CZ281476B6

CZ281476B6 - Polyhydroxycyklopentanové deriváty, způsob výroby a produkční mikroorganismy

Info

Publication number: CZ281476B6
Application number: CS92439A
Authority: CZ
Inventors: Mutsuo Nakajima; Shuji Takahashi; Kiyoshi Hamano; Hideyuki Haruyama; Akira Sato; Yasuyuki Takamatsu; Ryuzo Enokita; Osamu Ando; Takeshi Kinoshita
Original assignee: Sankyo Company Limited
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1996-10-16
Also published as: IE71947B1; HUT63845A; NO920555L; CZ281418B6; DK0499489T3; NO177589B; AU1094792A; HK117796A; KR920016401A; AU653384B2; HU214702B; NZ241623A; CA2061239C; NO920555D0; NO177589C; CN1043422C; KR100230626B1; DE69202075T2; DE69202075D1; CN1064861A

Abstract

5-amino-1-(hydroxymethyl)cyklopentan-1,2,3,4- -tetraol a 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a- -tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol,kte ré mají schopnost inhibovat aktivitu cukrových hydrolas, zejména beta-glukosidasy a sacharosy a tak mohou být užity k léčení a profylaxi tumorových podmínek, AIDS, diabetu a obesity, se mohou vyrobit hydrolysou trehazolinu. 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H -cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolse může také vyrobit fermentací užívající nově izolované kmeny Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521 a Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513.ŕ

Description

5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4-tetrazol a způsob jeho výroby

Oblast techniky

Vynález se týká 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-1,2,3,4-tetrazolu a způsobu jeho výroby.

Dosavadní stav techniky

Bylo již popsáno, že sloučeniny, mající silnou inhibiční aktivitu proti beta-glukosidáze, jako jsou castanospermin a deoxynojirimycin, jsou užitečné jako antineoplastická činidla a jako látky proti AIDS (R.A. Gruters a další, Nátuře, 330, 74

- 77, 1987, M.J. Humphries a další, Cancer. Res., 56, 5215

- 5222, 1986). Proto se očekává, že sloučeniny, mající schopnost inhibovat aktivitu beta-glukosidázy, budou užitečné jako antineoplastická činidla a látky proti AIDS.

Rovněž bylo popsáno, že sloučeniny, mající silnou inhibiční aktivitu proti sacharóze, jako je AO-128 a Acarbosa, jsou užitečné jako antidiabetická činidla a jako antiobezitní činidla (Satoshi Horii a další, Journal of Medicinal Cehmicstry, 29, 1038 - 1046, 1986, T. Aida a další, Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, 2, 134 - 139, 1981). Proto se očekává, že sloučeniny, mající schopnost inhibovat aktivitu sacharózy, budou užitečné k léčení a profylaxi diabetů a obezity.

Sloučeniny, mající určitou strukturní podobnost se sloučeninami podle vynálezu jsou: mannostatiny, popsané mezi jiným T. Aoyahim a další, The Journal of Antibiotics, sv. XLII, č. 6, 883, 1989, které jak uvedeno, mají schopnost inhibovat aktivitu alfa-D-mannosidázy.

(1S, 2R, 3S, 4R, 5R)-methyl-/2,3,4-trihydroxy-5- (hydroxymethyl )-cyklopentyl/amin, popsaný mimo jiné R.A.Farrem a dalšími, Tetrahedron Letters, 31, 7109, 1990, který jak je rovněž uvedeno, má schopnost inhibovat aktivitu alfa-mannosidázy, allosamidin, popsaný mezi jiným S. Sakudou a dalšími Tetrahedron Letters, 27, 2475, 1986, který, jak je uvedeno, má schopnost inhibovat aktivitu hmyzí chitinázy, a kifunensin, popsaný mezi jiným H. Kayakirim a dalšími, J. Org. Chem., 54, 4015, 1989, který, jak uvedeno, je imunomodulátorem se schopností inhibovat aktivitu alfa-mannosidázy.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří 5-amino-l-(hydroxymethyl)-cyklopentan-1,2,3,4-tetrazol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Tato sloučenina vzorce I

-1CZ 281476 B6

(I) je použitelná při léčení a profylaxi neoplasmatů, AIDS, obezity a diabetů.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4-tetrazolu, který spočívá v tom, že se hydrolyzuje trehazolin při použití koncentrovaného roztoku kyseliny, po dobu 1 hodiny až 2 dnů.

