DE69202075T2

DE69202075T2 - Polyhydroxycyclopentan Derivate, ihre Herstellung und ihre therapeutische Verwendung.

Info

Publication number: DE69202075T2
Application number: DE69202075T
Authority: DE
Inventors: Sato C O Sankyo Company Akira; Haruyama C O Sankyo C Hideyuki; Hamano C O Sankyo Comp Kiyoshi; Nakajima C O Sankyo Com Mutsuo; Ando C O Sankyo Company Osamu; Enokita C O Sankyo Compa Ryuzo; Takahashi C O Sankyo Com Shuji; Kinoshita C O Sankyo C Takeshi; Takamatsu C O Sankyo Yasuyuki
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-17
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2012-02-18
Also published as: IS4066A; CN1043422C; ES2074332T3; NZ241623A; IE71947B1; FI920663A0; EP0499489B1; HU214702B; FI920663A; CS43992A3; NO177589B; IS3815A; NO920555L; TW221804B; CA2061239A1; ATE121383T1; US5260447A; IS4064A; IL100955A0; NO920555D0

Description

Die Erfindung betrifft zwei neue Polyhydroxycyclopentan-Derivate, die bestimmte wertvolle biologische Aktivitäten besitzen, und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie Verfahren und Zusammensetzungen zu ihrer therapeutischen und prophylaktischen Anwendung.
Die Verbindungen nach der Erfindung sind 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol, deren Formeln (I) bzw. (II) nachstehend angegeben sind. Diese Verbindungen können durch Fermentation oder durch Spaltung der als Trehazolin bekannten Verbindung, die durch die nachstehend angegebene Formel (III) dargestellt ist, hergestellt werden. 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]- oxazol-4,5,6-triol und Trehazolin liegen jedoch in tautomeren Formen vor, so daß sie auch durch die nachstehenden Formeln (IIa) bzw. (IIIa) dargestellt werden können:
Es ist davon auszugehen, daß Trehazolin dieselbe Verbindung wie die in der PCT-Veröffentlichung WO 90/10010 genannte Verbindung "Trehalostatin" ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die Fähigkeit, die Aktivität von verschiedenen Zuckerhydrolasen, insbesondere von β-Glucosidase und Saccharase, zu hemmen.
Es ist berichtet worden, daß Verbindungen mit starker inhibitorischer Aktivität gegen β-Glucosidase wie Castanospermin und Desoxynojirimycin nützliche antineoplastische Mittel und Mittel gegen ATDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome = Erworbenes Immunschwächesyndrom) sind [R.A. Gruters et al., Nature, 330, 74-77 (1987); M.J. Humphries et al., Cancer Res. 46 5215-5222 (1986)]. Deshalb ist zu erwarten, daß Verbindungen mit der Fähigkeit zum Hemmen der Aktivität von β-Glucosidase nützliche antineoplastische oder Anti-AIDS-Mittel sind.
Es ist auch berichtet worden, daß Verbindungen mit starker inhibitorischer Aktivität gegen Saccharase wie AO-128 und Acarbose nützliche Mittel gegen Diabetes und Obesitas sind [Satoshi Horii et al., Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038-1046 (1986); T. Aida et al., Journal of Japanese Society of Food and Nutrition 34 (2) 134-139 (1981)]. Es ist deshalb zu erwarten, daß Verbindungen mit der Fähigkeit zum Hemmen der Aktivität von Saccharase sich auch zur Behandlung und Prophylaxe von Diabetes und Obesitas eignen.
Verbindungen, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen eine gewisse Strukturähnlichkeit haben, sind:
die Mannostatine, die u.a. von T. Aoyagi et al., [The Journal of Antibiotics, Bd. XLII, Nr. 6, 883 (1989)] beschrieben sind und denen die Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität von α-D-Mannosidase zugeschrieben wird,
(1S, 2R, 35, 4R, 5R)-Methyl[2,3,4-trihydroxy-5- (hydroxymethyl)-cyclopentyl]amin, das u.a. von R.A. Farr et al. [Tetrahedron Letters, 31, 7109 (1990)] beschrieben ist und dem die Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität von α-Mannosidase zugeschrieben wird,
Allosamidin, das u.a. von S. Sakuda et al. [Tetrahedron Letters, 27, 2475 (1986)] beschrieben ist und dem die Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität von Insekten-Chitinase zugeschrieben wird, und
Kifunensin, das u.a. von H. Kayakiri et al. [J. Org. Chem., 54, 4015 (1989)] beschrieben ist und das als Immunomodulator mit der Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität von α-Mannosidase bezeichnet wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol der oben angegebenen Formel (I) und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol der oben angegebenen Formel (II).
Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittelzusammensetzungen, die 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial, Verdünnungsmittel oder Exzipienten enthalten.
Ferner sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittelzusammensetzungen, die 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial, Verdünnungsmittel oder Exzipienten enthalten.
Erfindungsgemäß ist weiter die Verwendung dieser beiden Verbindungen in der Therapie vorgesehen.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von 5-Amino-1- (hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Tumoren oder Tumor-Vorstadien sowie die Verbindung selbst zur Verwendung für die Behandlung oder Prophylaxe.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von 5-Amino-1- (hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe des erworbenen Immunschwächesyndroms sowie die Verbindung selbst zur Verwendung für die Behandlung oder Prophylaxe.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cycylopent[d]oxazol- 4,5,6-triol zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Diabetes oder Obesitas sowie die Verbindung selbst zur Verwendung für die Behandlung oder Prophylaxe.
5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol kann durch Hydrolyse von Trehazolin oder von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol, wie nachfolgend noch ausführlicher beschrieben, hergestellt werden. 2- Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol kann durch Hydrolyse von Trehazolin oder durch Fermentation unter Verwendung eines Mikroorganismus des Genus Micromonospora oder Amycolatopsis hergestellt werden.
Trehazolin, das als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden kann, kann durch Züchten eines Trehazolin-produzierenden Mikroorganismus des Genus Micromonospora oder Amycolatopsis, vorzugsweise eines Trehazolin-produzierenden Mikroorganismus des Genus Micromonospora, hergestellt werden.
Ein Beispiel für einen Trehazolin-produzierenden Mikroorganismus des Genus Micromonospora ist Micromonospora sp. SANK 62390. Dieser Mikroorganismus wurde zuerst am 26. Juli 1990 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-11631 bei der Inlands-Hinterlegungsstelle des Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, und dann am 21. August 1991 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3521 gemäß dem Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
Ein Beispiel für einen Trehazolin-produzierenden Nikroorganismus des Genus Amycolatopsis ist Amycolatopsis sp. SANK 60791, welcher am 14. August 1991 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3513 gemäß dem Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan hinterlegt wurde.
Beide sind neue isolierte Stämme und Bestandteil der Erfindung.

CHARAKTERISIERUNG DER MIKROORGANISMEN

Micromonospora sp. SANK 62390

Der Stamm Micromonospora sp. SANK 62390 hat die folgenden mykologischen Eigenschaften:

1. Morphologische Eigenschaften

Stamm SANK 52390 wächst beim Züchten bei 28ºC während 7 bis 14 Tagen auf einem gewöhnlichen, für die Stamm-Identifizierung verwendeten Agar-Kulturmedium normal oder etwas schwach. Die Substrathyphen sind langgestreckt und verzweigt und haben hellorange, orange bis dunkelbraun-graue Farbe, sind jedoch ohne die Einschnitte oder scharfen Windungen, die bei Stämmen des Genus Nocardia beobachtet werden. Luftmyzelien sind rudimentär und weiß bis bräunlich-weiß gefärbt. Sporen, die jeweils ein relativ kurzes Sporangiophor bilden, werden nur auf den Substrathyphen beobachtet. Die Sporenform ist kugelförmig und die Sporenoberfläche glatt. Es werden keine besonderen Organe wie Sporangien, Sklerotien, Wirbel oder dergleichen beobachtet.

2. Wachstum auf verschiedenen Medien

Der Stamm wurde 14 Tage bei 28ºC auf verschiedenen Kulturmedien gezüchtet, wobei sich die in Tabelle 1 angegebenen Eigenschaften zeigten. Die Farbtöne sind durch die in "Guide to Colour Standard", herausgegeben vom Japan Colour Research Institute, angegebenen Farbspitzennummern ausgedrückt.
In der Tabelle werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
G: Wachstum; AM: Luftmyzelium; R: Rückseite; SP: Lösliches Pigment Tabelle 1 Eigenschaften des Stamines SANK 62390 Medium Merkmal Eigenschaften Saccharose-Nitrat-Agar Glucose-Asparagin-Agar Glycerin-Asparagin-Agar (ISP 5) etwas schwach, glatt, hellorange nicht ausgebildet nicht produziert etwas schwach, glatt gelblich-orange hell bräunlich-grau Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP 4) Tyrosin-Agar (ISP 7) Nähr-Agar (DIFCO) gut, glatt, hell-orange nicht ausgebildet grau nicht produziert etwas schwach, glatt, matt-orange kaum ausgebildet, rudimentär, weiß bräunlich-weiß etwas schwach, glatt, gelb-orange matt gelblich-orange Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 2P) Hafermehl-Agar (ISP 3) Wasser-Agar gut, glatt, dunkel bräunlich grau kaum ausgebildet, rudimentär, bräunlich-weiß bräunlich-schwarz nicht produziert gut, glatt, orange kaum ausgebildet, rudimentär, weiß orange etwas schwach, glatt, blaß gelblich-orange grau Kartoffelextrakt-Karottenextrakt-Agar gut, glatt, gelblich-grau kaum ausgebildet, rudimentär, weiß bräunlich-weiß nicht produziert

3. Physiologische Eigenschaften

Die über einen Zeitraum von Tag 2 bis Tag 21 nach Beginn des Züchtens bei 28ºC beobachteten physiologischen Eigenschaften von Stamm SANK 62390 sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Hydrolyse von Stärke Verflüssigung von Gelatine Nitratreduktion Milch-Gerinnung Peptonisierung von Milch Produktion von Melanoid-Pigmenten (Medium)* Zersetzung des Substrats Temperaturbereich des Wachstums (Medium 4)* Optimaler Temperaturbereich für das Wachstum (Medium 4)* Salz-Tolerierung Casein Tyrosin Xanthin positiv negativ
* Medium 1: Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP 1)
Medium 2: Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6)
Medium 3: Tyrosin-Agar (ISP 7)
Medium 4: Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 2)
Stamm SANK 62390 wurde auch bei 28ºC unter Verwendung von Pridham-Gottlieb-Agar (ISP 9) als Kulturmedium gezüchtet. Die nach 14-tägigem Züchten beobachtete Assimilation von Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 D-Glucose D-Fructose L-Arabinose L-Rhamnose D-Xylose Saccharose Inositol Raffinose D-Mannitol Vergleich ausgenutzt nicht ausgenutzt

