DE2124711A1 - - Google Patents

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DE2124711A1 DE19712124711 DE2124711A DE2124711A1 DE 2124711 A1 DE2124711 A1 DE 2124711A1 DE 19712124711 DE19712124711 DE 19712124711 DE 2124711 A DE2124711 A DE 2124711A DE 2124711 A1 DE2124711 A1 DE 2124711A1
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rabelomycin
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Description

" Rabeloniycin und Dehydrorabelomycin, ihre Salze und E3ter,
Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung von • Rabelomycin als Antibiotikum "
Priorität: 18. Juni 1970, V.St.A., Nr. 47 479
Die Erfindung betrifft ein neues und wertvolles Antibiotikum, genannt Rabelomycin, seine Salze und Ester sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung auf mikrobiologischem Wege.
Die zur Herstellung von Rabelomycin geeigneter. Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, im folgenden als Streptomyces olivaceus A.T.C,C. 21 549 bezeichnet, wurden aus einer bei Jean-Rabel, Haiti, gewonnenen Bodenprobe isoliert. Eine Kultur dieses Stammes v/urde bei der A.T.C.C. unter der Nummer 21 549 hinterlegt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mutanten dieses Stammes, die durch bekannte Verfahren, wie Behandlung mit.Röntgenstrahlen, UV-Strahlung und Stickst of float, erhalten v/erden.
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Zur Isolierung und Charalctorisierurig des Mikroorganismus wurde ein Teil der Bodenprobe in sterilem, destilliertem V/asser geschüttelt und auf ein IJähragar der folgenden Zusammensetzung aufgebracht: 15 g Agar, 10 g Glycerin, 1,2 g Citronensäure, 0,4 g (HH^)2HPO4-, 0,08 g KCl, 0,418 g HgCl2 . 6H2O, 0,036 g 1'InCl2 . 4H2O, 0,023 g FeCl5 . 6PI3O, 0,021 g 2nCl2 . 6H2 0,004 g CoCl2 . 6H2O und destilliertes V/asser ad 1000 ml.
Das Nährmedium war vor dem Aufbriiigen der Bodenprobe auf den Pu-Wert 7,0 eingestellt und 30 Minuten in einem Autoklaven bei 121 C sterilisiert worden. Nach sieben- bis zehntägiger Inkubation bei 25 C wurden die gebildeten Kolonien von Streptomyces olivaceus A.T.C. C. 21 549 isoliert. Diese Kulturen wurden anschliessend in einem Kährmedium folgender Zusammensetzung gezüchtet: 1,0 g Hindfieischextrakt, 1,0 g Hefeextralct, 2,0 g NZ imine I9 10,0 g Glucose, 15,0 g Agar und destilliertes Wasser ad 1000 ml.
Das Nährme&itim wurde auf den p„-Wert 7S3 eingestellt und 30 Minuten bei 121 C im Autoklaven sterilisiert.
Der Mikroorganismus gehört nach Pridham zur Reihe der graue Sporen bildenden Reihe. Die von ihm gebildete Sporenmasse ist mittelgrau (ISCC Hrβ 265) und stimmt mit der Farbprobe 2 Fe im Color Harmony Manual überein. Reichliche Sporenbildung tritt auf International Streptomycea Project Standardmedien ein: ISP-2j Hefeextrakt-Halzextrakt-Agar; ISP-3,, Hafermehlegar; ISP-4} anorganische Salse-Stärkeagar* An der Rüskseite tritt in diesen drei Medien eine dunkle Khakifärbung auf. In proteinhaltigen Medien bildet sich kein melanoides Pigment.
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Unter dem Mikroskop betrachtet bilden die Sporophoren ausgedehnte Spiralen,und die Sporenoberfläche ist glatt.
In folgender Übersicht werden Streptorayces olivaceus A.T.G.C. 21 549 und Streptomyces olivaceus IMRU 3355 verglichen.
