DK170029B1

DK170029B1 - Benanomicinforbindelser og salte og estere deraf, fremgangsmåder til fremstilling deraf, antifungale midler med indhold deraf samt deres anvendelse til fremstilling af farmaceutiske præparater

Info

Publication number: DK170029B1
Application number: DK608288A
Authority: DK
Inventors: Tomio Takeuchi; Takeshi Hara; Masa Hamada; Shinichi Kondo; Masaji Sezaki; Haruo Yamamoto; Shuichi Gomi
Original assignee: Zaidan Hojin Biseibutsu
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1988-11-01
Publication date: 1995-05-01
Also published as: ES2063015T3; FI98739C; AR241657A1; AU2457988A; FI98739B; FI885039A0; EP0315147B1; AU612189B2; DE3887820T2; EP0315147A2; EP0315147A3; DE3887820D1; US5278052A; DK608288D0; US5055453A; FI885039A; CA1339016C; MX9201563A; DK608288A

Description

i DK 170029 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte benano-micinforbindelser, som betegnes henholdsvis benanomicin A, benanomicin B og dexylosylbenanomicin B, og salte og 5 estere deraf. Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af benanomicin A og B samt en fremgangsmåde til fremstilling af dexylosylbenanomicin B ud fra benanomicin B eller salte eller estere deraf. Endelig angår opfindelsen også farmaceutiske præparater, 10 som indeholder benanomicin A, benanomicin B og/eller dexylosylbenanomicin B eller salte eller estere deraf som aktiv bestanddel samt anvendelsen af disse forbindelser til fremstilling af farmaceutiske præparater.

Selv om der kendes mange antibiotika, er der stadig et 15 behov for nye antibiotiske stoffer indenfor såvel det farmaceutiske område som det agrikultureile område. Den foreliggende opfindelse er baseret på omfattende forskning med henblik på at tilvejebringe nye antibiotiske stoffer, der har nyttig antibakteriel virkning og/eller antifungal 20 virkning. Som følge heraf har det nu vist sig, at man ved dyrkning af en mikroorganismestamme af slægten Actinomy-cetes, som er isoleret fra en jordprøve udtaget på området ved laboratoriet i Tokyo, Japan, og som har laborato-riebetegnelsen stamme MH193-16F4, i et dyrkningsmedium 25 under aerobe betingelser opnår nogle antibiotika, som har antifungale virkninger. Det er lykkedes at isolere og rense to antifungale antibiotika fra kulturen af stammen MH193-16F4, og de to isolerede antibiotika betegnes henholdsvis benanomicin A og benanomicin B. Undersøgelser 30 af de fysisk-kemiske og biologiske egenskaber ved benanomicin A og B viser, at benanomicin A og B er hidtil ukendte stoffer, som er forskellige fra alle de kendte antibiotika. Det er endvidere lykkedes at bestemme den kemiske struktur af benanomicin A og B, og det er tillige 35 lykkedes at fremstille en anden ny forbindelse, nemlig dexylosylbenanomicin B ved kemisk omdannelse af benanomicin B, og det har vist sig, at dexylosyl- 2 DK 170029 B1 benanomicin B også har nyttig antifungal virkning.

Det har vist sig, at de nye antibiotika benanomicin A og B ifølge opfindelsen med hensyn til fysisk-kemiske og biolo-5 giske egenskaber samt kemisk struktur i større eller * mindre grad minder om tre kendte antibiotika, nemlig stof KS-619-1, jf. Matsuda et al.: "Journal of Antibiotics", 40, 1104-1114 (1987), og stof G-2N og stof G-2A, jf.

Gerber et al: "Canad. J. Chem." 62, 2818-2821 (1984).

10 Imidlertid adskiller benanomicin A og B sig væsentligt fra de ovenfor omtalte tre kendte antibiotika med hensyn til såvel fysisk-kemiske og biologiske egenskaber som kemisk struktur.

Der kendes forskellige antibiotika, som dannes af 15 mikroorganismer. Blandt de kendte antibiotika findes der imidlertid kun få, som har en nyttig antifungal virkning og samtidig lav toksicitet over for pattedyr. Der er derfor et behov for tilvejebringelse af nye antifungale antibiotika, som kan anvendes ved terapeutisk behandling 20 af forskellige svampeinfektioner hos mennesker og dyr. Det har vist sig, at benanomicin A og B samt dexylosylbenano-micin B har lav toksicitet over for pattedyr, og at de kan repræsenteres ved den efterfølgende almene formel I.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe hidtil 25 ukendte antibiotika, som har en nyttig høj antifungal virkning med lav toksicitet over for pattedyr, samt farmaceutisk acceptable salte og estere deraf. Det er tillige formålet med opfindelsen at tilvejebringe fremgangsmåder til fremstilling af disse nye antibiotika.

30 Benanomicinforbindelserne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har den almene formel 3 DK 170029 B1 CHo

C0NHCHC00H

H0nJ^CH3

(IJ

OH O OH P

,.sv

OH

hvori R betyder en hydroxylgruppe eller en aminogruppe, og r1 betyder et hydrogenatom eller en xylosylgruppe, idet 5 dog Ri er forskellig fra hydrogen, når R er en hydroxylgruppe, eller er salte eller C(l-6)-alkyl-, C(2—6)— alkanoyloxy-C(1-6)-alkyl- eller C(l-6)~alkoxycarbonyloxy-C(1-6)-alkylestere deraf.

Forbindelsen med den almene formel I, hvori R betyder en 10 hydroxylgruppe, og R* betyder en xylosylgruppe med formlen

OH

er benanomicin A med formlen CHo

CONHCHCOOH

j (R) ch3 ynQn^ Ua)

OH o OH P

OH OH

4 DK 170029 B1

Forbindelsen med den almene formel I, hvori R betyder en aminogruppe, og R1 er en xylosylgruppe, er benanomicin B med formlen CH3 I 3

C0NHCHC00H

ho,J\-cH3 OH 0 OH ? H,N / n ^1 CH, /

OH OH

Endvidere er forbindelsen med den almene formel I, hvori R betyder en aminogruppe, og R^ er et hydrogenatom, dexylosylbenanomicin B med formlen CH3 conhJhcooh

XaXXI (ic)

oh o oh P

' W

oh 10 Benanonomicin A og benanomicin B kan tilsammen repræsen- ·> teres ved den almene formel 5 DK 170029 B1 3' ch3 15 2'| 1'

CONH(CFICOOH

(»3

»LY TTT

9J cj| 7a^^>aX'Y^ \ OH O ^ OH .0 .

H0^^'°\ LiH3-o /

°H OH

hvori R i tilfælde af benanomicin A er en hydroxyl gruppe, og i tilfælde af benanomicin B er en aminogruppe.

5 Inden det lykkedes at fastlægge strukturen af benanomicin A som anført ovenfor blev benanomicin A først opnået og identificeret som et antibiotisk stof med følgende egenskaber: Forbindelsen er et surt stof i form af et rødbrunt pulver, har en sumformel C3gH4^N0ig, et massespektrum 10 (FD-MS) på m/z 827 (M+), et smeltepunkt over 220°C, et absorptionsspektrum i det ultraviolette og synlige område (i methanol) som vist i fig. 1 på tegningen, et infrarødt absorptionsspektrum (pelletteret i kaliumbromid) som vist i fig. 2 på tegningen, et ^H-NMR-spektrum (400 MHz, 15 DMSO-dg, 40°C) som vist i fig. 3 på tegningen og et 13c-NMR-spektrum (100 MHz, DMSO-dg) som vist i fig. 4 på tegningen, er tungtopløseligt i methanol, chloroform, ethylacetat og acetone, og er opløseligt i dimethylsul-foxid, dimethylformamid og basisk vand, men er uopløse-20 ligt i vand.

Inden fastlæggelsen af den kemiske struktur for benanomicin B som angivet ovenfor blev benanomicin B først opnået og identificeret som et antibiotisk stof med følgende egenskaber: Hydrochloridet af benanomicin B er et amfotert 25 stof i form af et rødbrunt pulver, som har sumformlen 6 DK 170029 B1 C3gH42N20i8*HCl/ et massespektrum (SI-MS) på m/z 827 (MH+), et smeltepunkt over 2200C, en specifik drejningsevne [ar]2$ = +360° (c = 0,05, H^D), et absorptionsspek- * 5 trum (i methanol) i det ultraviolette og synlige område som vist i fig. 5 på tegningen, et infrarødt absorptionsspektrum (pelletteret i kaliumbromid) som vist i fig. 6 på tegningen, et ^-H-NMR-spektrum (400 MHz, DMSO-dg, 40eC) som vist i fig. 7 på tegningen og et ^^c-NMR-spektrum (100 10 MHz, DMSO-dg) som vist i fig. 8 på tegningen, er tungt-opløseligt i chloroform, ethylacetat og acetone og er opløseligt i methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid og vand.