Trehazolin lze vyjádřit vzorcem III

(III) nebo lila

(lila) vzhledem k tautomerii.

Má se za to, že trehazolin může být stejná sloučenina jako ta, jež je nazývána trehalostatin v PCT mezinárodní publikaci č. WO 90/10010.

Trehazolin, který se může užít jako výchozí materiál pro výrobu sloučeniny podle vynálezu, se může připravit kultivací trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Micromonospora nebo Amycolatipsis, výhodně trehazolin produkujícími mikroorganismy rodu Micromonosporu.

Příkladem trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Micromonospora je Micromonospora sp. SANK 62390. Tento mikroorganismus byl nejdříve uložen v domácím depozitáři Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki, ken. Japan 26. července 1990 pod přístupovým číslem FERM P-11631, a pak byl uložen za podmínek Budapeštské

-2CZ 281476 B6 smlouvy Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 21. srpna 1991 s přístupovým číslem FERM BP-3521.

Příkladem trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Amycolatopsis je Amycolatopsis sp. SANK 60791, který byl uložen za podmínek Budapeštské smlouvy ve Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, 14. srpna 1991 s přístupovým číslem FERM BP-3513.

Charakterizace mikroorganismů

Micromonospora sp.. SANK 62390

Kmen Micromonospora sp. SANK 62390 má následující mykologické vlastnosti.

1. Morfologické vlastnosti

Kmen SANK 62390 roste normálně nebo lehce slaběji v průběhu kultivace při 28 ’C po období 7 až 14 dnů na běžném agarovém kultivačním médiu, užívaném k identifikaci kmenů. Substrátové hyphae se vhodně prodlužují a větví, se světle oranžovým, oranžovým až tmavě hnědošedavým zbarvením, ale bez zářezů nebo ostrých obrátek, pozorovaných u kmenů rodu Nocardia. Vzdušná mycelia jsou reedimentární a jsou zbarvena bíle až šedavé bíle. Spory jsou pozorovány na substrátových hyphae ojediněle a,tvoři se po jednom na relativně krátkém sporangioforu. Tvar spor je kulovitý a povrch spor hladký. Nebyly pozorovány žádné speciální orgány, jako jsou sporengie, sklerotie, viry apod.

2. Růst na různých médiích

Kmen byl kultivován při 28 ’C 14 dnů na různých kultivačních médiích a vykazoval vlastnosti, ukázané v tabulce 1. Vyjádření barevných tónů je udáno v barevných číslech v Guide to Color Standard, vydaném Japa Color Research Institute.

V tabulce jsou užity následující zkratky: G růst, AM: vzdušné mycelium, R: reverze /převrácená/, RP: rozpustný pigment.

Tabulka 1 médium sacharózonitrátový agar glukózoasparaginový agar charakteristika

G

AH

R

RP

G vlastnosti lehce slabý, hladký světle oranžový /3-9-6/ nevytvořeno světle oranžový /3-9-6/ nevytvořen lehce, slabý,hladký žlutavě oranžový /12-7-7/

-3CZ 281476 B6

Tabulka 1 - pokračování médium charakteristika vlastnosti

AM R

RP glycerol-aspara- G ginový agar /ISP 5/

AM R

RP anorganické soli G /škrobový agar /IPS 4/

AM R

RP tyrosinový agarG hladký,

AM

R

RP nutriačni agarG /DIFCO/

AM R

RP kvasnivoý extraktG sladový extrakt agar /ISP 2/

AM

R RP ovesnomoučný agarG

AM

R.