S. olivaceus
S. olivaceus
ATCC Ur. 21549 IMRU 3335
grau
offene Spirale
glatt
khakifarben
grau
offene Spirale
glatt
dunkelbraun
Farbe der Sporen
Aussehen der Sporophoren
Sporenoberfläche
Bildung von melanoidera Pigment
Farbe der Rückseite
Kohlenstoffverwertung Glucose d-Mannit i-Inosit d-Xylose 1-Arabinose 1-Rhamnose d-Fructose Raffinose Sucrose
Die Unterschiede in der Verwertung von Ehamnose und Fructose sind als gering zu bewerten und rechtfertigen nicht, dass die Stämme als verschiedene Arten betrachtet werden.
Streptorayces olivaceus A.T.C.C. 21 549 bildet ein Antibiotikum (Rabelomycin), das hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam ist. Zur Herstellung des Antibiotikums wird Streptomyces olivaceus A.T.C.C. 21 549 bei etwa 25°C unter aeroben Submersbedingungen in einem wässrigen Kährnedium, das verwertbare Kohlenwasserstoff- und organische Stickstoffquellen
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enthält, gezüchtet. Die Züchtung dauert einige Tage, z.B. etwa 96 Stunden. Nach dieser Zeit hat sich das Antibiotikum in der Gärmaische gebildet.
Nach Beendigung der Züchtung wird die Gärmaische mit konzentrierter HCl auf einen Pg-Wert von etwa 6 eingestellt und filtriert. Das Antibiotikum wird mit Methanol aus dem Mycel, d.h. dem Filterkuchen, extrahiert. Die Methanollösung wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei eine wässrige Suspension zurückbleibt. Die wässrige Suspension wird mit dem Filtrat der Gärmaische vereinigt,und die vereinigte Suspension wird mit wassergesättigtem Essigsäureäthylester extrahiert. Die organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem Sirup eingedampft. Dieser Sirup wird durch Gegenstromverteilung mit Methanol:Wasser:Hexan (3:1:4, Vol/Vol/Vol) gereinigt. Die Fraktionen mit biologischer Aktivität werden vereinigt und mit Essigsäureäthylester nochmals extrahiert. Der Essigsäureäthylester wird durch Eindampfen entfernt,und der erhaltene trockene Rückstand wird durch Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose und anschliessender Chromatographie auf Kieselgelplatten im präparativen Masstab weiter gereinigt. Der endgültige Reinigungsschritt besteht in zweimaliger Kristallisation aus Benzol/Methanol.
Eabelomycin hat folgende Strukturformel I
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(D
OH
Rabelomycin kann durch Umsetzung mit einer Mineralsäure, wie konzentrierter Salzsäure oder konzentrierter Schwefelsäure, zum Dehydrorabelomycin der folgenden Strukturformel II dehydratisiert werden
(II)
OH O OH
Rabelomycin bildet Ester mit Säuren, z.B. durch Behandlung mit einem Acylhalogenid, wie Acetylchlorid, oder einem Säureanhydrid, wie Essigsäureanhydrid, in Gegenwart einer Base, wie I>yridin. Rabelomycin bildet auch Ester mit Aminosäuren, wie Glycin oder Phenylalanin.
Rabelomycin enthält drei acylierbare Hydroxylgruppen. Je nach Verhältnis von Acylierungsmittel zu Rabelomycin im Reaktionsmedium können Mono-, Di- und Triester gebildet werden. Ein durch Acylierung eines Äquivalents Rabelomycin mit einem Äquivalent Acylierungsmittel erhaltenes Gemisch von Monoestern, in dem eine der zwei phenolischen Hydroxylgruppen acyliert ist, lässt sich chromatographisch auftrennen. Bei Verwendung von zwei Äquivalenten Acylierungsmittel pro Äquivalent Rabelomycin tritt eine
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Acylierung der beiden phenolischen Hydroxylgruppen ein. Durch Behandlung von Rabelomycin mit drei Äquivalenten Acylierungsmittel kann auch die dritte Hydroxylgruppe verestert werden. Jedoch tritt vorwiegend eine Dehydratisierung mit anschliessender Acylierung unter -Bildung der Triester von Dehydrorabelomycin ein. Diese Triester erhält man auch aus Dehydrorabelomycin durch Behandlung mit Acylierungsmitteln.