De ovenfor omtalte og andre fysisk-kemiske egenskaber for 15 benanomicin A er nærmere anført i det følgende: (1) Farve og udseende: Rødbrunt pulver (2) Sumformel: CggH^NOig (3) Massespektrum (FD-MS): m/z 827 (M+)

(4) Smeltepunkt: >220°C

20 (5) Optisk drejningsevne: [a ]2$ kan ikke måles (c = 0,05, DMS0) (6) Absorptionsspektrum i det ultraviolette og synlige område 25 Xmax, ran (E^%cm): {I methanol}: 206(718), 230sh(600), 288(482), 302sh(390), 400sh(120), 476(197) {I 0,1 IN HC1-methanol}: 207(649), 233(629), 30 298(561), 395sh(140), 457(223) {I 0,1 N NaOH-methanol): 214(1270), 249(637), 320(289), 498(287) (7) Infrarødt absorptionsspektrum (KBr, cm”l): 3350, 2970, 2890, 1720, 1620, 1600, 35 1485, 1440, 1425, 1390, 1375, 1330, 1295, 1255, 1235, 1205, 1160, 1130, 7 DK 170029 B1 1070, 1040, 1000, 970, 900, 870, 830, 800, 750 (8) ^H-NMR-spektrum (400 MHz, i DMSO-dg, ved 40°C): 5 δ(ppm): 1,14(3H, d), 1,35(3H, d), 2,34(3H, s), 3,09(IH, dd), 3,13(IH, dd), 3,17(1H, dd), 3,32(1H, ddd), 3,56(1H, dd), 3,62(2H, m), 3,72(1H, dd), 3,74(1H, br), 3,92(3H, s), 4,43(1H, d), 4,43 10 (IH, dg), 4,53(IH, d), 4,57(1H, d), 4,65(IH, d), 4,90(2H, br), 5,61(1H, br), 6,05(IH, br), 6,86(1H, d), 7,21 (IH, s), 7,24(IH, d), 8,05( IH, s), 8,45(IH, d), 12,47(IH, br), 12,77(1H, 15 s), 13,69(IH, br) (9) spektrum (100 MHz, i DMSO-dg, ved 40°C): δ(ρρπι): 187,3 s, 184,9 s, 173,9 s, 166,9 s, 165.9 s, 164,7 s, 156,8 s, 151,1 s, 147,7 s, 138,1 s, 137,4 s, 134,2 s, 20 131,3 s, 127,5 s, 125,6 s, 118,6 d, 115.5 s, 115,4 d, 113,7 s, 110,0 s, 107.5 d, 106,8 d, 105,2 d, 104,4 d, 83,0 d, 81,7 d, 76,0 d, 73,6 d, 71,9 d, 70,3 d, 70,1 d, 70,1 d, 69,4 d, 25 65,6 t, 56,3 q, 47,6 d, 19,1 q, 16.9 q, 16,3 q (Signalerne ved 72,9, 81,7, 115,4 og 118,6 ppm er brede) (10) Opløselighed: Kun tungtopløseligt i methanol, chloroform, ethylacetat og acetone, opløseligt i 30 dimethylsulfoxid, dimethylformamid og basisk vand, men uopløseligt i vand.

(11) Skelnen mellem stoffets basiske, sure eller neutrale natur: Stoffet er surt.

De ovenfor omtalte og yderligere fysisk-kemiske egenskaber 35 for benanomicin B-hydrochlorid angives nærmere i det følgende : (1) Farve og udseende: Rødbrunt pulver.

8 DK 170029 B1 (2) Sumformel: CøgH^^Oig'HCl (3) Massespektrum (SI-MS): m/z 827 (MH+)

(4) Smeltepunkt: >220°C

5 (5) Optisk drejningsevne: [ a ]2§ = +360° (c = 0,05, H2P) (6) Absorptionsspektrum i det ultraviolette og synlige område 1%

Xmax, nm (E, ): ' v 1 cm7 {I methanol}: 205(587), 233(526), 296(426), 390sh 10 (100), 458(169) {I 0,1 N HC1-methanol): 207(514), 235(530), 295(442) 400sh(114), 457(173) {I 0,1 N NaOH-methanol}: 214(1219), 247(518), 317 (238), 496(215) 15 (7) Infrarødt absorptionsspektrum (KBr, cm“l): 3350, 2980, 2900, 1720, 1610, 1485, 1350, 1430, 1395, 1380, 1330, 1300, 1260, 1240, 1210, 1160, 1080, 1045, 970, 955, 900, 885, 840, 820 20 (8) lH-NMR-spektrum (400 MHz, i DMSO-dg, ved 40°C): 1,20(3H, d), 1,36(3H, d), 2,35(3H, s), 3,09(1H, dd), 3,17(IH, m), 3,19(1H, m), 3,34(1H, ddd), 3,44(1H, br), 3,65 (IH, br), 3,75(IH, dd), 3,90(1H, br 25 q), 3,94(3H, s), 3,97(1H, dd), 4,44 (IH, dq), 4,57(IH, d), 4,57(1H, br d), 4,62(IH, br d), 4,75(1H, d), 6,90(1H, d), 7,27(1H, d), 7,27(IH, br s), 7,99 (3H, br), 8,06(IH, br s), 8,45(1H, d), 30 8,45(IH, br), 12,79(1H, s), 13,81(1H, br), 4,1-6,3(5H, br) (9) 13C-NMR-spektrum (100 MHz, i DMSO-dg, ved 40°C): δ (ppm): 187,4 s, 184,9 s, 173,9 s, 166,9 s, 165.9 s, 164,7 s, 156,8 s, 151,0 s, 35 148,0 S, 137,8 S, 137,3 S, 134,2 s, 131,2 s, 127,5 s, 125,7 s, 118,9 d, 115.9 d, 115,5 S, 113,7 s, 110,0 s, 107,6 d, 106,8 d, 104,4 d, 104,1 d, 9 DK 170029 B1 81,0 d, 77,4 d, 75,9 d, 73,3 d, 71,5 d, 69,8 d, 69,4 d, 67,0 d, 65,7 t, 56,3 q, 54,2 d, 47,6 d, 19,1 q, 16,9 5 q, 16,3 q (Signalerne ved 71,5, 81,0, 113,7, 115,9, 118,9 og 125,7 ppm er brede).

(10) Opløselighed: Tungtopløseligt i chloroform, ethyl- acetat og acetone og opløseligt i 10 methanol, dimethylsulfoxid, dimethyl- formamid og vand.

(11) Skelnen mellem stoffets basiske, sure og neutrale egenskaber: Stoffet er amfotert.

De fysisk-kemiske egenskaber for dexylosylbenanomicin B-15 hydrochlorid er anført i det følgende: (1) Farve og udseende: Rødbrunt pulver (2) Sumformel: 0341134^014*1101 (3) Massespektrum (SD-MS): m/z 696 (M+2)+ (4) Smeltepunkt: >180°C (sønderdeling) 20 (5) Optisk drejningsevne: [a = +396° (c = 0,05, 0,05 N HC1) (6) Absorptionsspektrum i det ultraviolette og synlige område 1%

Xmax, nm (Et „ ): 1 cm 25 {I methanol}: 204(569), 234(517), 290(431), 300sh (395), 400sh(110), 463(170) {X 0,1 N HCl-methanol}: 209(522), 234(4557), 296 (487), 400sh(130), 459(196), {I 0,1 N NaOH-methanol): 213(1205), 249(575), 258sh 30 (520), 319(259), 496(251) (7) Infrarødt absorptionsspektrum (KBr, cm-1): 3400, 2980, 2910, 1730, 1610, 1515, 1490, 1450, 1435, 1395, 1380, 1340, 1300, 1260, 1240, 1210, 1170, 1130, 35 1090, 1030, 1005, 980, 880, 835 (8) 1H-NMR-spektrum (400 MHz, i DMSO-dg, ved 40°C): δ (ppm): 1,18 (3H, d), 1,34 (3H, d), 2,33 (3H, 10 DK 170029 B1 s), 3,26 (IH, br s), 3,47 (IH, br), 3,74 (IH, br dd), 3,86 (IH, br q), 3,96 (3H, s), 4,43 (IH, dq), 4,53 5 (IH, br d), 4,60 (IH, br d), 4,68 (IH, d), 6,94 (IH, d), 7,25 (IH, br s),7,31 (IH, d), 7,87 (3H, br), 8,08 (IH,s), 8,45 (IH, d), 8,60 (IH, br), 12,82 (IH, s), 13,81 (IH, br) 10 (9) 13C-NMR-spektrum (100 MHz, i DMSO-dg, ved 40°C): δ (ppm): 187,4 s, 184,9 s, 173,8 s, 166,8 s, 165.9 s, 164,7 s, 156,8 s, 150,9 s, 147.9 s, 137,9 s, 137,2 s, 134,2 s, 131,2 s, 127,4 s, 125,7 s, 118,8 d, 15 115,5 d, 115,5 s, 113,6 s, 110,0 s, 107.5 d, 106,8 d, 104,6 d, 81,1 d, 71.5 d, 70,5 d, 69,8 d, 67,1 d, 56,4 q, 54.6 d, 47,6 d, 19,1 q, 16,8 q, 16,3 q (Signalerne ved 115,5 og 118,8 ppm er brede).

20 (10) Opløselighed: Tungtopløseligt i chloroform, ethyl- acetat og acetone og opløseligt i vand, methanol, dimethylsulfoxid og dimethylformamid.

(11) Skelnen mellem stoffets basiske, sure og neutrale 25 egenskaber: Stoffet er amfotert.

Fig. 1 er et absorptionsspektrum i det ultraviolette og synlige område af benanomicin A i methanol (20 /ig/ml), fig. 2 er et IR-absorptionsspektrum af benanomicin A pelletteret i kaliumbromid, 30 fig. 3 er et 1H-NMR-absorptionsspektrum af benanomicin A optaget ved 400 MHz i deutero-dimethylsulfoxid (DMSO-dg),

fig. 4 er et ^3C-NMR-absorptionsspektrum af benanomicin A

11 DK 170029 B1 optaget ved 100 MHz i deutero-dimethyisulfoxid (DMSO-dg), fig. 5 er et absorptionsspektrum i det ultraviolette og synlige område af benanomicin B-hydrochlorid i methanol 5 (20 pg/ml), fig. 6 er et IR-absorptionsspektrum af benanomicin B-hydrochlorid pelletteret i kaliumbromid, fig. 7 er et ^H-NMR-absorptionsspektrum af benanomicin B-hydrochlorid optaget ved 400 MHz i deutero-dimethylsul-10 foxid, fig. 8 er et ^^c-nmr-absorptionsspektrum af benanomicin B-hydrochlorid optaget ved 100 MHz i deutero-dimethyisulfoxid, fig. 9 er absorptionsspektre i det ultraviolette og 15 synlige område af dexylosylbenanomicin B-hydrochlorid optaget i methanol (20 μg/ml) (ubrudt linie), i 0,1 N saltsyre-ethanol (20 pg/ml) (stiplet linie) og i 0,1 N natriumhydroxid-ethanol (20 ng/ml) (punkteret linie), fig. 10 er et IR-absorptionsspektrum af dexylosylbenano-20 micin B-hydrochlorid pelletteret i kaliumbromid, fig. 11 er et ^-NMR-absorptionsspektrum af dexylosylbenanomicin B-hydrochlorid optaget ved 400 MHz i deutero-dimethyisulfoxid og fig. 12 er et l^c-NMR-absorptionsspektrum af dexylosyl-25 benanomicin B-hydrochlorid optaget ved 100 MHz i deutero-dimethyisulfoxid.