RP nevytvořeno světle oranžový /6-8-7/ nevytvořen lehce slabý, hladký světle oranžový /8-7-6/ nevytvořeno světle hnědavě světlý /2-6-6/ nevytvořen dobrý, hladký, světle oranžový /8-7-6/ nevytvořeno šedý /N-5/ nevytvořen lehce slabý, kalně oranžový /6-8-6/ sotva vytvořena rudimentární, bílé hnědavě bílé /2-9-7/ nevytvořen lehce slabý,hladký, žlutavě oranžový /10-8-7/ nevytvořeno kalně žlutavě oranžový /8-8-7/ nevytvořeno dobrý, hladký, tmavě hnědavě šedý /1-4-6/ sotva vytvořeno rudimentární hnědavě bílé/1-8-6/ hnědavě černý /1-2-6/ nevytvořen dobrý, hladký, oranžový /10-7-6/ sotva vytvořena, rudimentární, bílé oranžový /12-7-6/ nevytvořen

-4CZ 281476 B6

Tabulka 1 - pokračování

médium	charakteristika	vlastnosti
vodní agar	G	lehce slabý,
hladký,		bledě žlutavě oranžový /2-9-9/
	AM	nevytvořeno
	R	šedý /N-5/
	RP	nevytvořen
bramborový extrakt	G	dobrý, hladký,
mrkvový extrakt		žlutavě šedý
agar		/1-9-10/
	AM	sotva vytvořeno, rudimentární, bílé
	R	hnědavé bílé /2-9-7/
	RP	nevytvořen

3. Fyziologické vlastnosti

Fyziologické vlastnosti kmene SANK 62390, pozorované v období od 2. dne do 21. dne po začátku kultivace při 28 ’C, ukazuje tabulka 2.

Tabulka 2

hydrolýza škrobu	pozitivní
ztekucení želatiny		pozitivní
redukce nitrátu		negativní
koagulace mléka		pozitivní
peptonizace mléka		pozitivní
produkce melanoidnich pigmentů	/médium 1/*	negativní
	/médium 2/*	negativní
	/médium 3/*	negativní
dekomposice substrátu	kasein	pozitivní
	tyrosin	negativní
	xanthin	negativní
teplotní rozsah pro růst optimální teplota	/médium 4/*	17 - 42 ’
pro růst	/médium R/*	27 - 32 '
tolerance soli		2%

* médium 1: tryptono-kvasnicový extrakt vývar /ISP 1/ médium 2: peptono-kvasnicový extrakt-železitý agar /ISP 6/ médium 3: tyrosinový agar /ISP 7/ médium 4: kvasnicový extrakt-sladový extrakt agar /ISP 2/

Kmen SANK 62390 byl rovněž kultivován při 28 °C s použitím Prichan-Gottjebova agaru /ISP 9/ jako kultivačního média. Asimilaci zdrojů uhlíku, pozorovanou po 14 denní kultivaci, ukazuje tabulka 3.

-5CZ 281476 B6

Tabulka 3

D-glukóza D-fruktóza

L-arabinóza L-rhamnóza využitá využitá využitá

D-xylóza sacharóza Inositol Raffinóza D-mannitol kontrola nevyužitá využitá nevyužitá využit využita nevyužit nevyužita

4. Buněčné složky

Buněčné stěny kmene SANK 62390 byly analyzovány metodou B. Beckera et al. [Apolied Microbiology, 12, 421-423 /1984/] a bylo nalezeno, že obsahují meso-diaminopimelovou kyselinu. Mimoto cukrové složky stěn celých buněk kmene SANK 62390 byly analyzovány metodou M.P. Lechevaliera [journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968/] a bylo nalezeno, že obsahují arabinózu a xylózu, ale nikoli kyselinu mykolovou. Ukázalo se, že acylový typ peptidového glykanu v buněčné stěně je glykolylového typu. Hlavní detekované menachinonové složky byly MK-10/H₆/, MK-10/H₄/ a MK-10/H₈/.

Je proto zřejmé, že tento mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh, patřící k rodu Micromonospora rodiny Actinomycetes. Na tomto základě byl označen jako Micromonospora sp. SANK 62390.

