden Fraktionen (20 bis 2 4 ml) gesammelt. Die infolge einer antimikrobiellen Wirksamkeit gewünschten Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 1,0 5 g Produkt gelangt.

Dieses Reinigungsverfahren wird unter Verwendung von 4,3 5 q, 4,25 g, 2,14 g, 2,00 g und 1,7 5 g an rohem Ausgangsderivat wiederholt, wodurch man insgesamt 5,58 g gereinigten N₁^ -(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern erhält.

Beispiel 28

N_mT. -(n-Decanoyl)-N ^-(n-Decanoyl)-A-219/8C (Verbindung 21) Der Ν_φ -(n-Decanoyl)-N -(n-decanoyl)-A-21973C-Kern

-L-Lp -. rs. y Ii ^

(Formel I mit R und R = n-Decanoyl, R = H) ist ein in geringerer Menge anfallendes Reaktionsprodukt bei der Herstellung des N,-. -(n-Decanovl )-Derivats von Beispiel 27.

= Trp

Dieser Kern wird während der darin im Abschnitt E. beschriebenen Reinigung durch Urnkehrphasen-KPLC isoliert-. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 211 mg Rohprodukt gelangt,. Die Verbindung wird durch analytische HPLC (C₁„-Microbonda-

pak, Waters Co.) unter Verwendung von RO : MeOH :. CH₃CM : NH_dOH : HOAc (6 : .23 : 15 : 0,5 : 0,5) als Eluiermittelsystem (32 Wiederholungen, 5 00 μg je eingespritzter Probe) gereinigt, wodurch man zu 4,4 mg N₁-, ^ -(n-Decanoyl)-N„-(n-decanoyl)-A-21978-C-Kern gelangt, wie eine Identifizierung durch 360 MHz-Protonen-NMR ergibt. 35

- 53 1 Beispiel 29

N_m -Cbz-N^ -Laurovl-A-21978C-Kern (Verbindung 20) χrp urn

Diese Methode erfordert einen Schutz der oC-Aminogruppe von Tryptophan beim N_n -t-BOC-A-21978C-Kern mit einer Cbz-Gruppe unter anschließender Abspaltung der t-BOC-Gruppe und Acylierung (an deroc-Aminogruppe des Ornithine) mit dem Trichlcrphenyllauroylester.

A. Herstellung des N_m -Cbz-N^ -t-3OC-A-21978C-Kerns

irp um

Der N _n-t-BOC-A-21978C-Kern (1,0 g) wird in DMF (150 ml) gelöst und die Lösung auf 50⁰C erwärmt. Man gibt zuerst Ν,Ο-Bistrimethyisilylacetamid (0,55 ml) und dann Benzylpentachlorphenylcarbonat (257 mg) zu. Nach 20 Stunden langem Rühren wird das Reaktionsgemisch auf ein Volumen von etwa 20 bis 25 ml eingeengt. Man gibt wasser (100 ml) zu und stellt den pH-Wert dieser Lösung mit In Natriumhydroxidlösung auf 6,0 ein. Das Gemisch wird mit Diethylether gewaschen (6-mal mit jeweils 200 ml) und dann lyophilisiert.

Das rohe Derivat wird in folgender weise durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Probe wird in Forin einer Lösung in etwa 6 ml eines Gemisches aus ~uO : MeOK : CH.,CN : Pyridin : HOAc (55 : 15 : 30 : 2 : 2) in eine 1,7 χ 85 cm messende Säule aus rostfreiem Stahl gespritzt, die mit LP-l/C·! „-Träger gefüllt ist. Die gewünschten Fraktionen' werden durch UV-Absorption (280 nm) und ihre antimikrobielle Wirksamkeit lokalisiert. Diese Fraktionen werden dann vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zu 951 mg

des N_m -CbZ-N₀ -t-3OC-A-21978C-Kernderivats gelangt., Trp Orn ^ ^

35 B. Abspaltung der t-BOC-Gruppe

Zur Abspaltung der t-30C-Gruppe löst man das Zwischenprodukt in einer Menge von 5 0 mg/ml in einem Gemisch aus Tri-

fluoressigsäure, Anisol und Triethylsilan (10 : 1 : 1) und beläßt das Ganze 3 Minuten bei -1O⁰C. Die Lösung wird zu einem Öl eingeengt und das Öl zweimal mit jeweils 2 5 ml Diethylether behandelt, wodurch man zu 5 20 mg rohem