4. Zellenkomponenten

Die Zellenwände von Stamm SANK 62390 wurden nach dem Verfahren von B. Becker et al. [Applied Microbiology, 12, 421-423 (1984)] analysiert, wobei gefunden wurde, daß sie Mesodiaminopimelinsäure umfaßten. Weiter wurden die Zuckerkomponenten der gesamten Zellenwände von Stamm SANK 62390 nach dem Verfahren von M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] analysiert, wobei gefunden wurde, daß sie Arabinose und Xylose, aber keine Mykolsäure umfaßten. Es zeigte sich, daß das Peptidglycan vom Acyl-Typ in der Zellenwand vom Glycolyl-Typ war. Die nachgewiesenen hauptsächlichen Menachinon-Komponenten waren MK-10(H&sub6;), MK-10(H&sub4;) und MK- 10(H&sub8;).
Daraus ist ersichtlich, daß dieser Mikroorganismus als neuer Stamm, der zum Genus Micromonospora der Familie Actinomycetes gehört, zu klassifizieren ist. Auf dieser Grundlage wurde er als Micromonospora sp. SANK 62390 bezeichnet.

Amycolatopsis sp. SANK 60791

Der Stamm Amycolatopsis sp. SANK 60791 hat die folgenden mykologischen Eigenschaften:

1. Morphologische Merkmale

Stamm SANK 60791 wächst beim Züchten bei 28ºC während 7 bis 14 Tagen auf einem herkömmlichen, für die Stammidentifizierung verwendeten Agar-Kulturmedium normal oder etwas schwach. Die Substrathyphen sind langgestreckt und verzweigen sich glatt oder unregelmäßig und haben bräunlich-weiße, blaß gelblich- braune bis trübgelbe Farbe. Luftmyzelien sind gering ausgebildet oder rudimentär mit weißer, blaßgelber bis hell- orange Farbe. Bei späteren Stadien der Inkubation werden manchmal Substrathyphen und Luftmyzelien, die in Abschnitte eingeteilt sind, wobei die Luftmyzelien eine Bacillus-Struktur haben, beobachtet. Die Hyphen sind länglich ohne die scharfen Windungen, die bei Stämmen des Genus Nocardia beobachtet werden. Es werden keine besonderen Organe wie Sporangien, Sklerotien, Quirle oder dergleichen beobachtet.

2. Wachstum auf verschiedenen Medien

Der Stamm wurde 14 Tage bei 28ºC auf verschiedenen Kulturmedien gezüchtet und zeigte die in Tabelle 4 angegebenen Eigenschaften. Die angegebenen Farbtöne sind durch die in "Guide to Colour Standard", herausgegeben vom Japan Colour Research Institute, angegebenen Farbspitzennummern ausgedrückt.
In der Tabelle werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
G: Wachstum; AM: Luftmyzelium; R: Rückseite; SP: Lösliches Pigment Tabelle 4 Eigenschaften von Stamm SANK 60791 Medium Merkmal Eigenschaften Saccharose-Nitrat-Agar gut, glatt, gelblich-grau etwas schwach, weiß nicht produziert Glucose-Asparagin-Agar Glycerin-Asparagin-Agar (ISP 5) Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP 4) etwas schwach, glatt, hellorange kaum ausgebildet, gelblich-grau hellbraun nicht produziert gut, glatt, bräunlich-wei rudimentär, weiß blaß gelblich-braun nicht produziert rudimentär, blaßgelb Tyrosin-Agar (ISP 7) Nähr-Agar (DIFCO) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 2) sehr gut, faltig, bräunlich-weiß kaum ausgebildet, hellorange nicht produziert gut, glatt, blaß gelblich-braun rudimentär, weiß blaßgelb gut, faltig, mattgelb rudimentär, weiß matt gelblich-orange Hafermehl-Agar (ISP 3) Wasser-Agar Kartoffelextrakt-Karottenextrakt-Agar etwas schwach, glatt, blaß gelblich-braun rudimentär, weiß blaßgelb nicht produziert etwas schwach, glatt, gelblich-grau

3. Physiologische Eigenschaften

Die während eines Zeitraums von 2 Tage bis 21 Tage nach Beginn des Züchtens bei 28ºC beobachteten physiologischen Eigenschaften von Stamm SANK 60791 sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Hydrolyse von Stärke Verflüssigung von Gelatine Nitrat-Reduktion Milch-Gerinnung Peptonisierung von Milch Produktion von Melanoid-Pigment (Medium )* Zersetzung des Substrats Salz-Tolerierung (Medium 4)* Casein Tyrosinv Xanthin negativ positiv * Medium 1: Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP 1) Medium 2: Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6) Medium 3: Tyrosin-Agar (ISP 7) Medium 4: Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 2)
Der Stamm SANK 60791 wurde auch bei 28ºC unter Verwendung von Pridham-Gottlieb-Agar (ISP 9) als Kulturmedium gezüchtet. Die bei 14-tägigem Züchten beobachtete Assimilierung von Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 D-Glucose D-Fructose L-Arabinose L-Rnamnose D-Xylose Saccharose Inositol Raffinose D-Mannitol Vergleich ausgenutzt schwach ausgenutzt nicht ausgenutzt