Amycolatospis sp. SANK 60791

Kmen Amycolatopsis sp. SANK 60791 má následující mykologické vlastnosti

1. Morfologické vlastnosti

Kmen SANK 60791 roste normálně nebo lehce slabě v průběhu kultivace při 28 ’C po období od 7 do 14 dnů na běžném agarovém kultivačním médiu, užívaném pro identifikaci kmenů. Hyphae substrátu se prodlužují dobře a větvi hladce nebo nepravidelné, s hnědavě bílým, bledě žlutavě hnědým až tlumeně žlutým zbarvením. Vzduchová mycelia jsou řídká nebo rudimentární s bílým, bledě žlutým až světle oranžovým zbarvením. V posledních stadiích inkubace se někdy pozorují hyphae substrátu a vzdušná mycelia, rozdělená v sekcích, a vzdušná mycelia, mající tyčinkovitou strukturu. Hyphae se prodlužují bez ostrých obratů, pozorovaných u kmenů rodu Nocardia. Nebyly pozorovány žádné speciální orgány, jako jsou sparangie, sklerotie, viry apod.

2. Růst na různých médiích

Kmen byl kultivován při 28 C 14 dnů na různých kultivačních médiích a vykazovat vlastností, ukázané v tabulce 4. Vyjádřené barevných tónů je udáno v barevných číslech v Guide to Color Standard, vydaném Japan Color Research Institute.

-6CZ 281476 B6

V tabulce jsou užity následující zkratky:

G: růst, AM: vzdušné mycelium, R: reverze /převrácená/, RP: rozpustný pigment.

Tabulka 4

Vlastnosti kmene SANK 60791 médium charakteristika vlastnosti

sacharózo-	G	dobrý, hladký,
nitrátový agar	AM	žlutavě šedý /1-9-10/ lehce slabý, bílý
	R	žlutavě šedý /2-9-10/
	RP	nevytvořen
glukóza-asparaginový	G	lehce slabý,
agar	AM	hladký, světle oranžový /3-9-6/ sotva vytvořeno, žlutavě šedý /2-9-10/
	R	světle hnědý /3-8-6/
	RP	nevytvořen
glycerin-asparaginový	G	dobrý, hladký,hnědavě
agar /ISP 5/	AM	bílý /2-9-7/ rudimentární, bílé
	R	bledě-žlutavě hnědý /6-8-8/
	RP	nevytvořen
anorganické soli-	G	lehce slabý, hladký,
škrobový agar		bledě žlutavě hnědý
/ISP 4/	AM	/4-8-9/ rudimentární, bledě žluté /3-9-10/
	R	bledé žlutavě hnědý /6-8-9/
	RP	nevytvořen
tyrosinový agar	G	velmi dobrý,vrásčitý,
/ISP 7/	AM	hnědavě bílý /2-9-6/ sotva vytvořeno, světle oranžové /3-9-6/
	R	světle oranžové /6-8-7/
	RP	nevytvořen
nutriční agar	G	dobrý, hladký, bledé
/DIFCO/	AM	žlutavě hnědý /4-8-8/ rudimentární, bílé
	R	bledé žlutý /3-9-8/
	RP	nevytvořeno

-7CZ 281476 B6

Tabulka 4 - pokračování

Vlastnosti kmene SANK 60791

médium	charakteristika	vlastnosti
kvasnicový extrakt-	G	dobrý, vrásčitý,matně
sladový extrakt		žlutý /10-7-9/
agar /ISP 2/	AM	rudimentární, bílý
	R	matně žlutavě oranžov¹
	RP	/10-7-8/ nevytvořeno
ovesnomoučný agar	G	lehce slabý, hladký,
/ISP 3/		bledě žlutavě hnědý
	AM	/4-8-9/ rudimentární, bílé
	R	bledé-žlutý /4-9-9/
	RP	nevytvořeno
vodní agar	G	lehce slabý, hladký,
	AM	žlutavě šedý /1-9-10/ lehce slabé, bílé
	R	žlutavě šedý
	RP	/1-9-10/ nevytvořeno
bramborový extrakt-	G	lehce slabý, hladký,
mrkvový extrakt		žlutavě šedý
agar		/1-9-10/
	AM	rudimentární, bílé žlutavě šedý /2-9-11/
	R
	RP	nevytvořeno

3. Fyziologické vlastnosti

Fyziologické vlastnosti kmene SANK 60791, pozorované v období od 2. dne do 21. dne po začátku kultivace při 28 ’C ukazuje tabulka 5.

