DE69927306T2

DE69927306T2 - Antibakterielle Verbindungen

Info

Publication number: DE69927306T2
Application number: DE69927306T
Authority: DE
Inventors: Inukai Shinagawa-ku Masatoshi; Kaneko Shinagawa-ku Masakatsu; Takatsu Shinagawa-ku Toshio; Hotoda Shinagawa-ku Hitoshi; Arai Shinagawa-ku Masatoshi; Miyakoshi Shinagawa-ku Shunichi; Kizuka Shinagawa-ku Masaaki; Ogawa Shinagawa-ku Yasumasa
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sequella Inc
Priority date: 1998-07-09
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-07-10
Also published as: US20030069204A1; PT1095947E; DE69935513T2; NO20010105D0; EP1319406A1; HK1053127B; CN1317008A; EP1319666A1; RU2209210C2; DE69927306D1; HK1053063A1; CA2337225A1; BR9911965A; NZ509233A; HK1053127A1; PL200426B1; KR20010083101A; PL345403A1; KR100622889B1; ES2248654T3

Description

[Technisches Gebiet]
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formeln (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) und (XVI), die eine hervorragende antibiotische Wirksamkeit aufweisen, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine oben beschriebene Verbindung als aktiven Bestandteil, die bei der Behandlung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer oben beschriebenen Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (XI), (XII), (XIV) oder (XV).
[Hintergrund der Erfindung]
Ein β-Lactamantibiotikum, ein Aminoglycosid, Isoniazid oder Rifampicin sind herkömmlicherweise bei der Behandlung oder Prophylaxe mikrobieller Infektionen, einschließlich Tuberkuloserbazillen, eingesetzt worden. Seit kurzem gibt es viele Bakterien, die gegen diese Antibiotika resistent sind. Es ist wünschenswert, neue Verbindungen zu entwickeln, die antimikrobielle Mittel eines anderen Typs als herkömmliche antimikrobielle Mittel sind.
Andererseits ist bekannt, dass Capuramycin mit der unten gezeigten Formel eine Anti-Tuberkulosebazillusaktivität aufweist (J. Antibiotics, 29, (8), 1047-1053 (1986)).
Capuramycin
Es wurden nun in den Kultivierungsprodukten eines Mikroorganismus neue Verbindungen der Formeln (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) und (XVI) gefunden, die keinerlei Kreuzresistenz gegenüber herkömmlichen Arzneimitteln aufweisen. Wir haben Derivate der oben beschriebenen Verbindungen und Capuramycin hergestellt. Es wurde die physiologische Aktivität dieser Derivate für einige Jahre untersucht und gefunden, dass diese Derivate eine hervorragende antibiotische Wirksamkeit aufweisen.
Durch die erfindungsgemäßen Verbindungen kann ein Verfahren bereitgestellt werden, das bezüglich der Behandlung und Vorbeugung von Infektionserkrankungen wirksam ist, einschließlich solcher, die von gegenüber herkömmlichen Antibiotika resistenten Bakterien hervorgerufen werden. Die Verbindungen der Formeln (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) und (XVI) sind auch als Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit hervorragender antibiotischer Wirksamkeit geeignet.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine Verbindung bereitgestellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(i) Verbindung A-500359E der folgenden Formel (XI):
oder einem Salz davon;
(ii) Verbindung A-500359F der folgenden Formel (XII):
oder einem Salz davon;
(iii) einem Amidderivat von Verbindung A-500359F der folgenden Formel (XIII):
oder einem Salz davon;
(iv) einer Verbindung A-500359H der folgenden Formel (XIV):
oder einem Salz davon;
(v) Verbindung A-500359J der folgenden Formel (XV):
oder einem Salz davon; und
(vi) Verbindung A-500359M-3 der folgenden Formel (XVI):
oder einem Salz davon.

(2) ein Verfahren zur Herstellung der in (i), (ii), (iv) oder (v) beschriebenen Verbindungen durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der zur Herstellung dieser Verbindung in der Lage ist und zu Streptomyces spp. gehört, und Gewinnen der Verbindung aus der Kulturbrühe;
(3) ein Verfahren wie in (2) beschrieben, wobei der zu Streptomyces spp. gehörende Mikroorganismus, der zur Produktion der Verbindung in der Lage ist, Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) ist, und in der Lage ist, die in (i), (ii), (iii) oder (iv) beschriebenen Verbindungen zu produzieren;
(4) eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten, welche die in (i), (ii), (iii), (iv) (v) oder (vi) beschriebenen Verbindungen oder ein pharmakologisch akzeptables Salz davon als wirksamen Bestandteil enthält;
(5) die Verwendung der in (i), (ii), (iii), (iv), (v) oder (vi) beschriebenen Verbindungen oder eines pharmakologisch akzeptablen Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Infektionskrankheiten; und
(6) eine in (i), (ii), (iii), (iv), (v) oder (vi) beschriebene Verbindung oder ein pharmakologisch akzeptables Salz davon zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von bakteriellen Infektionen.

Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die durch eine der Formeln (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) und (XVI) dargestellt werden, werden in der Kulturbrühe von Streptomyces griseus Stamm SANK60196, der zu Streptomyces spp. gehört und aus Erde abgetrennt wurde, die vom Mt. Tsukuba/Igaraki-ken gesammelt wurde, hergestellt; oder werden durch mikrobielle Umwandlung beim Kultivierungsverfahren oder eine chemische Umwandlung bei dem Isolations- und Reinigungsverfahren hergestellt.
Verbindung A-500359E der Formel (XI), Verbindung A-500359F der Formel (XII), das Amidderivat der Verbindung A-500359F der Formel (XIII), Verbindung A-500359H der Formel (XIV), Verbindung A-500359J der Formel (XV) und Verbindung A-500359M-3 der Formel (XVI) der vorliegenden Erfindung enthalten jeweils asymmetrische Kohlenstoffatome und können daher jeweils als verschiedene optische Isomere vorliegen. In der vorliegenden Erfindung werden Isomere jeder der Verbindungen A-500359E, Verbindung A-500359F, des Amidderivats der Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 durch die gleiche Formel dargestellt, die vorliegende Erfindung umfasst aber sämtliche Isomere, einschließlich racemischer Verbindungen, und auch Gemische davon. Wenn ein stereospezifisches Syntheseverfahren eingesetzt wird oder eine optisch aktive Verbindung als Ausgangsverbindung verwendet wird, kann das Isomer der Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat der Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 direkt hergestellt werden, oder wenn diese in Form eines Gemischs hergestellt werden, kann jedes Isomer auf eine dem Fachmann bekannte Weise gewonnen werden.
Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 der vorliegenden Erfindung können jeweils durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren in das entsprechende Salz umgewandelt werden. Die vorliegende Erfindung umfasst solche Salze von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3. Es besteht keine besondere Beschränkung bezüglich der Natur des Salzes der Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3, vorausgesetzt dass es medizinisch eingesetzt wird und ein pharmakologisch akzeptables Salz ist. Wenn das Salz von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A- 500359J und Verbindung A-500359M-3 zu einem anderen Zweck als als Arzneimittel eingesetzt wird, zum Beispiel als Zwischenprodukt, besteht keine Beschränkung. Bevorzugte Beispiele eines solchen Salzes sind Alkimetallsalze wie ein Natriumsalz, Kaliumsalz oder Lithiumsalz, Erdalkalimetallsalze wie ein Calciumsalz oder Magnesiumsalz, Metallsalze wie ein Aluminiumsalz, Eisensalz, Zinksalz, Kupfersalz, Nickelsalz oder Cobaltsalz, anorganische Salze wie Ammoniumsalz, organische Aminsalze wie t-Octylaminsalz, Dibenzylaminsalz, Morpholinsalz, Glucosaminsalz, ein Phenylglycinalkylestersalz, ein Ethylendiaminsalz, ein N-Methylglucaminsalz, ein Guanidinsalz, Diethylaminsalz, Triethylaminsalz, Dicyclohexylaminsalz, N,N'-Dibenzylethylendiaminsalz, Chlorprocainsalz, ein Procainsalz, ein Diethanolaminsalz, ein N-benzylphenethylaminsalz, Piperazinsalz und ein Tetramethylammoniumsalz oder ein Tris(hydroxymethyl)aminomethansalz, sowie Aminosäuresalze wie ein Glycinsalz, Lysinsalz, Argininsalz, Ornithinsalz oder ein Asparaginsalz. Bevorzugter sind Salze, die bevorzugt als pharmakologisch akzeptable Salze einsetzbar sind, wie beispielsweise ein Natriumsalz, Kaliumsalz und ein Ammoniumsalz.
Die Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat der Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 der vorliegenden Erfindung und Salze davon können jeweils als Solvat vorliegen. Wenn diese beispielsweise an der Luft stehen gelassen werden oder umkristallisiert werden, wird Wasser durch Absorption adsorbiert, oder es kann sich ein Hydrat bilden. Ein solches Solvat ist auch durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 der vorliegenden Erfindung, die durch die Formeln (XI), (XII), (XIV), (XV) und (XVI) dargestellt werden, sind durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, der zu Streptomyces spp. gehört, und Gewinnen aus der Kulturbrühe erhältlich. Der Streptomyces griseus Stamm-SANK60196 (der im Folgenden "Stamm SANK60196" genannt wird), der als zur Erzeugung von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 befähigter Mikroorganismus bevorzugt ist, wird wie oben beschrieben auf herkömmliche Weise aus der Erde des Mt. Ttsukubasan/Ibaraki-Präfektur gewonnen und isoliert. Der Stamm SANK60196 weist die folgenden biologischen Merkmale auf.
Mycologische Eigenschaften des Stammes SANK60196 sind wie folgt:
1) Morphologisches Erscheinungsbild
Stamm SANK60196 zeigte nach Kultivierung bei 28°C für 14 Tage auf einem durch das International Streptomyces Project (im Nachfolgenden abgekürzt als "ISP") [siehe Shirling, E.B. und Gottlieb, D., "Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340 (1996)"] spezifizierten Medium das unten beschriebene morphologische Erscheinungsbild. Die Beobachtung durch ein Lichtmikroskop zeigt, dass Substratmycelien von SANK60196 bevorzugt wachsen und sich verzweigen und eine gelblich-graue, gelblich-braune oder hell-olive Färbung zeigten, jedoch im Unterschied zu dem zu Nocardia spp. gehörenden Stamm keine Teilung oder Zick-zack-Ausdehnung aufwiesen. Luftmycelien weisen eine einfache Verzweigung auf. Die Form der Sporenkette ist gerade oder gekrümmt, wobei die Kette aus 10 bis 50 oder mehr Sporen gebildet wird. Die Beobachtung durch ein Scanning-Elektronenmikroskop zeigt, dass die Spore eine ovale Form und eine glatte Oberflächenstruktur aufweist. Die Spore hat eine Ausdehnung von 0,6-0,8 × 0,7-1,2 mm. Die Spore wird nur auf den Luftmycelien gebildet. Eine Sporangienbildung, axiale Teilung der Luftmycelien, Abspaltung der Luftmycelien und Sklerotien wurden nicht erkannt.
2) Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien
Die Wachstumseigenschaften des Stamms SANK60196 auf einem Agarmedium nach Kultivierung bei 28°C für 14 Tage ist unten in Tabelle 3 beschrieben. In der Tabelle ist die Zusammensetzung des mit der ISP-Nummer versehenen Mediums die gleiche, wie durch ISP spezifiziert. Bei diesem Punkt stehen die Abkürzungen G, AM, R und SP für Wachstum, Luftmycelien, Rückfärbungen und lösliches Pigment. Der Farbton wird gemäß "Colour Standards, ed. by Japan Colour Laboratory" beschrieben. Die Farbtonangabe in Klammern ist eine Farbzahl gemäß dem Munsell Farbsystem. Das hell-gelbe lösliche Pigment, das in einem Wasser-Agar-Medium erzeugt wird, ändert sich durch 0,05N Chlorwasserstoffsäure zu farblos, zeigt aber keine Änderung bei 0,05N Natriumhydroxid.
[Tabelle 3]