Salte af forbindelserne med den almene formel I, dvs. benanomicin A og B og dexylosylbenanomicin B, indbefatter farmaceutisk acceptable salte (carboxylater) med et 12 DK 170029 B1 farmaceutisk acceptabelt metal, især et farmaceutisk acceptabelt alkalimetal, såsom natrium og kalium, og et farmaceutisk acceptabelt jordalkalimetal, såsom calcium og 5 magnesium, og en ammoniumgruppe samt et farmaceutisk acceptabelt baseadditionssalt (ved forbindelsens carboxyl-gruppe) med en farmaceutisk acceptabel organisk base, især en amin, såsom en C(l-6)-alkylamin, især triethylamin, ethanolamin og dicyclohexylamin, og i tilfælde af benano-10 micin B og dexylosylbenanomicin B tillige et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt (ved aminogruppen) med en farmaceutisk acceptabel uorganisk syre, såsom hydrogen-chloridsyre, saltsyre, phosphorsyre og salpetersyre, eller en farmaceutisk acceptabel organisk syre, såsom 15 eddikesyre, propionsyre, maleinsyre, og en alkylsulfon-syre. Estere af forbindelser med den almene formel I er farmaceutisk acceptable estere (carboxylater) med en farmaceutisk acceptabel esterdannende gruppe valgt blandt en C(l-6)-alkylgruppe, især methyl eller ethyl, en 20 C(2-6)-alkanoyloxy-C(l-6)-alkylgruppe, såsom acetoxy-methyl, 1-acetoxyethyl og pivaloyloxymethyl, og en C(l-6)-alkoxycarbonyloxy-C(1-6)-alkylgruppe, såsom 1-(ethoxycarb-onyloxy)-ethyl.

De antibakterielle og antifungale virkninger af benano-25 micin A, benanomicin B og dexylosylbenanomicin B (som hydrochloridet) anføres i det følgende.

De minimale hæmningskoncentrationer (MIC, /ig/ml) af benanomicin A og B mod forskellige bakterier og svampe er bestemt ved hjælp af standardrækkefortyndingsmetoden og er 30 anført i nedenstående tabel 1 og 2. De minimale hæmningskoncentrationer (MIC, μg/ml) af dexylosylbenanomicin B-hydrochlorid mod forskellige svampe er bestemt på tilsvarende måde og anført i nedenstående tabel 2. Det fremgår af tabel 2, at benanomicin A og B samt dexylosylbenano-35 micin B har væsentlig antifungal virkning mod forskellige slags svampe.

13 DK 170029 B1

Tabel 1

Mikroorganisme MIC (yg/mJl)

(bakterier) Benanomicin A Benanomicin B

Staphylococcus aureus FDA209P 100 >100

Staphylococcus aureus Smith >100 >100

Micrococcus luteus FDA16 12,5 3,12

Bacillus subtilis PCI219 >100 >100

Corynebacterium bovis 1810 12^5 3,12

Mycobacterium smegmatis ATCC607 >100 >100

Escherichia coli NIHJ >100 >100

Escherichia coli K-12 >100 >100

Shigella dysenteriae JS11910 > 50 >100

Salmonella typhi T-63 >100 >100

Proteus vulgaris OX19 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa A3 >50 >100

Klebsiella pneumoniae PCI602 >100 >100 14 DK 170029 B1

CQ

G

•H

ϋ

•H

B

O in m in in in n

C CN H CN CN LO CN H

(rø rs »\ /> f** C loroioiofNionoininooinoo O h inrMCNOofNunin

Λ HH

r-f >1

M

O

H

>1

X

tU

— Ω o?__ ε

CQ

3» 3. c m m id h cn in n in in U ·> Λ Λι Λ *\

U ·η oiDincNiDMHoooooomin Η B o CN Η H OininOOOfNCN

S O Η Η Η Η H

C Λ Λ Λ Λ Λ ft!

G

0)

CQ

< C in in m ni •H cn m cn cn H ’ o r\ »Λ K ^ ^ „ H inioincNioiorooininooooo ™ B cn cn h oMCNooinmm

_, O Η Η H

® S Λ Λ Λ X) g

B CQ

m oo oo cn o I IH cn in fo fol CN Q) fo ^+1 tO d) >, H « W 10 W Λ HH H C 3 ω α i « r-* to cd G Ό o fo O ^ Hg« H H u HH > U 0) H O &» οι α n m οι o λ tu λ; tu n « H o IH«-l«««H«H<U+>

H W tO fo(UO>iNt0i-lN(U4->C

S « +> fi O- UOJH>i«4J>iCntOQ) 5 o O « o H 3gHt0HMH«g

.J Η Ό O CN tu tn O O O C

p α 3 Η H (1 ® ffl 01 « G G

b OtDJQI3O33«Hl0t0t0OO

2. Mt0H3H>,UHHK««3JJ+> g1 n C O ΟΛ «Η O OHJ3J3 X 2 «rt«««H00H3ggHDift

HS1 Ό'βΌΌ’Ο « OH 3 U O O 3> O O

j; § ηηηηηλ+»ηοηλλμλλ □ g O'd'd'd'doOiJSHH+i+itDuo

5 C- ctsceco>»onHaeo,HH

A m«««««no>i<u««tonM

uauuowuufofoxxcEHH

15 DK 170029 B1

Toksicitet af benanomicin A og B og dexylosylbenanomicin B.

Afprøvning af de nye antibiotikas akutte toksicitet ved 5 intravenøs indgift til pattedyr viser, at de omhandlede nye antibiotika har lav akut toksicitet. Ved en akut toksicitetstest, hvor benanomicin A og B og dexylosyl-benanomicin B hver for sig indgives intravenøst til mus af stammen Jcl:ICR (hanmus med en legemsvægt på 19-20 g, 5 10 mus pr. gruppe), kan musene tåle en dosis på 600 mg/kg benanomicin A (ingen af musene dør ved intravenøs indgift af benanomicin A i en dosis på 600 mg/kg), og musene kan også tåle en dosis på 100 mg/kg af benanomicin B eller dexylosylbenanomicin B.

15 Terapeutisk virkning af benanomicin A på svampeinfektioner.

De kurative eller terapeutiske virkninger ved benanomicin A på en eksperimentel Candida-infektion hos mus bestemmes ved intravenøs inokulering af en vandig suspension (0,2 20 ml) af en svamp, Candida albicans i en dosis på 10^ CFU/mus til mus af stammen Jcl:ICR (hanmus, legemsvægt 19-20 g, 5 mus pr. gruppe), hvorefter musene subkutant eller oralt indgives benanomicin A i forskellige doser, der er anført i nedenstående tabel 3, til musene, som er 25 blevet inficeret med Candida-svampen.

Indgivelsen af benanomicin A foretages tre gange, nemlig umiddelbart efter svampeinokuleringen samt 6 timer og 24 timer efter inokuleringen.

De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel 3.

16 DK 170029 B1

Tabel 3

Dosis af Indgiftsmåde Antal Procent- * benanomicin A overle- vis andel 5 (mg/mus) vende overleven- _mus_de mus 0,8 3 gange*, subkutant 5/5 100 0,4 3 gange*, subkutant 1/5 20 0,3 3 gange*, subkutant 2/5 40 10 0,2 3 gange*, subkutant 0/5 0 ubehandlet (kontrol) 3 gange*, subkutant 0/5 0 15 12,0 3 gange*, oralt 3/5 60 6.0 3 gange*, oralt 3/5 60 3.0 3 gange*, oralt 0/5 0 1,5 3 gange*, oralt 0/5 0 20 ubehandlet (kontrol) 3 gange*, oralt 0/5 0 * Indgivet umiddelbart efter inokulationen, 6 timer senere og 24 timer senere.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af benanomicin A og benanomicin B er ejendommelig ved, at man dyrker Actinomycetes-stammen MH193-16F4 (FERM BP-2051) eller en deraf afledt mutant, som har væsenligt samme egenskaber, i et dyrkningmedium indeholdende assimiler-30 bare kulstofkilder og assimilerbare nitrogenkilder under aerobe betingelser til dannelse og akkumulering af benanomicin A og benanomicin B i kulturen, hvorefter benanomicin A og benanomicin B eller en af disse udvindes fra kulturen.

17 DK 170029 B1

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan Actinomycetes-stammen dyrkes i et dyrkningsmedium under aerobe betingelser ved en temperatur på 20-40°C, fortrinsvis 5 25-37°C, i et tidsrum på fra 3 til 10 dage.

Actinomycetes-stammen MH193-16F4 beskrives nærmere i det følgende.

(a) Mikrobiologiske egenskaber ved Actinomycetes-stammen MH193-16F4.