Alle üblichen Acylierungsmittel können verwendet werden. Bevorzugte Acylierungsmittel sind Säureanhydride und Acylchloride der Ton Kohlenwasserstoffen abgeleiteten Carbonsäuren mit weniger als zwölf C-Atomen, wie niedere Alkanearbonsäuren, z.B. Essigsäure und Propionsäure, niedere Alkencarbonsäuren, monocyclisehe, aromatische Carbonsäuren, z.B. Benzoesäure, niedere Alkancarbonsäuren mit monocyclischen aromatischen Resten als Substituenten, z.B. Phenylessigsäure, Cycloalkancarbonsäuren und Cy el oalkenc arb ons äur en ·
Rabelomycin bildet Salze mit Basen, z.B. durch Umsetzung von Rabelomycin mit Alkalimetallhydroxiden oder Erdalkalimetallhydroxiden, wie Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid, Calciumhydroxid, Bariumhydroxid oder Magnesiumhydroxid.
Kristallines Habelomycin hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaftens
Farbe: gelb; F. 1930C (Zersetzung).
Elementaranalyse: G HO
gef.: 67,17# 4*,48?S 28,35?*
(durch Differenzbildung)
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Die Elementaranalyse und die Massenspektroskopie hoher Auflösung ergeben die Summenformel C-, qH-i jOc · Löslichkeit: löslich in Alkohol, Aceton und Chloroform. Unlöslich in Wasser und Petroläther.
ITV-Spektrum: Eine Lösung von kristallinem Rabelomycin in neutralem Methanol oder in 0,02 η HCl enthaltendem Methanol weist folgende Absorptionsbanden auf:
/λ max (mu): 26 600
228 28 800
267 8 000
433
In 0,02 η NaOH enthaltendem Methanol weist es folgende UV-Banden auf:
Λ max (muh (Schulter) 26 ε
258 - • 13 200
282 8 100
325 7 900
507 500
IR-Spektrum: Das IR-,$pektrum in 4-prozentiger Chloroforalösung ist in Figur 1 wiedergegeben. Im folgenden sind die signifikanten Absorptionsbanden in cm" angegeben:
3400 1290 921
2974 1259 903
1700 1181 867
1675 1168. 855
1630 1141 843
1602 1127 828
1566 1099
1463 1074
1448 1057
1375 979
1352 960
Optische Drehung: [aj^ - -102 + 10° (c=l, CHCl3). NMR-Spektrum: Das NMR-Spektrum v/urde in deuteriertem Chloroform .rnitTriilfe eines Varian T-60 NMR-Spektralgerätes aufgezeichnet. Im folgenden sind die chemischen Verschiebungen in Teile/ Million in Bezug zu Tetramethylsilan als internem Standard, die Aufspaltungen und die relativen Intensitäten angegeben:
Chemische Verschiebunga Aufspaltung Verhältnis der Flächen
1,47 S 3
2,37 breit 1
2,98 S 2
3,06 S 2
6,92 S 1
7-8 m 3
11,60 S 1
. 12,21 S 1
a) Chemische Verschiebung nach niedrigerem Feld in Teilen/ Million im Verhältnis zu Tetramethylsilan als internem Standard.
b) s - Singulett, m = Multiplett.
