DE3887820T2 - Antibiotika, Benanomicine A und B und Dexylosylbenanomicin B, ihre Herstellung und Verwendung. - Google Patents

Antibiotika, Benanomicine A und B und Dexylosylbenanomicin B, ihre Herstellung und Verwendung.

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DE3887820T2
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Description

    ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft neue antimykotisch wirkende Antibiotika, die jeweils als Benanomicin A, Benanomicin B und Dexylosylbenanomicin B bezeichnet sind und die jeweils als ein therapeutisches antimykotisch wirkendes Mittel brauchbar sind und in Form ihrer Salze oder im Fall von Benanomicin A und Dexylosylbenanomicin B in Form ihrer Ester vorliegen können. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung der Benanomicine A und B durch Fermentation sowie ein Verfahren zur Erzeugung von Dexylosylbenanomicin B aus Benanomicin B. Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Benanomicin A, Benanomicin B oder Dexylosylbenanomicin B als aktiven Bestandteil aufweist.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es sind schon viele Antibiotika bekannt, aber es werden immer noch neue antibiotische Substanzen auf dem pharmazeutischen Gebiet und auch in der Landwirtschaft benötigt. Wir, die Erfinder, haben ausführliche Untersuchungen durchgeführt, um neue antibiotische Substanzen zu entdecken und bereitzustellen, die nützliche antibakterielle und/oder antimykotische Wirksamkeit zeigen können. Als Ergebnis haben wir nunmehr gefunden, daß, wenn ein Mikrobenstamm der Gattung Actinomycetes, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die aus der Erde in unserem Labor in Tokio, Japan, entnommen wurde und die mit der Laborbezeichnung MH193-16F4-Stamm versehen wurde, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, einige Antibiotika erzeugt werden, die antimykotische Wirksamkeiten zeigen. Es ist uns gelungen, zwei antimykotisch wirkende Antibiotika aus der Kultur des Stamms MH193-16F4 zu isolieren und zu reinigen, und wir haben diese beiden isolierten Antibiotika Benanomicin A bzw. Benanomicin B genannt. Wir haben die physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften der Benanomicine A und B untersucht, um zu bestätigen, daß die Benanomicine A und B neue Substanzen sind, die sich von allen bekannten Antibiotika unterscheiden. Durch unsere weiteren Untersuchungen ist es uns nunmehr gelunden, die chemischen Strukturen der Benanomicine A und B festzustellen. Außerdem ist es uns gelungen, eine neue Verbindung, und zwar Dexylosylbenanomicin B, durch eine chemische Umwandlung von Benanomicin B zu synthetisieren, und wir haben gefunden, daß Dexylosylbenanomicin B ebenfalls eine nützliche antimykotische Wirkung zeigen kann.
  • Wir haben ferner gefunden, daß die neuen Antibiotika, die Benanomicine A und B, gemäß der Erfindung hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften sowie ihrer chemischen Strukturen drei bekannten Antibiotika mehr oder weniger gleich sind, und zwar der Substanz KS-619-1 {Matsuda et al.: "Journal of Antibiotics" 40, 1104-1114 (1987)}; und der Substanz G-2N und der Substanz G-2A {Gerber et al.: "Canad. J. Chem." 62, 2818-2821 (1984)}, daß aber die Benanomicine A und B von den drei vorgenannten bekannten Antibiotika klar unterschieden werden können aufgrund ihrer physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften sowie auch ihrer chemischen Strukturen.
  • Es ist bereits eine Vielzahl von Antibiotika bekannt, die von Mikroorganismen erzeugt werden. Unter den bekannten Antibiotika gibt es jedoch nur wenige, die zwar eine nützliche antimykotische Wirksamkeit zeigen, aber gegenüber Säugetieren geringe Toxizität aufweisen. Es besteht also immer Bedarf an der Entdeckung und Nutzbarmachung eines neuen antimykotisch wirkenden Antibiotikums, das bei der therapeutischen Behandlung von verschiedenem Pilzbefall bei Tieren, einschließlich Menschen, brauchbar ist. Wir haben nunmehr gefunden, daß die Benanomicine A und B sowie Dexylosylbenanomicin B geringe Toxizität gegenüber Tieren haben und daß sie durch eine nachstehend angegebene allgemeine Formel (I) repräsentiert werden können.
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung von neuen Antibiotika, die eine nutzbare hohe antimykotische Wirksamkeit bei niedriger Toxizität gegenüber Säugetieren zeigen können, und insbesondere von Benanomicin A, Benanomicin B und Dexylosylbenanomicin B, ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen sowie der Ester von Benanomicin A und der Ester von Dexylosylbenanomicin B. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Erzeugung dieser neuen Antibiotika. Weitere Ziele der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
    • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird daher eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
  • angegeben mit R = eine Hydroxylgruppe oder eine Aminogruppe und R¹ = ein Wasserstoffatom oder eine Xylosylgruppe mit der Maßgabe, daß, wenn R die Hydroxylgruppe ist, R¹ nicht das Wasserstoffatom ist,
  • und ein Salz der Verbindung der Formel (I) oder ein Ester der Verbindung der Formel (I) mit der Maßgabe, daß in diesem Fall R keine Aminogruppe und R¹ keine Xylosylgruppe ist.
  • Eine solche Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der R eine Hydroxylgruppe und R¹ eine Xylosylgruppe der Formel
  • ist, ist Benanomicin A der Formel (Ia)
  • Eine solche Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der R eine Aminogruppe und R¹ die Xylosylgruppe ist, ist Benanomicin B der Formel (Ib)
  • Eine solche Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der R eine Aminogruppe und R¹ das Wasserstoffatom ist, ist Dexylosylbenanomicin B der Formel (Ic)
  • Benanomicin A und Benanomycin B können kollektiv durch eine allgemeine Formel (I') repräsentiert werden:
  • wobei R eine Hydroxylgruppe für Benanomicin A und R eine Aminogruppe für Benanomicin B ist.
  • Bevor die chemische Struktur von Benanomicin A wie vorstehend geklärt wurde, mußte Benanomicin A zuerst erhalten und als eine solche antibiotisch wirksame Substanz identifiziert werden, die die folgenden Eigenschaften hat: sie ist eine saure Substanz in Form eines rötlichbraunen Pulvers, zeigt eine empirische Formel C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub1;NO&sub1;&sub9;, ein Massenspektrum (FD-MS) von m/z 827 (M&spplus;), einen Schmelzpunkt von höher als 220 ºC, ein UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum (in Methanol) gemäß Figur 1 der beigefügten Zeichnungen, ein IR-Absorptionsspektrum (in Kaliumbromid pelletiert) gemäß Figur 2 der beigefügten Zeichnungen, ein ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, DMSO-d&sub6;, 40 ºC) gemäß Figur 3 der beigefügten Zeichnungen und ein ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, DMSO-d&sub6;) gemäß Figur 4 der beigefügten Zeichnungen und ist nur schwerlöslich in Methanol, Chloroform, Ethylacetat und Aceton und löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und alkalischem Wasser, jedoch unlöslich in Wasser.
  • Bevor die chemische Formel von Benanomicin B wie oben geklärt wurde, wurde Benanomicin B zuerst erhalten und als eine solche antibiotisch wirksame Substanz identifiziert, die die folgenden Eigenschaften hat: das Hydrochlorid von Benanomicin B ist ein amphoterer Stoff in Form eines rötlichbraunen Pulvers, zeigt eine empirische Formel C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub8; HCl, ein Massenspektrum (SI-MS) von m/z 827 (MH&spplus;), einen Schmelzpunkt von höher als 220 ºC, eine spezifische Drehung [α]D22 +360º (c 0,05, H&sub2;O), ein UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum (in Methanol) gemäß Figur 5 der beigefügten Zeichnungen, ein IR-Absorptionsspektrum (in Kaliumbromid pelletiert) gemäß Figur 6 der beigefügten Zeichnungen, ein ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, DMSO- d&sub6;, 40 ºC) gemäß Figur 7 der beigefügten Zeichnungen und ein ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, DMSO-d&sub6;) gemäß Figur 8 der beigefügten Zeichnungen und ist nur schwerlöslich in Chloroform, Ethylacetat und Aceton und löslich in Methanol, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Wasser.
  • 1. Die oben angegebenen und weitere physikalisch-chemischen Eigenschaften von Benanomicin A sind nachstehend im einzelnen aufgeführt:
  • (1) Farbe und Auftreten: rötlichbraunes Pulver
  • (2) Empirische Formel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub1;NO&sub1;&sub9;
  • (3) Massenspektrum (FD-MS): m/z 827 (M&spplus;)
  • (4) Schmelzpunkt > 220 ºC
  • (5) spezifische Drehung: [α]D22 nichtmeßbar (c 0,05, DMSO)
  • (6) UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum λmax, nm (E11%cm):
  • {in Methanol}: 206(718), 230sh(600),
  • 288(482), 302sh(390),
  • 400sh(120), 476(197)
  • {in 0,1 N HCl-Methanol}: 207(649), 233(629), 298(561), 395sh(140), 457(223)
  • {in 0,1 N NaOH-Methanol}: 214(1270), 249(637), 320(289), 498(287)
  • (7) IR-Absorptionsspektrum (KBr, cm&supmin;¹): 3350, 2970, 2890, 1720, 1620, 1600, 1485, 1440, 1425, 1390, 1375, 1330, 1295, 1255, 1235, 1205, 1160, 1130, 1070, 1040, 1000, 970, 900, 870, 830, 800, 750
  • (8) ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, in DMSO-d&sub6; bei 40 ºC):
  • δ(ppm) : 1,14(3H, d), 1,35(3H, d), 2,34 (3H, s), 3,09(1H, dd), 3,13(1H, dd), 3,17(1H, dd), 3,32(1H, ddd), 3,56(1H,dd), 3,62(2H, m), 3,72 (1H, dd), 3,74(1H, br), 3,92(3H, s), 4,43(1H, d), 4,43(1H, dq), 4,53(1H,d), 4,57(1H, d), 4,65 (1H, d), 4,90(2H, br), 5,61(1H, br), 6,05(1H, br), 6,86(1H, d) 7,21(1H, s),7,24(1H, d), 8,05 (1H, s), 8,45(1H, d), 12,47 (1H, br), 12,77 (1H, s) 13,69 (1H, br)
  • (9) ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, in DMSO-d&sub6; bei 40 ºC):
  • δ(ppm) : 187,3 s, 184,9 s, 173,9 s, 166,9 s, 165,9. s, 164,7 s, 156,8 s, 151,1s, 147,7 s 138,1 s, 137,4 s, 134,2 s, 131,3 s, 127,5 s, 125,6 s, 118,6 d 115,5 s,115,4 d, 113,7 s, 110,0 s, 107,5 d, 106,8 d, 105,2 d, 104,4 d, 83,0 d, 81,7 d, 76,0 d, 73,6 d, 71,9 d, 70,3 d, 70,1 d, 70,1 d, 69,4 d, 65,6 t, 56,3 q, 47,6 d, 19,1 q, 16,9 q, 16,3 q
  • (Signale bei 72,9, 81,7, 115,4 und 118,6 ppm breit.)