Mediumnatur;
Punkt: Eigenschaften
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 2);
G: Hervorragend, flach, gelblich braun (10YR 5/6)
AM: Reichlich gebildet, samtig, hell-braun (2.5Y 8/2)
R: Gelblich braun (10YR 5/8)
SP: Gelblich braun (10YR 6/8)
Hafermehl-Agar (ISP 3);
G: Hervorragend, flach, gelblich braun (2.5Y 6/6)
AM: Reichlich gebildet, samtig, schwach gelblich orange (5Y 9/2)
R: Dunkel gelb (2.5Y 8/8)
SP: Nicht erzeugt
Stärke-anorganisches Salz-Agar (ISP 4);
G: Gut, flach, gelblich braun (2.5Y 6/4)
AM: Reichlich gebildet, samtig, gelblich grau (7.5Y 9/2)
R: Gelblich braun (2.5Y 6/4)
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP 5);
G: Hervorragend, flach, schwach gelblich braun (2.5Y 7/6)
AM: Reichlich gebildet, samtig, gelblich grau (5Y 8/2)
R: Schwach gelblich braun (2.5Y 8/6)
SP: Nicht erzeugt
Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6);
G: Hervorragend, flach, hell-olive Farbe (5Y 8/3)
AM: Schwach erzeugt, samtig, gelblich grau (5Y 9/1)
R: Hell gelb (5Y 8/6)
SP: Nicht erzeugt
Tyrosin-Agar (ISP 7);
G: Gut, flach, gräulich gelb-braun (2.5Y 5/4)
AM: Reichlich gebildet, samtig, schwach oliv grau (7.5Y 8/2)
R: Gelblich braun (10YR 5/4)
SP: Gräulich gelb braun (2.5Y 4/3)
Saccharose-Nitrat-Agar;
G: Nicht so gut, flach, hell-gelb (5Y 8/6)
AM: Reichlich gebildet, samtig, schwach oliv grau (7.5Y 8/2)
R: Dunkel-gelb (5Y 8/8)
SP: Hell-gelb (5Y 9/6)
Glucose-Asparagin-Agar;
G: Gut, flach, hell-gelb (5Y 9/3)
AM: Nicht so gut, samtig, gelblich grau (5Y 9/1)
R: Gelblich grau (7.5Y 9/3)
SP: Nicht erzeugt
Nährstoff-Agar (Produkt von Difco Laboratories);
G: Gut, flach, hell gelblich braun (2.5Y 8/3)
AM: Gut, samtig, gelblich grau (5Y 9/1)
R: Gelblich grau (5Y 9/4)
SP: Nicht erzeugt
Kartoffelextrakt-Karottenextrakt-Agar;
G: Nicht so gut, flach, gelblich grau (7.5Y 9/2)
AM: Nicht so gut, samtig, gelblich grau (5Y 9/2)
R: Gelblich grau (7.5Y 9/3)
SP: Gelblich grau (7.5Y 9/3)
Wasser-Agar;
G: Nicht gut, flach, gelblich grau (5Y 9/1)
AM: Nicht gut, samtig, gelblich grau (5ZY 9/1)
R: Gelblich grau (7,5Y 9/4)
SP: Schwach gelb (5Y 9/6)

3) Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften des für 2 bis 21 Tage nach Kultivierung bei 28°C beobachteten Stamms sind in Tabelle 4 gezeigt. In der Tabelle ist Medium 1 ein Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium (ISP 2).
[Tabelle 4]
Die Verwertung einer Kohlenstoffquelle durch den Stamm SANK60196, beobachtet nach Kultivierung bei 28°C für 14 Tage auf einem Pridham-Gottlieb-Agarmedium (ISP 9) ist in Tabelle 5 beschrieben. In der Tabelle bedeutet "+" verwertbar, während "–" nicht verwertbar bedeutet. [Tabelle 5]