4. Zellenkomponenten

Die Zellenwände von Stamm SANK 60791 wurden nach dem Verfahren von B. Becker et al. [Applied Microbiology, 12, 412-423 (1984)] analysiert, wobei gefunden wurde, daß sie Mesodiaminopimelinsäure umfaßten. Weiter wurden die Zuckerkomponenten der gesamten Zellenwände von Stamm SANK 60791 nach dem Verfahren von M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] analysiert, wobei gefunden wurde, daß sie Arabinose, aber keine Mykolsäure umfaßten. Es wurde nachgewiesen, daß das Peptidglycan vom Acyl-Typ in den Zellenwänden vom Acetyl-Typ war. Die hauptsächliche nachgewiesene Menachinon-Komponente war MK-9(H&sub4;).
Es ist deshalb begründet, daß der Mikroorganismus als neuer Stamm, der dem Genus Amycolatopsis der Familie Actinomycetes angehört, klassifiziert wird. Auf dieser Grundlage wurde er als Amycolatopsis sp. SANK 60791 bezeichnet.
Die Identifizierung der Stämme SANK 62390 und SANK 60791 erfolgte nach den ISP-Standards (The International Streptomyces Project), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 4, The Actinomycetes, Bd. 2, und anderer neuer Literatur über Actinomycetes.
Es ist gesichert, daß die Stämme SANK 62390 und SANK 60791 Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol produzieren. Wie jedoch gut bekannt ist, können die Eigenschaften von Pilzen im allgemeinen und Actinomycetes-Mikroorganismen im besonderen beträchtlich variieren, wobei solche Pilze sowohl durch natürliche Einflüsse als auch als Ergebnis der Induzierung durch künstliche Mittel (beispielsweise Ultraviolettlichtbestrahlung, radioaktive Bestrahlung, chemische Behandlung usw.) leicht Mutationen durchmachen. Deshalb umfaßt die Erfindung die Verwendung aller Mikroorganismen, die innerhalb des Genus Micromonospora oder Amycolatopsis klassifiziert werden können und die mit den Stämmen SANK 62390 und SANK 60791 die charakteristische Fähigkeit teilen, Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a- tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol zu produzieren. Die neuen Mikroorganismen der Stämme SANK 62390 und SANK 60791 sind nicht als ausschließlich anzusehen, d.h. daß die Ausdrücke "SANK 62390" und "SANK 60791" alle Mutanten dieser Stämme umfassen, die mit den Stämmen SANK 62390 und SANK 60791 die charakteristische Fähigkeit zum Produzieren von Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol teilen. Außerdem umfassen diese Mutanten diejenigen, die mittels gentechnischer Maßnahmen, beispielsweise Rekombination, Transduktion, Transformation oder dergleichen, erhalten werden. Auf der Grundlage der hier im Zusammenhang mit den Eigenschaften von Trehazolin und 2-Amino- 4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol- 4,5,6-triol gegebenen Informationen kann durch einen einfachen Versuch ermittelt werden, ob irgendein gegebener Stamm diese Verbindungen produziert oder diese in so ausreichender Menge produziert, daß der Stamm als von potentiellem wirtschaftlichem Interesse angesehen werden kann.
Das Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol nach der Erfindung können durch Züchten dieser Pilzstämme in Kulturmedien des für die Produzierung von anderen Fermentationsprodukten aus ähnlichen Mikroorganismen gebräuchlichen Typs hergestellt werden. Solche Medien enthalten notwendigerweise mikrobiologisch assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, wie den Fachleuten gut bekannt ist.
Bevorzugte Beispiele für Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Hafer, Roggen, Maisstärke, Kartoffelstärke, Maismehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatkuchen, Baumwollsaatöl, Melassen, Citronensäure, Weinsäure und dergleichen. Solche Verbindungen können allein oder in jeder geeigneten Kombination eingesetzt werden. Im allgemeinen kann die verwendete Menge innerhalb des Bereiches von 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, varieren.
Bevorzugte Stickstoffquellen umfassen normalerweise proteinhaltige Materialien, wie sie üblicherweise bei Fermentationsverfahren verwendet werden. Beispiele für solche Stickstoffquellen umfassen Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Erdnußmehl, Baumwollsaatkuchen, Baumwollsaatöl, Baumwollsaatmehl, Caseinhydrolysate, Pharmamin, Fischmehl, Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Malzextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen. Diese Stickstoffquellen können allein oder in jeder geeigneten Kombination verwendet werden. Im allgemeinen ist bevorzugt, sie in einer Konzentration von 0,2 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, zu verwenden.
Die anorganischen Nährsalze, die in dem Kulturmedium vorhanden sein können, sind gebräuchliche Salze, die zur Bereitstellung verschiedener Ionen befähigt sind, welche für das Wachstum von Mikroorganismen notwendig sind, wie Natrium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonat-Ionen. Außerdem sollte das Medium kleinere Mengen essentieller Spurenelemente wie Kalium, Calcium, Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium enthalten.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren mittels einer Flüssigkulturtechnik durchgeführt wird, wird in dem Kulturmedium vorzugsweise ein Antischaummittel wie Siliconöl, Pflanzenöl oder ein oberflächenaktives Mittel eingesetzt. Der pH-Wert des Kulturmediums zum Produzieren von Trehazolin oder 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol durch Züchten von Mikroorganismen der Genera Micromonospora und Amycolatopsis, insbesondere der Stämme SANK 62390 und SANK 60791, variiert vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 8,0, stärker bevorzugt von 6,5 bis 7,5.
Das Züchten kann bei jeder beliebigen Temperatur innerhalb des Bereiches von 15 bis 38ºC durchgeführt werden, wenn auch eine Temperatur von 22 bis 38ºC für ein gutes Wachstum bevorzugt ist, während eine Temperatur von 22 bis 28ºC für eine optimale Produktion von Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol bevorzugt ist.
Diese Verbindungen werden unter aeroben Kulturbedingungen hergestellt, wobei gebräuchliche aerobe Kulturverfahren wie die Festkultur, die Schüttelkultur und die Kulturverfahren unter Belüften und Rühren (Submerskultur) angewendet werden können. Im Falle der Züchtung im kleinen Maßstab wird üblicherweise die Schüttelkultur für wenige Tage bei 28ºC angewandt. Bei einem solchen Kulturverfahren im kleinen Maßstab kann die Kultur mit 1 oder 2 Wachstumsschritten zum Produzieren von Impfkulturen in beispielsweise Erlenmeyerkolben initiiert werden, die mit Prallplatten versehen sind, welche den Flüssigkeitsstrom regulieren. Das Medium für die Impfkulturschritte enthält vorzugsweise sowohl Kohlenstoff- als auch Stickstoffquellen. Bei der bevorzugten Abfolge der Verfahrensschritte für dieses Züchten im kleinen Maßstab werden die Impfkulturkolben in einem Inkubator bei konstanter Temperatur von 28ºC 7 Tage oder bis zum Erreichen eines ausreichenden Wachstums geschüttelt. Die gewachsene Impfkultur wird dann in ein zweites Impfmedium oder in das Produktionsmedium übergeführt. Wenn eine Wachstums-Zwischenphase angewandt wird, wird für das Wachstum im wesentlichen dasselbe Verfahren angewandt, wobei das Produktionsmedium mit einer Teilmenge des erhaltenen Zwischenprodukts beimpft wird. Der beimpfte Kolben kann mehrere Tage unter Schütteln inkubiert werden, wobei nach Beendigung der Inkubation der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert werden kann.
Bei der großtechnischen Produktion ist die Verwendung eines mit einem Rührer und einer Belüftungsvorrichtung versehenen geeigneten Fermenters bevorzugt. In diesem Fall kann das Nährmedium im Inneren des Fermenters hergestellt werden. Das Medium wird vorzugsweise durch Erhöhung der Temperatur auf 125ºC sterilisiert, wonach abgekühlt und das Kulturmedium mit der zuvor hergestellten Impfkultur beimpft werden kann. Das Züchten läuft dann unter Rühren und Belüftung bei beispielsweise 28ºC ab. Dieses Verfahren eignet sich für die großtechnische Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Das Fortschreiten der Züchtung und die Menge an mit Fortschreiten des Züchtens produziertem gewünschtem Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol kann durch Messen der biologischen Aktivitäten der Verbindungen oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Gaschromatographie/Massenspektrometrie einer gereinigten Probe der Verbindung aus der Kulturbrühe, wie nachstehend ausführlicher erläutert wird, ermittelt werden. Trehazolin hat eine inhibitorische Wirkung gegen Seidenraupen-Trehalase, so daß seine Produktion durch Verfolgen der Aktivität der Kulturbrühe gegen Seidenraupen- Trehalase überwacht werden kann, wobei Techniken angewandt werden, wie sie in dem folgenden Testbeispiel 3 erläutert sind.
Auf der anderen Seite wird die Produktion von 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol- 4,5,6-triol am besten durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Gaschromatographie/Massenspektrometrie überwacht. Hierfür kann die Kulturbrühe mit einem geeigneten Adsorptionsmittel-Harz [z.B. das, welches unter dem Handelsnamen Amberlite IRC-50 (NH&sub4;&spplus;) im Handel ist] in Berührung gebracht werden, wobei das 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol beispielsweise in einer chromatographischen Säule adsorbiert wird. Danach kann mit Wasser gewaschen, mit einem geeigneten Eluiermittel, z.B. einer 0,5 n wäßrigen Ammoniaklösung, eluiert, das Eluat konzentriert (z.B. durch Eindampfen unter vermindertem Druck) und der Rückstand lyophilisiert werden, wobei ein Pulver hergestellt wird. Die Menge an in dem Pulver enthaltenem 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol kann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden. Alternativ kann die Verbindung zunächst acetyliert und die Menge an in dem Pulver enthaltenem 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol durch Gaschromatographie/Massenspektrometrie gemessen werden.
Im allgemeinen erreicht die Menge an Trehazolin zwischen 72 und 150 Stunden nach Initiierung der Fermentation ein Maximum, während die Menge an 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol zwischen 96 und 168 Stunden nach Initiierung der Fermentation ein Maximum erreicht. Die genaue Zeit variiert jedoch in Abhängigkeit von der Temperatur oder anderen Fermentationsbedingungen, wobei die genaue optimale Zeit für jeden beliebigen Satz von Bedingungen durch Verfolgen der Produktion der gewünschten Verbindung, wie oben erläutert, leicht ermittelt werden kann.
Wenn ein Stamm des Genus Micromonospora verwendet wird, werden normalerweise sowohl Trehazolin als auch 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol produziert, die im Verlauf der Gewinnung durch herkömmliche Maßnahmen, wie nachstehend beschrieben, getrennt werden können. Stämme des Genus Amycolatopsis produzieren normalerweise nur 2- Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol. Beide Verbindungen werden in die flüssige Phase freigesetzt, obwohl sie auch beide in dem Myzelium vorhanden sind. Sie werden sehr einfach aus der flüssigen Phase gewonnen.
Nach Beendigung des Züchtens können die gewünschten Verbindungen Trehazolin und/oder 2-Amino-4-(hydroymethyl)-3a,5,6,6a- tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol, die in der flüssigen Phase der Kulturbrühe vorhanden sind, durch Abfiltrieren des Myzels und anderer fester Bestandteile, vorzugsweise unter Verwendung von Diatomeenerde, abgetrennt werden, die dann in dem Filtrat oder in der überstehenden Flüssigkeit vorliegen und durch Extraktion gewonnen werden können, wonach unter Ausnutzung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften durch gebräuchliche Maßnahmen gereinigt wird.
Beispielsweise können diese Verbindungen aus dem Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit gewonnen werden, indem dieses bzw. diese durch eine ein Adsorptionsmittel wie ein Ionenaustauscherharz, beispielsweise Amberlite IRC-50 oder CG-50 oder Dowex 50WX4 oder SBR-P, enthaltende Säule gegeben wird, so daß entweder die Verunreinigungen durch das Harz zurückgehalten und so entfernt werden oder die gewünschte Verbindung zurückgehalten und dann durch Eluieren, beispielsweise mit wäßrigem Ammoniak, gewonnen wird. Beispiele für andere Adsorptionsmittel umfassen Aktivkohle oder andere adsorbierende Harze wie Amberlite XAD-2 oder XAD-4 (ein Produkt von Rohm und Haas Co.) oder Diaion HP-10, HP-20, CHP-20 oder HP-50 (ein Produkt von Mitsubishi Kasei Corporation). Eine Trehazolin und/oder 2- Amino-4-hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol enthaltende Lösung wird durch eine eines dieser anderen Adsorptionsmittel wie vorstehend beschrieben enthaltende Adsorptionsmittelschicht gegeben, so daß entweder die Verunreinigungen durch das Adsorptionsmittel zurückgehalten und so entfernt werden oder die gewünschte Verbindung zurückgehalten und dann durch Eluieren, beispiels-weise mit wäßrigem Methanol, wäßrigem Aceton oder dergleichen, entfernt wird.
Das so erhaltene Trehazolin oder 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol kann durch verschiedene bekannte Techniken weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Adsorptionssäulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers wie Silicagel oder Florisil, durch Verteilungs-Säulenchromatographie unter Verwendung von Avicel (ein Produkt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) oder von Sephadex LH-20 (ein Produkt von Pharmacia Inc.), oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Normal-, Umkehrphasen- oder Ionenaustauschersäule.