  • (10) Löslichkeit: Nur schwerlöslich in Methanol, Chloroform, Ethylacetat und Aceton, löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und alkalischem Wasser, aber in Wasser unlöslich.
  • (11) Unterscheidung zwischen der basischen, sauren und neutralen Beschaffenheit von Stoffen: saure Substanz.
  • 2. Die oben angegebenen und weitere physikalisch-chemische Eigenschaften von Benanomicin-B-Hydrochlorid sind nachstehend im einzelnen aufgeführt:
  • (1) Farbe und Auftreten: rötlichbraunes Pulver
  • (2) Empirische Formel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub8; HCl
  • (3) Massenspektrum (SI-MS): m/z 827 (MH&spplus;)
  • (4) Schmelzpunkt : > 220 ºC
  • (5) Spezifische Drehung: [α]D22 + 360º (c 0,05, H&sub2;O)
  • (6) UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum, λmax, nm (E11%cm):
  • {in Methanol}: 205(587), 233(526), 296(426), 390sh(100), 458(169)
  • {in 0,1 N HCl-Methanol}: 207(514), 235(530), 295(442), 400sh(114), 457(173)
  • {in 0,1 N NaOH-Methanol}: 214(1219), 247(518), 317(238), 496(215)
  • (7) IR-Absorptionsspektrum (KBr, cm&supmin;¹):
  • 3350, 2980, 2900, 1720, 1610, 1485, 1350, 1430, 1395, 1380, 1330, 1300, 1260, 1240, 1210, 1160, 1080, 1045, 970, 955, 900, 885, 840, 820
  • (8) ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, in DMSO-d&sub6; bei 40 ºC):
  • 1,20(3H, d), 1,36(3H, 3), 2,35 (3H, s), 3,099(1H, dd), 3,17(1H, m), 3,19(1H, m), 3,34(1H, ddd), 3,44 (1H, br), 3,65(1H, br), 3,75 (1H, dd), 3,90(1H, br q), 3,94 (3H, s), 3,997(1H, dd), 4,44(1H, dq), 4,57(1H, d), 4,57(1H, br d), 4,62 (1H, br d), 4,75(1H, d), 6,90(1H, d), 7,27(1H, d), 7,27(1H, br s), 7,99 (3H, br), 8,06(1H, br s), 8,45(1H, d), 8,45(1H, br), 12,79(1H, s), 13,81(1H, br), 4,1-6,3(5H, br)
  • (9) ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, in DMSO-d&sub6;, bei 40 ºC):
  • δ (ppm): 187,4 s, 184,9 s, 173,9 s, 166,9 s, 165,9 s, 164,7 s, 156,8 s, 151,0 s, 148,0 s, 137,8 s, 137,3 s, 134,2 s, 131,2 s, 127,5 s, 125,7 s, 118,9 d, 115,9 d, 115,5 s, 113,7 s, 110,0 s, 107,6 d, 106,8 d, 104,44 d, 104,1 d, 81,0 d, 77,4 d, 75,9 d, 73,3 d, 71,5 d, 69,8 d, 69,4 d, 67,0 d, 65,7 t, 56,3 q, 54,2 d, 47,6 d, 19,1 q, 16,9 q, 16,3 q
  • (Die Signale bei 71,5, 81,0, 113,7, 115,9, 118,9 und 125,7 ppm sind breit.)
  • (10) Löslichkeit: Nur schwerlöslich in Chloroform, Ethylacetat und Aceton sowie löslich in Methanol, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Wasser.
  • (11) Unterscheidung zwischen der basischen, sauren und neutralen Beschaffenheit von Substanzen: Amphotere Substanz.
  • 3. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorid sind nachstehend aufgeführt.
  • (1) Farbe und Auftreten: rötlichbraunes Pulver
  • (2) Empirische Formel: C&sub3;&sub4;H&sub3;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub4; HCl
  • (3) Massenspektrum (SD-MS): m/z 696 (M+2)&spplus;
  • (4) Schmelzpunkt: > 180 ºC (zersetzt)
  • (5) Spezifische Drehung: [α]D24 + 396º (c 0,05, 0,05 N HCl)
  • (6) UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum λmax, nm (E11%cm)
  • {in Methanol}: 204(569), 234(517), 290(431), 300sh(395), 400sh(110), 463(170)
  • {in 0,1 N HCl-Methanol}: 209(522), 234(557), 296(487), 400sh(130), 459(196)
  • {in 0,1 N NaOH-Methanol}: 213(1205), 249(575), 258sh(520), 319(259), 496(251)
  • (7) IR-Absorptionsspektrum (KBr, cm&supmin;¹):
  • 3400, 2980, 2910, 1730, 1610, 1515, 1490, 1450, 1435, 1395, 1380, 1340, 1300, 1260, 1240, 1210, 1170, 1130, 1090, 1030, 1005, 980, 880, 835
  • (8) ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, in DMSO-d&sub6; bei 40 ºC):
  • δ (ppm): 1,18 (3H, d), 1,34 (3H, d), 2,33 (3H, s), 3,26 (1H, br s), 3,47 (1H, br), 3,74 (1H, br dd), 3,86 (1H, br q), 3,96 (3H, s), 4,43 (1H, dq), 4,53 (1H, br d), 4,60 (1H, br d), 4,68 (1H, d), 6,94 (1H, d), 7,25 (1H, br s), 7,31 (1H, d), 7,87 (3H, br), 8,08 (1H, s), 8,45 (1H, d), 8,60 (1H, br), 12,81 (1H, s), 13,81 (1H, br)
  • (9) ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, in DMSO-d&sub6; bei 40 ºC):
  • δ(ppm): 187,4 s, 184,9 s, 173,8 s, 166,8 s, 165,9 s, 164,7 s, 156,8 s, 150,9 s, 147,9 s, 137,9 s, 137,2 s, 134,2 s, 131,2 s, 127,4 s, 125,7 s, 118,8 d, 115,5 d, 115,5 s, 113,6 s, 110,0 s, 107,5 d, 106,8 d, 104,6 d, 81,1 d, 71,5 d, 70,5 d, 69,8 d, 67,1 d, 56,4 q, 54,6 d, 47,6 d, 19,1 q, 16,8 q, 16,3 q
  • (Die Signale bei 115,5 und 118,8 ppm sind breit.)
  • (10) Löslichkeit: Nur schwerlöslich in Chloroform, Ethylacetat und Aceton und löslich in Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
  • (11) Unterscheidung zwischen der basischen, sauren und neutralen Beschaffenheit von Substanzen: amphotere Substanz.
  • Die beigefügten Zeichnungen zeigen folgendes:
  • Fig. 1 ist ein UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum von Benanomicin A in Methanol (20 ug/ml);
  • Fig. 2 ist ein IR-Absorptionsspektrum von Benanomicin A, pelletiert in Kaliumbromid;
  • Fig. 3 ist ein ¹H-NMR-Absorptionsspektrum von Benanomicin A, gemessen bei 400 MHz in Deuterodimethylsulfoxid (DMSO-d&sub6;);
  • Fig. 4 ist ein ¹³C-NMR-Absorptionsspektrum von Benanomicin A, gemessen bei 100 MHz in Deuterodimethylsulfoxid (DMSO-d&sub6;);
  • Fig. 5 ist ein UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum von Benanomicin-B-Hydrochlorid in Methanol (20 ug/ml);
  • Fig. 6 ist ein IR-Absorptionsspektrum von Benanomicin-B- Hydrochlorid, pelletiert in Kaliumbromid;
  • Fig. 7 ist ein ¹H-NMR-Absorptionsspektrum von Benanomicin-B-Hydrochlorid, gemessen bei 400 MHz in Deuterodimethylsulfoxid; und
  • Fig. 8 ist ein ¹³C-NMR-Absorptionsspektrum von Benanomicin-B-Hydrochlorid, gemessen bei 100 MHz in Deuterodimethylsulfoxid;
  • Fig. 9 ist ein UV- und sichtbares Strahlenabsorptionsspektrum von Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorid, gemessen in Methanol (20 ug/ml) (dessen Spektrum durch eine Vollinie bezeichnet ist), in 0,1 N Chlorwasserstoffsäure-Ethanol (20 ug/ml) (dessen Spektrum durch eine Strichlinie bezeichnet ist); und in 0,1 N Natriumhydroxid-Ethanol (20 ug/ml) (dessen Spektrum durch eine Strich-Punkt-Linie bezeichnet ist);
  • Fig. 10 ist ein IR-Absorptionsspektrum von Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorid, pelletiert in Kaliumbromid;
  • Fig. 11 ist ein ¹H-NMR-Absorptionsspektrum von Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorid, gemessen bei 400 MHz in Deuterodimethylsulfoxid; und
  • Fig. 12 ist ein ¹³C-NMR-Absorptionsspektrum von Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorid, gemessen bei 100 MHz in Deuterodimethylsulfoxid.