D-Glucose +

L-Arabinose –

D-Xylose +

Inositol –

D-Mannitol +

D-Fructose +

L-Rhamnose –

Saccharose –

Raffinose –

Kontrolle –
4) Chemotaxonomische Eigenschaften
Die Zellwand des vorliegenden Stamms wurde gemäß dem Verfahren von Hasegawa, et al. [siehe Hasegawa, T., et al., "The Journal of General and Applied Microbiology", 29, 319-322 (1983)] untersucht, was zur Detektion von LL-Diaminopimelinsäure führte. Die Hauptzuckerkomponenten in den gesamten Zellen des vorliegenden Stamms wurde gemäß dem Verfahren von M.P. Lechevalier untersucht [siehe Lechevalier, M.P., "Journal of Laboratory and Clinical Medicine", 71, 934-944 (1968)]. Als Ergebnis wurde keine charakteristische Komponente detektiert.
Die oben beschriebenen mycologischen Eigenschaften zeigten, dass der vorliegende Stamm zu Streptomyces spp. unter den Actinomyceten gehört. Es wurde klar gemacht, dass der vorliegende Stamm ausgeprägt mit Streptomyces griseus verwandt ist, als Ergebnis eines Vergleichs mit dem in den ISP-Stämmen von Shirling und Gottlieb beschriebenen Mikroorganismus [siehe Shirling, E.B. und Gottlieb, D., "International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 68-189 und 279-392 (1968); 19, 391-512 (1969); 22, 265-394 (1972)"], dem in "The actinomycetes Vol. 2", geschrieben von Waksman, beschriebenen Mikroorganismus [siehe Waksman, S.A. "The actinomycetes 2 (1961)], mit dem in Bergey's Manual, herausgegeben von Buchanan und Gibbons, beschriebenen Mikroorganismus [siehe R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", B. Ausgabe (1974)], mit dem in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", herausgegeben von Williams, beschriebenen Mikroorganismus [siehe Williams, S.T., et al., "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 4 (1989)"] und mit dem in der jüngeren Literatur über Actinomyceten, die zu Streptomyces spp. gehören, beschriebenen Mikroorganismus. Er wurde jedoch als von Streptomyces griseus verschieden erkannt, da er ein gelblich graues lösliches Pigment auf einem Glycerin-Asparagin-Agarmedium und ein hell gelblich braunes lösliches Pigment auf einem Pepton-Hefeextrakt-Eisen- Agarmedium erzeugt, ein lösliches Pigment aber weder auf einem Kartoffelextrakt-Karottenextrakt-Agarmedium noch auf einem Wasser-Agarmedium erzeugt. Die maximale Wachstumstemperatur ist 40°C, und er wächst in Gegenwart von 7% Salz.
Der vorliegende Stamm mit diesen mycologischen Eigenschaften wird als neuer Stamm angesehen, der von Streptomyces griseus verschieden ist, es ist aber nicht möglich, diese nur aufgrund der oben beschriebenen Unterschiede zu unterscheiden. Die vorliegenden Erfinder haben den vorliegenden Stamm als Streptomyces griseus SANK60196 identifiziert.
Dieser Stamm wurde international bei der Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan) am 22. Februar 1996 mit der Zugangsnummer FERM BP-5420 hinterlegt.
Die verschiedenen Eigenschaften von Actinomyceten, die zu Streptomyces spp. gehören, wie der Stamm SANK60196, sind nicht stabil, sondern wie gut bekannt ist, ändern sich diese leicht auf natürliche Weise oder künstlich. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Stämme enthalten sämtliche solcher Varianten. Die vorliegenden Erfindung umfasst sämtliche Stämme, die zu Streptomyces spp. gehören und zur Herstellung von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J oder Verbindung A-500359M-3 befähigt sind.
Jedes synthetische oder natürliche Medium ist als Medium zur Kultivierung der zur Produktion von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J oder Verbindung A-500359M-3 befähigten Mikroorganismen verwendbar, solange es eine Quelle enthält, die aus Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Quellen anorganischer Ionen und organischer Nährstoffe ausgewählt ist, wie erforderlich enthält.
Beispiele der hier verwendbaren Nährstoffquelle schließen bekannte Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze ein, die herkömmlicherweise zur Kultivierung eines mycotischen- oder Actinomyceten-Stamms verwendet werden und durch Mikroorganismen verwertbar sind.
Spezifische Beispiele der Kohlenstoffquelle sind Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannitol, Glycerol, Dextrin, Hafer, Roggen, Maisstärke, Kartoffeln, Maismehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenöl, klebriger (glutinöser) Malzsirup, Sirup, Sojabohnenöl, Zitronensäure und Weinsäure. Diese können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die Menge der zuzugebenden Kohlenstoffquelle variiert üblicherweise in einem Bereich von 1 bis 10 Gew.-% der Menge des Mediums, ist aber nicht darauf beschränkt.
Eine ein Protein oder ein Hydrolysat davon enthaltende Substanz wird allgemein als Stickstoffquelle eingesetzt. Bevorzugte Beispiele der Stickstoffquelle sind Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Erdnussmehl, Baumwollsamenmehl, entrahmte Milch, Caseinhydrolysat, Pharmamin (Produkt von Sheffield Chemical), Fischmehl, Corn Steep Liquor, Pepton, Fleischextrakt, komprimierte Hefe, Trockenhefe, Hefeextrakt, Malzextrakt, Kartoffeln, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat. Es ist bevorzugt, die oben beispielhaft erwähnten Stickstoffquellen einzeln oder in Kombination in einem Anteil von 0,2 bis 6 Gew.-% der Menge des Mediums zu verwenden.
Ein gewöhnlich eingesetztes Salz, das ein Ion wie Sodium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid oder Carbonat enthält, kann als anorganisches Nährstoffsalz verwendet werden. Weiterhin können Spuren von Metallen wie bspw.
Kalium, Calcium, Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium eingesetzt werden.
Die Zugabe von Cobalt, entrahmter Milch oder Hefeextrakt ist besonders wirksam bei der Herstellung von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H oder Verbindung A-500359J.
Beim/nach dem Kultivieren des Mikroorganismus kann ein Inhibitor der Antibiotikabiosynthese zugegeben werden, um die Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F und Verbindung A-500359H herzustellen. Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F und Verbindung A-500359H können jeweils beispielsweise hergestellt werden, indem S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder ein Salz davon, welches ein Aspartasekinaseinhibitor ist, einzeln oder in Kombination mit Cobalt, entrahmter Milch und Hefeextrakt als Mediumzusatz verwendet werden. Beispielsweise verbessert die Verwendung des oben beschriebenen Additivs in Kombination mit entrahmter Milch die Produktivität von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F und Verbindung A-500359H. Das Additiv kann so zugebenen werden, dass dessen Endkonzentration von 1 bis 100mM reicht. Für die Herstellung von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F und Verbindung A-500359H ist eine Endkonzentration von 10mM bevorzugt.
Die Verwendung des oben beschriebenen Additivs in Kombination mit einer Aminosäure oder einem Salz davon ermöglicht es, nützliche Verbindungen herzustellen, die mit Verbindung A-500359F und Verbindung A-500359H verwandt sind. Insbesondere ist durch Verwendung in Kombination mit L-Allylglycin oder einem Salz davon Verbindung A-500359M-3 (XVI) erhältlich. Das L-Allylglycin kann mit einer Endkonzentration im Bereich von 1 bis 100 mM zugegeben werden. Bei der Endkonzentration von 10 mM kann Substanz A-500359M-3 bevorzugt hergestellt werden.
Bei Flüssigkultivierung kann ein Antischäumungsmittel wie Siliconöl, Pflanzenöl, ein oberflächenaktives Mittel oder dergleichen verwendet werden.
Das Medium zur Kultivierung des Stamms SANK60196 zur Herstellung der Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H oder Verbindung A-500359J weist bevorzugt einen pH von 5,0 bis 8,0 auf.
Obwohl die Temperatur, die ein Wachstum von Stamm SANK60196 erlaubt, von 12 bis 36°C erreicht, wird der Stamm bevorzugt bei 18 bis 28°C kultiviert, bevorzugter bei 19 bis 23°C, um Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H und Verbindung A-500359 J herzustellen.
Um Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F und Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 zu erhalten, kann eine aerobe Kultur von Stamm SANK60196 verwendet werden. Beispiele eines solchen Kultivierungsverfahren beinhalten üblicherweise eingesetzte aerobe Kulturen wie eine feste Kultur, eine Schüttelkultur und eine Lüftungsrüttelkultur.
Für eine Kultivierung im kleinen Maßstab ist eine Schüttelkultur für einige Tage bei 19 bis 23°C bevorzugt. Die Kultivierung wird gestartet, indem eine Stufe einer Impfkultur in einem ersten oder zweiten Stufenverfahren in einem "baffled Erlenmeyerkolben" (ausgestattet mit einer Wasserströmungseinstellwand) oder einem gewöhnlich eingesetzten Erlenmeyerkolben gezüchtet wird. Eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle können in Kombination als Medium in der Impfkultur verwendet werden. Der Impfkulturkolben kann bei 19 bis 23°C für 5 Tage in einem thermostatischen Inkubator geschüttelt werden, oder geschüttelt werden, bis die Impfkultur ausreichend wächst. Die so gezüchtete Impfkultur wird zur Animpfung des zweiten Impfkulturmediums oder eines Produktionsmediums verwendet. Wenn die Impfkulturen in einem Zwischenwachstumsschritt verwendet werden, werden sie auf ähnliche Weise wachsen gelassen, gefolgt von einer teilweisen Animpfung in ein Produktionsmedium. Der Kolben, in den die Impfungen eingeimpft wurden, wird einer Kultivierung unter Schütteln bei einer konstanten Temperatur für einige Tage unterzogen, und nach Beendigung der Kultivierung wird das Kulturmedium in dem Kolben zentrifugiert oder filtriert.
Für eine Kultivierung im großen Maßstab ist andererseits die Verwendung eines Gefäßfermenters oder -behälters, der mit einem Rührer und einer Belüftungsvorrichtung ausgestattet ist, bevorzugt. Vor Kultivierung in einem solchen Behälter wird ein Nährmedium zur Sterilisierung auf 121 bis 130°C erhitzt. Nach Abkühlen werden die Impfkulturen, die im Voraus durch das oben beschriebene Verfahren gezüchtet wurden, auf das sterilisierte Medium geimpft. Danach wird die Kultivierung unter Belüftung und Rühren bei 19 bis 23°C durchgeführt. Dieses Verfahren ist zur Herstellung einer großen Menge von Verbindungen geeignet.
Verbindung A-500359E, A-500359F oder A-500359H können auch durch Zugabe einer wässrigen Lösung von S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder eines Salzes davon, das zuvor steril filtriert wurde, als Aspartatkinaseinhibitor, bei Beginn oder während der Kultivierung zu dem sterilisierten Medium hergestellt werden.
Verbindung A-500359M-3 kann hergestellt werden, indem separat oder gleichzeitig eine wässrige Lösung von S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder einem Salz davon oder von L-Allylglycin oder einem Salz davon, die im Voraus steril filtriert wurden, bei Beginn oder während der Kultivierung zu dem sterilisierten Medium gegeben wird.
Das Kultivierungsprodukt von Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 kann bestimmt werden, indem ein Teil der Kulturbrühe einer HLPC-Analyse unterzogen wird. Der Titer von Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 erreicht üblicherweise in 3 bis 15 Tagen einen Peak.
Nach Beendigung der Kultivierung wird der Zellbestandteil von der Kulturbrühe durch Filtration unter Zuhilfenahme von Diatomeenerde oder Zentrifugation abgetrennt, und im Filtrat oder dem Überstand vorliegende Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 wird gereinigt, indem deren physiko-chemische Eigenschaften mit HPLC durch analytische Daten als Index verwendet werden. Als Diatomeenerde ist "Celite 545" (Produkt von Celite Corporation) bevorzugt. Im Filtrat vorliegende Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 können durch Verwendung von Adsorptionsmitteln einzeln oder in Kombination, beispielsweise Aktivkohle oder ein adsorbierendes Harz wie "Amberlite XAD-2 oder XAD-4" (Produkt von Rohm & Haas) und "Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P, HP-50 oder SP207" (jeweils ein Produkt von Mitsubishi Chemical), gereinigt werden. Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 können von Verunreinigungen durch Führen einer Lösung, die Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 enthält, durch die Schicht eines solchen Adsorptionsmittels wie oben beschrieben und Entfernen der daran adsorbierten Verunreinigungen aus der Lösung abgetrennt werden; oder durch Eluieren der adsorbierten Verbindung A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J und A-500359M-3 mit wässrigem Methanol, wässrigem Aceton, wässrigem n-Butanol, wässrigem Ammoniak, Ammoniak-haltigem wässrigen Methanol oder Ammoniak-haltigem wässrigen Aceton. Wenn eine Ammoniak-enthaltende Lösung als Elutionsmittel eingesetzt wird, wird das Amidderivat von Verbindung A-500359F bei Elution auf der Säule oder Aufkonzentrierung erzeugt.
Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3, die so erhalten wurden, können durch Adsorptionssäulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel "Florisil", "Cosmosil" (Produkt von Nacalai Tesque) oder "Diaion CHP-20P oder SP207" (Produkt von Mitsubishi Chemical) gereinigt werden; Gelfiltrationschromatographie mit "Sephadex G-10" (Produkt von Pharmacia Biotech) oder "Toyopearl HW40F" (Produkt von TOSOH Corporation); Anionenaustauschchromatographie mit "Dowex 1 oder SBR-P" (Produkt von Dow Chemical) oder "Diaion PA316" (Produkt von Mitsubishi Chemical); Normalphasen- und Umkehrphasen-HPLC oder dergleichen.
Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 der vorliegenden Erfindung können durch Verwendung der oben beispielhaft aufgeführten Abtrennungs- oder Reinigungsmaßnahmen einzeln oder in Kombination nach Bedarf abgetrennt und gereinigt werden, oder in einigen Fällen, indem eine dieser Maßnahmen wiederholt wird.
Verbindung A-500359F kann durch Hydrolyse von Verbindung A-500359E erhalten werden. Eine Hydrolyse wird beispielsweise unter basischen Bedingungen durchgeführt, bevorzugt in wässriger basischer Lösung.
Beispiele der für die Hydrolyse einsetzbaren basischen Verbindung sind Alkalimetallhydroxide und Salze schwacher Säuren davon wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Natriumacetat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat und Natriumbicarbonat; Erdalkalimetallhydroxide und Salze schwacher Säuren davon wie Calciumhydroxid, Magnesiumhydroxid und Magnesiumacetat; anorganische basische Verbindungen und basische Salze davon wie Ammoniak; organische Amine und basische Salze davon wie t-Octylamin, Dibenzylamin, Morpholin, Glucosamin, Phenylglycinalkylester, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, Guanidin, Diethylamin, Triethylamin, Dicyclohexylamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chloroprocain, Procain, Diethanolamin, N-Benzylphenethylamin, Piperazin, Tetramethylammoniak und Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Es kann auch ein basischer Puffer verwendet werden, der ein Alkalimetallion, ein Erdalkalimetallion, ein anorganisches Ion wie Ammoniak oder ein organisches Aminion der oben beispielhaft erwähnten basischen Verbindungen enthält. Hierunter sind Alkalimetallhydroxide bevorzugt, wobei Natriumhydroxid besonders bevorzugt ist. Insbesondere kann durch Hydrolyse von Verbindung A-500359E unter Verwendung von Natriumhydroxid leicht Verbindung A-500359F hergestellt werden.
Die Konzentration der in der oben beschriebenen Reaktion verwendeten basischen Verbindung reicht bevorzugt von 0,001 bis 1N, bevorzugter 0,3 bis 0,1N. Die Reaktionstemperatur beträgt bevorzugt –20 bis 40°C, bevorzugter 0 bis 30°C. Die Reaktionszeit beträgt bevorzugt 30 Sekunden bis 15 Stunden, bevorzugter 30 Minuten bis 2 Stunden.
Die Verwendung von wässrigem Ammoniak als Base erzeugt das Amidderivat von Verbindung A-500359F zusammen mit Verbindung A-500359F, diese Verbindungen können aber durch das oben beschriebene Verfahren getrennt und gereinigt werden.
Das Amidderivat von Verbindung A-500359F kann durch Umsetzung von Verbindung A-500359E mit Ammoniak in einem Lösungsmittel hergestellt werden.
Beispiele des Lösungsmittels sind Wasser und Alkohol wie Ethanol und Methanol, worunter Wasser und Methanol bevorzugt sind.
Gasförmiger Ammoniak kann in die Lösung der Verbindung eingeführt werden, eine Lösung von Ammoniak in Wasser oder in Alkohol wie Methanol oder Ethanol wird aber üblicherweise verwendet. Bevorzugt wird eine wässrige oder methanolische Lösung eingesetzt.
Wenn wässriger Ammoniak eingesetzt wird, reicht dessen Konzentration bevorzugt von 0,1 bis 1N, bevorzugter 0,3 bis 0,7N. Die Reaktionstemperatur beträgt bevorzugt –20 bis 40°C, bevorzugter 0 bis 30°C. Die Reaktionszeit beträgt bevorzugt 30 Minuten bis 15 Stunden, bevorzugter 1 bis 4 Stunden.
Wenn wässriger Ammoniak verwendet wird, wird zusätzlich zum gewünschten Amidderivat der Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359F durch Hydrolyse des Esters gebildet. Diese Verbindungen können jedoch durch die oben beschriebenen Verfahren abgetrennt und gereinigt werden.
Das Amidderivat der Verbindung A-500359F kann auch durch Umsetzung von Verbindung A-500359F mit einem Methylierungsmittel in einem Lösungsmittel gebildet werden, wodurch es in das Methylesterderivat umgewandelt wird, d.h. Verbindung A-500359E, und dann die erhaltene Verbindung wie oben beschrieben mit Ammoniak umgesetzt wird.
Beispiele des Methylierungsreagenz sind Diazomethan und Dimethylschwefelsäure, wobei Diazomethan bevorzugt ist. Das Methylierungsreagenz für die Umwandlung von Verbindung A-500359F in Verbindung A-500359E wird bevorzugt in einer Menge von 1 bis 5 Äquivalenten, bevorzugt 1,5 bis 2 Äquivalenten, zugegeben.
Beispiele des für die obige Reaktion einsetzbaren Lösungsmittels sind Wasser und Alkohole wie Methanol und Ethanol, wobei Wasser und Methanol bevorzugt sind.
Die Reaktionstemperatur beträgt bevorzugt –20 bis 40°C, bevorzugter 0 bis 30°C. Die Reaktionszeit beträgt bevorzugt 30 Minuten bis 15 Stunden, bevorzugter 1 bis 2 Stunden.
Nach Beendigung der Reaktion können Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359E und das Amidderivat von Verbindung A-500359F aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, durch Maßnahmen, die nach Bedarf aus den oben beschriebenen Maßnahmen bei den Abtrennung- und Reinigungsmaßnahmen für Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 beschrieben wurden.
Typische Herstellungsverfahren für Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 wurden oben beschrieben, die Herstellungsverfahren sind aber nicht darauf beschränkt, und es können andere dem Fachmann bekannte Verfahren ebenfalls eingesetzt werden.
Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, das Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 der vorliegenden Erfindung, die so erhältlich sind, sind neue Verbindungen, die in der Literatur noch nicht beschrieben wurden. Deren wachstumshemmende Aktivität gegen allgemein grampositive Bakterien oder gramnegative Bakterien kann durch das Disk-Assay-Verfahren unter Verwendung von normalem Agarmedium (Produkt von Eiken Chemical) oder Herzinfusions-Agarmedium (Produkt von Difco Laboratories) bestimmt werden. Die wachstumshemmende Wirkung gegen Mycobakterien, grampositive Bakterien, die zu Actinomycetales gehören, kann ähnlich auf dem oben beschriebenen Medium bestimmt werden, zu dem weiterhin Glycerin zugegeben wurde.
Typische Evaluierungsverfahren der biologischen Aktivität von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, dem Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J und Verbindung A-500359M-3 wurden bisher beschrieben, das Evaluierungsverfahren ist jedoch nicht darauf eingeschränkt, sondern es können auch andere Evaluierungsverfahren, die dem Fachmann bereits bekannt sind, eingesetzt werden.
Die Verbindungen in der vorliegenden Erfindung oder pharmakologisch akzeptable Salze davon können auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Beispiele sind die orale Verabreichung unter Verwendung von Tabletten, Kapseln, Granulaten, Pulvern, Sirupen oder dergleichen; sowie die parenterale Verabreichung unter Verwendung von Injektionen (intravenös, intramuskular oder subkutan), Tropfen, Zäpfchen oder dergleichen. Diese Formulierungen können auf herkömmliche Weise hergestellt werden, indem zu einem Arzneimittel üblicherweise eingesetzte, auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungstechnik bekannte Träger wie Excipienten (Arzneimittelträger), Bindemittel, Desintegrationsmittel, Schmiermittel, ein Corrigens, ein Hilfsstoff zur Solubilisierung, Suspendiermittel, Beschichtungsmittel und/oder dergleichen gegeben werden.
Zur Bildung von Tabletten können verschiedene auf diesem Gebiet bekannte Träger eingesetzt werden. Beispiele sind Excipienten wie Lactose, Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Calciumcarbonat, Kaolin, kristalline Cellulose und Kieselsäure; Bindemittel wie Wasser, Ethanol, Propanol, einfacher Sirup, Glucoselösung, Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Schellack, Methylcellulose, Kaliumphosphat und Polyvinylpyrrolidon; Desintegrationsmittel wie trockene Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Laminaranpulver, Natriumbicarbonat, Calciumcarbonat, Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester, Natriumlaurylsulfat, Stearinmonoglycerid, Stärke und Lactose; Desintegrationsunterdrückungsmittel wie Saccharose, Stearin, Kakaobutter und hydriertes Öl; Adsorptionserleichterer wie quaternäre Ammoniumsalze wie Natriumlaurylsulfat; Feuchthaltemittel wie Glycerin und Stärke; Adsorptionsmittel wie Stärke, Lactose, Kaolin, Bentonit und kolloidale Kieselsäure; sowie Schmiermittel wie gereinigter Talk, Stearate, Borsäurepulver und Polyethylenglykol. Tabletten können als solche bei Bedarf mit einer üblichen Beschichtung gebildet werden, wie bspw. zuckerbeschichtete Tabletten, Gelatine-umhüllte Tabletten, magensaftresistente Tabletten bzw. mit einem im Darm löslichen Überzug versehene Tabletten, filmbeschichtete Tabletten oder Doppelschicht- oder Mehrfachschicht-Tabletten.
Zur Bildung von Pillen können verschiedene auf diesem Gebiet bekannte Träger verwendet werden. Beispiele sind Excipienten wie Glucose, Lactose, Kakaobutter, Stärke, gehärtetes Pflanzenöl, Kaolin und Talk; Bindemittel wie Gummiarabikumpulver, Tragacanthpulver, Gelatine und Ethanol; sowie Desintegrationsmittel wie Laminaran-Agar.
Zur Bildung von Zäpfchen können verschiedene auf diesem Gebiet herkömmlicherweise bekannte Träger eingesetzt werden. Beispiele sind Polyethylenglycol, Kakaobutter, höhere Alkohole und Ester davon, Gelatine und semi-synthetische Glyceride.
Zur Formulierung von Injektionen ist es bevorzugt, dass Lösungen oder Suspensionen sterilisiert werden und diese zu Blut isotonisch gemacht werden. Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen können unter Verwendung irgendeines Verdünnungsmittels, das herkömmlicherweise auf diesem Gebiet verwendet wird, gebildet werden. Beispiele sind Wasser, Ethanol, Propylenglycol, ethoxylierter Isostearylalkohol, polyoxylierter Isostearylalkohol und Polyoxyethylensorbitanester von Fettsäuren. Es ist auch möglich, in eine pharmazeutische Zubereitung Salz, Glucose oder Glycerin in einer ausreichenden Menge zur Herstellung einer isotonischen Lösung einzubeziehen, oder ein herkömmlicherweise eingesetztes Hilfsmittel zur Solubilisierung, ein Puffer, ein Schmerzmittel und/oder dergleichen zuzugeben.
Wenn nötig, können ein Farbstoff, Konservierungsstoff, Geschmackstoff, Süßstoff oder andere Arzneimittel einbezogen werden.
Es gibt keine besondere Einschränkung bezüglich des Gehalts der Verbindung, die als wirksamer Bestandteil in die oben beschriebene pharmazeutische Zubereitung einbezogen wird. Dieser kann geeigneterweise aus einem breiten Bereich gewählt werden. Im Allgemeinen ist ein Gehalt von 1 bis 70 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 30 Gew.-%, in der Gesamtzusammensetzung wünschenswert.
Es gibt keine besondere Einschränkung bezüglich des Verabreichungsverfahrens der oben beschriebenen pharmazeutischen Zubereitung, und dieses wird in Abhängigkeit der Dosierungsform oder des Alters, Geschlechts oder anderen Zuständen des Patienten, dem etwas verabreicht werden soll, oder der Schwere der Krankheit des Patienten festgelegt. Beispielsweise werden Tabletten, Pillen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate oder Kapseln oral verabreicht. Injektionen werden intravenös entweder einzeln oder als Gemisch mit einem üblicherweise eingesetzten Fluidersatz wie Glucose oder Aminosäure verabreicht. Wenn nötig, werden sie einzeln intramuskulär, subkutan, intrakutan oder intraperitoneal verabreicht. Ein Zäpfchen wird rektal verabreicht.
Obwohl die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung von den Zuständen, dem Alter und dem Gewicht des Patienten, dem Verabreichungsweg oder der Dosierungsform abhängt, reicht die tägliche Dosis üblicherweise von 2.000 mg (vorzugsweise 100 mg) als Obergrenze bis 0,1 mg (vorzugsweise 1 mg, bevorzugter 10 mg) als Untergrenze bei einem Erwachsenen. Sie kann einmal oder in mehreren Portionen am Tag gemäß den Zuständen verabreicht werden.
[Beste Ausführungsform der Erfindung]
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele, Versuche und Formulierungsbeispiele beschrieben. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf oder hierdurch beschränkt ist.
Beispiel 43
Kultivierung von Streptomyces griseus-Stamm SANK60196 (FERM BP-5420)
In jeden von vier 2 l Erlenmeyerkolben (Impfkolben), die jeweils 500 ml der unten beschriebenen Impfkulturmediums enthielten, wurden aseptisch 4 Loops des Stamms SANK60196 geimpft, gefolgt von einem Schütteln in einem Rotationsschüttler bei 23°C und 210 UpM, und die Impfkultur wurde so 3 Tage fortgeführt.
Medium für die Impfkultur: enthaltend die folgenden Bestandteile in 1.000 ml Leitungswasser:

Maltose 30 g

Fleischextrakt 5 g

Polypepton 5 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 3 g

Antischäumungsmittel "CB442" (Produkt von NOF Corporation) 50 mg
Nach Einstellung des pH auf 7,4 wurde eine Sterilisierung bei 121°C für 30 Minuten durchgeführt.
Eine Kultivierung wurde wie unten beschrieben durchgeführt. Genau beschrieben, wurde die Impfkultur bei 3% (Volumen/Volumen: was im Folgenden als "v/v" abgekürzt wird) in zwei 30 l-Gefäßfermenter geimpft, die jeweils 15 l eines Kultivierungsmediums enthielten. 6 Stunden nach Beginn der Kultivierung bei 23°C wurde filtersterilisiertes S-(2-Aminoethyl)-L-cysteinhydrochlorid zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten, gefolgt von einer Kultivierung unter Belüftung und Rühren/Schütteln von 6 Tagen.

Kultivierungsmedium: Enthaltend folgende Bestandteile in 1000 ml Leitungswasser:

Maltose	30 g
Hefeextrakt (Produkt von Difco Laboratories)	5 g
Fleischextrakt	5 g
Polypepton	5 g
Natrimchlorid	5 g
Calciumcarbonat	3 g
Antischäumungsmittel "CB442" (Produkt von NOF Corporation)	50 mg