5 N„ -Cbz-A-21978C-Kern gelangt. Trp ^ ^

C. Acylierung des N -Cbz-A-2197 8C-Kerns

Der N -Cbz-A-21978C-Ksrn wird durch die Acylierungsmethode über den aktiven Trichlorphenylester acyliert. Hierzu gibt man N -Cbz-A-21978C (520 mg) zu einer Lösung von l-Hydroxyberizotriazol (7 mg) und aktivem Lauroyltrichlorphenylester (123 mg) in Pyridin (150 ml). Nach 20 Stunden langem Rühren bei 6O⁰C wird das Reaktionsgemisch zu einem Rückstand eingeengt, durch dessen Behandlung mit Diethylether (dreimal mit jeweils 25 ml) man zu N„ -Cbz-N,-

Trρ Orn

Lauroyl-A-21978C-Kern (550 mg) gelangt.

Beispiel 30 20

Herstellung von Schiff-Basen und von reduzierten Schiff-Basen

Mehrere Reaktionen werden in folgender Weise durchgeführt. Man löst A-21978C-Kem (40 mg) in Wasser (2 ml). Der pH-Wert der Lösung wird mit In Natriumhydroxidlösung von 4 auf 9 eingestellt. Teilmengen (0,5 ml) dieser Lösung vermischt man dann jeweils mit einer Lösung eines der im folgenden angegebenen Aldehyde (5 ul) in Methanol (4 ml):

1) Heptaldehyd

2) Octylaldehyd

3) Decylaldehyd ³⁵ 4) Undecylaldehyd

Die Reaktionsgemische werden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandenen Schiff-Basen werden zur Re-

] duktion 5 Minuten bei Raumtemperatur mit NaBEuCN (2,5 mg pro Reaktion) behandelt.

Die Reaktionen werden durch TLC unter Verwendung von SiIiciumdioxidgel, Einsatz eines Lösungsmittelsystems aus CH-.CN und H-O (7 : 3) und durch Prüfung gegenüber Staphylococcus aureus untersucht. Die Schiff-Basen sind bei diesem Versuch gegenüber Staphylococcus aureus nicht aktiv, was möglicherweise auf ihre Instabilität unter den Ver-Suchsbedingungen zurückzuführen ist. Bei jeder Reduktionsreaktion werden zwei Faktoren gebildet. Diese Verbindungen sind gegenüber Staphylococcus aureus aktiv und zeigen im TLC-System eine ähnliche Mobilität, was beweist, daß die folgenden Verbindungen der Formel I gebildet worden

15 sind, worin R jeweils für Wasserstoff steht:

V J

Herste]lung von Schiff-Basen und von reduzierten

Schiff-Basen

Produkt

Umsetzung von A-21978C mit

Heptaldehyd

Octylaldehyd

Decylaldehyd

Undecylaldehyd

CII₃ (CH₂) ₅CH CII₃ (CII₂) ₆-ClI₃ (CII₀) ₅CH CH₃(CH₂J₆-CIl₃ (CH₂) ₆CH CH₃(CH₂)₇-CIl₃ (CH₂) gCH CH₃ (CIl₂) ₇-CH

CH₁ (CIl₂) _aCH= CIl₃ (CH₂) ₉-CH₃ (CH₂) ₉C11= CH₃ (CII₂) ₁₀-

Ii II CH₃(CH₂)₅CH

Il II

CIl₃(CII₂) ₇-H H

H H CH₃(CII₂J₉CII

Aktiv gegenüber Staphylococcus aureus

el

nein

ja

nein

ja

nein

ja

nein

ja

nein ja nein

ja

nein ja

nein ja

Das Fehlen einer Aktivität der Schiff-Basen bei diesem Versuch ihrer Instabilität unter den Versuchsbedingungen sein.

eine Folge

- 57 1 Beispiel 31

Herstellung der Schiff-Base N -Lauraldehyd und der Schiff-Base N , N -Dilauraldehyd sowie der reduzierten Schiff-Basen hiervon (Verbindungen 22 und 23)