Das 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol, d.h. Verbindung (I) nach der Erfindung, und das 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol, d.h. Verbindung (II) nach der Erfindung, können durch Hydrolyse des wie vorstehend beschrieben hergestellten Trehazolins hergestellt werden.
Diese Umsetzung wird vorzugsweise in Gegenwart einer Säure durchgeführt, wobei Wasser anwesend sein muß. Hinsichtlich der Natur der verwendeten Säure besteht keine besondere Einschränkung, so daß jede für gebräuchliche Hydrolysereaktionen geeignete Säure hier ebenfalls verwendbar ist. Beispiele umfassen anorganische Säuren wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure und organische Säuren wie Essigsäure oder Propionsäure in wäßriger Lösung. Eine bevorzugte Säure ist Chlorwasserstoffsäure.
Die Umsetzung kann über einen weiten Temperaturbereich stattfinden, und die genaue Reaktionstemperatur ist bei der Erfindung nicht kritisch. Im allgemeinen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis 120ºC, stärker bevorzugt bei 90 bis 100ºC, durchzuführen. Die für die Umsetzung erforderliche Zeit kann in Abhängigkeit von vielen Faktoren, insbesondere der Reaktionstemperatur und der Natur der verwendeten Reagentien und Lösungsmittel und, wie nachstehend erläutert, von dem gewünschten Produkt, ebenfalls stark variieren.
Es ist zu beachten, daß sowohl 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraolalsauch2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol unter Anwendung derselben Hydrolysereaktion aus demselben Ausgangsmaterial hergestellt werden. Deshalb enthält das Produkt im allgemeinen ein Gemisch aus den beiden Verbindungen. Es ist jedoch möglich, die Produktion einer dieser Verbindungen gegenüber der anderen durch geeignete Auswahl der Reaktionsbedingungen zu begünstigen. So begünstigen im allgemeinen mildere Bedingungen die Produktion von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxahol-4,5,6-triol, während strengere Bedingungen die Produktion von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol begünstigen.
Deshalb ist es für die Produktion von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol bevorzugt, ein relativ milder saures Reagens, beispielsweise 0,2 n wäßrige Chlorwasserstoffsäure, zu verwenden, wobei die Reaktion vorzugsweise eine Dauer von 1 Stunde bis 2 Tagen, stärker bevorzugt 5 bis 6 Stunden, hat.
Wenn andererseits die Umsetzung stärker auf die Produktion von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol gerichtet werden soll, ist eine stärkere Säure wie 4 n wäßrige Chlorwasserstoffsäure bevorzugt, wobei die Reaktion vorzugsweise eine Dauer von 1 Stunde bis 2 Tagen, stärker bevorzugt von 20 biw 24 Stunden, hat.
Zusätzlich kann 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4- tetraol durch Hydrolyse von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol hergestellt werden. In diesem Fall kann die erfindungsgemäße Hydrolysereaktion in Gegenwart einer Säure oder einer Base durchgeführt werden. Hinsichtlich der Natur der verwendeten Säure oder Base besteht keine besondere Einschränkung, so daß jede bei Hydrolysereaktionen gewöhnlich verwendete Säure oder Base hier in gleicher Weise verwendet werden kann.
Wenn für diese Reaktion eine Säure verwendet wird, umfassen Beispiele für geeignete Säuren: anorganische Säuren, wie die Halogenwasserstoffsäuren (beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Iodwasserstoffsäure), Schwefelsäure, Perchlorsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure, organische Carbonsäuren wie niedere aliphatische Carbonsäuren (beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Oxalsäure oder Trifluoressigsäure), niedere Alkansulfonsäuren (beispielsweise Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure oder Trifluormethansulfonsäure) und Arylsulfonsäuren (beispielsweise Benzolsulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure usw.). Bevorzugte Säuren sind die anorganischen Säuren, insbesondere Chlorwasserstoffsäure.
Im allgemeinen wird die Umsetzung vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Die Reaktion wird normalerweise und vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Hinsichtlich der Natur des verwendeten Lösungsmittels besteht keine besondere Einschränkung, vorausgesetzt, daß es keinen nachteiligen Einfluß auf die Reaktion oder auf die beteiligten Reagentien hat und daß es die Reagentien zumindest in gewissem Ausmaß lösen kann. Beispiele für geeignete Lösungsmittel umfassen Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol, Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan, organische Säuren, insbesondere Fettsäuren, wie Essigsäure oder Propionsäure, und Wasser. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen Wasser und Gemische von Wasser und einem organischen Lösungsmittel.
Die Menge der verwendeten Säure beträgt normalerweise und vorzugsweise 1 bis 20 Mol, stärker bevorzugt 5 bis 10 Mol, pro Mol der Ausgangsverbindung.
Die Umsetzung kann über einen weiten-Temperaturbereich stattfinden, und die genaue Reaktionstemperatur ist bei der Erfindung nicht kritisch. Im allgemeinen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis 150ºC, stärker bevorzugt bei 90 bis 110ºC, durchzuführen. Die für die Umsetzung erforderliche Zeit kann in Abhängigkeit von vielen Faktoren, insbesondere der Reaktionstemperatur und der Natur der Reagentien und dem verwendeten Lösungsmittel, ebenfalls über einen weiten Bereich variieren. Vorausgesetzt jedoch, daß die Umsetzung unter den vorstehend genannten bevorzugten Bedingungen durchgeführt wird, ist eine Dauer von 1 Stunde bis 2 Tagen, stärker bevorzugt von 20 bis 30 Stunden, gewöhnlich ausreichend.
Wenn für die Reaktion eine Base verwendet wird, umfassen Beispiele für geeignete Basen: anorganische Basen wie Alkalimetallhydroxide (beispielsweise Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid), Erdalkalimetallhydroxide (beispielsweise Calciumhydroxid oder Bariumhydroxid), Alkalimetallcarbonate (beispielsweise Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat) und Alkalimetallhalogenide (beispielsweise Natriumiodid, Natriumbroinid oder Kaliumiodid), und organische Basen wie Ammoniak, Alkylamine (beispielsweise Triethylamin) und heterocyclische Amine (beispielsweise Morpholin, N-Ethylpiperidin oder Pyridin).
Im allgemeinen wird die Umsetzung vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Die Reaktion wird normalerweise und vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Hinsichtlich der Natur des verwendeten Lösungsmittels besteht keine besondere Einschränkung, vorausgesetzt, daß es keinen nachteiligen Einfluß auf die Reaktion oder die beteiligten Reagentien hat und daß es die Reagentien zumindest in gewissem Ausmaß löst. Beispiele für geeignete Lösungsmittel umfassen Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan, und Wasser. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen Wasser und Gemische von Wasser und einem organischen Lösungsmittel.
Die Menge der zugesetzten Base beträgt normalerweise und vorzugsweise 0,01 bis 10 Mol, stärker bevorzugt 1 bis 5 Mol, pro Mol der Ausgangsverbindung.
Die Umsetzung kann über einen weiten Temperaturbereich stattfinden, und die genaue Reaktionstemperatur ist bei der Erfindung nicht kritisch. Im allgemeinen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die Umsetzung bei einer Temperatur von 0 bis 120ºC, stärker bevorzugt von etwa Raumtemperatur bis 100ºCF durchzuführen. Die für die Umsetzung erforderliche Zeit kann in Abhängigkeit von vielen Faktoren, insbesondere der Reaktionstemperatur und der Natur der eingesetzten Reagentien und Lösungsmittel, ebenfalls über einen weiten Bereich variieren. Vorausgesetzt jedoch, daß die Umsetzung unter den vorstehend genannten bevorzugten Bedingungen durchgeführt wird, ist eine Dauer von 0,5 Stunden bis 2 Tagen, stärker bevorzugt von 1 bis 20 Stunden, gewöhnlich ausreichend.
Die gewünschten Verbindungen der Formeln (I) und (II) können aus dem Reaktionsgemisch durch gebräuchliche Maßnahmen, wie sie für die Abtrennung und Gewinnung von organischen Verbindungen üblich sind, beispielsweise verschiedene chromatographische Techniken, insbesondere die Säulenchromatographie oder die präparative Dünnschichtchromatographie, erhalten werden. Im Zusammenhang mit der Abtrennung und Reinigung von durch Fermentation hergestelltem Trehazolin und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol wurden verschiedene Wahlmöglichkeiten beschrieben, die zum Abtrennen und Reinigen von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4- tetraol und 2-Amino-4-(hyderoxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d)oxazol-4,5,6-triol, die wie vorstehend beschrieben durch Hydrolyse erhalten wurden, ebenfalls angewandt werden können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen 5-Amino-1-(hydroxymethyl)cyclopentan-1,2,3,4-tetraol und 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol enthalten jeweils mindestens ein basisches Stickstoffatom und können deshalb Säureadditionssalze bilden. Hinsichtlich der Natur dieser Salze besteht keine besondere Einschränkung, vorausgesetzt, daß sie in dem Fall, daß ihre Verwendung in der Therapie beabsichtigt ist, pharmazeutisch geeignet sind. Wenn sie für nichttherapeutische Zwecke, z.B. als Zwischenprodukte für die Herstellung von anderen, möglicherweise noch aktiveren, Verbindungen, verwendet werden sollen, gilt nicht einmal diese Einschränkung. Beispiele für solche Säureadditionssalze umfassen Salze mit Mineralsäuren, insbesondere Halogenwasserstoffsäuren (wie Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure), Perchlorsäure, Salpetersäure, Kohlensäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, Salze mit niederen Alkylsulfonsäuren wie Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Ethansulfonsäure, Salze mit Arylsulfonsäuren wie Benzolsulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure, Salze mit organischen Carbonsäuren wie Essigsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure oder Citronensäure, und Salze mit Aminosäuren wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten notwendigerweise mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome in ihren Molekülen und können deshalb optische Isomere bilden. Obwohl diese sämtlich durch eine einzige Molekülformel dargestellt werden, umfaßt die Erfindung sowohl die einzelnen isolierten Isomere als auch Gemische, einschließlich den Racematen. Wenn stereospezifische Synthesetechniken angewandt oder optisch aktive Verbindungen als Ausgangsstoffe eingesetzt werden, können die einzelnen Isomere direkt hergestellt werden. Wenn andererseits ein Isomerengemisch hergestellt wird, können die einzelnen Isomere durch gebräuchliche Trennungstechniken erhalten werden.
Die beiden erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die Fähigkeit, die Aktivität von Zuckerhydrolasen zu hemmen, so daß sie zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen und Störungen, an denen diese Enzyme beteiligt sind, eingesetzt werden können. Die detaillierte Natur dieser Aktivität ist jedoch bei den beiden Verbindungen verschieden. So hat 5-Amino-1-(hydroxymethyl)cyclopentan-1,2,3,4-tetraol die Fähigkeit, die Aktivität von β- Glucosidase zu hemmen und eine niedrige Toxizität, so daß es zur Behandlung und Prophylaxe von Tumoren und AIDS verwendet werden kann. 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol hat die Fähigkeit, die Aktivität von Saccharase zu hemmen und eine niedrige Toxizität, so daß davon auszugehen ist, daß es sich zur Behandlung und Prophylaxe von Diabetes und Obesitas eignet.
Wenn beabsichtigt ist, diese Verbindungen therapeutisch zu verwenden, können sie allein oder in einer geeigneten pharmazeutischen Zubereitung, die neben der aktiven Verbindung ein oder mehrere gebräuchliche Verdünnungsmittel, Trägermaterialien oder Exzipienten enthält, verabreicht werden. Die Natur der Zubereitung hängt natürlich von dem beabsichtigten Verabreichungsweg ab. Für die perorale Gabe ist die Verbindung vorzugsweise als Pulver, Granulat, Tabletten oder Kapseln formuliert. Für die parenterale Gabe ist sie vorzugsweise als Injektionsflüssigkeit formuliert. Diese Zubereitungen können durch bekannte Maßnahmen durch Zusatz von Additiven wie Trägermaterialien, Bindemitteln, Zerfallhilfsmitteln, Gleitmitteln, Stabilisatoren und Korrigentien hergestellt werden. Wenn auch die Dosierung von den Symptomen und dem Alter des Patienten, der Natur und der Schwere der Krankheit oder Störung und dem Weg und der Weise der Verabreichung abhängt, so werden im Falle der peroralen Gabe die erfindungsgemäßen Verbindungen an einen erwachsenen Patienten normalerweise in einer täglichen Dosis von 1 bis 1000 mg gegeben. Die Verbindungen können als Einzeldosis oder aufgeteilt auf mehrere Gaben, beispielsweise zwei- bis dreimal täglich, verabreicht werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird nachstehend anhand von Beispielen erläutert, die jedoch keinerlei Einschränkung des Erfindungsbereiches bedeuten.