Nach Einstellung des pH auf 7,4 wurde eine Sterilisierung bei 125°C für 30 Minuten durchgeführt.
Beispiel 44
Reinigung von Verbindung A-500359E
Die in Beispiel 43 erhaltene Kulturbrühe (30 l) wurde mit Hilfe von "Celite 545" (Produkt von Celite Corporation) filtriert.
Nach Reinigung wie nachfolgend beschrieben, wurde die aktive Fraktion mit Hilfe von HPLC unter Verwendung der unten beschriebenen Säule und Analysebedingungen beobachtet.
Säule: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel: 0,04 flüssige Trifluoressigsäure, enthaltend 4% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/Min
Detektion: UV 210 nm
Retentionszeit: 21,2 Minuten
30 l des erhaltenen Filtrats wurden auf eine Säule (6 l), gepackt mit "Diaion HP-20" (Produkt von Mitsubishi Chemical), geladen. Nach Waschen der Säulen mit 12 l entionisiertem Wasser wurden die nicht-adsorbierte Fraktion und die Waschfraktion vereinigt (die vereinigte Fraktion wird im Nachfolgenden "nicht-adsorbierte·Wasch-Fraktion" genannt). Die adsorbierte Substanz wurde mit 12 l 10% wässrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, um Aceton zu entfernen, und lyophilisiert, wobei 39 g eines rohen pulverförmigen Produkts erhalten wurden.
Das erhaltene rohe pulverförmige Produkt wurde in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Säule (2 l), gepackt mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical), geladen. Die Säule wurde dann mit 4 l entionisiertem Wasser und 4 l 10% wässrigem Methanol gewaschen, während die adsorbierte Substanz mit 4 L 15% wässrigem Methanol und 4 l 20% wässrigem Methanol eluiert wurde. Ein Teil von 2 bis 4 l des 15% wässrigem Methanoleluats und des 20% wässrigen Methanoleluats wurden vereinigt, gefolgt von einer Aufkonzentrierung. Nach Entfernen des Methanol durch Destillation wurde der Rückstand lyophilisiert, wobei 8,9 g eines Pulvers erhalten wurden.
Das erhaltene Pulver wurde in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule (1 l) geladen, die mit "Toyopearl HW40F" (Produkt von TOSHO Corporation) gepackt war, gefolgt von einer Entwicklung der Säule mit entionisiertem Wasser. Als Ergebnis der Fraktionierung des Eluats in Teilen von jeweils 100 ml wurde die aktive Substanz mit einer Retentionszeit von 21,2 Minuten bei der oben beschriebenen HPLC in den Fraktionen Nr. 5 bis 10 eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf konzentriert und lyophilisiert, wobei 2,7 g eines Pulvers erhalten wurden.
Das erhaltene Pulver wurde in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf einer HPLC-Säule ("YMC-Pack ODS-1050-20-SR": 100Φ × 500 mm; Produkt von YMC), die mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure, die 4% Acetonitril enthielt, äquilibriert war geladen. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 208 ml/Min mit 0,04% wässriger Trifluoressigsäure, die 4% Acetonitril enthielt, entwickelt. Als Ergebnis der Fraktionierung des Eluats in Teilen von jeweils 1 l wurde die aktive Substanz in den Fraktionen Nrn. 6 und 7 eluiert.
Diese Fraktionen wurden vereinigt, gefolgt von einer Aufkonzentrierung auf 200 ml durch "Evapor" (Produkt von Okawara Seisakujo) und Lyophilisierung, wobei 99 mg eines Pulvers erhalten wurden. Das erhaltenen Pulver wurde in 5 ml destilliertem Wasser gelöst, und unlösliche Bestandteile wurden dann abfiltriert. Das Filtrat wurde mittels eines Rotationsverdampfers auf 2 ml auf konzentriert, gefolgt von einer Lyophilisierung, wobei 87 mg von Verbindung A-500359E als reines Produkt erhalten wurden.
Die Verbindung A-500359E wies die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:

1) Aussehen der Substanz: weißes Pulver
2) Löslichkeit: Löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, unlöslich in normalem Hexan und Chloroform
3) Molekülformel : C₁₈H₂₃N₃O₁₂
4) Molekülgewicht: 473 (gemessen mittels FAB-Massenspektrometrie)
5) Genaue Masse, [M+H]⁺, gemessen durch hochauflösende FAB-Massenspektrometrie, beträgt wie folgt: Ermittelt: 474,1349 Berechnet: 474,1359
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Ultravioletabsorptionsspektrum weist die folgende maximale Absorption auf: 251 nm (ε 10000)
7) Optische Drehung: Die in Wasser gemessene optische Drehung weist den folgenden Wert auf: [α]_D ²⁰: +115°C (c 0,28)
8) Infrarotabsorptionsspektrum: Das durch das Kaliumbromid (KBr)-Scheibenverfahren gemessene Infrarotabsorptionsspektrum wies die folgenden Absorptionsmaxima auf: 3410, 2955, 1683, 1464, 1441, 1396, 1309, 1267, 1206, 1138, 1115, 1088, 1062, 1023 cm^–1.
9) Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in deuteriertem Dimethylsulfoxid mit Tetramethylsilan als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 3,24 (3H, s), 3,52 (1H, dd, J = 4,5, 6,1 Hz), 3,72 (3H, s), 3,98 (1H, m), 4,10 (1H, m), 4,25 (1H, m), 4,29 (1H, d, J = 2,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J = 2,0, 6,1 Hz), 5,05 (1H, d, J = 3,9 Hz), 5,16 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,45 (1H, d, J = 4,2 Hz), 5, 54 (1H, d, J = 5,9 Hz), 5,61 (1H, d, J = 3,3 Hz), 5,61 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,93 (1H, dd, J = 1,3, 2,9 Hz), 7,56 (1H, br. s), 7,69 (1H, br. s), 7,74 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in deuteriertem Dimethylsulfoxid mit Tetramethylsilan als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 52,0 (q), 57,3 (q), 61,5 (d), 64,9 (d), 72,1 (d), 75,4 (d), 78,2 (d), 81,3 (d), 89,0 (d), 99,2 (d), 101,2 (d), 114,2 (d), 139,2 (s), 139,8 (d), 150,3 (s), 161,8 (s), 163,1 (s), 170,1 (s) ppm.
11) Hochleistungsflüssigchromatographie (im Nachfolgenden als "HPLC" abgekürzt)-Analyse: Säule: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.) Lösungsmittel: 0,04% wässrige Trifluoressigsäure, die 4% Acetonitril enthält Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min Detektion: UV 210 nm Retentionszeit: 21 Minuten

Beispiel 45
Reinigung der Verbindungen A-500359F und A-500359H
In der unten beschriebenen Reinigung wurde die aktive Fraktion durch HPLC unter Verwendung der folgenden Säule und Analysebedingungen beobachtet.
Säule: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel: 0,04% wässrige Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
Detektion: UV 210 nm
Retentionszeit: 8 Minuten (Verbindung A-500359H)
18 Minuten (Verbindung A-500359F)
Nachdem 42 l der in Beispiel 44 erhaltenen nicht-adsorbierten-Wasch-Fraktion mit 6N Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt wurden, wurde diese Fraktion auf eine Säule (8,5 1), gepackt mit "Diaion PA316 (Cl^–)" (Produkt von Mitsubishi Chemical), geladen. Die Säule wurde mit 27 l entionisiertem Wasser gewaschen, und die adsorbierte Substanz wurde dann mit 27 l 0,1N Chlorwasserstoffsäure eluiert.
Das Eluat wurde mit 6N Natriumhydroxid auf pH7 eingestellt und dann auf eine Aktivkohlsäure geladen (2 l). Die Säule wurde mit 8 l entionisiertem Wasser gewaschen, und die aktive Substanz wurde dann mit 8 l 0,5N wässrigem Ammoniak, der 10% Aceton enthielt, eluiert. Die Konzentrierung und Lyophilisierung des erhaltenen Eluats ergab 28 g eines Pulvers.
Das erhaltene Pulver wurde in 400 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach Einstellung auf pH 3,0 wurde die erhaltene Lösung auf eine Säule (2 l) geladen, die mit Wasser eingestellt worden war und mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical) gepackt war. Diese nicht-adsorbierte Flüssigkeit und Waschfraktionen wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert, wobei 12 g einer viskosen Substanz erhalten wurden.
Diese viskose Substanz wurde in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach Einstellung auf pH 3,3 mit Trifluoressigsäure, wurde die erhaltene Lösung dann auf eine Säule (1 l) geladen, die mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war und mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical) gepackt war. Nach Entwicklung der Säule mit 2 l 0,04 wässriger Trifluoressigsäure und Vereinigen der Fraktion (Fraktion H), die zwischen 0,8 und 1,4 l eluiert wurde, wurde die Elutionslösung auf 2 l destilliertes Wasser gewechselt. Eine Konzentrierung und Lyophilisierung von 2 l der Fraktion (Fraktion F), die mit destilliertem Wasser eluiert wurde, ergab 605 mg eines Pulvers.
600 ml von Fraktion H wurden mit destilliertem Wasser auf 1 l verdünnt, und dessen pH wurde mit Trifluoressigsäure auf 2,8 eingestellt, und die erhaltene Lösung wurde dann wieder auf eine Säule (1 l) geladen, die mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical), die mit 0,04 flüssiger Trifluoressigsäure äquilibriert war, gepackt war. Die Säule wurde mit 2,2 l 0,04% wässriger Trifluoressigsäure eluiert. Die durch Fraktionierung des Eluats in Portionen von 200 ml erhaltenen Fraktionen 8 bis 11 wurden jeweils konzentriert und lyophilisiert, wobei 233 mg eines Pulvers erhalten wurden.
Eine 100 mg-Portion eines erhaltenen Pulvers wurde in 5 ml Wasser gelöst, und 1 ml-Portionen der erhaltenen Lösung wurden auf eine HPLC-Säule geladen ("Senshu Pak ODS-H-5251": 20Φ × 250 mm; Produkt von Senshu Scientific), die mit 0,04% wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt. Die Ultraviolettabsorption der aktiven Fraktion bei 210 nm wurde detektiert, und es wurde ein Peak, der bei einer Retentionszeit von 14 bis 16 Minuten eluierte, gesammelt, wobei das Verfahren fünfmal durchgeführt wurde. Die so erhaltenen Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer konzentriert, gefolgt von einer Lyophilisierung, wobei 23 mg der Verbindung A-500359H als reines Produkt erhalten wurden.
In 15 ml Wasser wurden 605 mg lyophilisiertes Pulver von Fraktion F gelöst, und 1 ml-Portionen der erhaltenen Lösung wurden auf eine HPLC-Säule ("Senshu Pak ODS-H-5251": 20Φ × 250 mm; Produkt von Senshu Scientific), die mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war, geladen. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt. Die Absorption der aktiven Fraktion im Ultraviolettbereich von 210 nm wurde detektiert, und ein Peak, der bei einer Retentionszeit von 29 bis 31 Minuten eluiert wurde, wurde 15 Mal durch Fraktionierung gewonnen. Die so erhaltenen Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer auf konzentriert, gefolgt von einer Lyophili sierung, wobei 134 mg einer Verbindung A-500359F als reines Produkt erhalten wurden.
Die Verbindung A-500359F wies die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:

1) Aussehen der Substanz: weißes Pulver
2) Löslichkeit: Löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, unlöslich in normalem Hexan und Chloroform
3) Molekülformel: C₁₇H₂₁N₃O₁₂
4) Molekülgewicht: 459 (gemessen mittels FAB-Massenspektrometrie)
5) Genaue Masse, [M+H]⁺, gemessen durch hochauflösende FAB-Massenspektrometrie, beträgt wie folgt: Ermittelt: 460,1201 Berechnet: 460,1203
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum weist die folgende maximale Absorption auf: 262 nm (ε 7.000)
7) Optische Drehung: Die in Wasser gemessene optische Drehung weist den folgenden Wert auf: [α]_D ²⁰: +111° (c 0,41)
8) Infrarotabsorptionsspektrum: Das durch das Kaliumbromid (KBr)-Scheibenverfahren gemessene Infrarotabsorptionsspektrum wies die folgenden Absorptionsmaxima auf: 3391, 2941, 1684, 1466, 1400, 1333, 1269, 1205, 1137, 1115, 1062, 1020 cm^–1.
9) Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit dem Signal von Wasser als 4,75 ppm gemessen. Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 3,37 (3H, s), 3,79 (1H, dd, J = 5,1, 6,4 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,6, 3,4, 4,6 Hz), 4,38 (1H, dd, J = 3,5, 5,1 Hz), 4,48 (1H, dd, J = 2,4, 6,4 Hz), 4,49 (1H, ddd, J = 0,6, 2,7, 4,6 Hz), 4,69 (1H, d, J = 2,4 Hz), 5,32 (1H, dd, J = 0,6, 3,4 Hz), 5,77 (1H, d, J = 3,5 Hz), 5, 90 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,11 (1H, dd, J = 1,6, 2,7 Hz), 7,75 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (67,4 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 58,6 (q), 62,7 (d), 65,5 (d), 72,7 (d), 76,3 (d), 78,8 (d), 91,2 (d), 100,0 (d), 102,7 (d), 114,8 (d), 140,7 (s), 141,9 (d), 152,1 (s), 165,4 (s), 167,0 (s), 173,9 (s) ppm.
11) HPLC-Analyse: Säule: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.) Lösungsmittel: 0,04 wässrige Trifluoressigsäure Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min Detektion: UV 210 nm Retentionszeit: 18 Minuten