  • Salze der Verbindung der allgemeinen Formel (I), und zwar der Benanomicine A und B und von Dexylosylbenanomicin B, umfassen ein phamazeutisch akzeptables Salz (das Carboxylat) mit einem pharmazeutisch akzeptablen Metall, speziell einem pharmazeutisch akzeptablen Alkalimetall wie Natrium und Kalium, und einem pharmazeutisch akzeptablen Erdalkalimetall wie Calcium und Magnesium, und Ammoniumgruppe, sowie ein pharmazeutisch akzeptables Base-Additionssalz (an der Carboxylgruppe der Verbindung) mit einer pharmazeutisch akzeptablen organischen Base, speziell einem Amin wie etwa einem niederen (C&sub1;-C&sub6;) Alkylamin, insbesondere Triethylamin, Ethanolamin und Dicyclohexylamin, und außerdem im Fall von Benanomicin B und Dexylosylbenanomicin B einem pharmazeutisch akzeptablen Säure-Additionssalz (an der Aminogruppe) mit einer pharmazeutisch akzeptablen anorganischen Säure wie etwa Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure oder einer pharmazeutisch akzeptablen organischen Säure wie etwa Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure und einer Alkansulfonsäure. Ester der Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit der Maßgabe, daß in diesem Fall R der Verbindung der Formel (I) keine Aminogruppe ist und R¹ der Formel (I) keine Xylosylgruppe ist, umfassen einen pharmazeutisch akzeptablen Ester (das Carboxylat) mit einem pharmazeutisch akzeptablen esterbildenden Radikal wie etwa einer niederen (C&sub1;-C&sub6;) Alkylgruppe, speziell Methyl oder Ethyl; eine niedere (C&sub2;-C&sub6;) Alkanoyloxy/niedere (C&sub1;-C&sub6;) Alkylgruppe wie Acetoxymethyl, 1- Acetoxyethyl und Pivaloyloxymethyl; oder eine niedere (C&sub1;- C&sub6;) Alkoxycarbonyloxy/niedere (C&sub1;-C&sub6;) Alkylgruppe wie 1- (Ethoxycarbonyloxy)ethylgruppe.
  • 4. Die antibakterielle und antimykotische Wirksamkeit von Benanomicin A, Benanomicin B und Dexylosylbenanomicin B (als das Hydrochlorid) werden nachstehend beschrieben.
  • Die minimale Hemmkonzentration (MIC, ug/ml) von Benanomicin A und Benanomicin B gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen wird nach einer Standard-Reihenverdünnungsmethode bestimmt und ist in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 gezeigt. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC, ug/ml) von Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorid gegenüber einer Vielzahl von Pilzen werden ebenfalls auf gleiche Weise bestimmt und sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Wie die Tabelle 2 zeigt, können die Benanomicine A und B sowie Dexylosylbenanomicin B gegenüber verschiedenen Pilzarten beträchtliche antimykotische Wirksamkeiten aufweisen. Tabelle 1 Test-Mikroorganismus (Bakterien) Benanomicin Staphylococcus aureus FDA209P Staphylococcus aureus Smith Micrococcus luteus FDA16 Bacillus subtilis PCI219 Corynebacterium bovis 1810 Mycobacterium smegmatis ATCC607 Escherichia coli NIHJ Escherichia coli K-12 Shigella dysenteriae JS11910 Salmonella typhi T-63 Proteus vulgaris OX19 Pseudomonas aeruginosa A3 Klebsiella pneumoniae PCI602 Tabelle 2 Test-Mikroorganismus (Pilze) Benanomicin Dexylosylbenanomicin B Candida tropicalis F-1 Candida pseudotropicalis F-2 Candidia albicans 3147 Candida Yu-1200 Candida krusei F-5 Saccharomyces cerevisiae F-7 Cryptococcus neoformans F-10 Cochliobolus miyabeanus Pyricularia oryzae Pellicularia sasakii Xanthomonas citri Xanthomonas oryzae Aspergillus niger Trichophyton asteroides 429 Trichophyton mentagrophytes (883)
  • 5. Toxizität der Benanomicine A und B und von Dexylosylbenanomicin B
  • Bei dem Test auf akute Toxizität der neuen Antibiotika der Erfindung bei einem Säugetier nach intravenöser Verabreichung zeigte sich, daß die neuen Antibiotika der Erfindung geringe akute Toxizität haben. Bei einem Test auf akute Toxizität, wobei die Benanomicine A und B und Dexylosylbenanomicin B Mäusen vom Jcl:ICR-Stamm (männlich, Körpergewicht 19-20 g, 5 Mäuse je Gruppe) separat intravenös verabreicht wurden, tolerierten die Mäuse eine Dosis von 600 mg/kg Benanomicin A (d. h. keine der Mäuse wurde durch die intravenöse Verabreichung von Benanomicin A in einer Dosierung von 600 mg/kg getötet), und die Mäuse tolerierten auch eine Dosierung von 100 mg/kg Benanomicin B oder Dexylosylbenanomicin B.
  • 6. Therapeutische Auswirkungen von Benanomicin A bei einer Pilzinfektion
  • Heilende oder therapeutische Auswirkungen von Benanomicin A bei einer experimentellen Candida-Infektion bei Mäusen wurden geschätzt durch intravenöses Beimpfen von Mäusen vom Jcl:ICR-Stamm (männlich, Körpergewicht 19-20 g, 5 Mäuse je Gruppe) mit einer wäßrigen Suspension (0,2 ml) eines Fungus, Candida albicans, in einer Dosis von 10&sup6; CFU/Maus und subcutane oder orale Verabreichung von Benanomicin A in verschiedenen Dosierungen, die in der Tabelle 3 angegeben sind, an die Mäuse, die mit dem Candida-Fungus infiziert worden waren.
  • Die Verabreichung von Benanomicin A erfolgte dreimal, und zwar direkt nach der Pilzbeimpfung, 6 h und 24 h nach der Beimpfung.
  • Die erhaltenen Testergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Dosis von Benanomicin A (mg/Maus) Verabreichungsroute Zahl der überleb. Mäuse % der Zahl der überl. Mäuse gegenüber den Testmäusen unbehandelt (Kontrolle) mal*, subcutan mal*, oral *Verabreicht unmittelbar nach der Beimpfung bzw. 6 h später bzw. 24 h später.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zur Herstellung von Benanomicin A und/oder Benanomicin B, das folgende Schritte aufweist: Züchten eines Benanomicin A und Benanomicin B produzierenden Stamms von Actinomycetes in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen aufweist, unter aeroben Bedingungen, um Benanomicin A und/oder Benanomicin B in der Kultur zu produzieren und zu akkumulieren, und anschließendes Gewinnen von Benanomicin A und Benanomicin B oder eines davon aus der Kultur.
  • Bei dem Verfahren nach dem zweiten Aspekt der Erfindung kann der Benanomicin A und Benanomicin B produzierende Stamm von Actinomycetes, der in dem Verfahren eingesetzt werden kann, in dem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20-40 ºC, bevorzugt von 25-37 ºC, für die Dauer von 3-10 Tagen gezüchtet werden.
  • Ein geeignetes Beispiel des Stamms, der fähig ist, Benanomicin A und Benanomicin B zu produzieren, und der bei dem Verfahren eingesetzt werden kann, ist ein Actinomycetes- Stamm MH193-16F4 der nachstehend wie folgt spezifiziert wird.
    • (a) Mikrobiologische Eigenschaften des Actinomycetes- Stamms MH193-16F4
  • Dieser Stamm MH193-16F4 ist ein Stamm der Familie Actinomycetes, der im März 1984 in unserem Labor, Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyujo aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die auf dem Gelände des Labors entnommen worden war, und dem die Laborbezeichnung MH193-16F4 zugeordnet wurde. Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stamms sind folgende.
    • 1. Morphologie
  • Bei Beobachtung unter dem Mikroskop bildet der Stamm MH193-16F4 Luftmycel aus verzweigtem Substratmycel. Eine Fragmentierung von Substratmycel wird nicht beobachtet. Die Bildung von Luftmycel wird nur auf ISP-Medium 2 und ISP- Medium 3 beobachtet. Sporenbildung beginnt gewöhnlich bei 27 ºC etwa ab dem 18. Tag der Inkubation in ISP-Medium 3. An dem Luftmycel werden weder Wirbelbildung noch Spiralen noch Sporangien beobachtet, aber kurze Sporenträger werden im wesentlichen vertikal an dem Luftmycel gebildet. Eine Kette von gewöhnlich 3-7 Sporen, selten 2 Sporen, wird an der Spitze jedes Sporenträgers gebildet. Sporenketten können manchmal eine Schleifengestalt annehmen. Einzelsporen haben zylindrische (0,8 x 1,0-1,2 um) bis kugelige (0,8-1,2 um) Gestalt, und ihre Oberflächen sind glatt.
    • 2. Kultivierungs-Charakteristiken in verschiedenen Medien:
  • Die Beschreibungen von Farben, die in Klammern angegeben sind, erfolgen nach den Regeln des Color Harmony Manual of Container Corporation of America.
  • (1) Saccharosenitrat-Agarnährlösung (bei 27 ºC kultiviert):
  • Das Wachstum war farblos. Luftmycel wurde nicht gebildet, auch wurde kein lösliches Pigment produziert. Im gleichen Medium, aber mit Vitamin B angereichert, war das Wachstum farblos bis rosa-grau {5ec, Dusty Peach}. Hier wurde kein Luftmycel gebildet, aber lösliches Pigment wurde nur gering rötlich getönt.