10 Denne MH193-16F4-stamme er en stamme af familien Actinomycetes, som blev isoleret i marts 1984 i laboratoriet hos Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyujo fra en jordprøve udtaget i jorden ved laboratoriet, og som har laboratoriebetegnelsen MH193-16F4. Denne stamme har 15 følgende mikrobiologiske egenskaber: 1. Morfologi MH193-16F4-stammen danner luftmycelium fra forgrenet substratmycelium ved iagttagelse under mikroskop. Der konstateres ikke fragmentering eller deling af substrat-20 mycelium. Dannelse af luftmycelium iagttages kun på ISP-medium 2 og ISP-medium 3. Sporedannelse begynder sædvanligvis ved 27°C fra omkring den 18. inkuberingsdag i ISP-medium 3. På luftmyceliet iagttages hverken hvirveldannelse, spiraler eller sporangier, men korte sporophore 25 dannes næsten altid lodret på luftmyceliet. For enden af hver sporophor dannes en kæde af sædvanligvis 3-7 sporer, i sjældne tilfælde 2. Sporekæder kan somme tider have et løkkeformet udseende. De enkelte sporer har cylindrisk (0,8 x 1,0-1,2 /xm) til sfærisk (0,8-1,2 μια) form, og de 30 har glatte overflader.

18 DK 170029 B1 2. Kulturkarakteristika i forskellige medier

Farvebeskrivelserne anført i paranteserne er i overensstemmelse med standarderne fra Color Harmony Manual of 5 Container Corporation of America.

(1) Saccharose-nitrat-agarmedium (dyrkning ved 27eC): Væksten er farveløs. Der dannes ikke luftmycelium. Der dannes heller ikke noget opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B er væksten farveløs til grå med 10 lyserødt skær [5ec, Dusty Peach]. Der dannes ikke luftmycelium, og opløseligt pigment har kun en svag rødlig tone.

(2) Glucose-asparagin-agarmedium (dyrket ved 27®C): Væksten er farveløs. Der dannes hverken luftmycelium eller 15 opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B er væksten farveløs til svag lyserød [4gc, Nude Tan]. Der dannes ikke noget luftmycelium men derimod et rødligt opløseligt pigment.

(3) Glycerol-asparagin-agarmedium (ISP-medium 5, dyrk- 20 ning ved 27°C): Væksten er farveløs, og der dannes hverken luftmycelium eller opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B er væksten grålig purpurrød [81g, Rose Mauve ] til mørk purpurrød [ 81e, Rose Wine]. Der dannes et tyndt 25 hvidt luftmycelium og opløseligt pigment med mørk purpurrød farve [ 8pc, Cranberry].

(4) Uorganiske salte-stivelse-agarmedium (ISP-medium 4, dyrkning ved 27°C): Væksten er farveløs, og der dannes hverken luftmycelium 19 DK 170029 B1 eller opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B dannes et opløseligt pigment med en svag rødlig farve.

5 (5) Tyrosin-agarmedium (ISP-medium 7, dyrkning ved 27°C): Væksten er farveløs til svag gulligbrun [3ic, Lt. Amber],

Der dannes hverken luftmycelium eller opløseligt pigment.

I det samme medium tilsat vitamin B er væksten farveløs til gråligpurpurrød. Der dannes intet luftmycelium men 10 derimod opløseligt pigment med en svag rødlig farve.

(6) Næringsagarmedium (dyrkning ved 27°C): Væksten er lysegul [2gc, Bamboo ], og der dannes hverken luftmycelium eller opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B opnås vækst med samme egenskaber.

15 (7) Gærekstrakt-maltekstrakt-agarmedium (ISP-medium 2, dyrkning ved 27°C): Væksten er lysegul [2ec, Biscuit] til mørkerød [7pi, Dk. Wine - 7 l/2pe, Dk. Red] til grålig rød [7pg, Wine]. Efter ca. 14 dages inkubering dannes et grålig hvidt luftmyce-20 lium. Selv om der dannes et opløseligt pigment med en mørkerød farve [6 l/2pe, Tomato Red ] omkring væksten ved inkuberingens begyndelse, spredes det opløselige pigment gradvis. Kulturens farve og det opløselige pigment skifter til orange farver med reaktion med HC1, men der optræder 25 ingen farveændringer ved reaktion med NaOH. Ved dyrkning i det samme medium tilsat vitamin B udviser bevoksningen samme egenskaber.

(8) Havremel-agarmedium (ISP-medium 3, dyrkning ved 27°C): 30 Bevoksningen udviser en svag lyserød [4gc, Nude Tan ] til 20 DK 170029 B1 gråligrød [ 6le, Cedar ] til mørkerød [7pe, Cherry Wine ] til purpurgrå [8ig, Mauve Gray ] farve og luftmyceliet en grålig hvid [3cb, Sand ] farve efter ca. 10 dages inkube-5 ring. Det opløselige pigment er tonet svagt rødligt. Bevoksningens farve og det opløselige pigment skifter til orange farver ved reaktion med HC1, medens der ikke fremkommer farveændringer ved reaktion med NaOH. I det samme medium tilsat vitamin B udviser bevoksningen lignende 10 egenskaber.

(9) Glycerol-nitrat-agar-medium (dyrkning ved 27°C):

Bevoksningen er farveløs, og der dannes ikke luftmycelium.

Der dannes intet opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B udviser bevoksningen lignende 15 egenskaber.

(10) Stivelses-agar-medium (dyrkning ved 27°C):

Bevoksningen er farveløs, der dannes hverken luftmycelium eller opløseligt pigment. I det samme medium tilsat vitamin B er bevoksningen farveløs, og der dannes intet 20 luftmycelium, men det opløselige pigment er tonet svagt rødligt.

(11) Calciummalat-agarmedium (dyrkning ved 27°C):

Bevoksningen er farveløs, og der dannes intet luftmycelium. Det opløselige pigment er tonet svagt rødligt. I det 25 samme medium tilsat vitamin B er bevoksningen farveløs, og der dannes hverken luftmycelium eller opløseligt pigment.

(12) Cellulose (syntetisk testopløsning indeholdende filtrerpapirstykker, dyrkning ved 27°C):

Der iagttages ingen vækst.

21 DK 170029 B1 (13) Gelatine-stavkultur:

Bevoksningen er tynd såvel i 15%’s simpel gelatinemedium (dyrkning ved 20°C) som i glucose-pepton-gelatine-medium 5 (dyrkning ved 27°C). Bevoksningen er farveløs, og der dannes hverken luftmycelium eller opløselige pigmenter.

(14) Skummetmælk (dyrkning ved 37°C):

Bevoksningen er yderst tynd og er farveløs. Der dannes hverken luftmycelium eller opløseligt pigment.

10 3. Fysiologiske egenskaber (1) Væksttemperaturområde:

Inkuberingen af stammen MH193-16F4 testes i et stivelsegær- agarmedium indeholdende 1,0% opløseliggjort stivelse, 0,2% gærekstrakt og 2,0% agar (pH-værdi 7,0), inkubations-15 temperaturer på henholdsvis 20, 24, 27, 30, 37 og 50eC. Resultaterne viser, at stammen vokser ved alle de afprøvede temperaturer med undtagelse af 50°C. Imidlertid synes den optimale væksttemperatur for denne stamme at være i området fra ca. 27 til ca. 37°C.

20 (2) Gelatinesmeltning (i 15%'s simpel gelatinemedium, dyrkning ved 20°C, og i glucose-pepton-gelatine-medium, dyrkning ved 27°C):

Der konstateres ingen smeltning af gelatine i det simple gelatinemedium og i glucose-pepton-gelatinemediet ved 25 inkuberingen af stammen i 3 måneder.

(3) Hydrolyse af stivelse (i uorganiske salte-stivelses-agarmedium og i stivelses-agarmedium, dyrkningerne gennemføres i begge tilfælde ved 27®C): 22 DK 170029 B1

Der indtræder ikke hydrolyse af stivelse ved inkubering af stammen i uorganiske salte-stivelses-agarmediet og heller ikke i stivelses-agarmediet.

5 (4) Koagulering og peptonisering af skummetmælk (i skummetmælk, dyrkning ved 37°C):

Bevoksningen er tynd, og der iagttages hverken koagulering eller peptonisering af skummetmælk under inkuberingen af stammen i 3 måneder.

10 (5) Dannelse af melanoide pigmenter (i trypton-gæreks trakt-medium, ISP-medium 1, pepton-gærekstrakt-jernagar, ISP-medium 6, tyrosin-agar, ISP-medium 7, alle dyrkninger gennemføres ved 27°C):

Melanoiddannelse er negativ i alle medierne.

15 (6) Udnyttelse af kulstofkilder (i Pridham-Gottlieb- agarmedium, ISP-medium 9, dyrkning ved 27°C): Når stammen vokser, udnyttes glucose, L-arabinose, D-xylose, D-fructose, saccharose, rhamnose, raffinose og D-mannitol, men ikke inositol.

20 (7) Smeltning af calciummalat (i calciummalat-agar, dyrk ning ved 27°C): Negativ.

(8) Nitratreduktion (i Bacto-nitrat-medium, ISP-medium 8, dyrkning ved 27°C): Positiv.

(9) Cellulosenedbrydning (i en syntetisk testopløsning 25 indeholdende filtrerpapirstykker, dyrkning ved 27°C):

Stammen vokser ikke.

De ovenfor anførte mikrobiologiske egenskaber kan sammen- 23 DK 170029 B1 fattes på følgende måde: Stammen MH193-16F4 er karakteriseret ved, at der dannes sporekæder på 3-7 sporer (i sjældnere tilfælde 2 sporer) stort set lodret på hoved-5 stænglerne i luftmyceliet, og der iagttages hverken hvirveldannelse eller spiraler eller sporangier. Der iagttages endvidere ingen opdeling af substratmyceliet. Sporeoverfladerne er glatte. Der dannes et spredt luftmycelium med grålighvid farve på bevoksning med 10 gråligrød til mørkerød farve såvel i ISP-medium 2 som ISP-medium 3. Når stammen MH193-16F4 inkuberes successivt i et skrårørsmedium indeholdende 0,2% gærekstrakt, 1,0% solubiliseret stivelse og 2,0% agar (pH-værdi 7,0) dannes somme tider et luftmycelium med en lyserød farve. Endvi-15 dere dannes opløseligt pigment med en mørkerød farve i ISP-medium 2. I forskellige andre dyrkningsmedier er bevoksningen farveløs. Der dannes intet luftmycelium og praktisk taget intet opløseligt pigment. Væksten fremmes imidlertid ved tilsætning af vitamin B12 til dyrknings-20 medierne. I nogle dyrkningsmedier vokser stammen med en rød farve. Farven af bevoksningerne og det opløselige pigments farve skifter fra rødt til orange ved reaktion med HC1, men ændres ikke ved reaktion med NaOH. Melanoid-dannelse, proteolytisk virkning og hydrolyse af stivelse 25 er alle negative, medens nitratreduktion er positiv. Væksten kan i nogle tilfælde fremmes i dyrkningsmedier tilsat vitamin B, hvilket synes at vise, at stammen har behov for vitaminer til sin vækst.