Verbindung A-500359H wies die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften auf:

1) Aussehen der Substanz: weißes Pulver
2) Löslichkeit: Löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, unlöslich in normalem Hexan und Chloroform
3) Molekülformel: C₁₆H₁₉N₃O₁₂
4) Molekülgewicht: 445
5) Genaue Masse, [M+H]⁺, gemessen durch hochauflösende FAB-Massenspektrometrie, beträgt wie folgt: Ermittelt: 446,1025 Berechnet: 446,1047
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Ultravioletabsorptionsspektrum weist die folgende maximale Absorption auf: 262 nm (ε 7.400)
7) Optische Drehung: Die in Wasser gemessene optische Drehung weist den folgenden Wert auf: [α]_D ²⁰: +115° (c 0,33)
8) Infrarotabsorptionsspektrum: Das durch das Kaliumbromid (KBr)-Scheibenverfahren gemessene Infrarotabsorptionsspektrum wies die folgenden Absorptionsmaxima auf: 3361, 2934, 1683, 1467, 1403, 1336, 1270, 1206, 1114, 1090, 1058, 1021 cm^–1.
9) Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit dem Signal von Wasser als 4,75 ppm gemessen. Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 4,13 (br. t, J = 5,4 Hz), 4,15-4,19 (2H), 4,43 (1H, dd, J = 2,5, 5,8 Hz), 4,48 (1H, dd, J = 2,9, 4,7 Hz), 4,72 (1H, d, J = 2,5 Hz), 5,31 (1H, d, J = 4,0 Hz), 5,80 (1H, d, J = 4,0 Hz), 5,89 (1H, d, J = 8,3 Hz), 6,12 (1H, dd, J = 1,4, 2,9 Hz), 7,75 (1H, d, J = 8,3 Hz) ppm.
10) Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (67,4 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 62,8 (d), 65,8 (d), 70,3 (d), 74,6 (d), 77,0 (d), 84,2 (d), 90,3 (d), 100,3 (d), 102,9 (d), 113,9 (d), 141,2 (s), 141,9 (d), 152,2 (s), 165,9 (s), 167,0 (s), 174,2 (s) ppm.
11) HPLC-Analyse: Säule: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.) Lösungsmittel: 0,04% wässrige Trifluoressigsäure Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min Detektion: UV 210 nm Retentionszeit: 8 Minuten

Beispiel 46: Kultivierung des Streptomyces griseus-Stamm SANK 60196 (FERM BP-5420)
In jeden von drei 2 l-Erlenmeyerkolben, die jeweils 500 ml des Impfkulturmediums mit der unten beschriebenen Zusammensetzung enthielten, wurden aseptisch vier Loops des Stamms SANK60196 geimpft. Diese Kolben wurden auf einem Rotationsschüttler bei 23°C und 210 UpM geschüttelt, und die anfängliche Impfkultur wurde drei Tage so fortgeführt.

Das Impfkulturmedium enthält die folgenden Bestandteile in 100 ml Leitungswasser.

Glucose	20 g
Lösliche Stärke	10 g
Gepresste Hefe	9 g
Fleischextrakt	5 g
Polypepton	5 g
Natriumchlorid	5 g
Calciumcarbonat	3 g
Antischäumungsmittel "CB442" (Produkt von NOF Corporation)	50 mg

Nach Einstellung des pH auf 7,4 wurde eine Sterilisierung bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt.
Die erste so erhaltene Impfkultur wurde bei 3% in einen 60 l-Behälter geimpft, der 30 l des gleichen Vorkulturmediums enthielt, und die zweite Impfkultur wurde unter Belüftung und Rühren bei 23°C für 24 Stunden durchgeführt.
Die Kultivierung wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Ausführlich beschrieben, wurde die zweite Impfkulturbrühe mit 3% (v/v) in zwei 600 l-Behälter geimpft, die jeweils 400 l des unten beschriebenen Kultivierungsmediums enthielten, und die Kultivierung wurde dann unter Belüftung und Rühren/Schütteln bei 23°C für sechs Tage durchgeführt.

Kultivierungsmedium: enthält die folgenden Bestandteile in 1000 ml Leitungswasser.

Nach Einstellung des pH auf 7,4 wurden 3 g Calciumcarbonat zugegeben, und das Gemisch wurde bei 125°C für 20 Minuten sterilisiert.
Beispiel 47: Reinigung von Verbindung A-500359E
Die in Beispiel 46 erhaltene Kulturbrühe (810 l) wurde mit Hilfe von "Celite 545" (Produkt von Celite Corporation) filtriert.
Bei einer folgenden Reinigung wurde die aktive Fraktion mittels HPLC unter Verwendung der folgenden Säule und Analysebedingungen beobachtet.
Säule: "YMC-Pak ODS-A A-312" 6Φ × 150 mm (Produkt von YMC)
Lösungsmittel: 0,04% wässrige Trifluoressigsäure, enthaltend 4% Acetonitril
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Detektion: UV 210 nm
Retentionszeit: 19,8 Minuten
Das erhaltene Filtrat (800 l) wurde auf eine Säule (160 l) geladen, die mit "Diaion HP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical) gepackt war. Die Säule wurde mit 640 l entionisiertem Wasser gewaschen, und die nicht-adsorbierte Fraktion und die Waschfraktion wurden dann vereinigt (nicht-adsorbierte·Wasch-Fraktion). Die adsorbierte Substanz wurde mit 348 l 10% wässrigem Aceton eluiert.
Nach Konzentration der eluierten Fraktion auf 10 l wurde der Rückstand auf eine Säule (45 l) geladen, die mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical) gepackt war. Die Säule wurde dann mit 90 l entionisiertem Wasser, 100 l 10% wässrigem Methanol und 100 l 15% wässrigem Methanol gewaschen. Die adsorbierte Substanz wurde mit 100 l 20% wässrigem Methanol eluiert.
Nach Konzentration der 20% wässrigen Methanolfraktion auf 5 l wurde das Konzentrat auf eine Säule (22 l) gebracht, die mit "Toyopearl HW40F" (Produkt von TOSOH Corporation) gepackt war. Die Säule wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen, und das Eluat wurde durch Fraktionieren in Portionen von jeweils 5 l gewonnen. Die aktive Substanz mit einer Retentionszeit von 19,8 Minuten bei der oben beschriebenen HPLC wurde in den Fraktionen Nrn. 3 bis 6 eluiert. Diese Fraktionen wurden auf 5,8 l konzentriert und lyophilisiert, wobei 55,8 g eines Pulvers erhalten wurden.
Das erhaltene Pulver wurde in 1,2 l entionisiertem Wasser gelöst. Ein 200 ml-Teil der erhaltenen Lösung wurde auf eine HPLC-Säule ("YMC-Pak ODS-1050-20-SR"; 100Φ × 500 mm; Produkt von YMC) geladen, die mit 0,04 % wässriger Trifluoressigsäure, enthaltend 4% Acetonitril, äquilibriert war. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure, enthaltend 4% Acetonitril, entwickelt. Die aktive Substanz wies eine Retentionszeit von 105 bis 124 Minuten auf. Dieser Vorgang wurde 6 Mal wiederholt. Die so erhaltenen Fraktionen wurden vereinigt, mittels "Evapor" auf 5 l konzentriert und anschließend lyophilisiert, wobei 24,2 g von Verbindung A-500359E als reines Produkt erhalten wurden.
Beispiel 48: Reinigung von Verbindung A-500359F und A-500359H
Bei der nachfolgenden Reinigung wurde die aktive Fraktion durch HPLC unter Verwendung der folgenden Säule und Analysebedingungen beobachtet.
Säule: "YMC-Pak ODS-A A-312" 6Φ × 150 mm (Produkt von YMC)
Lösungsmittel: 0,04 wässrige Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
Detektion: UV 210 nm
Retentionszeit: 7,7 Minuten (Verbindung A-500359H)
16,6 Minuten (Verbindung A-500359F)
Die in Beispiel 47 erhaltene nicht-adsorbierte·Wasch-Fraktion (1370 l) wurde auf eine Aktivkohlesäule (65 l) geladen. Nachdem die Säule mit 260 l entionisiertem Wasser gewaschen wurde, wurde die aktive Substanz mit 270 l 0,5N wässrigem Ammoniak, enthaltend 10% Aceton, eluiert. Nach Konzentrierung des Eluats auf 40 l und Einstellung des Konzentrats auf pH 2,4 mit Trifluoressigsäure, wurde es auf eine Säule (45 l) geladen, die mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical), die mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war, gepackt war. Die Säule wurde mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure entwickelt, um eine Fraktion (Fraktion H) zu erhalten, die in 0 bis 47 l eluierte, sowie eine andere Fraktion (Fraktion F), die in 47 bis 91 l eluierte. Fraktion H wurde auf 1,5 l konzentriert, wobei Fraktion F nach Konzentrierung und Lyophilisierung als 287 g eines Pulvers erhalten wurde.
Das Konzentrat von Fraktion H wurde mit entionisiertem Wasser auf 3,2 l verdünnt. Ein Teil von 160 ml hiervon wurde auf eine HPLC-Säule ("YMC-Pack ODS-1050-20-SR": 100Φ × 500 mm; Produkt von YMC) geladen, die mit 0,04% wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war, gefolgt von einer Entwicklung bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min. Die Ultraviolettabsorption der aktiven Fraktion bei 210 nm wurde detektiert, und ein bei einer Retentionszeit von 67 bis 72 Minuten eluierter Peak wurde durch Fraktionierung gewonnen. Dieser Vorgang wurde 20 Mal wiederholt. Die so erhaltenen Fraktionen wurden durch "Evapor" (Produkt von Okawara Seisakujo) konzentriert und lyophilisiert, wobei 5,9 g von Verbindung A-500359H als reines Produkt erhalten wurden.
Ein Teil von 277 g von Fraktion F in Pulverform wurde in 50 l entionisiertem Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit Trifluoressigsäure auf pH 2,2 eingestellt. Die Lösung wurde wieder auf eine Säule (45 l) geladen, die mit "Diaion CHP-20P" (Produkt von Mitsubishi Chemical) gepackt und mit 0,04% wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war. Nach Waschen der Säule mit 97 l 0,04 wässriger Trifluoressigsäure wurde die aktive Substanz mit 120 l entionisiertem Wasser eluiert. Die eluierte entionisierte Wasserfraktion wurde konzentriert und lyophilisiert, wobei 75,6 g von Fraktion F als lyophilisiertes Pulver erhalten wurden.
Das erhaltene lyophilisierte Pulver von Fraktion F wurde in 4 1 Wasser gelöst. Eine 150 ml-Teil der Lösung wurde auf eine HPLC-Säule ("YMC-Pak ODS-1050-20-SR", 100Φ × 500 mm, Produkt von YMC) geladen, die mit einem Gemisch von 0,5% Acetonitril und 0,04 wässriger Trifluoressigsäue äquilibriert war, gefolgt von einer Entwicklung mit dem gleichen Lösungsmittelsystem bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min. Die Absorption der aktiven Fraktion im Ultraviolettbereich von 210 nm wurde detektiert, und ein bei einer Retentionszeit von 88 bis 97 Minuten eluierter Peak wurde durch Fraktionierung gewonnen. Dieser Vorgang wurde 27 Mal wiederholt. Die so erhaltenen Fraktionen wurden dann konzentriert und lyophilisiert, wobei 19,2 g von Verbindung A-500359F als reines Produkt erhalten wurden.
Beispiel 49: Herstellungsverfahren von Verbindung A-500359F und des Amidderivats von Verbindung A-500359F (chemische Umwandlung von Verbindung A-500359E durch wässrigen Ammoniak)
Die in Beispiel 44 erhaltene Verbindung A-500359E (75 mg) wurde in 2 ml 0,5N wässrigem Ammoniak gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden stehen gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch lyophilisiert, wobei 78 mg eines Pulvers erhalten wurden.
Das erhaltene Pulver wurde in 1 ml 0,04 wässriger TFA gelöst. Ein 100 μl-Teil der erhaltenen Lösung wurde auf eine HPLC-Säule geladen ("Capcellpak UG 120 Å", 20⌀ × 250 mm; Produkt von Shiseido), die mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war, gefolgt von einer Elution mit 0,04% wässriger Trifluoressigsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min. Die Ultraviolettabsorption der aktiven Fraktion bei 210 nm wurde detektiert, und Peaks, die bei einer Retentionszeit von 21 bis 22 Minuten und einer Retentionszeit von 31 bis 33 Minuten eluierten, wurden durch Fraktionierung gewonnen, wobei das Verfahren 10 Mal durchgeführt wurde.
Die bei den Retentionszeiten von 21 bis 22 Minuten eluierten Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer konzentriert und lyophilisiert, wobei 14 mg des Amidderivats von Verbindung A-500359F in reiner Form erhalten wurden.
Die bei einer Retentionszeit von 31 bis 33 Minuten eluierten Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer konzentriert und lyophilisiert, wobei 50 mg von Verbindung A-500359F in reiner Form erhalten wurden.
Das Amidderivat von Verbindung A-500359F weist die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften auf:

1) Aussehen der Substanz: weißes Pulver
2) Löslichkeit: Löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, unlöslich in normalem Hexan und Chloroform
3) Molekülformel: C₁₇H₂₂N₄O₁₁
4) Molekülgewicht: 458 (gemessen durch FAB-Massenspektrometrie)
5) Genaue Masse, [M+H]⁺, gemessen durch hochauflösende FAB-Massenspektrometrie, beträgt wie folgt: Ermittelt: 459,1328 Berechnet: 459,1364
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Ultravioletabsorptionsspektrum weist die folgende maximale Absorption auf: 258 nm (ε 7500)
7) Optische Drehung: Die im Wasser gemessene optische Drehung weist den folgenden Wert auf: [α]_D ²⁵: +119° (c 0,87)
8) Infrarotabsorptionsspektrum: Das durch das Kaliumbromid (KBr)-Scheibenverfahren gemessene Infrarotabsorptionsspektrum wies die folgenden Absorptionsmaxima auf: 3339, 2943, 1686, 1598, 1495, 1402, 1337, 1272, 1205, 1136, 1115, 1060, 1019 cm^–1.
9) Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit dem Signal von Wasser als 4,75 ppm gemessen. Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 3,30 (3H, s), 3,67 (1H, dd, J = 5,0, 6,8 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,8, 2,9, 4,4 Hz), 4,35 (1H, dd, J = 3,2, 5,0 Hz), 4,43 (1H, dd, J = 2,3, 6,8 Hz), 4,45 (1H, dd, J = 2,4, 4,4 Hz), 4,66 (1H, d, J = 2,3 Hz), 5,35 (1H, d, J = 2,9 Hz), 5,71 (1H, d, J = 3,2 Hz), 5,85 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,97 (1H, dd, J = 1,8, 2,4 Hz), 7,71 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (67,4 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 58,6 (q), 62,7 (d), 65,3 (d), 72,6 (d), 75,7 (d), 78,7 (d), 82,3 (d), 91,3 (d), 99,8 (d), 102,7 (d), 110,8 (d), 141,9 (d), 142,3 (s), 152,1 (s), 166,0 (s), 167,0 (s) ppm.
11) HPLC-Analyse: Säule: "Senshu Pack ODS-H-2151", 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.) Lösungsmittel: 0,04 wässrige Trifluoressigsäure Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min Detektion: UV 210 nm Retentionszeit: 11 Minuten

Beispiel 50: Herstellung von Verbindung A-500359F (Hydrolyse von Verbindung A-500359E durch Natriumhydroxid)
Die in Beispiel 44 erhaltene Verbindung A-500359E (4,4 mg) wurde in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach tropfenweiser Zugabe von 0,5 ml 0,02N wässrigem Natriumhydroxid wurde 1 ml 0,1N wässriges Natriumhydroxid tropfenweise zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 50 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und dann auf 2 ml einer Aktivkohlesäule geladen. Die Säule wurde mit 8 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die Reaktionssubstanz wurde dann mit 8 ml 0,5N wässrigem Ammoniak, welcher 10% Aceton enthielt, eluiert.
Nach Konzentrieren des Eluats auf 700 μl wurde das Konzentrat auf eine HPLC-Säule ("Senshu Pak ODS-H-4251"; 10Φ × 250 mm; Produkt von Senshu Scientific) geladen, die mit 0,04 wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war, gefolgt von einer Elution bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min. Die Ultraviolettabsorption der aktiven Substanz bei 210 nm wurde detektiert, und ein bei einer Retentionszeit von 25 bis 30 Minuten eluierter Peak wurde durch Fraktionierung gewonnen. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Die so erhaltenen Fraktionen wurden in einem Rotationsverdampfer konzentriert und lyophilisiert, wobei 2,6 mg von Verbindung A-500359F in reiner Form erhalten wurden.
Beispiel 51: Kultivierung von Streptomyces griseus-Stamm SANK60196 (FERM BP-5420)
Ein Loop Schleife des Stamms SANK60196 wurde sterilisiert und dann in einen 500 ml Erlenmeyerkolben (Impfkolben) geimpft, der 100 ml eines Mediums mit der unten beschriebenen Zusammensetzung enthielt. Die Impfkultur wurde 3 Tage durch Schütteln des Kolbens in einem Rotationsschüttler bei 23°C und 210 UpM durchgeführt.
Das Impfkulturmedium enthielt die folgenden Bestandteile in 1000 ml Leitungswasser.

Maltose 30 g

Fleischextrakt 5 g

Polypepton 5 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 3 g

"Antischäumungsmittel CB442" 50 mg
Nach Einstellung auf pH 7,4 wurde eine Sterilisation bei 121°C für 30 Minuten durchgeführt.
Eine Kultivierung wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Ausführlich beschrieben wurde die Impfkultur mit 3% (V/V) in jeden von zehn 500 ml Erlenmeyerkolben geimpft, die jeweils 100 ml eines sterilisierten Mediums mit der unten beschriebenen Zusammensetzung enthielt. Die Kultivierung wurde für 11 Tage durch Schütteln in einem Rotationsschüttler bei 23°C und 210 UpM durchgeführt.
Kultivierungsmedium: enthielt die folgenden Bestandteile in 1000 ml Leitungswasser.

Glucose 50 g

Fleischextrakt 4 g

Polypepton 3 g

Entrahmte Milch 10 g

Corn Steep Liquor 10 g

Natriumchlorid 5 g

"Antischäumungsmittel CB442" 50 mg
Nach Einstellung auf pH 7,4 wurde eine Sterilisierung bei 125°C für 30 Minuten durchgeführt.
Beispiel 52: Reinigung von Verbindung A-500359J
Bei nachfolgender Reinigung wurde die aktive Fraktion mittels HPLC unter Verwendung der folgenden Säule und Analysebedingungen beobachtet.
Säule: "Pegasil ODS", 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel: 0,04 wässrige Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Detektion: UV 260 nm
Retentionszeit: 5,57 Minuten
Die in Beispiel 51 erhaltene Kulturbrühe wurde mit Hilfe von "Celite 545", das mit 5% (W/V) zugegeben wurde, filtriert. Das so erhaltene Filtrat (1 l) wurde auf eine Säule (200 ml), "Diaion HP-20", geladen. Die Säule wurde dann mit destilliertem Wasser (500 ml) gewaschen. Nach Einstellung des pH von 1,5 l der nicht-adsorbierten·Wasch-Fraktion auf 9 mit 6N Natriumhydroxid wurde die Fraktion auf eine Säule (100 ml) von "Dowex SBR-P (OH)" geladen. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser (300 ml) gewaschen, und die adsorbierte Substanz wurde mit 300 ml 1N wässriger Chlorwasserstoffsäure eluiert.
Nach Einstellung des pH nach Elution auf 7 mit Natriumhydroxid wurde das Eluat auf eine Aktivkohlesäule (50 ml) geladen. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser (100 ml) gewaschen, und die aktive Substanz wurde mit 60% wässrigem Aceton (200 ml) verdünnt. Eine Aufkonzentrierung und Lyophilisierung des Eluats ergab 558 mg eines Pulvers. Das Pulver wurde in 5 ml destilliertem Wasser gelöst, und 500 μl-Portionen der erhaltenen Lösung wurden auf eine HPLC-Säule geladen ("Senshu Pack Pegasil ODS"; 20Φ × 250 mm; Produkt von Senshu Scientific), die mit 0,05 wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert war. Diese wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 10,0 ml/min entwickelt. Die Ultraviolettabsorption der aktiven Substanz bei 260 nm wurde detektiert, und ein bei einer Retentionszeit von 11,1 Minuten eluierter Peak wurde durch Fraktionierung gewonnen, wobei das Verfahren 10 Mal durchgeführt wurde. Die erhaltenen Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer auf konzentriert und dann lyophilisiert, wobei 16,2 mg von Substanz A-500359J in reiner Form erhalten wurden.
Verbindung A-500359J weist die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften auf:

1) Aussehen der Substanz: weißes Pulver
2) Löslichkeit: Löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, unlöslich in normalem Hexan und Chloroform
3) Molekülformel: C₁₆H₂₁N₃O₁₃
4) Molekülgewicht: 463 (gemessen durch FAB-Massenspektrometrie)
5) Genaue Masse, [M+H]⁺, gemessen durch hochauflösende FAB-Massenspektrometrie, beträgt wie folgt: Ermittelt: 462,0996 Berechnet: 462,1006
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Ultravioletabsorptionsspektrum weist die folgende maximale Absorption auf: 194 (ε 8800), 262 (ε 10000) nm
7) Optische Drehung: Die im Wasser gemessene optische Drehung weist den folgenden Wert auf: [α]_D ²⁸: +83° (c 0,1, H₂O)
8) Infrarotabsorptionsspektrum: Das durch das Kaliumbromid (KBr)-Scheibenverfahren gemessene Infrarotabsorptionsspektrum wies die folgenden Absorptionsmaxima auf: 3372, 2931, 1684, 1467, 1407, 1273, 1204, 1107, 1058 cm^–1.
9) Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (3,53 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 3,75 (1H, t, J = 3,4 Hz), 3,83 (1H, ddd, J = 1,4, 1,9, 3,4 Hz), 4,02 (1H, ddd, J = 1,4, 1,7, 3,4 Hz), 4,05 (1H, dd, J = 5,3, 5,6 Hz), 4,11 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,13 (1H, dd, J = 3,1, 5,6 Hz), 4,30 (1H, d, J = 5,3 Hz), 4,33 (1H, d, J = 1,7 Hz), 4,90 (1H, d, J = 1,9 Hz), 5,50 (1H, d, J = 3,1 Hz), 5,7 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,6 (1H, d, J = 8,2 Hz) ppm.
10) Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (67,4 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 64,4 (d), 68,8 (d), 68,9 (d), 69,7 (d), 71,4 (d), 73,0 (d), 75,4 (d), 82,8 (d), 90,7 (d), 99,2 (d), 101,7 (d), 141,6 (d), 151,0 (s), 165,9 (s), 171,9 (s), 172,6 (s) ppm.
11) HPLC-Analyse: Säule: "Senshu Pak ODS-H-2151", 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.) Lösungsmittel: 0,05% wässrige Trifluoressigsäure Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min Detektion: UV 260 nm Retentionszeit: 5,57 Minuten

Beispiel 53: Kultivierung von Streptomyces griseus-Stamm SANK 60196 (FERM BP-5420)
Ein Loop des Stamms SANK60196 wurde vor Einimpfung in einen 500 ml Erlenmeyerkolben (Impfkolben), der 100 ml eines Mediums der unten beschriebenen Zusammensetzung enthielt, geimpft. Eine Vorkultur wurde drei Tage durch Schütteln des Kolbens in einen Rotationsschüttler bei 23°C und 210 UpM durchgeführt.
Prekulturmedium: enthält folgende Bestandteile in 1000 ml Leitungswasser.