Tabulka 5

hydrolýza škrobu	negativní
ztekucení želatiny		pozitivní
redukce nitrátu		pozitivní
koagulace mléka		pozitivní
peptinizace mléka		negativní
produkce melanoidního pigmentu	/médium 1/*	negativní
	/médium 2/*	negativní
	/médium 3/*	negativní
dekomposice substrátu	kasein	negativní
	tyrosin	pozitivní
	santhin	negativní
tolerance soli	/médium 4/*	3%

-8CZ 281476 B6 * médium 1: tryptona-kvasnicový extrakt vývar /ISP 1/ médium 2: peptono-kvasnicový extrakt-železitý agar /ISP 6/ médium 3: tyrosinový agar /ISP 7/ médium 4: kvasnicový extrakt-sladový extrakt agar /ISP 2/

Kmen SANK 60791 byl rovněž kultivován při 28 °C s použitím Pridham-Gottliebova agaru /ISP 9/ jako kultivačního média. Asimilaci zdrojů uhlíku, pozorovanou po 14 denní kultivaci, ukazuje tabulka 6.

Tabulka 6

D-glukóza D-fruktóza L-arabinóza L-rhamnóza D-xylóza sacharóza Inositol Raffinóza D-mannitol kontrola využita využita slabě -využita využita využita využita nevyužit využita využit nevyužita

4. Buněčné složky

Buněčné stěny kmene SAMK 60791 byly analyzovány metodou B. Beckera et. al. [Applied Microbiology, 12, 421-423 /1984/] a bylo nalezeno, že obsahují kyselinu maso-diaminopimelovou. Mimoto byly analyzovány cukrové složky celých buněčných stěn kmene SANK 60791 metodou M.P. Lechevaliera [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 /1968/] a bylo nalezeno, že obsahují arabinózu, ale že neobsahují kyselinu mykolovou. Bylo stanoveno, že, acylový typ peptidového glykonu v buněčné stěně je acetolového typu. Hlavní detekovaná menachinonová složka byla NK-9/H₄/.

Je proto zřejmé, že mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh, patřící k rodu Amycolatopsis rodiny Actinomycetes. Na tomto základě byl označen jako Amycolatopsis sp. SANK 60791.

Identifikace kmenů SANK 62390 a SANK 60791 byla provedena podle standardů ISP (The International Streptomyces Project), Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology, sv. 4, The Actinomycetes, sv. 2 a ostatní současné literatury o Acrinomycetách.

Bylo potvrzeno, že kmeny SANK 62390 a SANK 60791 vytvářejí trehazolin 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4-tetrazol. Sloučenina (I) podle vynálezu se získá hydrolýzou trehazolinu, vyrobeného jako bylo shora popsáno.

Tato reakce se výhodně uskuteční v přítomnosti kyseliny a musí se provést za přítomnosti vody. Neexistuje žádné určité omezení, pokud jde o povahu užité kyseliny, a jakákoliv kyselina běžně užívaná pro běžné hydrolyzační reakce, se zde může rovněž použít, příklady zahrnují takové anorganické kyseliny, jako jsou kyseliny chlorovodíková nebo sírová, a takové organické kyselina

-9CZ 281476 B6 octová nebo propionová ve vodném roztoku. Výhodnou kyselinou je kyselina chlorovodíková.

Reakce se může realizovat v širokém rozmezí teplot a přesná reakční teplota není pro vynález kritická. Obecně je vhodné provést reakci při teplotě od teploty místnosti do 120 °C, mnohem výhodněji od 90 ’C do 100 °C. Čas, požadovaný pro reakci, může se rovněž široce měnit v závislosti na faktorech, zejména na reakční teplotě a povaze použitých reagencii a rozpouštědla.