For øvrigt indeholder stammen MH193-16F4 mesodiamino-30 pimelinsyre som komponent i cellevæggen og glucose, ribose og madurose som saccharidkomponenterne i de hele celler, hvilket viser, at hovedbestanddelene i cellevæggen er af typen HIB ifølge Lechevalier et al. "International Journal of Systematic Bacteriology", 20, 435 (1970). På 35 den anden side er phospholipiderne af typen P IV (omfattende phosphatidylethanolamin og ukendte glucosaminhol-dige phospholipider men ikke phosphatidylglycerol). Mena- 24 DK 170029 B1 quinonerne omfatter MK-9(Hg) som en hovedkomponent og endvidere MK-9(H6), MK-9(H4), MK-9(H2), MK-9(H10), og GC-indholdet i DNA'et udgør 71,5%. En gaskromatografisk 5 analyse af myceliet viser, at der forekommer isoforgrenede fedtsyrer (i-16:0), antiiso-forgrenede fedtsyrer (a-17:0) og 10-methylfedtsyre (10Me-17:0), hvilket giver stammens karakteristiske træk.

Blandt kendte Actinomycetes-stammer hører de stammer, som 10 danner sporekæder og har cellevægkomponenter af typen IIIB til de tre slægter Actinomadura, Microbispora og Micro-tetraspora. Karakteristiske egenskaber ved stammen MH193-16F4 og de ovenfor beskrevne tre slægter er anført i tabel 4. Den efter en menaquinon anført * indicerer, at 15 den pågældende menaquinon forekommer som hovedkomponent.

DK 170029 B1 25 _

i—I

- \D

«· ·» O pH

/'“s «"—s O ^ * «ς}ΐ O t*P V.D ·· '»O v-* «Η *H ®fu a am B ^ h cxn -P rt -P -P u O CC^C^C H !·♦<-> (DM -H 0} &» σ>Ρισ>σ>(ΐ)σ><ΐ)σ> ι o η r- co p *h w -p h (Dl I i—I I Η I -P ·· ~H co Ό ft 0¾ '2 ~ CO ~ II Otn ft 0 S O' h s g <d a α> s η η φ φ co h > ·©· jj -> (D'T aj-as'^ - p m p «.

S h»· *. ·> «.ft»æ>iO^fdtna)MH<i)0 ^ ^ >i O H P H -ri -P Η 0) I Φ «. +

Irt m ft ID CO CN oo «tf P · +J CO P P Η Η ΙΟ >i P H

g h MS K M a . d ~ d o 'T d S' ^ « HCl !c g μ h o w o i id <d . φ -g C Η H O' O' O' O' O' RJ I ·· 0 ·· O Φ G ' . ft •H II I I I ΦΦΓ'-Οιί'-Γ-ΦΑί <U 4J tø d 0 4J ft ft ft ft ft W GSHgH ΧΛί O' id Η 0(β ω ο wgassa -poioi ,¾ & g h j>h φ ,¾ ir^ F r ιg h g w ο hgiho κλ s -id

(N CM >X) P P

a a ffi a) O'

V—<* ^ W

Id O'fHO'MO' 'ΰ ' μ ι <D I CD I 0 Td o ft H ft H ft 1-1 'k ft g H g H g _ > m CD a) - ·σ -5 4JHHVO^O^^ I Γ* H I Φ £ *d ο) h aa a a a j d .. £ + £, 0 H^0'O' O' O' O' I O ® Φ P Ό O 0 μ I I I I I CO^I S’^'^’dd ffi 5 ft ft ft ft ft "* x gh >g φ d É g s g g H ho aois g * *_ * ^ ·» ""^Τ CN CN o a a a ·· d — — — k in o O' P O' M O' OH O;

I Q) I (D I ·· I — O' _ P

ft H ft H ft r- C cn -Η το Φ id g h g h g φ h ^ ft -p d ^ μ 0) CD ft I - O' , > d η * >i id o co P a φ ι ^[ ^ ^ J i at ^ Q,) Γ-!

(DM HH 1C' 00 O «3* 'd* VOP - Γ" H ' Η -H

«λ h (i, SS S S δδ a° V ^ 4J ΐ c. ? + a a

* ° TTTTTTasi s s s &P

Η ώώώώώώδίο ό o' ni m wfi d iiigggO-HH O GH >1 φ φ

S « fstfj — GlHOiG S-P

k k ”^70 Φ a a d, ^'— * O'

O' O' o Q CN

II ·· G

Kd Si r~ -P -p

Is φ ι—ι φ -p c ft I — p φ ' ktf ^ «. >iGO Ό O' Od [V. ,—, ^ o +J ·· Ο ·Ρ i—I -Η ID ffl > ΜΊ1 H +j-r^ ΙΛΗ·Ρ|Φ d HHHaaa d0r7l Tr-S'S d

1 |_i m ·· I rPCrorH B O » , G

m H ft O' O' O' ΟΟΦ I'HJOSG '-•rllj + ft S w|| I ftHS ΗΦ 0 r] ώώώ S ι o m^H0'Gr'»Gtn to 3 asg' S-HH ffi«.-HGHISrt>i Φ g It W— SPlPHOroOH g LO ^

-. ^ r-H

'Z φ *~N I -I ' K- ' '

ry P ' ' P P

^ -P P Η Π3

d _ Λ +J O) lp P

HH ^tD-ΡΦ

dP Q) O' ~a in P

mnrtu ^ ' W G(0PP>G

ft -p φ CO H Id Η Φ Φ o ft

SftG Τ3ΦΡΡΡ-ΡΡΦ P-PO H HG Ο P Q Η Φ ft oihg 8 oc ftiuftoas

ao-p P ,G(d m>tnuGO

>rGG >ι Ό Ό 0 0 bdt!

Sq,h tn αω'Ο'ϋΦΗβε-ρ H05G 4J ΗΡΰΟΡΦΡΦΦ hog V iogooppp-« Φ UftPWftGG-PÆ $P4S ft oraniftra<J >> 26 DK 170029 B1

Henvisningstallene i ovenstående tabel refererer til følgende litteratursteder: 1) Et japansk skrift "Hosenkin no Dotei Jikkenho 5 (Experiments for the identification of Actinomuy- cetes)", samlet af Nihon Hosenkin Kenkyukai (1985).

2) J. Poschner et al., "DNA-DNA Reassociation and Chemotaxonomic Studies on Actinomadura, Microbispora, Microtetraspora, Micropolyspora and Nocardiopsis" i 10 "Systematic and Applied Microbiology", 6, 264-270, (1985).

3) A. Fisher et al., "Molecular-genetic and Chemotaxonomic Studies on Actinomadura and Nocardiopsis" i "Journal of General Microbiology", 129, 3433-3446, (1983).

15 4) Thiemann et al., "A New Genus of the Actinomycetales:

Microtetraspora gen. nov." i "Journal of General Microbiology", 50, 295-303, (1968).

5) Nonomura et al., en japansk artikel "Dojochu ni okeru Hosenkin no Bunpu (Distribution of Actinomycetes in 20 Soil) (11th Report) Several New Species of Actino madura, Lechevalier et al." i et japansk skrift "Hakko Kogaku Kaishi", 49, 904-912, (1971).

Det fremgår af tabel 4, at der ikke synes at være nogen slægt, hvortil stammen MH193-16F4 helt klart hører i alle 25 henseender. Der er hårfine overgange mellem disse tre slægter. Det vil derfor være interessant at se, hvordan disse slægter vil blive defineret i den næste udgave af Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Mange arter er imidlertid anført under slægten Actinomadura, og disse 30 arters egenskaber varierer i vid udstrækning. Der findes signifikant lighed med hensyn til morfologi, fedtsyresammensætning i myceliet og menaquinonsammensætningen mellem stammen MH193-16F4 og Actinomadura spadix blandt sådanne Actinomadura-stammer, jf. litteraturstederne 1), 3) og 5).

35 I forbindelse med den foreliggende opfindelse er det derfor hensigten at gennemføre et første sammenligningsforsøg 27 DK 170029 B1 mellem stamme MH193-16F4 og Actinomadura spadix. Det er imidlertid yderst sandsynligt, at stammen MH193-16F4 hører til slægten Actinomadura og udgør en ny art.

5 Stammen MH193-16F4 er blevet deponeret i det japanske deponeringsinstitut "Fermentation Research Institute", kontoret for industriel videnskab og teknologi, ministeriet for international handel og industri, under deponeringsnummeret FERM P-9529 den 21. august 1987.

10 Stammen MH193-16F4 er nu blevet deponeret i "Fermentation Research Institute" i overensstemmelse med Budapest-trak-tatens forskrifter under deponeringsnummeret "FERM BP-2051".

(b) Dyrkning af stammen MH193-16F4: 15 Produktionen af benanomicin A og B gennemføres ved at inokulere en benanomicin A- og benanomicin B-producerende Actinomycetes-stamme i et dyrkningsmedium, som indeholder sådanne næringskilder, der kan udnyttes af almindelige mikroorganismer, hvorefter den benanomicin-producerende 20 stamme inkuberes under aerobe betingelser. Benanomicin A og B produceres og akkumuleres primært i dyrkningsvæsken.