A-21978C-Kern (1 g) wird in Wasser (50 ml) gelöst und die Lösung mit einer Lösung von Dodecylaldehyd (500 μΐ) in Methanol (200 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann 50 Minuten lang durch Zugabe von NaBH-.CN (291 mg) reduziert. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum und Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1 zur Entfernung stückiger Teilchen filtriert. Die überstehende Flüssigkeit wird zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, durch deren Lyophilisierung man zu 1,256 g Produkt gelangt. Dieses Produkt wird durch analytische HPLC untersucht und durch präparative Umkehrphasen-HPLC in Anteilen gereinigt. Jeder Anteil (350 mg) wird in 50 %-igem wäßrigem Methanol (6 ml) unter Beschallung und Erhitzung zum Auflösen des Materials gelöst. Die Lösung wird dann auf eine 1,5 χ 8 0 cm messende und mit LP, -C-, _fl gefüllte Säule gegeben, die man mit einem Gemisch aus CH-,OH : CH₃CN : H₃O (25 : 40 : 35), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % Essigsäure enthält, bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 7,5 ml/min eluiert. Die Elution wird durch UV-Licht bei 2 80 nm überwacht. Die die gewünschten Produkte enthaltenden Fraktionen werden vereinigt,wodurch man zu insgesamt 104 mg M -(n-Dodecyl)-A-21978C-

Kern (Verbindung 22) und 19,2 mg-Ν_φ -(n-Dodecyl)-N_ (n-dodecyl)-A-21978C-Kern (Verbindung 23) gelangt.

Beispiel 32

Die antibakterielle Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I kann in vitro gezeigt werden. Die bei der Untersuchung repräsentativer Verbindungen der Formel I bezüglich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit unter Anwendung des Scheibendiffusionstests auf Agar-Piatten erhaltenen Ergab-

nisse gehen aps der folgenden Tabelle VII hervor. In dieser Tabelle VII ist die Wirksamkeit durch die Größe (Durchmesser in mm) der beobachteten'Zone gemessen, in der ein Wachstum des Mikroorganismus durch die jeweils unter-

5. suchte Verbindung gehemmt wird.

TABELLE VII

Antibakterielle Wirksamkeit von Verbindungen der Formel I nach dem Scheibendiffusionstest

auf Agar-Platten

Verbindung Nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11. 12 13

cu₃(cn₂)₅co-

k (ClL), CO-3 2 6

CH CH₃

C0-CO-

CH₃ (CIl₂) ₀CO-

cii₃(cii₂)_loco-

CH₃(CH₉)₁₁CO-

^C113^(CH2⁾14^CO~ CII₂=CII-(CH₂)₈CO-

CH (CIl₂) CH=CIl(CH₂) CO-ClI CH₂Ch

	R2	Größe der	Heniinzone	( mm)	Bacillus
	H	Staphylococcus	Bacillus	Micrococcus	sUbL11 is
1	H	aure.us	tiubL.il is	luteus	ATCC 6633
R1	H	ATCC 6738P	ATCC 6633	ATCC 9341	16
H	H	17	15	21	20
H	H	23	18	23	27
H	H	20	16	18	29
II	H	24	20	22	21
H	H	19	19	21	32
H	II	25	20	19	29
H	H	21	17	19	28
H	H	22	21	21	24
H	II	20	19	19	23
II	19	17	17	25
H	21	17	20	30
11	2 2	19	20

13

14

TABELLE VII (Fortsetzung)

Antibakterielle Wirksamkeit von Verbindungen der Formel I nach dem Scheibendiffusionstest

auf Agar-Platten

Große der Ue mm ζ one (nun)

Micrococcus Bacillus

Ve rb in-	CH3	R	(CH9)	,CO- 0	1	R2	,CO- 6	aureus	subtllis	luteus	subtil is ,
dimg Nr.	ClL	CH2CH(CH3)	(CH?)	,.co-	R1	CH CO-	qCO-	ATCC 6738P	ATCC 6633	ATCC 9341	ATCC 6633
14	CH3	CH2CH(CH3)			Il	110CO(CH0	nco-	21	18	20	25
15	CH3	(CH2)6co-			H	CH3(CH2)		21	18	19	25
16	CH3	(CH2) (JCO-			H	CH3(CH2)	!0C°-	11	,Sp°	10	17
17	ClI3	(CH2)1XCO-	(CH2)	,CO- D	H	CH3(CH2)	17	13	14	20
18	Cbz	CH2CH(CH3)			H	t-BOC	12	Sp	-	13
19				11	CH (CH )	14	11	10	22
20			Il		15	10	17	23

Die jeweiligen Verbindungen sind in Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. In die Suspension wird eine 7 mm große Scheibe getaucht/ die man dann auf die Agar-Oberflache legt. Es wird 24 bis 48 Stunden bei 25 bis 37°C inkubiert.