  • (2) Glucose-Asparagin-Agarnährmedium (kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos. Weder Luftmycel noch lösliches Pigment wurde prodziert. Im gleichen Nährmedium, aber mit Vitamin B angereichert, war das Wachstum farblos bis blaßrosa {4gc, Nude Tan}. Hier wurde kein Luftmycel gebildet, aber rötliches lösliches Pigment wurde gebildet.
  • (3) Glycerin-Asparagin-Agarnährmedium (ISP-Medium 5, kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos, und es wurde weder Luftmycel noch lösliches Pigment produziert. Im gleichen Medium, jedoch mit Vitamin B angereichert, war das Wachstum graurotviolett {81g, Rose Mauve} bis purpurrot {81e, Rose Wine}, wobei dünnes weißes Luftmycel gebildet und lösliches purpurrotes {8pc, Cranberry} Pigment produziert wurde.
  • (4) Anorganische Salze-Stärke-Agarnährmedium (ISP-Medium 4, kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos, und weder Luftmycel noch lösliches Pigment wurde gebildet. Im gleichen Medium, jedoch mit Vitamin B angereichert, wurde lösliches Pigment von leicht rötlicher Farbe produziert.
  • (5) Tyrosin-Agarnährmedium (ISP-Medium 7, kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos bis blaßgelblichbraun {3ic, Lt. Amber}. Es wurde weder Luftmycel noch lösliches Pigment produziert. Im gleichen Nährmedium, das jedoch mit Vitamin B angereichert war, war das Wachstum farblos bis graurotpurpur. Dabei wurde kein Luftmycel gebildet, aber lösliches Pigment von schwach rötlicher Farbe wurde produziert.
  • (6) Nährboden-Agarmedium (kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war blaßgelb {2gc, Bamboo}, wobei weder Luftmycel noch lösliches Pigment produziert wurde. Im gleichen Medium, jedoch mit Vitamin B angereichert, zeigte das Wachstum gleiche Eigenschaften.
  • (7) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium (ISP-Medium 2, kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war blaßgelb {2ec, Biscuit} bis dunkelrot {7pi, Dk. Wine - 7 1/2pe, Dk. Red} bis graurot {7pg, Wine}. Ab etwa dem 14. Inkubationstag wurde an dem Wachstum grauweißes Luftmycel gebildet. Lösliches Pigment einer mattroten Farbe {6 1/2pe, Tomato Red} wurde zwar um das Wachstum herum zu Beginn der Inkubation produziert, das lösliche Pigment breitete sich danach allmählich aus. Die Farbe des Wachstums und des löslichen Pigments änderten sich zu Orangefärbung durch Umsetzung mit HCl, zeigten aber bei Umsetzung mit NaOH keine Farbänderungen. Das Wachstum zeigte außerdem ähnliche Eigenschaften im gleichen Medium, das mit Vitamin B angereichert war.
  • (8) Hafermehl-Agarmedium (ISP-Medium 3, kultiviert bei 27 ºC):
  • Auf dem Wachstum einer blaßrosa ({4gc, Nude Tan} bis grauroten {6le, Cedar} bis dunkelroten {7pe, Cherry Wine} bis purpurgrauen {8ig, Mauve Gray} Farbe wurde grauweißes {3cb, Sand} Luftmycel etwa ab dem 10. Inkubationstag gebildet. Lösliches Pigment war leicht rötlich getönt. Die Farbe des Wachstums und des löslichen Pigments ging in orange Farben über durch Umsetzung mit HCl, zeigte jedoch bei Umsetzung mit NaOH keine Farbänderungen. Das Wachstum zeigte auch im gleichen, jedoch mit Vitamin B angereicherten Nährmedium ähnliche Eigenschaften.
  • (9) Glycerin-Nitrat-Agarmedium (kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos, und es wurde kein Luftmycel gebildet. Es wurde kein lösliches Pigment produziert. Im gleichen, jedoch mit Vitamin B angereicherten Medium zeigte das Wachstum ähnliche Eigenschaften.
  • (10) Stärke-Agarmedium (kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos. Weder Luftmycel noch lösliches Pigment wurden produziert. Im gleichen, aber mit Vitamin B angereicherten Medium war das Wachstum farblos, und es bildete sich kein Luftmycel, aber lösliches Pigment war leicht rötlich getönt.
  • (11) Calciummalat-Agarmedium (kultiviert bei 27 ºC):
  • Das Wachstum war farblos, und es wurde kein Luftmycel gebildet. Lösliches Pigment war leicht rötlich getönt. Im gleichen Medium, jedoch mit Vitamin B angereichert, war das Wachstum farblos, und es wurde weder Luftmycel noch lösliches Pigment gebildet.
  • (12) Cellulose (synthetische Testlösung, die Filterpapierstückchen enthielt, kultiviert bei 27 ºC):
  • Es wurde kein Wachstum beobachtet.
  • (13) Gelatinestichkultur:
  • Das Wachstum war dünn, und zwar sowohl in 15 % einfachem Gelatinemedium (bei 20 ºC kultiviert) als auch in Glucose- Pepton-Gelatinemedium (bei 27 ºC kultiviert). Das Wachstum war farblos, und es wurden weder Luftmycel noch lösliche Pigmente gebildet.
  • (14) Magermilch (kultiviert bei 37 ºC):
  • Das Wachstum war extrem dünn. Das Wachstum war farblos, und es wurde weder Luftmycel noch lösliches Pigment gebildet.
    • 3. Physiologische Charakteristiken:
  • (1) Wachstumstemperaturbereich:
  • Die Inkubation des Stamms MN193-16F4 wurde in einem Stärke-Hefe-Agarmedium getestet, das 1,0 % solubilisierte Stärke, 0,2 % Hefeextrakt und 2,0 % Agar-Agar (pH 7,0) enthielt, und zwar bei verschiedenen Inkubationstemperaturen von 20 ºC, 24 ºC, 27 ºC, 30 ºC, 37 ºC und 50 ºC. Als Resultat wuchs der Stamm bei sämtlichen Test-Temperaturen außer bei 50 ºC. Die optimale Wachstumstemperatur für diesen Stamm liegt jedoch offenbar im Bereich zwischen ca. 27 ºC und 37 ºC.
  • (2) Verflüssigung von Gelatine (in 15 % einfachem Gelatinemedium, kultiviiert bei 20 ºC, und in Glucose- Pepton-Gelatinemedium, kultiviert bei 27 ºC):
  • In dem einfachen Gelatinemedium und in dem Glucose- Pepton-Gelatinemedium wurde während der Inkubation des Stamms über 3 Monate keine Verflüssigung der Gelatine beobachtet.
  • (3) Hydrolyse von Stärke (in anorganischem Salze-Stärke- Agarmedium und in Stärke-Agarmedium, beide bei 27 ºC kultiviert):
  • Stärkehydrolyse setzte erst ein, nachdem der Stamm in dem anorganischen Salze-Stärke-Agarmedium und auch in dem Stärke-Agarmedium inkubiert wurde.
  • (4) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch (in Magermilch, kultiviert bei 37 ºC):
  • Das Wachstum war dünn, und während der Inkubation des Stamms über 3 Monate wurde weder Koagulation noch Peptonisierung von Magermilch beobachtet.
  • (5) Bildung von melanoiden Pigmenten (in Trypton-Hefeextraktbrühe, ISP-Medium 1; Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar, ISP-Medium 6; Tyrosin-Agar, ISP-Medium 7; sämtlich bei 27 ºC kultiviert):
  • Die Bildung von Melanoiden war in sämtlichen Medien negativ.
  • (6) Verwertbarkeit von Kohlenstoffquellen (in Pridham- Gottlieb-Agarmedium, ISP-Medium 9; kultiviert bei 27 ºC):
  • Wenn der Stamm wächst, sind Glucose, L-Arabinose, D- Xylose, D-Fractose, Saccharose, Rhamnose, Raffinose und D- Mannitol verwertbar, während Inositol nicht verwertbar ist.
  • (7) Verflüssigung von Calciummalat (in Calciummalat- Agar, kultiviert bei 27 ºC): negativ.
  • (8) Reduktion von Nitrat (in Bacto-Nitratbrühe, ISP- Medium 8, kultiviert bei 27 ºC): positiv.
  • (9) Abbau von Zellulose (in einer synthetischen Testlösung, die Filterpapierstückchen enthielt, kultiviert bei 27 ºC):
  • Der Stamm wächst nicht.
  • Wenn man die obigen mikrobiologischen Eigenschaften zusammenfaßt, so ist der Stamm MH193-16F4 dadurch charakterisiert, daß Sporenketten von 3-7 Sporen (selten 2 Sporen) im wesentlichen vertikal an Hauptstengeln von Luftmycel gebildet werden, und daß weder Wirbelbildung noch Spiralen noch Sporenträger beobachtet werden. Außerdem wird keine Fragmentierung des Substratmycels beobachtet. Die Sporenoberflächen sind glatt. Luftmycel einer grauweißen Farbe wird dünn auf dem Wachstum gebildet, und zwar mit grauroter bis dunkelroter Farbe, sowohl in ISP-Medium 2 als auch in ISP- Medium 3. Wenn der Stamm MH193-16F4 erfolgreich in einem Schrägmedium inkubiert wird, das 0,2 % Hefeextrakt, 1,0 % solubilisierte Stärke und 2,0 % Agar (pH 7,0) aufweist, kann sich manchmal Luftmycel von rosa Farbe bilden. Außerdem wird in ISP-Medium 2 lösliches Pigment einer mattroten Farbe produziert. In verschiedenen anderen Nährmedien war das Wachstum farblos, und Luftmycel wurde nicht gebildet, aber lösliches Pigment wird im wesentlichen nicht produziert. Sein Wachstum wird jedoch durch die Zugabe von Vitamin B zu dem Kulturmedium gefördert. Es gibt einige Kulturmedien, in denen der Stamm mit roter Farbe wächst. Die Farben des Wachstums und des löslichen Pigments ändern sich beide von roter zu oranger Färbung durch Umsetzung mit HCl, ändern sich jedoch nicht durch Umsetzung mit NaOH. Die Bildung von Melanoiden, die proteolytische Aktivität und die Stärke- Hydrolysierbarkeit sind sämtlich negativ, während die Reduktion von Nitrat positiv ist. Das Wachstum kann in einigen Fällen in mit Vitamin B angereichertem Kulturmedium gefördert werden, so daß der Stamm anscheinend Vitamine für sein Wachstum verlangt.