De ønskede antibiotika udvindes fra den fremkomne kultur, især fra dyrkningsvæsken eller den filtrerede dyrkningsvæske .

25 Som næringskilder til dyrkningsmediet kan anvendes alle de konventionelle næringskilder, som anvendes som næringskilder til dyrkningen af kendte Actinomycetes-stammer. De assimilerbare nitrogenkilder kan eksempelvis omfatte sojamel, pepton, kødekstrakt, majsstøbevand, bomuldsfrø- 30 mel, jordnøddemel, tørgær, gærekstrakt, NZ-amin, casein, natriumnitrat, ammoniumsulfat og ammoniumnitrat, som er kommercielt tilgængelige. De assimilerbare kulstofkilder kan omfatte glycerol, saccharose, stivelse, glucose, galactose, maltose, dextrin, lactose, melasse, sojabønne 28 DK 170029 B1 olie, fedtsyrer og aminosyrer, som er kommercielt tilgængelige. Dyrkningsmediet kan også indeholde uorganiske salte, såsom natriumchlorid, phosphater, calciumcarbonat, 5 magnesiumsulfat, cobaltchlorid og manganchlorid. Der kan desuden tilsættes spormængder af metalsalte og en eller flere animalske, vegetabilske eller mineralske olier som antiskummidler. Der kan anvendes ethvert materiale, når blot det kan udnyttes af den benanomicinproducerende 10 stamme og er anvendeligt til produktionen af benanomicin A og B. Kendte næringsmaterialer til dyrkning af kendte Actinomycetes-stammer er alle anvendelige.

Til fremstilling af benanomicin A og B i stor målestok foretrækkes væskedyrkningsmetoden. Dyrkningstemperaturen 15 kan vælges indenfor det temperaturområde, hvori den benanomicinproducerende mikroorganisme kan vokse og producere benanomicin A og B. Dyrkningstemperaturen ligger sædvanligvis mellem 20 og 40°C, fortrinsvis mellem 25 og 37°C. Dyrkningen kan gennemføres ved passende valg af de 20 ovenfor anførte dyrkningsbetingelser under hensyntagen til naturen af den mikroorganisme, som kan producere benanomicin A og B.

(c) Udvinding og rensning af benanomicin A og B:

Benanomicin A og B kan udvindes fra den dannede kultur af 25 mikroorganismen, som kan danne benanomicin A og B ved ekstraktion fra kulturen eller kulturfiltratet, hvorefter de renses ved anvendelse af sædvanlige udvindings- og rensningsmetoder, f.eks. opløsningsmiddelekstraktion, kromatografi på ionbytterharpiks, adsorptions- eller 30 fordelingssøjlekromatografi, gelfiltrering, dialyse, fældning og lignende, enten enkeltvis eller i kombination. Benanomicin A og B kan eksempelvis udvindes fra den inkuberede myceliekage ved ekstraktion med acetone-vand eller methanol-vand. På den anden side kan benanomicin A 35 og B, som er produceret og akkumuleret i dyrkningsvæsken 29 DK 170029 B1 eller filtratet, adsorberes på et adsorptionsmiddel, såsom et mikroporøst ikke-ionisk harpiksadsorptionsmiddel, f.eks. "DIAION HP-20" (syntetisk harpiksagtigt adsorp-5 tionsmiddel fremstillet af Mitsubishi Kasei Corporation, Japan). Når dyrkningsvæsken eller dyrkningsfiltratet ekstraheres med et organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand, f.eks. butanol, ethylacetat eller lignende, går benanomicin A og B over i den organiske 10 opløsningsmiddelfase.

I overensstemmelse med en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes stammen MH193-16F4 (identificeret som FERM BP-2051) i et dyrkningsmedium under aerobe betingelser ved en temperatur på 25-37°C, 15 fortrinsvis i 3-10 dage, dyrkningsvæsken filtreres, det fremkomne dyrkningsfiltrat ledes gennem en søjle af et adsorptionsmiddel til adsorption af benanomicin A og benanomicin B på adsorptionsmidlet, og benanomicin A og benanomicin B udvindes hver for sig ved kromatografisk 20 eluering af søjlen med adsorptionsmidlet indeholdende benanomicin A og B.

Til fælles isolering og yderligere rensning af benanomicin A og B kan der passende anvendes kromatografiske fremgangsmåder med anvendelse af et adsorptionsmiddel, såsom 25 silicagel ("WAKOGEL C-300", Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), og aluminiumoxid eller et gelfiltreringsmiddel "Sephadex LH-20"® (Pharmacia AB) eller lignende.

Benanomicin A og B som produceret ved den ovenfor beskrevne dyrkning kan isoleres i fri form, dvs. som 30 benanomicin A og B.

Når en opløsning indeholdende benanomicin A og/eller B eller en koncentreret opløsning deraf behandles med en basisk forbindelse, f.eks. en uorganisk base, herunder en alkalimetalforbindelse, såsom natriumhydroxid, kalium- 30 DK 170029 B1 hydroxid, en jordalkalimetalforbindelse, såsom calciumhydroxid eller magnesiumhydroxid, eller et ammoniumsalt eller en organisk base, såsom ethanolamin, triethylamin 5 eller dicyclohexylamin, under gennemførelsen af et af udvindingstrinene, f.eks. under ekstraktionen, isoleringen eller rensningen, sker det, at benanomicin A og/eller B omdannes til de tilsvarende salte, som derefter kan fraskilles eller isoleres i form af sådanne salte.

10 Saltet af benanomicin A eller B dannet som beskrevet ovenfor kan derefter omdannes til den fri form, dvs. benanomicin A eller B, under anvendelse af en i og for sig kendt måde til omdannelse af et salt til en syre. Endvidere kan benanomicin A og/eller B opnået på fri form atter 15 omdannes til de tilsvarende salte ved omsætning med en af de ovenfor beskrevne baser på sædvanlig måde.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af dexylosylbenanomicin B, dvs. forbindelsen med den ovenfor anførte formel Ic, er ejendommelig ved, at benanomicin B 20 omdannes kemisk til dexylosylbenanomicin B.

Ved udtrykket "kemisk omdannelse af benanomicin B" skal her forstås enten sur hydrolyse af benanomicin B eller alkoholyse af benanomicin B efterfulgt af behandling af den dannede dexylosylbenanomicin B-ester med en basisk 25 forbindelse til dannelse af dexylosylbenanomicin B. Når benanomicin B hydrolyseres med en syre, fraspaltes xylosylgruppen i benanomicin B ganske enkelt, hvorved man får det ønskede dexylosylbenanomicin B. Når benanomicin B underkastes en alkoholyse med en alkohol, f.eks. en 30 C(l-6)-alkanol, såsom methanol eller ethanol, fraspaltes xylosylgruppen, og samtidigt esterificeres carboxylgrup-pen i benanomicin B med alkoholen under dannelse af en ester af dexylosylbenanomicin B, som derefter underkastes basisk hydrolyse med en basisk forbindelse til dannelse af 35 dexylosylbenanomicin B i fri form.

31 DK 170029 B1

Ved en særlig udførelsesform for denne fremgangsmåde ifølge opfindelsen til fremstilling af dexylosyl-benanomicin B spaltes xylosylgruppen fra benanomicin B 5 enten ved sur hydrolyse eller ved alkoholyse efterfulgt af behandling med en basisk forbindelse til dannelse af dexylosylbenanomicin B. Ved denne udførelsesform kan den sure hydrolyse af benanomicin B gennemføres ved at omsætte en uorganisk eller organisk syre med benanomicin B i 10 vandig opløsning ved en temperatur på 60-110°C i fortrinsvis 5-15 timer. Når den sure hydrolyse af benanomicin B gennemføres ved omsætning med en almindeligt anvendt uorganisk eller organisk syre, såsom saltsyre, svovlsyre, eddikesyre, trifluoreddikesyre, p-toluensulfonsyre eller 15 benzensulfonsyre, dannes dexylosylbenanomicin B i reaktionsopløsningen .

Alkoholysen af benanomicin B kan sædvanligvis gennemføres ved opvarmning af en opløsning af benanomicin B i en C(l-6)-alkanol, fortrinsvis methanol eller ethanol, i 20 nærværelse af en uorganisk syre, såsom saltsyre, svovlsyre eller salpetersyre, ved en temperatur på 50-120°C i fortrinsvis 5-15 timer til dannelse af en ester (carboxy-latet) af dexylosylbenanomicin B med den anvendte alkanol.

Den dannede dexylosylbenanomicin B-ester kan derefter 25 hydrolyseres ved omsætning med en basisk forbindelse, f.eks. et alkalimetalhydroxid eller -carbonat, fortrinsvis natrium- eller kaliumhydroxid eller -carbonat, i vandig opløsning ved stuetemperatur eller højere temperatur til dannelse af dexylosylbenanomicin B. Når 30 benanomicin B således alkoholyseres, f.eks. methanoly-seres, og derefter behandles med en base, såsom natriumhydroxid eller kaliumhydroxid, dannes dexylosylbenanomicin B i reaktionsopløsningen.

Til udvinding af det dannede dexylosylbenanomicin B fra 35 reaktionsopløsningen kan denne forbindelse ekstraheres og derefter renses under anvendelse af almindelige udvin- 32 DK 170029 B1 dings- og rensningsfremgangsmåder, f.eks. opløsningsmiddelekstraktion, kromatografi på ionbytterharpikser, adsorptions- eller fordelingssøjlekromatografi, gelfil-5 trering, dialyse, fældning og lignende enten enkeltvis eller i kombination. Dexylosylbenanomicin B i den vandige reaktionsopløsning kan eksempelvis adsorberes på en adsorberharpiks "DIAION HP-20" (syntetisk adsorberharpiks fra Mitsubishi Kasei Corporation). Til yderligere rensning 10 af dexylosylbenanomicin B kan der hensigtsmæssigt anvendes kromatografiske metoder under anvendelse af et adsorptionsmiddel, f.eks. silicagel ("WAKOGEL C-300", Wako Pure Chemical Industries, Ltd., eller lignende) aluminiumoxid og et gelfiltreringsmiddel "Sephadex LH-20"® (Pharmacia 15 AB) eller et lignende produkt.