In einem mit kristallinem Rabelomycin durchgeführten Röhrchentest wurden für die minimale Hemmkon.zentration (MIC) in p.g/ml folgende Werte bestimmt:
Microorganismus
Staphylococcus aureus 2O9P Streptocuccus pyogenes C2O3 Bacillus subtilis Escherichia coli
Salmonella schottmuelleri Pseudomonas aeruginosa
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... MIC . ( Hg /ml)
6, 3
1, 2
4, 7
>50
>50
>25
Candida albicans >50
Trichophyton mentagrophytes > 25
Rabelomycin kann in Forschungs- und Krankenhauslaboratorien zur Isolierung gram-negativer Bakterien aus Bodenproben, Abstrichen oder Körperausscheidungen, in denen gram;-positive und gram-negar tive Mikroorganismen zusammen vorkommen, verv/endet v/erden. Rabelomycin kann auch zur Desinfektion von rait Staphylococcus aureus kontaminierten Laborgeräten verwendet werden, insbesondere wenn diese durch die üblichen Desinfektionsverfahren Schaden nehmen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Nährmedien aus Tomatenmark-Hafermehl-Agar werden in Form von schräggestellten Flächen mit Streptomyces olivaceus A.T.C.C. 21 54-9 angeimpft. Nach vierzehntägiger Inkubation werden die Nährmedien zum Animpfen von jeweils 50 ml eines in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befindlichen wässrigen Sojabohnenmehl-Nährmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Sojabohnenmehl (Staley's 4S) 15,0
entwässertes Kartoffelpüree 15,0
Glucose 50,0
CoCl2.2H2O 0,005
CaCO^ 10,0
Agar 2,5
destilliertes Wasser ad 1000 ml.
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Vor dem Animpfen wird das Nährmedium 30 Minuten bei 1210C und 1,05 atü Dampfdruck sterilisiert. Die angexmpften Flaschen v/erden 72 bis 96 Stunden bei 25°G auf einer Drehschüttelmaschine bei 280 U/min und 5,1 cm Hub inkubiert.
500 ml fassende Erlenmeyerkolben mit je 100 ml des folgenden Nährmediums werden mit je 5 Prozent (Vol/Voi) der oben erhaltenen Anzuchtlösung angeimpft:
Sojabohnenmehl (Staley's 4S) 30,0
entwässertes Kartoffelpüree 15,0
Glucose 15,0
CoCl2.2H2O 0,005
CaCO5 10,0
destilliertes Wasser ad 1000 ml
Die Permentationskolben werden ebenso wie die Anzuchtkolben inkubiert und geschüttelt, llaeh 72 bzw. 96 Stunden werden Proben entnommen und zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Mycel mit dem gleichen Volumen Methanol wie der dekantierte Überstand extraliiert. Der Überstand v/ird mit dem halben Volumen wassergesättigtem Essigsäureäthyleßter extrahiert. Der Essigsäureäthylester- und Methanolextrakt werden an Kieselgel chromatographisch mit einem lösungsmittel der folgenden Zusammensetzung untersucht; Chloroform:Methanol:Piperidin (94:5:1, Vol/Vol/Vol). In diesem System weist das Antibiotikum einem Hf-Wert von. etwa 0,45 auf. Das Antibiotikum wird durch Bioautographie mit Hilf e von Staphylococcus aureus 209 P nachgewiesen. Die nach 72 bzw. 96 Stunden Züchtungszeit gewonnenen Methanol- und Essigsäureäthylesterextrakte weisen aufgrund ihres Habelomycingehalts antibiotische Aktivität auf, was durch
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Chromatographie und Bioautographie gezeigt werden kann.
Bei.spiel 2
In einem 440 Liter fassenden Gefäss aus korrosionsbeständigem Stahl wird Streptomyces olivaceus A.T.C.C. 21 549 in 250 Liter Nährmedium der folgenden Zusammensetzung unter den folgenden Bedingungen gezüchtet:
Stufe 1
Inoculum: Eine aus Milch lyophilisierte Kultur von Streptomyces olivaceus A.T.C.C. 21 549 wird auf ein Nährmedium aus Tomatenmark-Hafermehl-Agar in Form einer schräggestellten Hache aufgebracht und gezüchtet. Das Oberflächenwachstum wird in 11 ml einer 0,01prozentigen Lösung einer grenzflächenaktiven Verbindung vom Alkoholsulfattyp suspendiert, und 3 ml dieser Suspension werden als Inoculum verwendet. ,
Nährmedium: g
Sbjabohnenmehl (Staley's 4S) 15,0
entwässertes Kartoffelpüree 15,0
Glucose 50,0
CoCl2.2H2O 0,005
CaCO, * 10,0
Agar 2,5
destilliertes Wasser ad 1000 ml.