  • Im übrigen enthält der Stamm MH193-16F4 Mesodiaminopimelinsäure als die Zellwandkomponenten sowie Glucose, Ribose und Madurose als die Saccharidkomponenten in den ganzen Zellen und zeigt, daß die Hauptbestandteile der Zellwand von dem Typ IIIB sind, wie er von Lechevalier et al. in "International Journal of Systematic Bacteriology", 20, 435 (1970) vorgeschlagen wurde. Andererseits sind seine Phospholipide vom Typ P IV (der Phosphatidylethanolamin und unbekannte glykosaminhaltige Phospholipide, jedoch kein Phosphatidylglycerin aufweist). Die Zusammensetzung von Menachinonen weist MK-9(H&sub8;) als eine Hauptkomponente sowie auch MK-9(H&sub6;), MK-9(H&sub4;), MK-9(H&sub2;), MK-9(H&sub1;&sub0;) auf, und der GC-Anteil in der DNA betrug 71,5 %. Eine Analyse des Mycels mittels Gaschromatographie zeigt, daß isoverzweigte Fettsäuren (i-16:0), anti-isoverzweigte Fettsäuren (a-17:0) und 10-Methylfettsäure (10Me-17:0) anwesend sind, die die charakteristischen Merkmale des Stamms darstellen.
  • Von bekannten Stämmen von Actinomycetes gehören diejenigen, die die Kette von Sporen bilden und die Zellwandkomponenten vom Typ IIIB zeigen, zu den drei Arten Actinomadura, Microbispora und Microtetraspora. Charakteristische Merkmale des Stamms MH193-16F4 und der drei vorstehend beschriebenen Arten sind in der Tabelle 4 gezeigt. Der an einem Menachinon angebrachte Stern (*) bedeutet, daß dieses Menachinon als eine Hauptkomponente anwesend ist. Tabelle 4 Microbispora Microtetraspora Actinomadura Zellwandtyp1) Phospholipid1) Menachinone 1),2),3) Fettsäuren3) GC-Gehalt (%) Bildungszustand von Sporen Pseudosporangia1) Sporenoberfläche1),4),5) Sporenzahl Farbe von Luftmycel1) Vitaminbedarf1) Wachstumstemperatur1) Verbundtyp Nahezu vertikal. In einigen Fällen schleifenförmig. keine glatt 3-7 (selten 2) grauweiß, rosa mesophil Vertikal glatt oder stachelig rosa, weiß mesophil oder thermophil Nicht immer vertikal weiß, grauweiß, grau, gelblichgrüne Nicht immer vertikal, schleifenartig, spiralig keine oder positiv glatt oder warzenartig weiß, rosa, grau blau, grün, gelb
  • Bemerkungen zu der in der obigen Tabelle zitierten Literatur:
  • 1) Japanische Druckschrift "Hosenkin no Dotei Jikkenho (Experiments for the identification of Actinomycetes)", gesammelt von Nihon Hosenkin Kenkyukai (1985).
  • 2) J. Poschner et al., "DNA-DNA Reassociation and Chemotaxonomic Studies on Actinomadura, Microbiaspora, Microtetraspora, Micropolyspora and Nocardiopsis." in "Systematic and Applied Microbiology", 6, 264-270 (1985).
  • 3) A. Fisher et al., "Molecular-genetic and Chemotaxonomic Studies on Actinomadura and Nocardiopsis." in "Journal of General Microbiology", 129, 3433-3446 (1983).
  • (4) Thiemann et al., "A New Genus of the Actinomycetales: Microtetraspora gen. nov." in "Journal of General Microbiology", 50, 2995-303 (1968).
  • 5) Nonomura et al., japanische Abhandlung "Dojochu ni okeru Hosenkin no Bunpu (Distribution of Actinomycetes in Soil) (11th Report) Several New Species of Actinomadura Lechevalier et al." in einer japanischen Druckschrift "Hakko Kogaku Kaishi", 49, 904-912 (1971).
  • Wie aus der Tabelle 4 hervorgeht, gibt es anscheinend keine Art, zu der der Stamm MH193-16F4 ganz offensichtlich in jeder Beziehung gehört. Die oben genannten drei Arten waren transitorisch mit Empfindlichkeit. Es ist daher von Interesse, wie diese Arten in der nächsten Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology definiert werden. Viele Spezies sind jedoch unter der Gattung Actinomadura aufgeführt, und die Eigenschaften dieser Spezies sind sehr verschieden. Eine signifikantte Ähnlichkeit findet man in der Morphologie, der Fettsäurezusammensetzung des Mycels und der Zusammensetzung von Menachinonen zwischen dem Stamm MH193-16F4 und Actinomadura spadix unter solchen Spezies von Actinomadura {siehe die genannten Literaturstellen 1), 3) und 5)}. Wir, die Erfinder, planen daher, ein erstes vergleichendes Experiment zwischen dem Stamm MH193-16F4 und Actinomadura spadix durchzuführen. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, daß der Stamm MH193-16F4 zu der Gattung Actinomadura gehört und eine neue Spezies sein kann Im übrigen ist der Stamm MH193-16F4 bei einer japanischen Hinterlegungsstelle, "Fermentation Research Instistute", Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japanese Government, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-9529 seit dem 21. August 1987 hinterlegt. Der Stamm MH193-16F4 wurde nunmehr bei dem "Fermentation Research Institute" unter der Hinterlegungsnummer "FERM BP-2051" nach den Bedingungen des Vertrags von Budapest hinterlegt.
    • (b) Kultivierung des Stamms MH193-16F4:
  • Die Produktion der Benanomicine A und B erfolgt durch Einimpfen eines Benanomicin A und Benanomicin B produzierenden Stamms von Actinomycetes in ein Nährmedium, das solche Nahrungsquellen enthält, die von normalen Mikroorganismen verwertet werden können, und anschließendes Inkubieren des Benanomicin produzierenden Stamms unter aeroben Bedingungen. Benanomicin A und B werden primär in der Kulturbrühe produziert und akkumuliert. Die Ziel-Antibiotika werden aus der resultierenden Kultur, insbesondere der Kulturbrühe oder ihrem Filtrat, rückgewonnen.
  • Die in dem einzusetzenden Kulturmedium verfügbaren Nährstoffquellen können alle diejenigen sein, die als Nährstoffquellen für die Kultivierung bekannter Stämme von Actinomycetes brauchbar sind. Beispielsweise können die assimilierbaren Stickstoffquellen aufweisen: Sojamehl, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Trockenhefe, Hefeextrakt, NZ-Amin, Casein, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, die handelsüblich sind. Die assimilierbaren Kohlenstoffquellen können aufweisen: Glycerin, Saccharose, Stärke, Glucose, Galactose, Maltose, Dextrin, Lactose, Melasse, Sojaöl, Fett und Aminosäuren, die handelsüblich sind. Das Kulturmedium kann außerdem anorganische Salze wie Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Cobaltchlorid und Manganchlorid enthalten. Außerdem können Spurenmengen von Metallsalzen und eines oder mehr von tierischen, pflanzlichen oder Mineralölen als Entschäumer ebenfalls zugefügt werden. Es kann sich um alle Materialien handeln, solange sie von dem die Benanomicine produzierenden Stamm verwertet werden können und für die Produktion der Benanomicine A und B nützlich sind. Bekannte Nährstoffmaterialien für die Züchtung bekannter Stämme von Actinomycetes sind sämtlich einsetzbar.
  • Ein Flüssigkultivierungsverfahren wird für die Produktion der Benanomicine A und B im großtechnischen Maßstab bevorzugt. Die Kultivierungstemperatur kann innerhalb des Temperaturbereichs gewählt sein, bei dem der die Benanomicine produzierende Mikroorganismus wachsen und Benanomicin A und B produzieren kann. Die Kultivierungstemperatur kann im allgemeinen 20-40 ºC sein, bevorzugt 25-37 ºC. Die Kultivierung kann durchgeführt werden, indem die oben aufgeführten Bedingungen der Kultivierung ordnungsgemäß nach Maßgabe der Beschaffenheit der Mikroorganismen gewählt werden, die die Benanomicine A und B produzieren können.
    • (c) Rückgewinnung und Reinigung der Benanomicine A und B:
  • Zur Rückgewinnung von Benanomicin A und B aus der resultierenden Kultur des Mikroorganismus, der fähig ist, Benanomicin A und B zu produzieren, können die Benanomicine A und B aus der Kultur oder dem Bouillonfiltrat extrahiert und dann gereinigt werden, indem herkömmliche Methoden zur Rückgewinnung und Reinigung angewandt werden, beispielsweise Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschharz-Verfahren, adsorptive oder Trennsäulen-Chromatographie, Gel-Filtration, Dialyse, Ausfällung und dergleichen, und zwar entweder für sich oder in Kombination. Beispielsweise können die Benanomicine A und B aus dem inkubierten Mycelkuchen rückgewonnen werden durch Extraktion mit Aceton-Wasser oder Methanol-Wasser. Andererseits können die Benanomicine A und B, die in der Bouillon oder dem Filtrat produziert und akkumuliert sind, an einem Adsorptionsmittel wie etwa einem mikroporösen nichtionischen Harzadsorptionsmittel, beispielsweise "DIAION HP-20" (Warenname; synthetisches Harzadsorptionsmittel von Mitsubishi Kasei Corporation, Japan). Wenn ferner die Bouillon oder das Bouillonfiltrat mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, das mit Wasser nichtmischbar ist, beispielsweise mit Butanol, Ethylacetat oder dergleichen, werden die Benanomicin-A- und -B- Substanzen in die organische Lösungsmittelphase extrahiert.