BEISPIEL 1

Herstellung von Trehazolin

1(A) Züchten

Drei 500-ml-Erlenmeyerkolben, die mit Prallplatten versehen waren und jeweils 80 ml Medium 1 (mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung) enthielten, wurden jeweils mit einer Platinschlinge Micromonospora sp. SANK 62390 beimpft und 216 Stunden auf einer Rotationschüttelmaschine, die mit 220 Umdrehungen/min rotierte, bei 28ºC inkubiert, wodurch eine erste Impfkultur erhalten wurde.

Medium 1:

Glucose 1 %
Glycerin 1 %
Hafermehl 0,5 %
Saccharose 1 %
Sojabohnenmehl 2 %
Casaminosäuren 0,5 %
Preßhefe 1 %
CaCO&sub3; 0,1 %
CB442 0,01 %
Wasser auf 100 %
(pH-Wert 7,0 vor der Sterilisierung)
Die Prozentsätze sind Gewichtsprozente, bezogen auf das Endvolumen des Mediums.
Vier 2-1-Erlenmeyerkolben, die jeweils 800 ml Medium 2 (mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung) enthielten, wurden jeweils mit 40 ml der Kulturbrühe aus den ersten Kolben beimpft und 96 Stunden auf einer Rotationsschüttelmaschine, die mit 220 Umdrehungen/min rotierte, bei 28ºC geschüttelt, wodurch eine zweite Impfkultur erhalten wurde. Zwei 30-1-Krugfermenter, die jeweils 15 l Medium 2 (mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung) enthielten, wurden jeweils mit 1,5 l dieser zweiten Impfkulturbrühe, die zunächst 35 Minuten bei 120ºC sterilisiert und auf 28ºC abgekühlt worden war, beimpft. Die Fermenter wurden 96 Stunden bei 28ºC mit 100 Umdrehungen/min unter Belüftung mit einem Luftstrom von 15 l/min gerührt.

Medium 2:

Glucose 2 %
Lösliche Stärke 1 %
Preßhefe 0,9 %
Fleischextrakt (Kyokuto) 0,5 %
Polypepton 0,5 %
NaCl 0,5 %
CaCO&sub3; 0,3 %
CB442 0,01 %
Wasser auf 100 %
(ph 7,2 vor der Sterilisierung)
Die Prozentsätze sind Gewichtsprozente, bezogen auf das Endvolumen des Mediums.

(B) Gewinnung

3 kg Celite 545-Filterhilfe (Warenzeichen für ein Produkt von Johns Manville Products Corp.) wurden zu 30 l der gesamten vorstehend erhaltenen Kulturbrühe zugesetzt und das Gemisch filtriert. Das Filtrat (29 l) wurden durch eine 6 l Dowex SBR-P (Cl&supmin;) (Warenzeichen für ein Produkt von Dow Chemical) enthaltende Säule gegeben. Der pH-Wert des Eluats wurde dann auf 5,0 eingestellt, wonach die Lösung durch eine 6 l Dowex 50WX4 (H&spplus;) (Warenzeichen für ein Produkt von Dow Chemical) enthaltende Säule gegeben wurde. Das Trehazolin wurde adsorbiert und somit von der Säule zurückgehalten. Die Säule wurde mit 20 l entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 30 l 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert, wodurch 13 l aktive Fraktionen erhalten wurden. Die Gesamtmenge dieses Eluats (13 l) wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, so daß 43,4 g eines rohen, Trehazolin enthaltenden Pulvers erhalten wurden. Das rohe Pulver wurde in 2 l einer 10 mM Ammoniumformiat-Pufferlösung (ph 6,0) gelöst und die Lösung in einer Säule adsorbiert, die 1,5 1 Dowex 50WX4 (Warenzeichen) enthielt und die zuvor mit einer 20 mM Ammoniumformiat-Pufferlösung (pH 6,0) äquilibriert worden war. Die Säure wurde mit 3 l derselben 20 mM Ammoniumformiat-Pufferlösung und dann mit 2 l entionisiertem Wasser gewaschen, wonach mit 0,2 n wäßrigem Ammoniak eluiert wurde. Das Eluat wurde in 500-ml-Anteile fraktioniert. Die Fraktionen 2 bis 4, die nahezu das gesamte Trehazolin enthielten, wurden vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Dann wurde das Produkt lyophilisiert, wodurch 2,55 g eines rohen Pulvers erhalten wurden. Ein rohes Pulver, das durch Wiederholen der Schritte bis zu diesem Punkt hergestellt worden war, wurde direkt ohne weitere Reinigung in Beispiel 3 eingesetzt.
Dieses rohe Pulver wurde an einer mit 200 ml Avicel (Warenzeichen für ein Produkt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) gepackten Säule unter Verwendung von 80 %igem Vol./Vol. wäßrigem Acetonitril adsorbiert. Die Säule wurde mit 700 ml 80 %igem Vol./Vol. wäßrigem Acetonitril gewaschen und dann zunächst mit 500 ml 75 %igem Vol./Vol. wäßrigem Acetonitril und dann mit 700 ml 70 %igem Vol./Vol. wäßrigem Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde in 19-ml-Anteile fraktioniert. Die Trehazolin enthaltenden Fraktionen 35 bis 50 wurden vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Dann wurde der Rückstand lyophilisiert, wodurch 658 mg eines Pulvers erhalten wurden. Das gesamte Pulver wurde in 150 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 6,0 eingestellt. Dann wurde die Lösung in einer mit 300 ml Amberlite CG- 50 (H&spplus;:NH&sub4;&spplus; = 2:3, Warenzeichen) gepackten Säule adsorbiert. Diese Säule wurde mit 500 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 0,1 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 20- ml-Anteile fraktioniert. Die Trehazolin enthaltenden Fraktionen 92 bis 121 wurden vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Dann wurde der erhaltene Rückstand lyophilisiert, wodurch 102,8 mg eines Pulvers erhalten wurden. Das gesamte Pulver wurde in 10 ml einer 2 mM Ammoniumformiat- Pufferlösung (ph 6,0) gelöst und die erhaltene Lösung in einer mit 400 ml Diaion CHP20P (Warenzeichen für ein Produkt von Mitsubishi Kasei Co.) gepackten Säule unter Verwendung derselben 2 mM Ammoniumformiat-Pufferlösung adsorbiert. Die Säule wurde mit derselben 2 mM Ammoniumformiat-Pufferlösung eluiert. Das Eluat wurde in 5-ml-Anteile fraktioniert. Die Trehazolin enthaltenden Fraktionen 59 bis 73 wurden vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde dann lyophilisiert, wodurch 18 mg eines Pulvers erhalten wurden, welches durch Eluieren durch Diaion CHP20P unter Verwendung derselben 2 mM Ammoniumformiat-Pufferlösung als Eluiermittel weiter gereinigt wurde, wodurch 6,2 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden.
Dieses Pulver wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie wie folgt gereinigt. Das Pulver (6,2 mg) wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und auf 3 Silicagel-Platten (Merck Art 7515, 20 x 20 cm) aufgetragen. Die Platten wurden mit einem Gemisch von Acetonitril, Essigsäure und Wasser in einem Volumenverhältnis von 6:1:3 bis auf eine Höhe von 15 cm entwickelt. Die Bande zwischen Rf 0,42 und 0,5 wurde von den Platten abgeschabt und in eine Säule gepackt. Die Säule wurde mit 100 ml entionisiertem Wasser eiuiert. Das Eluat wurde durch eine 5 ml Dowex 50WX4 (H&spplus;) enthaltende Säule gegeben, in der das Trehazolin adsorbiert und so zurückgehalten wurde. Die Säule wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 50 ml 0,5 n wäβrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert und der erhaltene Rückstand lyophilisiert, wodurch 5,1 mg Trehazolin als farbloses Pulver, für das die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ein einziges Maximum zeigte, erhalten wurden.
Das Produkt hatte die folgenden Eigenschaften:
1) Natur und Aussehen: basisches farbloses Pulver
2) Löslichkeit: löslich in Wasser und Methanol, unlöslich in Aceton und Chloroform
3) Farbtest: Schwefelsäure-Reaktion positiv
4) Molekülformel: C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub0;
5) Molekulargewicht: 366 (ermittelt durch FAB-Massenspektroskopie - "FAB" bedeutet Fast Atom Bombardment (Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen)
6) Spezifische Drehung: [α]25D +99,5º (c = 0,41, H&sub2;O)
7) Ultraviolettabsorptionsspektrum: λmax nm (E1%1cm):
Das in Wasser gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt oberhalb von 220 nm keine charakteristischen Absorptionsmaxima
8) Infrarotabsorptionsspektrum: νmax cm&supmin;¹ (in KBr):
3367, 2938, 1663, 1552, 1384 und 1056
9) ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: δ ppm:
Das ¹H-kernmagnetische Resonanzspektrum (400 MHZ) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von TMS (Tetramethylsilan) als äußerer Standard gemessen und zeigte die folgenden Signale:
3,22 (1H, Dublett von Dubletts, J = 8,98 u. 10,31 Hz)
3,38 (1H, Multiplett, J = 2,44, 5,26 u. 10,31 Hz)
3,46 (1H, Dublett von Dubletts, J = 8,98 u. 9,99 Hz)
3,53 (1H, Dublett, J = 11,96 Hz)
3,55 (1H, Dublett von Dubletts, J = 5,26 u. 12,21 Hz)
3,57 (1H, Dublett von Dubletts, J = 5,38 u. 9,99 Hz)
3,62 (1H, Dublett von Dubletts, J = 2,44 u. 12,21 Hz)
3,63 (1H, Dublett, J = 11,96 Hz)
3,77 (1H, Dublett, J 4,89 Hz)
4,02 (1H, Dublett von Dubletts, J = 2,08 u. 4,89 Hz)
4,17 (1H, Dublett, J = 8,55 Hz)
4,77 (1H, Dublett von Dubletts, J = 2,08 u. 8,55 Hz)
5,15 (1H, Dublett, J = 5,38 Hz)
10) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: δ ppm:
Das ¹³C-kernmagnetische Resonanzspektrum (100 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerer Standard gemessen, wobei die folgenden Signale erhalten wurden:
60,7, 61,9, 69,6, 69,9, 72,0, 73,0, 73,0, 80,1, 80,3, 80,6, 82,8, 87,3 und 161,1
11) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:
Trennungssäule: Senshu Pak ODS-H-2151 (Senshu Scientific Co.), 60 x 150 mm (5 u);
Mobile Phase: 10 %ige (Vol./Vol.) Acrylnitril- Wasser-Lösung, die 0,5 % PIC B8 (Produkt von Waters Inc.) enthielt;
Fließrate: 1,5 ml/min;
Überwachte Wellenlänge: Ultraviolett 210 nm;
bei einer Säulentemperatur von 25ºC wurde ein Maximum mit einer Retentionszeit von 6,9 Minuten beobachtet; und
12) Dünnschichtchromatographie:
Rf-Wert 0,44,
Adsorptionsmittel: Silicagel auf Glasplatte
(Merck Art 5715);
Entwicklungsmittel: Gemisch von Acetonitril,
Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis von 6:1:1.