Výhodné je užití koncentrované kyseliny, jako 4N vodná kyselina chlorovodíková, a průběh reakce nechat probíhat v období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 20 do 24 hodin.

Nadto se 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2-3-4-tetrazol může vyrobit hydrolýzou 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]- oxazol-4,5,6-triolu. V tomto případě hydrolyzační reakce podle vynálezu se může uskutečnit v přítomnosti kyseliny nebo zásady. Není žádné určité omezení v provozu užité kyseliny nebo zásady a jakákoli kyselina nebo zásada, běžně užívaná v hydrolyzačnich reakcích, se zde může rovněž použít.

Kde je pro reakci užita kyselina, příklady vhodných kyselin zahrnují: anorganické kyseliny, jako jsou kyseliny halogenovodíkové /například chlorovodíková, bromovodíková nebo jodovodíková kyselina/, kyselina sírová, kyselina chloristá, kyselina fosforečná a kyselina dusičná; organické karboxylové kyseliny, jako jsou nižší alkanoické kyseliny /například kyselina mravenči, kyselina octová, kyselina štavelová nebo kyselina trifluoroctová/; nižší alkensulfonové kyseliny /například kyselina methansulfonová, ethansulfonová nebo trifluormethansulfonová/; arylsulfonové kyseliny /například kyselina benzensulfonová nebo p-toluensulfonová atd./. Výhodnými kyselinami jsou anorganické kyseliny, zejména kyselina chlorovodíková.

Obecné se reakce uskuteční výhodně a normálně v přítomnosti rozpouštědla. Nejsou žádná určitá omezení v povaze rozpouštědla, jež má být užito, za předpokladu, že nejsou žádné nepříznivé účinky na reakci nebo na určitá reagencia a že může rozpouštět, při nejmenším v určitém rozsahu, tato reagencia. příklady vhodných rozpouštědel zahrnuji: alkoholy, jako methanol, ethanol, propanol nebo butanol; sulfoxidy, jako dimethylsulfoxid, nebo sulfolan; organické kyseliny, zejména mastné kyseliny, jako kyselina octová nebo propionová; a vodu. Výhodná rozpouštědla zahrnují vodu a směsi vody a organického rozpouštědla.

Množství užité kyseliny je normálně a výhodně od 1 do 20 mol, mnohem výhodněji od 5 do 10 mol, na mol výchozího materiálu.

Reakce se může uskutečnit v rozsahu širokého rozmezí teplot, a přesná reakční teplota není kritická pro vynález. Obecně bylo nalezeno, že je vhodné provést reakci při teplotě od asi teploty místnosti do 150 ’C, mnohem výhodněji od 90 “C do 110 °C. Čas, požadovaný pro reakci se může také široce měnit, zejména podle reakční teploty a povahy užitých reagencii a rozpouštědel. Avšak za předpokladu, že reakce se uskuteční za výhodných podmínek uve

-10CZ 281476 B6 děných shora, bude dostatečné období od 1 hodiny do 2 dnu, mnohem výhodněji od 20 do 30 hodin.

Když je pro reakci užita zásada, příklady vhodných zásad zahrnují anorganické zásady, jako hydroxidy alkalických kovů /například hydroxid lithný, sodný nebo draselný/; hydroxidy kovů alkalických zemin /například hydroxid vápenatý nebo barnatý/; uhličitany alkalických kovů /například uhličitan sodný nebo draselný a halogenidy alkalických kovů /například jodid sodný, bromid sodný nebo jodid draselný/; a organické zásady, jako amoniak; alkylaminy /například triethylamin/; a heterocyklické aminy /například morfolin, N-ethyl-piperidin nebo pyridin/.

Obecně se reakce uskutečňuje výhodně a normálně v přítomností rozpouštědla. Není zde žádné určité omezení v povaze užitého rozpouštědla, za předpokladu, že nemá žádný nepříznivý účinek na reakci nebo na použité reagencia, a že při nejmenším v určitém rozsahu může tato reagencia rozpouštět. Příklady vhodných rozpouštědel zahrnují alkoholy, jako methanol, ethanol, propanol nebo butanol; ethery, jako tetrahydrofuran nebo dioxan, sulfoxidy, jako dimethylsulfoxid nebo sulfolan, a vodu. Výhodná rozpouštědla zahrnují vodu a směsi vody a organického rozpouštědla.