  • Gemäß einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens nach dem zweiten Aspekt der Erfindung wird der Stamm MH193-16F4 (als FERM BP-2051 identifiziert) in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25-37 ºC, bevorzugt für 3-10 Tage, kultiviert, um Benanomicin A und Benanomicin B in der resultierenden Bouillon zu produzieren und zu akkumulieren, die Bouillon wird filtriert, und das resultierende Bouillonfiltrat wird durch eine Säule eines Adsorptionsmittels geleitet, um die Adsorption von Benanomicin A und Benanomicin B an dem Adsorptionsmittel zu bewirken, und Benanomicin A und Benanomicin B werden getrennt rückgewonnen durch chromatographisches Eluieren der Säule des Adsorptionsmittels, in dem die Benanomicine A und B adsorbiert enthalten sind.
  • Zur gegenseitigen Isolierung und weiteren Reinigung der Benanomicine A und B kann zweckmäßig eine chromatographische Methode angewandt werden unter Verwendung eines Adsorbens wie Silicagel ("WAKOGEL C-300", Warenname, Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), und eines Aluminiumoxids oder Gel-Filtrationsmittels "Sephadex LH-20" (Warenname; Produkt von Pharamacia AB), oder dergleichen.
  • Die in der Kultur wie oben beschrieben erzeugten Benanomicine A und B können in ihrer freien Form isoliert werden, d. h. als Benanomicine A und B selber.
  • Wenn eine Lösung, die Benanomicin A und/oder B enthält, oder ihre konzentrierte Lösung mit einer basischen Verbindung, beispielsweise einer anorganischen Base einschließlich einer Alkalimetallverbindung wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, einer Erdalkalimetallverbindung wie Calciumhydroxid oder Magnesiumhydroxid und einem Ammoniumsalz; sowie einer organischen Base wie Ethanolamin, Triethylamin oder Dicyclohexylamin während der Durchführung eines der Rückgewinnungsschritte behandelt wird, beispielsweise während des Schritts der Extraktion, der Isolierung oder der Reinigung, so geschieht es, daß Benanomicin A und/oder B in die entsprechenden Salze umgewandelt wird/werden, die dann in Form solcher Salze oder eines solchen Salzes abgetrennt oder isoliert werden können.
  • Außerdem kann das Salz von Benanomicin A oder B, das wie oben beschrieben produziert wurde, dann in die freie Form umgewandelt werden, und zwar Benanomicin A oder B als solches, wenn es nach einer an sich bekannten Methode zur Umwandlung eines Salzes in eine Säure behandelt wird. Außerdem können die in der freien Form erhaltenen Benanomicine A und/oder B durch Umsetzung mit der vorgenannten Base auf eine übliche Weise erneut in die entsprechenden Salze oder das Salz umgewandelt werden. Die Salze von Benanomicin A und B wie die beispielsweise vorstehend genannten sollten daher für Benanomicin A und B gleichermaßen vom Umfang der Erfindung umfaßt sein.
  • Bei dem dritten Aspekt der Erfindung wird ferner ein Verfahren angegeben zur Erzeugung von Dexylosylbenanomicin B, d. h. der Verbindung der oben definierten Formel (Ic), wobei das Verfahren die chemische Umwandlung von Benanomicin B zu Dexylosylbenanomicin B aufweist.
  • Dabei bedeutet der Ausdruck "chemische Umwandlung von Benanomicin B" entweder eine Säurehydrolyse von Benanomicin B oder eine Alkoholyse von Benanomicin B, gefolgt von der Aufbereitung des resultierenden Dexylosylbenanomicin-B- Esters mit einer basischen Verbindung, um Dexylosylbenanomicin B zu bilden. Wenn Benanomicin B mit einer Säure hydrolysiert wird, wird die Xylosylgruppe des Benanomicin-B- Moleküls einfach gespalten, was das gewünschte Dexylosylbenanomicin B ergibt. Wenn Benanomicin B einer Alkoholyse mit einem Alkohol, beispielsweise einem niederen (C&sub1;-C&sub6;) Alkanol wie Methanol und Ethanol unterworfen wird, wird die Xylosylgruppe gespalten, und gleichzeitig wird die Carboxylgruppe des Benanomicin-B-Moleküls mit dem Alkohol esterifiziert, so daß ein Ester von Dexylosylbenanomicin B erhalten wird, der anschließend mit einer basischen Verbindung zur alkalischen Hydrolyse aufbereitet werden kann, so daß Dexylosylbenanomicin B in der freien Form produziert wird.
  • Gemäß einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens des dritten Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung von Dexylosylbenanomicin B angegeben, das aufweist: Abspalten der Xylosylgruppe von Benanomicin B entweder durch Säurehydrolyse oder durch Alkoholyse, gefolgt von Behandeln mit einer basischen Verbindung, um das Dexylosylbenanomicin B zu bilden. Bei dieser Ausführungsform kann die Säurehydrolyse von Benanomicin B durchgeführt werden durch Umsetzen einer anorganischen oder organischen Säure mit Benanomicin B in wäßriger Lösung bei einer Temperatur von 60-110 ºC, bevorzugt für 5-15 h. Wenn die Säurehydrolyse von Benanomicin B erfolgt durch Umsetzen mit einer routinemäßig einsetzbaren anorganischen oder organischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, p-Toluolsulfonsäure oder Benzolsulfonsäure, wird Dexylosylbenanomicin B in der Reaktionslösung produziert.
  • Außerdem kann die Alkoholyse von Benanomicin B im allgemeinen durchgeführt werden durch Erwärmen einer Lösung von Benanomicin B in einem niederen (C&sub1;-C&sub6;) Alkanol, bevorzugt Methanol und Ethanol, in Anwesenheit einer anorganischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure bei einer Temperatur von 60-120 ºC, bevorzugt für 5-15 h, um einen solchen Ester (das Carboxylat) des Dexylosylbenanomicins B zu erzeugen, wie er mit dem Alkanol gebildet wird. Dieser so gebildete Dexylosylbenanomicin-B- Ester kann dann hydrolytisch behandelt werden durch Umsetzen mit einer basischen Verbindung, beispielsweise einem Alkalimetallhydroxid oder -carbonat, bevorzugt Natrium- oder Kaliumhydroxid oder -carbonat in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur oder einer höheren Temperatur, so daß das Dexylosylbenanomicin B erzeugt wird. Wenn also Benanomicin B einer Alkoholyse, beispielsweise einer Methanolyse unterworfen und dann mit einer Base wie einem Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid behandelt wird, wird in der Reaktionslösung Dexylosylbenanomicin B erzeugt.
  • Um Dexylosylbenanomicin B wie erzeugt aus der Reaktionslösung rückzugewinnen, kann dieses Produkt daraus extrahiert und dann gereinigt werden unter Anwendung herkömmlicher Verfahren zur Rückgewinnung und Reinigung, beispielsweise Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschharz-Verfahren, Adsorptions- oder Trennsäulen-Chromatographie, Gel-Filtration, Dialyse, Ausfällung und dergleichen, und zwar einzeln oder in Kombination. Beispielsweise kann Dexylosylbenanomicin B in der wäßrigen Reaktionslösung an einem Adsorptionsharz "DIAION HP-20" (Warenname; synthetisches Harzadsorptionsmittel von Mitsubishi Kasei Corporation) adsorbiert werden. Zur weiteren Reinigung von Dexylosylbenanomicin B kann zweckmäßig eine chromatographische Methode angewandt werden unter Verwendung eines Adsorptionsmittels wie Silicagel ("WAKOGEL C-300", Warenname; Produkt der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; oder dergleichen), Aluminiumoxid und eines Gel-Filtrationsmittels "Sephadex LH-20" (Warenname; Produkt von Pharmacia AB) oder dergleichen.
  • Dexylosylbenanomicin B, wie es in der oben beschriebenen Reaktionslösung gebildet wird, kann in der freien Form, also als Dexylosylbenanomicin selbst, isoliert werden. Eine Dexylosylbenanomicin B enthaltende Lösung oder seine eingeengte Lösung kann mit einer routinemäßig einsetzbaren Säure behandelt werden, beispielsweise mit einer anorganischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure, oder mit einer organischen Säure wie Essigsäure und einer Alkylsulfonsäure, oder einer anorganischen Base, beispielsweise einer Alkalimetallverbindung wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid; einer Erdalkalimetallverbindung wie Calciumhydroxid oder Magnesiumhydroxid; und einem Ammoniumsalz oder einer organischen Base wie Ethanolamin, Triethylamin oder Dicyclohexylamin während der Durchführung eines Schritts zur Rückgewinnung und Reinigung. Dann wird Dexylosylbenanomicin B in das entsprechende Salz umgewandelt und kann weiter in Form des Salzes isoliert werden. Ferner können die so erzeugten Dexylosylbenanomicin-B-Salze dann in die freie Form, d. h. Dexylosylbenanomicin B selber, umgewandelt werden, wenn sie nach einem an sich bekannten Verfahren aufbereitet werden. Außerdem kann in der freien Form erhaltenes Dexylosylbenanomicin B durch Umsetzung mit der oben genannten Säure oder Base auf eine übliche Weise erneut in ein Salz umgewandelt werden. Wenn ferner Dexylosylbenanomicin B mit einem Alkohol, beispielsweise einem niederen Alkanol wie Methanol und Ethanol, umgesetzt wird, kann der entsprechende Ester an seiner Carboxylgruppe gebildet werden.
  • Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine antimykotische Zusammensetzung angegeben zur therapeutischen Behandlung einer Pilzinfektion bei einem Tier einschließlich eines Menschen, wobei die Zusammensetzung eine antimykotisch wirksame Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Patentanspruch 1 als wirksamen Bestandteil in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen festen oder flüssigen Trager aufweist.
  • Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung von Benanomicin A, Benanomicin B, Dexylosylbenanomicin B oder eines Salzes davon oder eines Esters von Benanomicin A oder von Dexylosylbenanomicin B in einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung gemäß Anspruch 1 enthält, kann auf eine bekannte Weise zu einer herkömmlichen Formulierung für die Verabreichung formuliert werden, beispielsweise als Pulver, Granulat, Tabletten, Pillen und Kapseln für die orale Verabreichung sowie als intravenös, intramuskulär oder subcutan injizierbare Lösung und als Suppositorien, unter Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen festen oder flüssigen Trägers, der für die Formulierung geeignet ist. Ein geeigneter fester Träger kann beispielsweise Zucker wie Maltose und Saccharose, Aminosäure, Cellulosederivate wie Hydroxypropylcellulose und Cyclodextrine aufweisen. Ein geeigneter flüssiger Träger kann beispielsweise Wasser, Alkohole wie Ethanol, Sojaöl und andere diverse Öle sowie auch physiologische Kochsalzlösung aufweisen. Die Formulierung kann die Verbindung der Formel (I) normalerweise in einem Verhältnis von 0,1-90 Gew.-% in Abhängigkeit von der Art der Formulierung enthalten. Eine injizierbare Lösung kann im allgemeinen 0,1-10 Gew.-% der neuen Verbindung dieser Erfindung aufweisen. Die Dosierung der neuen Verbindung dieser Erfindung kann nach Maßgabe von verschiedenen Faktoren wie Alter, Körpergewicht, Allgemeinzustand von Patienten, Art der Pilzinfektion und Zweck der therapeutischen Behandlung bestimmt werden, und nur als Leitlinie kann die neue Verbindung der Erfindung in einer Dosis von 1-300 mg/kg/d bei nichtoraler Verabreichung und in einer Dosis von 5-500 mg/kg/d bei oraler Verabreichung gegeben werden.
  • Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verdeutlicht, durch die die Erfindung in keiner Weise eingeschränkt wird. So wurden die genauen Eigenschaften der Benanomicine A und B und auch von Dexylosylbenanomicin B durch die Erfindung offenbart, und für den Fachmann ist es daher annnehmbar, die Verfahren zur Erzeugung der Benanomicine A und B oder von Dexylosylbenanomicin B auf verschiedene Weisen vorzusehen und durchzuführen, wobei die oben beschriebenen Eigenschaften dieser Verbindungen zu berücksichtigen sind. Die Erfindung umfaßt somit nicht nur alle Modifikationen der Vorgänge gemäß den nachstehenden Beispielen, sondern auch alle derartigen Verfahren, bei denen auf bekannte Weise unter Nutzung der Eigenschaften der Benanomicine A und B oder von Dexylosylbenanomicin B die Benanomicine A und B oder Dexylosylbenanomicin B erzeugt, konzentriert, extrahiert und/oder gereinigt werden.
    • Beispiel 1
  • Eine der Füllung einer Schlaufe entsprechende Menge des Stamms MH193-16F4 (identifiziert als FERM BP-2051), der in einem Schrägagarmedium inkubiert worden war, wurde in 80 ml eines flüssigen Nährmediums eingeimpft, das 1,0 % Stärke und 3,0 % Sojamehl (pH 7,0 vor der Sterilisation) aufwies und das in einen Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml verbracht wurde. Das eingeimpfte Nährmedium wurde bei 28 ºC für 3 Tage unter Schütteln (135 U/min) inkubiert, um eine erste Samenkultur zu ergeben. Die erste erhaltene Samenkultur wurde in 3 ml-Portionen in 80 ml-Portionen des flüssigen Nährmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie oben eingeimpft, die separat in viele Sakaguchi-Kolben verbracht wurden. Die beimpften Nährmedien wurden für 3 Tage unter den gleichen Inkubationsbedingungen wie oben inkubiert, um die zweite Samenkultur zu ergeben. Die resultierende zweite Samenkultur (2 l) wurde dann in ein Nährmedium (50 l) der gleichen Zusammensetzung wie oben eingeimpuft, das bei 120 ºC für 15 min sterilisiert worden war, und in einen Bioreaktor mit einem Fassungsvermögen von 100 l eingebracht. Das so beimpfte Nährmedium wurde dann bei 28 ºC für 2 Tage unter Belüftung mit einer Rate von 50 l Luft pro Minute und unter Bewegung mit 200 U/min inkubiert, um die Tiefenkultivierung des Stamms MH193-16F4 unter aeroben Bedingungen durchzuführen und eine dritte Samenkultur zu erhalten. Die resultierende dritte Samenkultur (12 l) wurde einem Produktions-Nährmedium (300 l) eingeimpft, das aufwies: 2,0 % Glycerin, 1,5 % Sojamehl (handelsüblich unter einem Warennamen "Esusan Meat", ein Erzeugnis von Ajinomoto Co. Ltd., Japan), 0,0025 % K&sub2;HOP&sub4;, 0,1125 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,0005 % CoCl&sub2;.6H&sub2;O, 0,03 % eines Siliconöls "KM72" (ein Entschäumer, Warenname eines Produkts von Shinetsu Chemicals Co. Ltd., Japan) und 0,01 % eines Tensids "Adekanol" (Warenname, Produkt von Asahi Denka Kogyo Co. Ltd., Japan), und das vorher bei 125 ºC für 30 min sterilisiert worden war, und wurde in einen Bioreaktor mit einer Kapazität von 570 l verbracht. Die Kultivierung wurde bei 28 ºC für 7 Tage unter Bewegen mit 300 U/min und unter Belüftung mit einer Rate von 150 l Luft pro Minute während der ersten 24 h der Kultivierung und dann mit einer Rate von 300 l Luft pro Minute nach der 24. Kultivierungsstunde durchgeführt. Nach beendeter Kultivierung wurde die erhaltene Bouillon mit Kieselgur als Filtrationshilfsmittel vermischt und dann filtriert, um 250 l des Bouillonfiltrats (pH 6,0) zu ergeben.
    • Beispiel 2
  • Das in dem obigen Beispiel 1 erhaltene Bouillonfiltrat (250 l) wurde durch eine Säule von 15 l eines mikroporösen nichtionischen Adsorptionsharzes "DIAION HP-20" geschickt, um die Adsorption der aktiven Substanzen durch das Adsorptionsmittel zu bewirken. Nach Waschen der Adsorptionsmittelsäule mit 100 l Wasser und mit 45 l von 50 % wäßrigem Methanol wurde die Adsorptionsmittelsäule mit 45 l von 70 % wäßrigem Methanol und dann mit 90 l Trockenmethanol eluiert, so daß die erste Fraktion (53 l), die zweite Fraktion (38 l) und die dritte Fraktion (27 l) des Eluats separat erhalten wurden. Die erste Fraktion, die die wirksame Substanz enthielt, wurde auf 3 l unter vermindertem Druck eingeengt, gefolgt von Einstellung auf einen pH 3,5 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure, um ein Präzipitat einer roten Farbe abzuscheiden. Das Präzipitat wurde durch Filtration aufgefangen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, so daß 152 g eines rohen braunen Pulvers, der in der Hauptsache Benanomicin A aufwies, erhalten wurden.
  • 150 g des Rohpulvers wurden in 600 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Sättigung der resultierendenn Lösung mit Wasserdampf bei Raumtemperatur für 3 Tage in einem Entfeuchter wurde ein kristallines Präzipitat abgeschieden. Das Präzipitat wurde durch Filtration aufgefangen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch 29 g Benanomicin-A- Dimethylformamid-Solvat erhalten wurden. Die zweite Fraktion des Eluats wurde auf die gleiche Weise wie die erste Fraktion aufbereitet, wodurch 14 g Benanomicin-A-Dimethylformamid-Solvat erhalten wurden.
  • 1 g des Benanomicin-A-Dimethylformamid-Solvats, wie es aus der ersten Fraktion erhalten wurde, wurde in Dimethylsulfoxid (5 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde tropfenweise unter Rühren 300 ml Methanol zugesetzt, gefolgt von Rühren für 10 min, um ein Präzipitat einer rötlichbraunen Farbe abzuscheiden. Das Präzipitat wurde abfiltriert und dann unter vermindertem Druck getrocknet, um 935 mg eines gereinigten Benanomicins A als rötlichbraunes Pulver zu ergeben.