BEISPIEL 2

Herstellung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4- tetraol

Eine Lösung von 19,3 mg Trehazolin (hergestellt wie in dem obigen Beispiel 1 beschrieben) in 1 ml 4 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure wurde in eine Ampulle gegeben und durch Erhitzen auf 100ºC 24 Stunden hydrolysiert. Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser vermischt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde erneut mit Wasser vermischt und zum Abdestillieren der Chlorwasserstoffsäure durch Eindampfen unter vermindertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Der durch diese Destillation erhaltene Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Losung auf 6,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule mit 20 ml Amberlite CG-50 (NH&sub4;&spplus;) - Warenzeichen - gegeben und die Säule mit 60 ml entionisiertem Wasser gwaschen und dann mit 0,2 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand lyophilisiert, wodurch 5,1 mg unreines 5-Amino-1- (hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol als farbloses Pulver erhalten wurden.
Das gesamte oben erhaltene unreine pulverförmige 5-Amino-1- (hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und mittels präparativer Dünnschichtchromatographie wie folgt gereinigt. Die Lösung wurde auf zwei Silicagelplatten (Merck Art 5715, 20 x 20 cm) aufgetragen und unter Verwendung eines Gemisches von Acetonitril, Essigsäure und Wasser in einem Volumenverhältnis von 6:1:3 bis zu einer Höhe von 15 cm entwickelt. Die Bande zwischen Rf 0,36 und 0,47 wurde von der Platte abgeschabt und in eine Säule gepackt, die dann mit 50 ml entionisiertem Wasser eluiert wurde. Das Eluat wurde durch 10 ml Amberlite CG-50 (NH&sub4;&spplus;) gegeben, wobei das 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4- tetraol in der Säule adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 50 ml 0,2 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch 3 mg des gewünschten 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4- tetraols als farbloses Pulver mit den folgenden Eigenschaften erhalten wurden:
1) Farbe und Aussehen: basisches farbloses Pulver
2) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in Aceton und Chloroform
3) Farbtest: Ninhydrinreaktion positiv
4) Molekülformel: C&sub6;H&sub1;&sub3;NO&sub5;
5) Molekulargewicht: 179 (ermittelt durch FAB-Massenspektroskopie)
6) Spezifische Drehung: [α]²&sup5; = -3,7º (c = 0,51, H&sub2;O)
7) Ultraviolettabsorptionsspektrum: max nm (E1cm):
Das in Wasser gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum weist oberhalb 210 nm keinerlei charakteristische Absorptionsmaxima auf
9) ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: δ ppm:
Das ¹H-kernmagnetische Resonanzspektrum (400 MHZ) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerer Standard gemessen, wobei die folgenden Signale erhalten wurden:
3,12 (1H, Dublett, J = 7,1 Hz)
3,56 (1H, Dublett, J = 11,98 Hz)
3,62 (1H, Dublett, J = 12,2 Hz)
3,62 (1H, Dublett, J = 6,8 Hz)
3,78 (1H, Dublett von Dubletts, J = 5,5 u. 6,8 Hz)
3,90 (1H, Dublett von Dubletts, J = 5,5 u. 7,1 Hz)
10) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: δ ppm:
Das ¹³C-kernmagnetische Resonanzspektrum (100 MHZ) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerer Standard gemessen, wobei sich die folgenden Signale zeigten:
57,8, 61,0, 73,6, 79,4, 81,5 und 81,7; und
11) Dünnschichtchromatographie:
Rf-Wert 0,39;
Adsorptionsmittel: Silicagel auf Glasplatte (Merck Art 5715);
Entwicklungsmittel: Gemisch von Acetonitril, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis von 6:1:3

BEISPIEL 3

Herstellung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol

100 g des in Beispiel 1 erhaltenen rohen Pulvers, das etwa 225 mg Trehazolin enthielt, wurden in einem Gemisch von 100 ml Wasser und 150 ml 4 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure gelöst und der pH-Wert der Lösung durch Zusatz von 4 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 eingestellt. Dann wurden zu der Lösung 8 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure und 72 ml Wasser zugesetzt, so daß das Gesamtvolumen 480 ml betrug und eine 0,2 n Chlorwasserstoffsäure-Konzentration erhalten wurde. Die erhaltene Lösung wurde in einen Rundkolben gegeben und in einem Ölbad bei 100ºC 6 Stunden hydrolysiert. Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser vermischt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Zum Abdestillieren der Chlorwasserstoffsäure wurden die Schritte des Vermischens mit Wasser und des Eindampfens bis zur Trockne wiederholt. Der Rückstand wurde in 400 ml Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung durch Zusatz einer 1 n wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Wasser auf ein Volumen von 8 1 verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde durch eine mit 600 ml Amberlite CG-50 (NH&sub4;&spplus;) gepackte Säule gegeben und die Säule mit 6 1 entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 200 ml konzentriert und das Konzentrat durch eine mit 800 ml Dowex 1X2 (OH&supmin;) gepackte Säule gegeben. Die Säule wurde dann mit entionisiertem Wasser eluiert. Nachdem die ersten 1,5 l Eluat verworfen worden waren, wurde das nachfolgende Eluat in 20-ml-Anteile fraktioniert. Jede Fraktion wurde der nachfolgend beschriebenen quantitativen Analyse daraufhin unterzogen, ob sie die gewünschte Verbindung enthielt. Die Fraktionen 70 bis 110, die diese Verbindung enthielten, wurden vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde lyophilisiert, wodurch 30 mg 2- Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]- oxazol-4,5,6-triol als farbloses Pulver mit den folgenden Eigenschaften erhalten wurden:
1) Farbe und Aussehen: basisches farbloses Pulver
2) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in Aceton und Chloroform
3) Molekülformel: C&sub7;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub5;
4) Molekulargewicht: 204 (ermittelt durch FAB-Massenspektroskopie)
5) Spezifische Drehung: [α]25D +10,00 (c = 0,51, H&sub2;O)
6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: λmax nm (E1%1cm)
Das in Wasser gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum wies oberhalb von 210 nm keinerlei charakteristische Absorptionsmaxima auf
7) Infrarotabsorptionsspektrum: νmax cm&supmin;¹ (in KBr)
3358, 1668, 1528, 1398 und 1066
8) ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: δ ppm
Das ¹H-kernmagnetische Resonanzspektrum (500 MHZ) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von TSP (Natriumtrimethylsilylpropionat) als äußerer Standard gemessen und zeigte die folgenden Signale:
3,73 (1H, Dublett, J = 11,72 Hz)
3,82 (1H, Dublett, J = 12,21 Hz)
3,97 (1H, Dublett, J = 4,4 Hz)
4,23 (1H, Dublett von Dubletts, J = 4,4 u. 2,44 Hz)
4,37 (1H, Dublett, J = 8,79 Hz)
5,03 (1H, Dublett von Dubletts, J = 8,79 u. 2,44 Hz)
9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:
Trennungssäule: Asahi Pak ES-502C (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.);
Mobile Phase: 20 mM Ammoniumacetat (pH 8,5) + 50 mM wäßriges Natriumchlorid;
Fließrate: 1 ml/min;
Überwachte Wellenlänge: Ultraviolett 210 nm;
Temperatur: 25ºC
Retentionszeit: 8,39 Minuten

Quantitative Analse von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a5,6'6a- tetrahydro-4H-cyclopent[dioxazol-4'5'6-triol unter Anwendung von Gaschromatographie/Massenspektrometrie

Die obige quantitative Analyse wurde wie folgt durchgeführt:
Eine Probe wurde in einem Lösungsmittel (Wasser) mit bekanntem Flüssigkeitsvolumen gelöst. 10 ul der erhaltenen Lösung wurden in ein Glasröhrchen gegeben und zur Acetylierung bis zur Trockne eingedampft. Zu dem Rückstand wurden 30 ul Essigsäureanhydrid und 50 ul Pyridin zugegeben und das erhaltene Gemisch 40 Minuten bei 60ºC erhitzt. Etwaige Reagentienüberschüsse wurden durch Hindurch leiten eines Stickstoffstroms durch das Reaktionsgemisch entfernt. Der Rückstand- wurde mit einer bekannten Menge eines inneren Standards (Pentaacetyl-1-amino-1-deoxy-β-D- glucose) vermischt und das Gemisch in 100 ul Ethylacetat gelöst, wodurch eine Probe für die Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Analyse erhalten wurde. Die Analyse wurde unter Verwendung einer Quarzglas-Kapillarsäule (Produkt von J & W Scientific Co., DB-5, 15 m) als Gaschromatographiesäule durchgeführt. Es wurde eine Testprobe (2 ul) eingespritzt und die Säulentemperatur bei einer Rate von 25ºC/min von 60ºC auf 280ºC erhöht. Negative Ionen wurden durch ein chemisches Ionisierungsverfahren unter Verwendung von Methangas mit einem Quadrupolmassenspektrometer Trio-1 (Produkt von VG) nachgewiesen. Negative Ionen-Maxima bei m/z 388 (entsprechend der Pentaacetylverbindung als innerem Standard) und bei m/z 413 (entsprechend dem Pentaacetat von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol] wurden für die quantitative Analyse verwendet. Der Gehalt an 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol4,5,6-triol wurde durch ein inneres Standard-Verfahren berechnet.