100 ml dieses 3 ml S. olivaceus-Suspension enthaltenden/ in einem 500 ml Brlenmeyerkolben befindlichen Nährmediums werden 96 Stunden bei 25 C auf einer Drehschüttelmaschine inkubiert. Die Schüttelmaschine arbeitet mit 280 U/min bei einem Hub von 5,1 cm.
109852 ! 30
Stufe 2
Inoculum: 100 ml aus Stufe 1.
Nahrmedium: Dasselbe wie in Stufe 1. lOOO ml Kahrmedium und Inoculum werden in einem 4 Liter fassenden Erlenraeyerkolben 72 Stunden bei 25 C auf einer Drehschüttelmaschine inkubiert. Der Schüttler arbeitet mit 120 U/min bei einem Hub von 5,1 cm.
Stufe 3
Inoculum: 1000 ml aus Stufe 2.
Nährmedium! Dasselbe wie in Stufe 1. 30 Liter Nährmedium und Inoculum werden in einem 38 Liter fassenden Fermentationsge-
fäss 96 Stunden bei 25°C inkubiert. Während der Inkubation wird die Gärmaische geschüttelt Tmd bei 60 cm/min Oberflächenluft-
geschwindigkeit belüftet·
Stufe 4
Inoculum: 12,5 Liter aus Stufe 3.
Nährmedium:
Sojabohnenmehl (Staley's 4S) 30,0
entwässertes Kartoffelpüree ^ 15,0
Glucose 15,0 GoCl2.2H2O 0,005
CaCO3 10,0 destilliertes Wasser ad 1000 ml,
250 Liter des das Inoculum enthaltenden Nähreinediums werden 96 Stunden inkubiert. Während der Inkubation wird die Gärmaische gerührt und mit 60 cm/min Oberflächenluftgeschwindi^keit belüftet.
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Stufe 5
(a) 240 Liter der erhaltenen Gärmaische werden mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und filtriert. Man erhält 72,5 g unlöslichen Mycelkuchen und 190 Liter KlI tr at.
(b) 72,5 Kilogramm Filterkuchen werden dreimal mit je 100 Liter Methanol extrahiert. Der Kuchen wird zwischen den Extraktionen abfiltriert. Die vereinigten Methanolextrakte werden zur Entfernung des Methanols auf 13,5 Liter eingedampft. Die erhaltene wässrige Suspension wird zu den 190 Litern des in (a) erhaltenen Filtrats gegeben.
(c) Die vereinigten wässrigen Phasen werden dreimal mit je
70 Liter wassergesättigtem Essigsäureäthylester gewaschen. Die vereinigten Essigsäureäthylesterextrakte werden unter vermin-
etwa
dertem Druck eingedampft. Man erhält/400 g eines braunen Sirups. 100 g des Sirups werden der Verteilung zwischen den zwei Schichten des folgenden Lösungsmittelsystems unterzogen: Methanol:Wasser:Hexan (3:1:4, Vol/Vol/Vol). Die Verteilung wird in sechs je 500 ml fassenden Scheidetrichtern durchgeführt, wobei pro Scheidetrichter jeweils 200 ml des oberen und des unteren Lösungsmittels verwendet werden. Der Verteilungsvorgang wird zwölfmal wiederholt. Die Praktionen mit biologischer Aktivität, die nach dem Blättchentest 'ipi't. Hilfe ...von-Staphylococcus aureus 209P festgestellt werden, werden vereinigt, zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft und mit wassergesättigtem Essigsäureäthylester nochmals extrahiert. Der Essigsäureäthylesterextrakt wird mit wasserfreiem Ifatrium-
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sulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Es hinterblei-"ben 30 g trockener Rückstand.