Auf Minimalnähragar gewachsen

Spur

] Die bei der Untersuchung d-_=J_- antimikrobiell en Wirksamkeit repräsentativer Verbindungen der Formel 1 unter Anwendung des üblichen Agar-Verdünnungsversuchs erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle VIII hervor. In dieser Tabelle VIII ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MlC.-Wert) gemessen, nämlich durch die niedrigste Konzentration der Verbindung, die das Wachstum des Mikroorganismus hemmt.

^y

TABELLE VIII

Äntibiotische Wirksamkeit von A-21978C-Cyclopeptiden

MIC-Werte der untersuchten Verbindungen VersuchsOrganismen

1	8	16	2d	3	4e	5d	6e	7	8	9	10	11	I
8	8 2	4	2	1,0.5	0.25	0.5,0.5	0.125	0.5,1	1	1	0.5	cn NJ I
8	8	4	2	1,0.5	0.25.	0.5,1	0.125	0.5,2	1	1	0.5
8	128	8	4	2,1	0.5	1,1	0.5	1,2	2	') L.	0.5
128	4	2	1,0.5	0.5	0.5,0.5	0.25	1,2	1	1	0.25
8	4	2,1	0.5	1,1	0.5	1,4	2	2	1
4 1	2 0.25	1,0.5 0.25, 0.125	0.5 0.125	1,1 0.125, 0.25	0.5 0.25	2,2 0.5,2	4 1	2 1	1 0.5
8	2	1,0.5	0.25	0.25, 0.25	0.25	0.03, 0.125	0.06	0.06	0.25
64	32	16', 16	2	2,4	0.03	0.5,2	2	2	1
16	8	2,2	0.5	0.5,0.5	32	0.125, >128	0.25	0.25	0.5

Staphylococcus aureus Xl.1 Staphylococcus aureus V41 Staphylococcus aureus X400 Staphylococcus aureus SI3E Staphylococcus epidermidis EPIl Staphylococcus epidermidis ΕΡΪ2 Streptococcus pyogenes C2O3

Streptococcus pneumoniae Park

Streptococcus Gruppe I) X66 Streptococcus Gruppe 9960

^a MIC-Werte in pg/ml. Die Nummern der jeweiligen Verbindungen stammen von den Tabellen II, IV und VI sowie von Beispiel

Penicillinresistenter Stamm d

^c Methiciilinresistenter Stamm Mittelwert aus drei Versuchen Zwei Versuche

TABELLE VIII (Fortsetzung)

VersuchsOrganismen

Staphylococcus aureus Xl.1 Staphylococcus aureus V41 Staphylococcus aureus X400 Staphylococcus aureus S13E Staphylococcus epidermidis EPIl Staphylococcus epidermidls El^J12 Streptococcus pyogenes C2O3 Streptococcus pneuinoniae Park Streptococcus Cruppe D X66 Streptococcus Gruppe 9960

13

MIC-Werte der untersuchten Verbindungen

16

18

20

21

22

1	>128	4,4	4,4	8	1	8	8	1	0.5	8	σ\ UJ I
1	>128	4,4	8.8	16	4	64	16	4	1	8
2	>128	8,8	4,0	8	4	>128	32	32	1	16
1	>128	8,4	4,8	8	1	>128	8	16	0.5	8
2	>128	8,8	8,8	16	0	>128	32	2	1	8
2	>128	0.4	8,8	16	8	>128	32	2	1	8
0.5 0.5	>128 >128	1.1 2,2	1,1 2.4	4 4	0.25 0.125	1 0.5	4	0.125 0.5	0.5 1	4 8
2	>128	64,32	64,64	>128	8	>128	128	>128	4	32
1	>128	32,8	32,32	64	8	>128	64	128	1	8