BEISPIEL 4

Herstellung von2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro- 4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol

(A) Kultur

Zwei 500-ml-Erlenmeyerkolben, die jeweils mit Prallplatten versehen waren und 80 ml Medium 1 (mit der oben in Beispiel 1 angegebenen Zusamensetzung) enthielten, wurden jeweils mit einer von einer Schrägkultur entnommenen Platinschlinge Amycolatopsis sp. SANK 60791 beimpft. Die beimpften Kolben wurden 96 Stunden bei 28ºC auf einer Rotationsschüttelmaschine, die mit 210 Umdrehungen/min rotierte, inkubiert, wodurch eine Impfkulturbrühe erhalten wurde.
Zwei 30-l-Krugfermenter, die jeweils 15 l Medium 2 (mit der oben in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung) enthielten, wurden 30 Minuten bei 120ºC sterilisiert. Dann wurden sie auf 28ºC abgekühlt und mit 75 ml der Impfkulturbrühe beimpft. Die Krugfermenter wurden dann 144 Stunden bei einer Geschwindigkeit im Bereich von 100 bis 400 Umdrehungen/min (um eine Konzentration von 2 ppm gelöstem Sauerstoff aufrechtzuerhalten) und unter Belüftung mit einem Luftstrom von 7,5 l/min gerührt.

(B) Gewinnung

1,5 kg Celite 545-Filterhilfe wurden zu 25 l der gesamten Brühe [erhalten wie oben in (A) beschrieben] zugegeben und das Gemisch filtriert, wodurch 23 l Filtrat erhalten wurden. Der pH-Wert des Filtrats wurde durch Zufügen von wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf 6,0 eingestellt und die Lösung durch eine mit 3 l Amberlite IRC-50 (NH&sub4;&spplus;) gepackte Säule gegeben, wobei das 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 15 l entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 0,5 n wäβrigem Ammoniak eluiert. Nachdem das Eluat alkalisch gemacht worden war, wurden 4,5 l des Eluats aufgefangen und durch Eindampfen unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 200 ml eingedampft. Das Konzentrat wurde durch eine mit 450 ml Dowex 1X2 (OH&supmin;) gepackte Säule gegeben und diese mit entionisiertem Wasser eluiert. Die ersten 800 ml des Eluats wurden verworfen und das nachfolgende Eluate in 20-ml-Anteile fraktioniert. Durch quantitative Analyse durch entweder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, wie später beschrieben, oder Gaschromatographie/Massenspektrometrie wurde ermittelt, daß die Fraktionen 60 bis 90 das gewünschte 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a- tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol enthielten, so daß diese Fraktionen vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert wurden. Das Konzentrat wurde lyophilisiert, wodurch 16,6 mg 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6atetrahydro-4H-cyclopent[djoxazol-4,5,6-triol als farbloses Pulver mit den oben beschriebenen Eigenschaften erhalten wurden.

Quantitative Analyse unter Anwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Trennungssäule:
Asahi Pak ES-502C (Produkt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)
Mobile Phase:
20 mM Ammoniumacetat (pH 8,5) &spplus; 50 mM Kochsalzlösung
Fließrate:
1 ml/min
Wellenlänge für den Nachweis:
210 nm
Temperatur:
25ºC
Retentionszeit:
8,39 Minuten

Quantitative Analyse unter Anwendung von Gaschromatographie/Massenspektrometrie

Die obige quantitative Analyse wurde weitgehend unter Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensschritte durchgeführt.

BEISPIEL 5

Herstellung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro- 4H-cyclopent[d]oxazol-4,56-triol

(A) Kultur

Eine Schrägkultur von Micromonospora sp. SANK 62390 wurde zur Herstellung einer Suspension in 10 ml physiologischer Kochsalz lösung homogenisiert. Zwei 2-1-Erlenmeyerkolben, die jeweils mit Prallplatten versehen waren und 500 ml Medium 3 (mit der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung) enthielten, wurden jeweils mit 1 ml der Suspension beimpft, wonach die beimpften Kolben 96 Stunden bei 28ºC auf einer Rotationsschüttelmaschine, die mit 210 Umdrehungen/min rotierte, inkubiert wurden, wodurch eine erste Impfkulturbrühe erhalten wurde.
Medium 3:
Glucose 2%
Hefeextrakt (Difco) 0,5 %
Polypepton 0,5 %
CaCO&sub3; 0,1 %
CB-442 0,01 %
Wasser auf 100 %
(ph 7,2 vor der Sterilisierung)
Die Prozentsätze sind Gewichtsprozente, bezogen auf das Endvolumen des Mediums.
30 l des Mediums 3 wurden in einen 60-1-Krugfermenter gegeben und 30 Minuten bei 120ºC sterilisiert. Dann wurde auf 28ºC abgekühlt und mit 600 ml der ersten Impfkulturbrühe beimpft. Der Fermenter wurde 48 Stunden bei 28ºC mit 165 Umdrehungen/min unter Belüftung mit einem Luftstrom von 15 l/min gerührt, wodurch eine zweite Impfkulturbrühe erhalten wurde.
Ein 600-l-Behälter, der 300 l des Mediums 4 (mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung) enthielt, wurde 35 Minuten bei 120ºC sterilisiert. Dann wurde auf 28ºC abgekühlt und mit 15 l der zweiten Impfkulturbrühe beimpft. Der Behälter wurde dann 144 Stunden bei 28ºC mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 82 bis 142 Umdrehungen/min (zur Aufrechterhaltung eines Gehaltes an gelöstem Sauerstoff von 2 ppm) unter Belüftung mit einem Luftstrom von 150 l/min und bei einem inneren Druck von 0,5 kg/cm² gerührt.
Medium 4:
Glucose 8%
(zuvor 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert)
Lustergen FK* 2 %
Preßhefe 1,8 %
Fleischextrakt (Kyokuto) 1 %
Polypepton 1%
NaCl 0,5 %
CaCO&sub3; 0,3 %
K&sub2;HPO&sub4; 0,25 %
CB-442 0,02 %
Wasser auf 100 %
(ph 7,2 vor der Sterilisation)
* Handelsname für eine von Nichiden Kagaku Co., Ltd. vertriebene Stärke-Marke

(B) Gewinnung

15 kg Celite 545-Filterhilfe wurden zu 300 1 der gesamten obigen Kulturbrühe zugegeben und das Gemisch filtriert, wodurch 290 1 Filtrat erhalten wurden. Der pH-Wert von 20 l Filtrat wurde durch Zusatz von wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf 6,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde durch eine mit 3 l Amberlite IRC-50 (NH&sub4;&spplus;) gepackte Säule gegeben und das gewünschte 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol in der Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 15 1 entionisiertem Wasser gewaschen und mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Nachdem das Eluat alkalisch geworden war, wurden 4,5 l Eluat aufgefangen und durch Eindampfen unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 150 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde durch eine mit 500 ml Dowex 1X2 (OH&supmin;) gepackte Säule gegeben und mit entionisiertem Wasser eluiert. Der erste Liter wurde verworfen und das nachfolgende Eluat in 20-ml-Anteile fraktioniert. Jede Fraktion wurde wie in Beispiel 3 beschrieben quantitativ analysiert. Es zeigte sich, daß die Fraktionen 58 bis 80 die aktive Verbindung enthielten, so daß diese Fraktionen vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert wurden. Der Rückstand wurde lyophilisiert, wodurch 9,6 mg 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol als rohes Pulver erhalten wurden. Das Pulver wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer mit 100 ml Dowex 1X2 (OH&supmin;) gepackten Säule und Eluieren mit entionisiertem Wasser erneut gereinigt, wodurch 4,8 mg 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol als farbloses Pulver mit den oben beschriebenen Eigenschaften erhalten wurden.

BEISPIEL 6

Herstellung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4- tetraol

Eine Lösung von 16 mg pulverförmigem 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol in 2 ml 6 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure wurde in eine Ampulle eingeschlossen und dann durch Erhitzen auf 100ºC 24 Stunden hydrolysiert. Danach wurde zu dem Hydrolysat Wasser zugesetzt und das erhaltene Gemisch durch Eindampfen unter vermindertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde erneut in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung zur Entfernung der Chlorwasserstoffsäure wiederum bis zur Trockne konzentriert, wonach der erhaltene Rückstand in 20 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung durch Zusatz einer 1 n wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die Lösung wurde durch 20 ml Amberlite CG-50 (NH&sub4;&spplus;) gegeben, wodurch das 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol adsorbiert wurde, worauf die Säule mit 60 ml entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 0,2 n wäßriger Ammoniaklösung eluiert wurde. Das Eluat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch 5 ml eines Konzentrats erhalten wurden. Dieses Konzentrat wurde durch eine mit 50 ml Dowex 1X2 (OH&supmin;) gepackte Säule gegeben und die Säule mit 200 ml entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 20 %igem Vol./Vol. wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde in 5-ml-Anteile fraktioniert. Die Fraktionen 5 bis 23, die eine inhibitorische Wirkung gegenüber β-Glucosidase zeigten, wurden vereinigt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde lyophilisiert, so daß 6,2 mg 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol als farbloses Pulver mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften erhalten wurden.