Maltose 30 g

Fleischextrakt 5 g

Polypepton 5 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 3 g

"Antischäumungsmittel CB442" 50 mg
Nach Einstellung des pH auf 7,4 wurde eine Sterilisierung bei 121°C für 30 Minuten durchgeführt.
Die Kultivierung wurde wie unten beschrieben durchgeführt. Ausführlich beschrieben, wurde die Vorkulturbrühe mit 3% (V/V) jeweils in zehn 500 ml Erlenmeyerkolben geimpft, die jeweils 100 ml eines sterilisierten Mediums mit der unten beschriebenen Zusammensetzung enthielten. Eine Kultivierung wurde durch Schütteln der Kolben in einem Rotationsschüttler bei 23°C und 210 UpM durchgeführt. Sechs Stunden nach Beginn der Kultivierung wurden filtersterilisiertes S-(2-Aminoethyl)-Lcysteinhydrochlorid und L-Allylglycin zugegeben, so dass sich eine Konzentration von 10 mM ergab. Die Kultivierung wurde dann sieben Tage durchgeführt.
Kultivierungsmedium: enthält die folgenden Bestandteile in 1000 ml Leitungswasser.

Maltose 30 g

Hefeextrakt (Produkt von Difco Laboratories) 5 g

Fleischextrakt 5 g

Polypepton 5 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 3 g

"Antischäumungsmittel CB422" 50 mg
Nach Einstellung auf pH 7,4 wurde eine Sterilisierung bei 125°C für 30 Minuten durchgeführt.
Beispiel 54: Reinigung von Substanz A-500359M-3
Die in Beispiel 53 erhaltene Kulturbrühe (1 l) wurde bei 3000 UpM für 20 Minuten zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde gereinigt.
Bei/nach der anschließenden Reinigung wurde die aktive Fraktion durch HPLC unter Verwendung der folgenden Säule und Analysebedingungen beobachtet.
Säule: "Pegasil ODS" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific)
Lösungsmittel: 7,2% Acetonitril – 0,05 wässrige Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Detektion: UV 260 nm
Retentionszeit: 10,1 Minuten
Nach Einstellung des Überstands auf pH 3 mit Trifluoressigsäure wurde die erhaltene Lösung (1 l) auf eine "Diaion HP-20"-Säule (200 ml) aufgetragen, die mit 0,05% wässriger Trifluoressigsäure (500 ml) äquilibriert war. Die Säule wurde mit 0,05 wässriger Trifluoressigsäure (500 ml) gewaschen, gefolgt von einer Eluierung mit destillierten. Wasser (500 ml). Das so erhaltene Eluat von destillierten. Wasser (500 ml) wurde konzentriert und lyophilisiert, wobei 230 mg eines rohen pulverförmigen Produkts erhalten wurden.
Das rohe Pulverprodukt wurde in 2 ml destilliertem Wasser gelöst und ein Teil von 500 μl der erhaltenen Lösung wurde auf eine HPLC-Säule aufgetragen ("Pegasil ODS", Handelsname; 20Φ × 250 mm; Produkt von Senshu Scientific), die mit 0,05 wässriger Trifluoressigsäure, enthaltend 7% Acetonitril, äquilibriert war.
Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 10,0 ml/min entwickelt, und die Ultraviolettabsorption bei 210 nm wurde beobachtet, was zu einer Elution der aktiven Substanz bei einer Retentionszeit von 28,0 Minuten führte. Dieser Vorgang wurde 4 Mal wiederholt, und die Eluate wurden vereinigt, konzentriert und lyophilisiert, wobei 11,1 mg der Substanz A-500359M-3 in reiner Form erhalten wurden.
Verbindung A-500359M-3 wies die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften auf:

1) Aussehen der Substanz: weißes Pulver
2) Löslichkeit: Löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, unlöslich in normalem Hexan und Chloroform
3) Molekülformel: C₂₂H₂₈N₄O₁₃
4) Molekülgewicht: 556 (gemessen durch FAB-Massenspektrometrie)
5) Genaue Masse, [M+H]⁺, gemessen durch hochauflösende FAB-Massenspektrometrie, beträgt wie folgt: Ermittelt: 557,1754 Berechnet: 557,1731
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Ultravioletabsorptionsspektrum weist die folgende maximale Absorption auf: 236 nm (ε 10000)
7) Optische Drehung: Die in Wasser gemessene optische Drehung weist den folgenden Wert auf: [α]_D ²⁶: +92° (c 0,1, H₂O)
8) Infrarotabsorptionsspektrum: Das durch das Kaliumbromid (KBr)-Scheibenverfahren gemessene Infrarotabsorptionsspektrum wies die folgenden Absorptionsmaxima auf: 3407, 2938, 1684, 1524, 1465, 1399, 1385, 1335, 1268, 1205, 1139, 1118, 1095, 1063, 1021 cm^–1.
9) Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (3,53 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹H-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 2,44 (1H, ddd, J = 4,3, 7,3, 13,3 Hz), 2,52 (1H, ddd, J = 4,3, 7,5, 13,3 Hz), 3,27 (3H, s), 3,66 (1H, t, J = 5,5 Hz), 4, 17 (1H, ddd, J = 1,1, 2,5, 3,1 Hz), 4,32 (1H, dd, J = 3,7, 5,5 Hz), 4,33 (1H, t, J = 4,3 Hz), 4,45 (1H, m), 4,46 (1H, m), 4,73 (1H überlappend mit HDO), 5,07 (1H, d, J = 10,2 Hz), 5,36 (1H, d, J = 3,1 Hz), 5,51 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,58 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,73 (1H, m), 5,74 (1H, d, J = 3,7 Hz), 5,95 (1H, dd, J = 1,1, 1,9 Hz), 7,72 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum wurde in Deuteriumoxid mit 1,4-Dioxan (67,4 ppm) als interner Standardsubstanz gemessen. Das ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrum ist wie folgt: 37,1 (t), 55,4 (d), 58,6 (q), 62,6 (d), 65,3 (d), 72,6 (d), 75,7 (d), 78,9 (d), 82,4 (d), 90,6 (d), 99,8 (d), 102,6 (d), 109,9 (d), 119,0 (t), 134,0 (d), 141,7 (d), 142, 2 (s), 152,0 (s), 162,3 (s), 166,8 (s), 173,6 (s), 177,6 (s) ppm.
11) HPLC-Analyse: Säule: "Pegasil ODS" 6Φ × 150 mm (Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.) Lösungsmittel: 7,2% Acetonitril – 0,05% wässrige Trifluoressigsäure Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min Detektion: UV 260 nm Retentionszeit: 10,1 Minuten

Versuch 1. Antibakterielle Wirksamkeit Disk-Assay
Ein so genannter Disk-Assay ("Experimental Agricultural Chemistry", ed. by Agricultural Chemistry Class/Agriculture Dept./Tokyo Univ., 3 rd edition, Volume II, veröffentlicht durch Asakura Shoten in 1978) wurde unter Verwendung von 40 μg einer Testsubstanz pro Papierscheibe von 8 mm durchgeführt. Verbindung A-500359E wies einen inhibitorischen Kreis von 12 mm Durchmesser gegen Mycobacterium smegmatis SANK 75075 auf, das Amidderivat von Verbindung A-500359F wies einen inhibitorischen Kreis von 12 mm im Durchmesser auf, und Verbindung A-500359M-3 wies ebenfalls einen inhibitorischen Kreis von 12 mm im Durchmesser auf.
Zubereitungsbeispiel
Kapseln wurden jeweils durch Mischen von 100 mg von Verbindung A-500359E, Verbindung A-500359F, dem Amidderivat von Verbindung A-500359F, Verbindung A-500359H, Verbindung A-500359J oder Verbindung A-500359M-3, 100 mg Lactose, 148,8 mg Maisstärke und 1,2 mg Magnesiumstearat (insgesamt 350 mg) in Pulverform, Sieben des erhaltenen Gemischs durch ein 60-Mesh-Sieb und Einführen des Pulvers in eine Gelatinekapsel, erhalten.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen der Erfindungen, dargestellt durch die Formeln (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) und (XVI), sowie pharmakologisch akzeptable Salze davon hervorragende antibakterielle Wirksamkeiten gegen verschiedenen Bakterien aufweisen, einschließlich Mycobakterien, sodass sie zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionserkrankungen, die von solchen Bakterien hervorgerufen werden können, einsetzbar sind. Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) ist als Bakterium zur Herstellung der Verbindungen der Formeln (XI), (XII), (XIV), (XV) oder (XVI) einsetzbar. Die Verbindungen der Erfindung der Formeln (XI), (XIII), (XIV), (XV) oder (XVI) sind auch als Ausgangsmaterial zur Synthese eines Derivats zur Herstellung einer Vorbeugung oder Behandlung für verschiedene Infektionskrankheiten durch organisch-chemische oder mikrobiologische Umwandlung geeignet.

Claims

Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) Verbindung A-500359E der folgenden Formel (XI):
oder einem Salz oder einem Solvat davon; (ii) Verbindung A-500359F der folgenden Formel (XII):
oder einem Salz oder einem Solvat davon; (iii) einem Amidderivat von Verbindung A-500359F der folgenden Formel (XIII):
oder einem Salz oder einem Solvat davon; (iv) einer Verbindung A-500359H der folgenden Formel (XIV):
oder einem Salz oder einem Solvat davon; (v) einer Verbindung A-500359J der folgenden Formel (XV):
oder einem Salz oder einem Solvat davon; und (vi) einer Verbindung A-500359M-3 der folgenden Formel (XVI):
oder einem Salz oder einem Solvat davon.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1(i), (ii), (iv) oder (v) durch ein Kultivierungsverfahren, welches umfasst: Kultivieren eines Stamms eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, und Isolieren der Verbindung aus den Kultivierungsprodukten.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Stamm des Mikroorganismus Streptomyces griseus (SANK 60196; FERM BP-5420) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer pharmakologisch aktiven Verbindung zusammen mit einem Träger oder Verbindungsmittel dafür umfasst, wobei die pharmakologisch aktive Verbindung eine Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer bakteriellen Infektion.
Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Verwendung als Arzneimittel.
Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer bakteriellen Infektion.