Die A-21978C-Cyclopeptide der Formel I zeigen auch in vivo eine antimikrobiellIe Wirksamkeit gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen. Verabreicht man Mäusen mit den gezeigten Infektionen subkutan oder oral jeweils zwei Dosen der zu untersuchenden Verbindung, dann läßt sich eine entsprechende Wirksamkeit beobachten, die in Form der ED-_Q-Werte gemessen wird (wirksame- Dosis in mg/kg, die einen Schutz von 5 0 % der Versuchstiere ergibt) (J. Bacteriol. 81, 233 bis 235 (1961)). Die dabei für typisehe A-219TSC-Verbindungen der Formel I erhaltenen ED-^- Werte gehen aus der folgenden Tabelle IX hervor.

TABELLE_IX In vivo-Wirksamkeit von A-21'JVSC-Cyclopeptiden

ED_5Q-Werte^a

Verbindung Nr.

Verbindung der Formel I

₂ ) ₅C0-

ClL (ClL),CO-J Zb

CII

C0-

CH₃(CH₂)₈C0-

cn₃(cii₂)_gco-

CH₃(Cn₂)_1LCO-CIl₃ (CH₂) ₁₂C0-)_]3C0-CH₃ (CIl₂) _UCO-CIl=CH-(ClL)₀CO-CH₃(CH₂) CH=CH(CH₂) CO-

CiL₁CILCH(CIL) (CIL),CO-J / j Ib

CIL₁CILCII(CIl) (CIL),CO- Sl J Ib

Stapliylococcus aureus

JL

H II 11 II U II Il U H II II 11

H H Il II H H II H H H Il H

S ii bleu tan

II CH CO-II HOCO-

2.65

3.75,1.4 0.5 0.28 0.37 0.44 0.54

1.17,3.08 8.3

0.93 3.28 1.3

6.27 ,CO-Streptococcus pyogenes

Subkutan	Oral
1.49,5.lb	NU C
<2.2,0.65,1.9d	>200
0.14,0.243	92,117
0.03	66
0.13	138
0.05	69
0.046	45
O.98,O.20,<0.54	<50,<200
<0.5,0.18	>200
0.18	>200
0.068	138
0.134	75
2.2,1.9	163,>2OO
1.4	>200

₃(CH₂)_gC0

H CH (CH ) CO- ^J>35

11 Il

1.25 2.85 1.1,0.85

>200 >200

'mg/kp; χ 2; Zwei Versuche; ^c Nicht untersucht; Drei Versuche

Einige A-21978C-Cyclopeptide der Formel I sind auch bezüglich ihrer Toxizität untersucht worden, und die. dabei erhaltenen Versuchswerte gehen aus der folgenden Tabelle X hervor.

TABELLE X

Toxizität von A-2ly7BC-Cyclopeptiden

/erbin- lung Nr.	Formel I R	R1	R2	LD1- -Werte (rag (kg) an der Maus
1	CII3(CH2J5CO-	H	H	>600
2	CH3(ClI2J6CO-	H	II	>600
3	ClI3 (CH0J7CO-	II	Il	>600
4	CIl3(CH2J8CO-	11	Ii	>300
5	CH3(CII2J9CO-	H	H	>600
6	CH3(CH2J10CO-	H	IL	144,265b
7	CH3 (CH2) uC0-	Ii	H	112.5
8	CH3 (CH2J12CO-:	H	IL	62.5,<150
9	CIi3(CH2J13CO-	II	M	56.25
10 ·	CH3(CH2J14CO-	H	H	50
11	ClL--CH-(CILJ oC0- Z Za	Ii	H	>500
12	CIU (CIU) -,CH=CH (ClU) -,CO- 3 2 3 Zl	H	H	450
14	CH3CH2CIl(CH3) (CIU)6CO-	H	CH3CO-	>600;600
15	CH3CH2CIl(CIi3) (CH2J6CO-	H	HOC 0 (CH ) CO— 2 2	450,600
16	CH3(CH2J6CO-	Il	CH3(CH2)6C0-	>600
17	CII3 (CH2) 9C0-	H	CH3JCH2J9CO-	94
22	CH3 (CH0J11-	H-	Ii	>300