Dexylosylbenanomicin B dannet i reaktionsopløsningen som beskrevet ovenfor kan isoleres i fri form, nemlig som dexylosylbenanomicin B selv. En opløsning indeholdende dexylosylbenanomicin B eller et koncentrat deraf kan 20 behandles med en almindeligt anvendt syre, f.eks. en uorganisk syre, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre eller salpetersyre, eller en organisk syre, såsom eddikesyre eller en alkylsulfonsyre, eller en uorganisk base, f.eks. en alkalimetalforbindelse, såsom natrium-25 hydroxid eller kaliumhydroxid, en jordalkalimetalforbin-delse, såsom calciumhydroxid eller magnesiumhydroxid, og et ammoniumsalt eller en organisk base, såsom ethanolamin, triethylamin eller dicyclohexylamin under gennemførelsen af et trin i udvindings- og rensningsprocessen. Dexylosyl-30 benanomicin B omdannes derved til det tilsvarende salt og kan endvidere isoleres i form af saltet. Endvidere kan de således dannede dexylosylbenanomicin B-salte derefter omdannes til den fri form, dvs. dexylosylbenanomicin B selv, ved behandling på i og for sig kendt måde.

35 Dexylosylbenanomicin B opnået på fri form kan desuden atter omdannes til et salt ved omsætning med de ovenfor omtalte syrer eller baser på sædvanlig måde. Når endvidere 33 DK 170029 B1 dexylosylbenanomicin B omsættes med en alkohol, f.eks. en lavalkanol, såsom methanol og ethanol, kan der dannes den tilsvarende ester ved carboxylgruppen.

5 Det antifungale middel ifølge opfindelsen til terapeutisk behandling af en svampeinfektion hos mennesker eller dyr, er ejendommeligt ved, at det indeholder en antifungal virksom mængde af en forbindelse med den almene formel I som defineret ovenfor, nemlig en af benanomicinerne A og 10 B, dexylosylbenanomicin B, eller deres salte eller estere som definerede ovenfor som aktiv bestanddel i kombination med et farmaceutisk acceptabelt fast eller flydende bærestof.

Det antifungale middel ifølge opfindelsen er især 15 anvendeligt til behandling af Candida-infektioner hos et menneske eller et pattedyr.

Opfindelsen angår tillige anvendelsen af benanomicin A, benanomicin B, dexylosylbenanomicin B eller et salt eller en ester deraf som defineret ovenfor til fremstilling af 20 farmaceutiske præparater.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen, som indeholder en forbindelse med den almene formel I eller et salt eller en ester deraf som defineret ovenfor, kan formuleres på kendt måde til et konventionelt præparat 25 beregnet til administration, f.eks. pulvere, granulater, tabletter, piller og kapsler til oral indgift, samt injektionsopløsninger til intravenøs, intramuskulær eller subkutan indgift, og suppositorier under anvendelse af et farmaceutisk acceptabelt fast eller flydende bærestof, 30 som egner sig til den pågældende formulering. Egnede faste bærestoffer omfatter sukkerrør, såsom maltose og saccharose, aminosyrer, cellulosederivater, såsom hydroxy-propylcellulose, og cyclodextriner. Egnede flydende bærestoffer kan indbefatte vand, alkoholer, såsom ethanol, 34 DK 170029 B1 sojabønneolie og forskellige andre olier, såvel som fysiologiske saltopløsninger. Formuleringen kan indeholde forbindelsen med formlen I sædvanligvis i en mængde på 5 0,1-90 vægt-%, afhængigt af den pågældende forms formu lering. En injektionsopløsning kan sædvanligvis indeholde 0,1-10 vægt-% af forbindelsen ifølge opfindelsen. Dosis af de omhandlede forbindelser kan fastlægges under hensyntagen til forskellige faktorer, såsom alder, legems-10 vægt, patienttilstand, type af svampeinfektion og formål med den terapeutiske behandling. Som en almen vejledning kan forbindelserne ifølge opfindelsen indgives i en dosis på 1-300 mg/kg pr. dag ved non-oral administration og i en dosis på 5-500 mg/kg pr. dag ved oral administration.

15 Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler. Ved den foreliggende opfindelse er de detaljerede egenskaber ved benanomicin A og B og dexylo-sylbenanomicin B blevet bestemt, og det er derfor muligt for en fagmand at gennemføre fremgangsmåderne til frem-20 stilling af benanomicin A og B eller dexylosylbenanomicin B på forskellige måder under hensyntagen til de ovenfor beskrevne egenskaber ved disse forbindelser.

Eksempel 1

Med en podenål inokuleres stammen MH193-16F4 (identifice-25 ret som FERM BP-2051), som er blevet inkuberet på et agar-skrårør, i 80 ml flydende dyrkningsmedium indeholdende 1,0% stivelse og 3,0% sojabønnemel (pH 7,0 inden sterilisering) i en Sakaguchi-kolbe på 500 ml. Det inokulerede dyrkningsmedium inkuberes ved 28°C i 3 dage under rystning 30 (135 o/m) til dannelse af en første podekultur. Denne op nåede første podekultur inokuleres i 3 ml-portioner i 80 ml-portioner af et dyrkningsmedium med den ovenfor beskrevne sammensætning i et stort antal Sakaguchi-kolber.

Det inokulerede dyrkningsmedium inkuberes i 3 dage under 35 de samme inkuberingsbetingelser som beskrevet ovenfor, 35 DK 170029 B1 hvorved man får en anden podekultur. Den opnåede anden podekultur (2 1) inokuleres derefter til et dyrkningsmedium (50 1) med den samme sammensætning som beskrevet 5 ovenfor, som er blevet steriliseret ved 120°C i 15 minutter og anbragt i en 100 liters fermenteringstank. Det inokulerede dyrkningsmedium inkuberes derefter ved 28°C i 2 dage under beluftning med 50 1 luft pr. minut og under omrøring ved 200 o/m til gennemførelse af den submerse 10 dyrkning af stammen MH193-16F4 under aerobe betingelser, hvorved man opnår en tredje podekultur. Denne tredje pode-kultur (12 1) inokuleres til et produktionsdyrkningsmedium (300 1) indeholdende 2,0% glycerol, 1,5% sojabønnemel (kommercielt produkt forhandlet under varemærket 15 "Esusan Meat" af Ajinomoto Co. Ltd., Japan), 0,0025% K2HP04, 0,1125% KH2P04, 0,0005% CoC12*6H20, 0,03% silikoneolie "KM72" (handelsnavnet for et antiskummiddel fra Shinetsu Chemicals Co. Ltd., Japan) og 0,01% "Adekanol" (varemærke for et overfladeaktivt middel fra 20 Asahi Denka Kogyo Co. Ltd., Japan), som forinden er blevet steriliseret ved 125°C i 30 minutter og anbragt i en 570 1-fermenteringstank. Dyrkningen gennemføres ved 28°C i 7 dage under omrøring ved 300 o/m og under beluftning med 150 1/min i de første 24 timer af dyrkningen og derefter 25 med 300 1/min efter de første 24 timers dyrkning. Efter endt dyrkning blandes dyrkningsvæsken med diatoméjord som filtreringshjælpemiddel, hvorpå der filtreres, og man får 250 1 dyrkningsfiltrat (pH-værdi 6,0).

Eksempel 2 30 Dyrkningsfiltratet (250 1) fra eksempel 1 ledes gennem en søjle med 15 1 mikroporøs ikke-ionisk adsorptionsharpiks "DIAION HP-20" til adsorption af de aktive stoffer på adsorptionsmidlet. Adsorptionssøjlen vaskes med 100 1 vand og med 45 1 50%'s vandigt methanol, hvorpå adsorptions-35 søjlen elueres med 45 1 70%'s vandigt methanol og derpå med 90 1 tørt methanol, således at der opnås en første 36 DK 170029 B1 eluatfrektion på 53 1, en anden eluatfraktion på 38 1 og en tredje eluatfraktion på 27 1. Den første fraktion indeholdende det aktive stof koncentreres til 3 1 under 5 formindsket tryk, hvorefter den indstilles på pH-værdien 3,5 med fortyndet saltsyre til udfældning af et rødt bundfald. Bundfaldet frafiltreres og tørres derefter under formindsket tryk, hvorved man får 152 g af et råt brunt pulver, som hovedsagelig indeholder benanomicin A.

10 150 g råt pulver opløses i 600 ml dimethyl formamid. Efter mætning af den dannede opløsning med vanddamp ved stuetemperatur i 3 dage i en ekssikator, udskilles et krystallinsk bundfald. Bundfaldet frafiltreres og tørres derefter under reduceret tryk, hvorved man får 29 g benanomicin 15 A-dimethylformamid-solvat. Den anden fraktion af eluatet oparbejdes på samme måde som den første fraktion, hvorved man får 14 g benanomicin A-dimethylformamid-solvat.

1 g af benanomicin A-dimethylformamid-solvatet opnået fra den første fraktion opløses i 5 ml dimethylsulfoxid. Den 20 dannede opløsning sættes dråbevis under omrøring til 300 ml methanol, hvorefter der omrøres i 10 minutter til aflejring af et rødbrunt bundfald. Bundfaldet frafiltreres og tørres derpå under reduceret tryk, hvorved man får 935 mg renset benanomicin A i form af et rødbrunt pulver.

25 Eksempel 3

Den tredje eluatfraktion fremstillet som beskrevet ovenfor i eksempel 2 koncentreres til 1,5 1 under formindsket tryk, hvorefter der indstilles på pH-værdien 3,5 med fortyndet saltsyre, hvorved der dannes et rødt bundfald.