TESTBEISPIEL 1

BIOLOGISCHE AKTIVITÄT

Inhibitorische Aktivität von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)- cyclopentan-1,2,3,4-tetraol gegenüber β-Glucosidase

Proben von β-Glucosidase (aus Mandeln isoliert), p-Nitrophenyl- β-D-glucopyranosid, Desoxynojirimycin und Castanospermin, die bei diesem Versuch verwendet wurden, wurden sämtlich von Sigma Chemicals Co. bezogen.
Die verwendeten Testverbindungen waren 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol [Verbindung (I)] und Desoxynojirimycin oder Castanospermin, welche beide bekannte Verbindungen dieses Aktivitäts-Typs sind.
Ein Gemisch von 0,01 Einheiten/ml β-Glucosidase und 100 ul einer Pufferlösung (pH 5,6), die 20 mM Citronensäure, 40 mM Dinatriumphosphat und die dem Test unterzogene Verbindung enthielt, wurde 15 Minuten bei 37ºC stehengelassen. Danach wurden zu dem Gemisch 50 41 einer 3 mg/ml p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid enthaltenden Pufferlösung zugegeben und das Gemisch zum Reagieren 20 Minuten bei 37ºC stehengelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 20 ul einer 1 M Glycin/Natriumhydroxid-Pufferlösung (ph 10,4) zugesetzt, worauf die freigesetzte Menge p- Nitrophenol durch das Absorptionsvermögen bei 405 nm überwacht wurde. In Tabelle 7 sind die Konzentrationen jeder Testverbindung angegeben, die notwendig sind, um die Aktivität von β-Glucosidase um 50 % zu hemmen (IC&sub5;&sub0;). Tabelle 7 Inhibitor Konzentration von β-Glucosidase für 50 % Inhibition Verbindung (I) Desoxynojirimycin Castanospermin

TESTBEISPIEL 2

Inhibitorische Aktivität von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol [(Verbindung (II)] aegenüber Ratten-Saccharase

Nach dem Verfahren von M. Kessler et al. [Biochimica et Biophysica Acta, 506, 136-154 (1978)] wurde aus dem Dünndarm von drei männlichen Ratten vom Wistar-Stamm eine Rattendünndarm-Bürstenbesatzmembran-Enzymlösung hergestellt und in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
Eine Probe von 4-Aminoantipyrin (A 4382) wurde von Sigma Chemical Co. bezogen, während Proben von Peroxidase (Güteklasse I) und von Glucoseoxidase (Güteklasse I) von Boehringer Mannheim Co. bezogen wurden. Eine 20 mM Citronensäure und 40 mM Dinatriumphosphat enthaltende Pufferlösung (pH 6,2) wurde bei dem folgenden Versuch als Verdünnungsmittel verwendet.
Jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte (Produkt von Falcon Co.) wurde mit 130 ul eines Gemisches gefüllt, das 0,2 mg Rinderserumalbumin (Sigma, A 7906), 3 Einheiten Glucoseoxidase, 0,132 Einheiten Peroxidase, 20 ug 4-Aminoantipyrin, 40 ug Phenol, 3 uMol Saccharose und eine Testverbindung enthielt. Jeder Vertiefung wurden 20 ul einer 100-fach verdünnten Lösung der Rattendünndarm-Bürstenbesatzmembran-Enzymlösung zugegesetzt. Man ließ das Gemisch 20 Minuten bei 37ºC reagieren, wonach die Menge der freigesetzten Glucose durch das Absorptionsvermögen bei 492 nm überwacht wurde.
Die Glucosekonzentration wurde mit 0 % bzw. mit 100 % Inhibition angenommen, wenn die Enzymreaktionen ohne Zufügen einer Testverbindung bzw. ohne Zufügen einer Enzymlösung durchgeführt wurde. Es zeigte sich, daß die für eine Inhibition der Aktivität von Ratten-Saccharase um 50 % erforderliche Konzentration an Verbindung (II) (IC&sub5;&sub0;) 18 ug/ml betrug.

TESTBEISPIEL 3

Inhibitorische Aktivität von Trehazolin gegenüber Seidenraupen- Trehalase

10 Seidenraupenlarven nach der fünften Häutung (Gesamtgewicht 44 g) wurden in 120 ml einer Pufferlösung (pH 5,6), die unter Verwendung von 20 mM Citronensäure und 40 mM Dinatriumphosphat hergestellt worden war (dieselbe Pufferlösung wurde auch danach verwendet), unter Verwendung eines Polytrone-Homogenisators (Warenzeichen) 2 Minuten unter Eiskühlung homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wurde dann mit 6000 Umdrehungen/min 10 Minuten zentrifugiert und die überstehende Lösung abgetrennt. Zu 120 ml der überstehenden Lösung wurden unter Eiskühlung und Rühren 240 ml Aceton zugegeben und das erhaltene Gemisch mit 9000 Umdrehungen/min 20 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde abgetrennt und in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung lyophilisiert, wodurch 2,0 g Rohenzym erhalten wurden.
130 ul der obigen Pufferlösung, 50 ul einer Probelösung, die Trehazolin in verschiedenen Konzentrationen enthielt, und 50 ul der vorstehend hergestellten Seidenraupen-Enzymlösung, die 4 mg/ml des Enzyms enthielt, wurden in ein Teströhrchen gegeben und das Gemisch 15 Minuten in einem auf 37ºC gehaltenen Wasserbad geschüttelt. Danach wurden 20 ml einer 250 mM Trehaloselösung zugesetzt und das Gemisch 15 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 3 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt, wonach es mit Eiswasser abgekühlt wurde. Dann wurde es mit 3000 Umdrehungen/min 10 Minuten zentrifugiert und die von dem Niederschlag befreite erhaltene Lösung zum Bestimmen der Glucosekonzentration verwendet.
Die Reaktion wurde unter Verwendung des Waku-Glucose C-Tests (Produkt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) und der Probelösung in 10-mal größerer Menge als beim Standardverfahren durchgeführt. Die Inhibitionsrate wurde aus den Glucosekonzentrationen errechnet, die erhalten wurden, wenn bei Verwendung einer Pufferlösung anstelle der Probelösung 0 % und bei Verwendung einer Pufferlösung anstelle der Substrat lösung 100 % Inhibition angenommen werden. Es wurde errechnet, daß die zur Inhibierung der Enzymaktivität um 50 % erforderliche Konzentration (IC&sub5;&sub0;) 2,0 ng/ml betrug.

Claims

1. 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol und dessen pharmazeutisch geeignete Salze.

2. 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a, 5,6, 6a-tetrahydro-4Hcyclopent[d]oxazol-4,5, 6-triol und dessen pharamazeutisch geeignete Salze.

3. Verfahren zur Herstellung von 5-Antino-1-(hydroxymethyl)- cyclopentan-1,2,3,4-tetraol durch Hydrolyse von Trehazolin.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Hydrolyse in Gegenwart einer Säure durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem die Hydrolyse unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß die Herstellung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan- 1,2,3,4-tetraol maximal gefördert und die Bildung von 2- Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d]oxazol-4,5,6-triol auf ein Mindestmaß unterdrückt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, bei dem die Hydrolyse unter Verwendung einer starken Säure durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Hydrolyse unter Verwendung von 4 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure während einer Dauer von 1 Stunde bis 2 Tagen durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Hydrolyse unter Verwendung 4 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure während einer Dauer von 20 bis 24 Stunden durchgeführt wird.

9. Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)- cyclopentan-1,2,3,4-tetraol durch Hydrolyse von 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol- 4,5,6-triol.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Hydrolyse in einem wäßrigen Medium unter Verwendung einer Säure oder einer Base durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Säure Chlorwasserstoffsäure ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, bei dem die Menge der verwendeten Säure 1 bis 20 Mol pro Mol des 2-Amino- 4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d]oxazol-4,5,6-triols beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Menge der verwendeten Säure 5 bis 10 Mol pro Mol des 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol- 4,5,6-triols beträgt.

14. Verfahren nach Ansptuch 10, bei dem die Base Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Bariumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumiodid, Natriumbromid, Kaliumiodid, Ammoniak, Triethylamin, Morpholin, N-Ethylpiperidin oder Pyridin ist.

15. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 14, bei dem die Menge der verwendeten Base 0,01 bis 10 Mol pro Mol des 2- Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d]oxazol-4,5,6-triols beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Menge der verwendeten Base 1 bis 5 Mol pro Mol des 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol- 4,5,6-triols beträgt.

17. Verfahren zur Herstellung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol durch Hydrolyse von Trehazolin.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Hydrolyse in Gegenwart einer Säure durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, bei dem die Hydrolyse unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß die Bildung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol maximal gefördert und die Bildung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan- 1,2,3,4-tetraol auf ein Minimuin unterdrückt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, bei dem die Hydrolyse unter Verwendung einer schwachen Säure durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Hydrolyse unter Verwendung von 0,2 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure während einer Dauer von 1 Stunde bis 2 Tagen durchgeführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Hydrolyse unter Verwendung einer 0,2 n wäßrigen Chlorwasserstoffsäure während einer Dauer von 5 bis 6 Stunden durchgeführt wird.

23. Verfahren zur Herstellung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol durch Züchten eines Mikroorganismus des Genus Micromonospora oder Ainycolatopsis, der zur Bildung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[djoxazol-4,5,6-triol befähigt ist, und Abtrennen des 2-Amino-4-(hydroxymethyl)- 3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triols aus der Kulturbrühe.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem der Mikroorganismus ein Stamm der Spezies ist, zu der Micromonospora sp. SANK 62390, FERN BP-3521 gehört.

25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem der Mikroorganisnus Micromonospora sp. SANK 62390, FERN BP-3521 ist.

26. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem der Mikroorganismus ein Stamm der Spezies ist, zu dem Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERN BP-3513 gehört.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem der Mikroorganismus Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERN BP-3513 ist.

28. Micromonospora sp. SANK 62390, FERN BP-3521.

29. Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERN BP-3513.

30. Arzneinittelzusammensetzung, enthaltend 5-Amino-1- (hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial, Verdunnungsmittel oder Exzipienten.

31. Arzneimittelzusammensetzung, enthaltend 2-Amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol- 4,5,6-triol im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial, Verdünnungsmittel oder Exzipienten.

32. 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol zur Verwendung in der Therapie.

33. 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[d]oxazoi-4,5,6-triol zur Verwendung in der Therapie.

34. Verwendung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan- 1,2,3,4-tetraol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Tumoren oder Tumor-Vorstadien.

35. 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol zur Verwendung zur Behandlung oder Prophylaxe von Tumoren oder Tumor-Vorstadien.

36. Verwendung von 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan- 1,2,3,4-tetraol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe des erworbenen Immunschwächesyndroms (Acquired Immune Deficiency Syndrome).

37. 5-Amino-1-(hydroxymethyl)-cyclopentan-1,2,3,4-tetraol zur Verwendung zur Behandlung oder Prophylaxe des erworbenen Immunschwächesyndroms (Acquired Immune Deficiency Syndrome).

38. Verwendung von 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a- tetrahydro-4H-cyclopent[d]oxazol-4,5,6-triol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Diabetes oder Obesitas.

39. 2-Amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H- cyclopent[djoxazol-4,5,6-triol zur Verwendung zur Behandlung oder Prophylaxe von Diabetes oder Obesitas.