Intravenöse Verabreichung

Zwei Versuche

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von A-21978C-Cyclopeptid-Derivaten der Formel I

HO2

KOs

worin R, R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, C₄-C,^-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₅-C,_Q-Alkanoyl, C--C, q-Alkenoy.l oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, r3, R^ und R^ alle Wasserstoff sind oder (i) R und R" und/oder (ii) R und R und/oder (iii) R³ und R" zusammen eine C.-C, ,-Alkylidengruppe darstellen können, mit dei Maßgabe, daß (1) wenigstens einer der Substituenten R, R

^ 2

oderV'-R eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, (2) wenigstens einer der Sub-

\ ' 2
stituenten R oder R Wasserstoff oder eine Aminoschutz-

1 gruppe darstellen muß, (3) die Substituenten R, R und R zusammen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten müssen

1 2
und (4), falls R und R ausgewählt sind aus Wasserstoff oder einer Aminoschutzgruppe, der Substituent R dann nicht für 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die spezielle C,»-Alkanoylgruppe des Fak

tors C_Q von A-21978C oder die speziellen C -Alkanoylgruppen der Faktoren C. und C,- von A-21978C sein kann, oder von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen hiervon mit organischen oder anorganischen Säuren, dadurch

5 gekennzeichnet , daß man einen A-21978C-Cyclopeptidkern der Formel IU

NHR'

ΗΟξ

HOa

III

oder ein geeignet geschütztes Derivat hiervon, worin R'

0
und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon mit einer organischen oder anorganischen Säure,

(a) mit einem Acylierungsmittel der Formel V

R - COOH

oder einem aktivierten Drivat hiervon, worin R für gegebenenfalls substituiertes C.-C. η-Alkyl oder C.-C₁„-Alkenyl steht, umsetzt, oder

22AuRiQ.

A -i j κ- .. ~

1 (b) mit einem Carbonylderivat der Formel VI

R⁷ - C - R⁸ (VI)

Il

7 Q

worin die Gruppe R R C= für C . -C₁ .-Alkyliden steht, ° umsetzt und-

(c) ein gemäß obigem Verfahren (b) erhaltenes C₄-C₁₄-Alkylidenprodukt gegebenenfalls durch Reduktion in eine Verbindung der Formel I überführt, worin R, R

oder R für eine C₄-C₁,-Alkylgruppe stehen und

¹^ (d) von dem nach einer der obigen Reaktionen (a), (b) oder (c) erhaltenen Produkt die eventuell vorhandenen Schutzgruppen gewünschtenfalls abspaltet und (e) gegebenenfalls die Verbindungen der Formel I mit organischen oder anorganischen Säuren ' in ihre pharmazeutisch, unbedenklichen Salze überführt.

2. Verfahren nach Punkt 1,dadurch gekennzeichnet , daß R für Alkanoyl der Formel

20 ^CH3^(CH2⁾n " ^ "

steht und η eine ganze Zahl von 3 bis 17 bedeutet.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß R für Alkanoyl der Formel

25 CH₃ " O

CH₀(CH₀) - CH(CH_n) -C-3 Z η 2 m

steht und η 'sowie m jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 14 bedeuten, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf, und mit der weiteren Maßgabe, daß, falls η für O steht, m nicht 8 sein kann, und, falls η für 1 steht, m nicht 6 oder 8 sein kann.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch ge.kenn zeichnet, daß R für eis- oder trans-Alkenyl der Formel

CH₃(CH₉J_nCH = CH(CH₂)_m - C -

_ "7 1 _

ι Χ

1 steht, worin η und m jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 14 bedeuten, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf.

5 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch ge

kennzeichnet , daß R für eis- oder trans-Alkenyl der Formel

CH₀ -- CH(CH_n) C 2. Zn

steht, worin η eine ganze Zahl von 2 bis 16 ist.

6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß R für C_d-C,_d-Alkyliden 15 steht.

7. Verfahren nach Punkt 6, dadurch ge

kennzeichnet , daß R für Dodecylidenyl steht.

20 3· Verfahren nach Punkt 1, dadurch ge-

k e η η zeichnet , daß R für C₄-C₁₄-AlXyI steht.

9. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet , daß R für Dodecyl steht. 25