(d) 10 g des in (c) erhaltenen Rückstands werden in 20 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird auf eine DSAE-Cellulosesäule, 3,8 χ 45 cm, die etwa 40 g mit Methanol äquilibrierte DEAE-Gellulose (.Cellex-D, Bio-Rad laboratories, Richmond, California, V.St.A.) enthält, aufgesetzt· Die Säule wird mit Methanol eluiert, und Fraktionen von jeweils 20 ml werden gesammelt. Die Fraktionen mit biologischer Aktivität beim Blättchentest jnit Hilfe vtn. 3"japhylococcus aureu3 209? werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Man erhält 1 g Rückstand.
1 g des in (d) erhaltenen Rückstands wird in Methanol gelöst und in einem Abstand von 2 cm vom unteren Rand auf 20 χ 20 cm Kieselgel-Dünnschichtplatten von 1000 μ Schichtstärke (Quanta/gram, Quantum Industries, !"airfield, New Jersey, V,St.A.)aufgesetzt. Als Laufmittel wird lOprozentiges Methanol in Benzol verwendet. Die mit einem Rf-V/ert von 0,5 auftretende gelbe Rabelomycinbande wird ausgekratzt und mit Aceton aus dem Kieselgel ausgewaschen. Das Acetoneluat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in einem kleinen Volumen Methanol gelöst und,wie oben beschrieben,auf Kieselgelplatten rechromat og'raphiert.
Das aus den Kieselgelplatten erhaltene Material mit biologischer Aktivität wird aus Benzol/Methanol kristallin erhalten. Rabelomycin kristallisiert in Form von gelben Nadeln. Die Ausbeute beträgt etwa 70 mg.
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B e is ρ i e 1 3
Dehydrorabelomycin wird auf folgende Weise hergestellt: Rabelomycin wird in konzentrierter Schwefelsäure gelöst, dann mit Wasser versetzt und das entstandene Gemisch mit Essigsäureäthylester extrahiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man Dehydrorabelomycin als Rohprodukt, das durch Chromatographie an Kieselgel und Umkristallisieren aus Essigsäureäthylester weiter gereinigt wird.
Beispiel 4
Rabelomycin-Diacetat wird auf folgende Weise hergestellt: Eine Probe von Rabelomycin in wasserfreiem Dimethylformamid wird mit 2 Äquivalenten Essigsäureanhydrid und einer katalytischen Menge Pyridin 24 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Rohprodukt wird durch Zusatz von Wasser ausgefällt und durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt.
Beispiel 5
• i Natriumsalz von Rabelomycin wird folgendermassen hergestellt: " Eine Probe von Rabelomycin wird in einem Äquivalent 0,1 η ITaOH gelöst. Die erhaltene "Lösung wird unter verminderten Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält.das Natriumsalz als festes Produkt.
1 0 9 8 5 2 / ι " 1 G

Claims (4)

  1. - 16 Paten tans ρ r ü ehe
    Ä./ Rabelomycin der Strukturformel I und Dehydrorabelomycin der Strukturformel II ,
    und
    OH O OH
    (D
    ihre Alkali- und Erdalkalimetallsalze und ihre Ester.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces' olivaceus in einem verwertbare Kohlenwasserstoff- und organische Stickstoffquellen enthaltenden Nährmediuia unter aeroben Submersbedingiingen bis zur Bildung der Verbindung der Formel I züchtet und gegebenenfalls diese Verbindung durch Umsetzen mit einer Säure zur Verbindung der Formel II dehydratisiert und gegebenenfalls diese Verbindungen mit 'einem Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid zum entsprechenden Alkali- oder !Erdalkalimetallsalz umsetzt oder mit einem Acylierungsmittel verestert,
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptomyces olivaceus A.T.C.G. 21 549 verwendet.
  4. 4. Verwendung der Verbindung der Strukturformel I nach Anspruch 1 als Antibiotikum.
    10 9 8 5 2/1930
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