30 Bundfaldet frafiltreres og tørres derpå under reduceret tryk, hvorved man får 98 g råt brunt pulver, som indeholder benanomicin B. 1 g af dette rå pulver opløses i 10 ml dimethyl formamid ved 40°C, og den dannede opløsning ledes gennem en søjle af 1 1 gelfiltreringsmiddel "Sephadex 37 DK 170029 B1 LH-20"®, som er blevet udblødt med dimethylformamid, hvorefter "Sephadex LH-20"®-søjlen fremkaldes med dimethyl-formamid. Eluatet opsamles i 6 ml-fraktioner. Fraktionerne 5 64-72 indeholdende det aktive stof opsamles, hældes sammen og koncentreres derpå til tørhed under formindsket tryk, hvorved man får 657 mg råt brunt pulver indeholdende benanomicin B-dimethylformamid-solvat. 300 mg af dette rå pulver opløses i 100 ml methanol, hvorpå der tilsættes 1 10 ml 1 N saltsyre, og opløsningen koncentreres til tørhed under formindsket tryk. Det dannede rå brune pulver opløses i 3 ml dimethylsulfoxid. Den fremkomne opløsning sættes dråbevis til 200 ml chloroform under omrøring, hvorpå der omrøres i 20 minutter til aflejring af et 15 rødbrunt bundfald. Bundfaldet frafiltreres og tørres derpå under formindsket tryk, hvorved man får 258 mg benanomicin B-hydrochlorid på renset form.

Eksempel 4

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af dexylosyl-20 benanomicin B ved sur hydrolyse af benanomicin B.

130 mg benanomicin B-hydrochlorid opløses i 10 ml vand, hvorpå der tilsættes 10 ml koncentreret saltsyre. Den dannede blanding hældes i et glasrør, som forsegles. Efter gennemførelse af hydrolysereaktionen ved 110°C i 12 timer 25 frafiltreres det dannede bundfald. Bundfaldet ekstraheres med 3 x 10 ml dioxan, hvorved man får 47,5 mg benanomici-non (aglycon af benanomicin B). Ekstraktionsresten renses ved hjælp af præparativ silicageltyndtlagskromatografi (på silicagel "Art. 5744" fra Merck & Co., Inc. Som fremkalder 30 anvendes et blandet opløsningsmiddel af butanol-eddike-syrepyridin = 6:1:4:), hvorved man får fraktion 1 indeholdende dexylosylbenanomicin B og fraktion 2 indeholdende benanomicinon. Fraktion 1 adsorberes på 20 ml af adsorptionsmidlet "DIAION HP-20". Efter vaskning af adsorp-35 tionsmidlet med 60 ml vand elueres adsorptionsmidlet med 4 38 DK 170029 B1 x 40 ml methanol. Eluatet koncentreres til tørhed, den fremkomne remanens opløses i 3 ml vand, og den dannede opløsning indstilles på pH-værdien 2 med 0,1 N saltsyre.

5 Ved koncentrering af opløsningen til tørhed fås 17,8 mg renset dexylosylbenanomicin B-hydrochlorid. På lignende måde renses fraktion 2 ved kromatografi under anvendelse af adsorptionsmidlet "DIAION HP-20", hvorved man får 9,5 mg benanomicinon.

10 Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af dexylosylbenanomicin B ved methanolyse af benanomicin B efterfulgt af behandling med en basisk forbindelse, nemlig natriumhydroxid.

15 40 ml af en opløsning af 217 mg benanomicin B-hydrochlorid i 1 N methanolisk saltsyre anbringes i et glasrør, som forsegles og opvarmes til 90°C i 12 timer til alkoholysen. Reaktionsopløsningen koncentreres derefter til tørhed. Remanensen opløses i 30 ml vand og adsorberes på 100 ml 20 "DIAION HP-20". Adsorptionsmidlet vaskes derpå med 300 ml vand, hvorefter der ekstraheres fire gange med 200 ml methanol. Ekstraktopløsningen koncentreres til tørhed, hvorved man får 125 mg af methylesteren af dexylosylbenanomicin B. Den dannede methylester opløses i 20 ml vand, 25 og efter tilsætning af 5 ml 1 N natriumhydroxidopløsning gennemføres den basiske hydrolyse af esteren ved stuetemperatur i 10 minutter. Efter tilsætning af 7 ml 1 N saltsyre til reaktionsopløsningen koncentreres den dannede blanding til tørhed. Remanensen opløses i 20 ml vand, 30 hvorpå opløsningen adsorberes på en søjle af 100 ml "DIAION HP-20". Efter vaskning af adsorptionssøjlen med 300 ml vand elueres adsorptionsmidlet med 200 ml methanol.

Den opnåede opløsning koncentreres til tørhed, hvorpå den ledes gennem en søjle af 650 ml gelfiltreringsmiddel 35 "Sephadex LH-20"®. Søjlen fremkaldes med methanol. Aktive 39 DK 170029 B1 fraktioner af eluatet samles, hældes sammen og koncentreres til tørhed. Den opnåede remanens opløses i 10 ml vand, og opløsningen indstilles på pH-værdien 2 med 1 N salt-5 syre. Ved koncentrering af opløsningen til tørhed fås 109,5 mg renset dexylosylbenanomicin B-hydrochlorid i form af et rødbrunt pulver.

Claims

40 DK 170029 B1

1. Benanomicinforbindelser, kendetegnet ved, at de har den almene formel CH-5 C0NHCHC00H o ho γ ||

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er benanomicin A med formlen CH3 C0NHCHC00H I (R) H0 λ ch3 (Ial OH 0 OH P _ O H<L CH3 / Η0^^^υ\ W£>^Ov / 0H OH 41 DK 170029 B1 eller et salt eller en ester deraf som defineret i krav 1.

3. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 5 den er benanomicin B med formlen CH-a I 3 C0NHCHC00H I (R) CH3 h3°0 OH 0 OH P H2^\ / OH OH eller et salt eller en ester deraf som defineret i krav 1.

4. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 10 den er dexylosylbenanomicin B med formlen f3 CONHCHCOOH H0N^k^CH3 o ho T il (lc) OH 0 OH ? OH 42 DK 170029 B1 eller et salt eller en ester deraf som defineret i krav 1.

5. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den foreligger i form af et salt (carboxylat) deraf med 5 et alkalimetal eller jordalkalimetal eller i form af en acetoxymethyl-, 1-acetoxyethyl-, pivaloyloxymethyl- eller l-(ethoxycarbonyloxy)ethylester deraf.

5 H3C°OiWt (i) 0H 0 OH P ..SV OH hvori R betyder en hydroxylgruppe eller en aminogruppe, og R1 er et hydrogenatom eller en xylosylgruppe, idet dog R^-er forskellig fra hydrogen, når R betyder hydroxyl, samt salte og C(1-6)-alkyl-, C( 2-6)-alkanoyloxy-C(1-6)-alkyl-10 og C(l-6)-alkoxycarbonyloxy-C(l-6)-alkylestere deraf.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af benanomicin A og benanomicin B, kendetegnet ved, at man dyrker Actino- 10 mycetes-stammen MH193-16F4 (FERM BP-2051) eller en deraf afledt mutant, som har væsentligt samme egenskaber, i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kulstofkilder og assimilerbare nitrogenkilder under aerobe betingelser til dannelse og akkumulering af benanomicin A og 15 benanomicin B i kulturen, hvorefter benanomicin A og benanomicin B eller en af disse udvindes fra kulturen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man dyrker stamme MH193-16F4 identificeret som den kultur, som er deponeret under deponeringsnummeret "FERM

20 BP-2051" i det japanske deponeringsinstitut "Fermentation Research Institute" i henhold til Budapest-traktatens bestemmelser.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres under aerobe betingelser ved en 25 temperatur på 20-40°C, fortrinsvis 25-37°C.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at stammen MH193-16F4 (FERM BP-2051) dyrkes ved en temperatur på 25-37°C, dyrkningsvæsken filtreres, det fremkomne dyrkningsfiltrat ledes gennem en søjle med et 30 adsorptionsmiddel til adsorption af benanomicin A og benanomicin B på adsorptionsmidlet, og benanomicin A og benanomicin B udvindes hver for sig ved kromatografisk eluering af søjlen med adsorptionsmidlet indeholdende 43 DK 170029 B1 benanomicin A og B.

10. Antifungalt middel til terapeutisk behandling af svampeinfektioner hos mennesker eller dyr, kendetegnet 5 ved, at det indeholder en antifungalt virksom mængde af en forbindelse med den almene formel I ifølge krav 1 eller et salt eller en ester deraf som defineret i krav 1 som aktiv bestanddel i kombination med et farmaceutisk acceptabelt fast eller flydende bærestof.

11. Anvendelse af benanomicin A, benanomicin B, dexylosylbenanomicin B eller et salt eller en ester deraf som defineret i krav 1 til fremstilling af farmaceutiske præparater.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af dexylosylbena-15 nomicin B, kendetegnet ved, at benanomicin B omdannes kemisk til dexylosylbenanomicin B.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at xylosylgruppen spaltes fra benanomicin B enten ved sur hydrolyse, eller ved alkoholyse efterfulgt af behandling 20 med en basisk forbindelse.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den sure hydrolyse af benanomicin B gennemføres ved omsætning af en uorganisk eller organisk syre med benanomicin B i en vandig opløsning ved en temperatur på 25 60-110°C i 5-15 timer.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at alkoholysen af benanomicin B gennemføres ved opvarmning af en opløsning af benanomicin B i en lavalkanol, såsom methanol eller ethanol, i nærværelse af en uorganisk syre 30 ved en; temperatur på 60-120°C i 5-15 timer til dannelse af en ester (carboxylat) af dexylosylbenanomicin B med alkanolen, hvorpå den dannede ester af dexylosylbenano- 44 DK 170029 B1 micin B omsættes med et alkalimetalhydroxid eller -carbo-nat i en vandig opløsning til dannelse af dexylosylbenano-micin B.