    • Beispiel 3
  • Die dritte Fraktion des Eluats, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde unter vermindertem Druck auf 1,5 l eingeengt, gefolgt von ihrer Einstellung auf pH 3,5 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure, um ein Präzipitat von roter Farbe zu erhalten. Das Präzipitat wurde durch Filtration aufgefangen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 98 g eines rohen braunen Pulvers, das Benanomicin B enthielt, erhalten wurden. 1 g dieses Rohpulvers wurde in 10 ml Dimethylformamid bei 40 ºC gelöst, und die resultierende Lösung wurde durch eine Säule von 1 l eines Gel- Filtrationsmittels "Sephadex LH-20" geschickt, das mit Dimethylformamid getränkt worden war, und dann wurde die "Sephadex"-Säule mit Dimethylformamid entwickelt. Das Eluat wurde in 6 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 64-72, die die wirksame Substanz enthielten, wurden aufgefangen, vereinigt und dann bis zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 657 mg eines rohen braunen Pulvers, das Benanomicin-B-Dimethylformamid-Solvat enthielt, erhalten wurde. 300 mg dieses Rohpulvers wurden in 100 ml Methanol gelöst, und nach Zugabe von 1 ml von 1 N Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Das resultierende Rohpulver einer braunen Farbe wurde in 3 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Die resultierende Lösung wurde tropfenweise 200 ml Chloroform unter Rühren zugefügt, gefolgt von Rühren für 20 min, um ein rötlichbraunes Präzipitat abzuscheiden. Das Präzipitat wurde durch Filtration aufgefangen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, um 258 mg Benanomicin-B-Hydrochlorid in einer gereinigten Form zu ergeben.
    • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel zeigt die Produktion von Dexylosylbenanomicin B durch Säurehydrolyse von Benanomicin B.
  • Benanomicin-B-Hydrochlorid (130 mg) wurde in 10 ml Wasser gelöst, gefolgt von der Zugabe von 10 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure. Das resultierende Gemisch wurde in einem Glasrohr dicht verschlossen. Nach Durchführung der Hydrolysereaktion bei 110 ºC für 12 h wurde das resultierende Präzipitat durch Filtration aufgefangen. Das Präzipitat wurde dreimal mit 10 ml Dioxan extrahiert, so daß 47,5 mg Benanomicinon (Aglykon von Benanomicin B) erhalten wurden. Der Rückstand, der nach der Extraktion verblieb, wurde mittels präparativer Silicagel-Dünnschichtchromatographie gereinigt (auf Silicagel "Art. 5744", Warenname, Produkt von Merck & Co., Inc.; entwickelt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Butanol-Essigsäure-Pyridin = 6:1:4), wobei Fraktion 1, die Dexylosylbenanomicin B enthielt, und Praktion 2, die Benanomicinon enthielt, separat erhalten wurden. Fraktion 1 wurde an 20 ml eines Adrosptionsmitttels "DIAION HP-20" adsorbiert. Nach Waschen des Adsorptionsmittels mit Wasser (60 ml) wurde das Adsorptionsmitel viermal mit 40 ml Methanol eluiert. Das Eluat wurde bis zur Trockne eingeengt, der erhaltene Rückstand wurde in 3 ml Wasser gelöst, und die resultierende Lösung wurde auf pH 2 mit 0,1 N Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Bei der Einengung der Lösung bis zur Trockne wurden 17,8 mg eines gereinigten Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorids erhalten. Fraktion 2 wurde gleichermaßen chromatographisch unter Einsatz des Adsorptionsmittels "DIAION HP-20" gereinigt, wobei 9,5 mg Benanomicinon rückgewonnen wurde.
    • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel zeigt die Erzeugung von Dexylosylbenanomicin B durch Methanolyse von Benanomicin B, gefolgt von der Aufbereitung mit einer basischen Verbindung, und zwar Natriumhydroxid.
  • 40 ml einer Lösung von 217 mg Benanomicin-B-Hydrochlorid in 1 N HCl-Methanol wurden in einem Glasrohr dicht verschlossen und für 12 h bei 90 ºC für die Alkoholyse erwärmt. Die Reaktionslösung wurde danach bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstannd wurde in 30 ml Wasser gelöst und an 100 ml eines Adsorptionsmittels "DIAION HP-20" adsorbiert. Das Adsorptionsmittel wurde dann mit Wasser (300 ml) gewaschen, gefolgt von viermaliger Extraktion mit 200 ml Methanol. Die Extraktlösung wurde bis zur Trockne eingeengt, um 125 mg des Methylesters von Dexylosylbenanomicin B wie gebildet zu erhalten. Der erhaltene Methylester wurde in 20 ml Wasser gelöst, und nach Zugabe von 5 ml von 1 N NaOH wurde die alkalische Hydrolyse des Esters bei Raumtemperatur für 10 min durchgeführt. Nach Zugabe von 7 ml von 1 N Chlorwasserstoffsäure zu der Reaktionslösung wurde das resultierende Gemisch bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde an einer Säule von 100 ml eines Adsorptionsmittels "DIAION HP-20" adsorbiert. Nach Waschen der Adsorptionsmittelsäule mit 300 ml Wasser wurde das Adsorptionsmittel mit 200 ml Methanol eluiert. Die erhaltene Lösung wurde bis zur Trockne eingeengt und dann durch eine Säule von 650 ml eines Gel- Filtrationsmittels "Sephadex LH-20" geschickt. Die "Sephadex"-Säule wurde mit Methanol entwickelt. Aktive Fraktionen des Eluats wurden aufgefangen, vereinigt und bis zur Trockne eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt. Nach Einengung der Lösung bis zur Trockne wurden 109,5 mg eines gereinigten Dexylosylbenanomicin-B-Hydrochlorids als rötlichbraunes Pulver erhalten.

Claims (15)

1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
mit R = eine Hydroxylgruppe oder eine Aminogruppe und R¹ = ein Wasserstoffatom oder eine Xylosylgruppe mit der Maßgabe, daß, wenn R die Hydroxylgruppe ist, R¹ nicht das Wasserstoffatom ist,
und ein Salz der Verbindung der Formel (I) oder ein Ester der Verbindung der Formel (I) mit der Maßgabe, daß in diesem Fall R keine Aminogruppe und R¹ keine Xylosylgruppe ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, die Benanomicin A der Formel (Ia)
oder ein Salz oder ein Ester von Benanomicin A ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1, die Benanomicin B der Formel (Ib)
oder ein Salz von Benanomicin B ist.
4. Verbindung nach Anspruch 1, die Dexylosylbenanomicin B der Formel (Ic)
oder ein Salz oder ein Ester von Dexylosylbenanomicin B ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1, die in der Form eines Salzes (Carboxylats) davon mit einem Alkalimetall oder einem Erdalkalimetall oder in der Form eines Esters (Carboxylats) davon mit der Maßgabe, daß in diesem Fall R der Verbindung der Formel (I) keine Aminogruppe und R¹ der Formel (I) keine Xylosylgruppe ist, mit einer niederen Alkylgruppe, einer niederen Alkanoyloxy/niederen Alkylgruppe wie Acetoxymethyl, 1-Acetoxyethyl und Pivaloyloxymethyl, oder einer niederen Alkoxycarbonyloxy/niederen Alkylgruppe wie etwa 1-(Ethoxycarbonyloxy)ethylgruppe ist.
6. Verfahren zur Herstellung von Benanomicin A und/oder Benanomicin B, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: Züchten eines Benanomicin A und Benanomicin B erzeugenden Stamms von Actinomycetes in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen aufweist, unter aeroben Bedingungen, um Benanomicin A und/oder Benanomicin B in der Kultur zu produzieren und zu akkumulieren, und anschließendes Gewinnen von Benanomicin A und Benanomicin B oder eines davon aus der Kultur.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Benanomicin A und Benanomicin B erzeugende Stamm der Stamm MH193-16F4 ist, der als die Kultur identifiziert ist, die unter der Hinterlegungsnummer "FERM BP-2051" bei der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute" unter den Bedingungen des Vertrags von Budapest hinterlegt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Benanomicin A und Benanomicin B produzierende Stamm unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20-40 ºC, bevorzugt 25-37 ºC, kultiviert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Stamm MH193-16F4 (als FERN BP-2051 identifiziert) in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25-37 ºC kultiviert wird, um Benanomicin A und Benanomicin B in dem resultierenden Nährboden zu produzieren und zu akkumulieren, der Nährboden filtriert und das resultierende Nährbodenfiltrat durch eine Säule eines Adsorbtionsmittels geschickt wird, um die Adsorption von Benanomicin A und Benanomicin B an dem Adsorbens zu bewirken, und Benanomicin A und Benanomicin B separat rückgewonnen werden durch chromatographisches Eluieren der Saule des Adsorbens, das darin adsorbiertes Benanomicin A und B enthält.
10. Antimykotische Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung einer Pilzinfektion bei einem Tier einschließlich eines Menschen, wobei die Zusammensetzung eine antimykotisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen festen oder flüssigen Träger aufweist.
11. Verwendung von Benanomicin A, Benanomicin B oder Dexylosylbenanomicin B oder eines Salzes davon oder eines Esters von Benanomicin A oder von Dexylosylbenanomicin B in einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
12. Verfahren zur Herstellung von Dexylosylbenanomicin B, das die chemische Umsetzung von Benanomicin B zu Dexylosylbenanomicin B aufweist.
13. Verfahren zur Herstellung von Dexylosylbenanomicin B, das das Spalten der Xylosylgruppe von Benanomicin B entweder durch Säurehydrolyse oder durch Alkoholyse, gefolgt von Behandeln mit einer basischen Verbindung, aufweist, um das Dexylosylbenanomicin B zu bilden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Säurehydrolyse von Benanomicin B erfolgt durch Umsetzen einer anorganischen oder organischen Säure mit Benanomicin 3 in einer wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von 60-110 ºC für 5-15 h.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Alkoholyse von Benanomicin B erfolgt durch Erwärmen einer Lösung von Benanomicin B in einem niederen Alkanol wie Methanol und Ethanol in Anwesenheit einer anorganischen Säure bei einer Temperatur von 60-120 ºC für 5-15 h, um einen Ester (Carboxylat) von Dexylosylbenanomicin B mit dem Alkanol herzustellen, und der resultierende Ester von Dexylosylbenanomicin B mit einem Alkalimetallhydroxid oder -carbonat in einer wäßrigen Lösung umgesetzt wird, um Dexylosylbenanomicin B zu produzieren.
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