Množství přidané zásady je normálně a výhodně od 0,01 do 10 mol, mnohem výhodněji od 1 do 5 mol, na mol výchozí sloučeniny.

Reakce se může uskutečnit v širokém rozsahu teplot a přesná reakční teplota není kritická pro vynález. Obecně bylo nalezeno vhodným provést reakci při teplotě od asi 0 °C do 120 ’C, mnohem výhodněji od asi teploty místnosti do 100 ’C. Požadovaný čas pro reakci se může rovněž široce měnit v závislosti na mnoha faktorech, zřetelně na reakční teplotě a na povaze užitých reagencií a rozpouštědle. Avšak za předpokladu, že reakce je uskutečněna za shora uvedených výhodných podmínek, bude obvykle dostatečné období od 0,5 hodin do 2 dnů, mnohem výhodněji od 1 hodiny do 20 hodin.

Sloučeniny vzorce I se mohou regenerovat z reakční směsi běžnými prostředky pro oddělení a regeneraci organické sloučeniny, jako jsou různé chromatografické techniky, zejména chromatograf ie na sloupci nebo preparativní chromatografie na tenké vrstvě.

Sloučenina podle vynálezu, 5-amino-l-(hydroxymethyl)-cyklopentan-1,2,3,4-tetrazol obsahuje zásaditý atom dusíku, a tak se mohou vytvořit adiční soli s kyselinami, Není zde žádná určitá restrikce o povaze těchto solí, s výjimkou, že když jsou zamýšleny pro terapeutické užití, jsou farmaceuticky přijatelné. Když jsou zamýšleny pro neterapeutické použití, například jako meziprodukty v přípravě ostatních a možná aktivnějších sloučenin, dokonce není nutno ani toto omezení aplikovat. Příklady takových adičních solí s kyselinami zahrnují: soli s minerálními kyselinami, zejména halogenovodíkovými (jako kyselina fluorovodíková, bromovodíková, jodovodíková nebo chlorovodíková), kyselinu chloristou, kyselinu dusičnou, kyselinu uhličitou, kyselinu sírovou nebo kyselinu fosforečnou, soli s nižšími alkylsulfonovými kyselinami, jako kyselina methansulfonové, trifluormethansulfonová nebo ethansulfonová, soli s arylsulfonovými kyselinami, jako

-11CZ 281476 B6 kyselina benzensulfonová nebo p-toluensulfonová, soli s karboxylovými kyselinami jako kyselina octová, mravenčí, vinná, šťavelová, maleinová, jablečná, jantarová nebo citrónová, a soli s aminokyselinami, kyselina glutamová nebo asparagová.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu nezbytně obsahují ve své molekule několik asymetrických atomů uhlíku, a tak mohou tvořit optické izomery. Ačkoli tyto všechny jsou zde vyjádřeny jediným molekulárním vzorcem, tento vynález zahrnuje jak individuální izolované izomery, tak směsi, včetně jejich racemátů. Jsou-li užity stereospecifické syntetizačni techniky, nebo jsou užity opticky aktivní sloučeniny jako výchozí materiály, mohou se přímo připravit individuální izomery, na druhé straně, je-li připravena směs izomerů, individuální izomery se mohou získat běžnými rozlišovacími technikami.

5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-1,2,3,4-tetrazol má schopnost inhibovat aktivitu beta-glukosidázy a má nízkou toxicitu a proto může být očekáváno, že bude užitečný v léčení a profylaxi tumorů a AIDS.

Když jsou tyto sloučeniny určeny k terapeutickému užití, mohou být aplikovány samostatně nebo ve vhodném farmaceutickém přípravku, obsahujícím vedle aktivní sloučeniny jednu nebo více konvenčních ředidel, nosičů nebo vehikulí. Povaha přípravku bude ovšem závislá na zamýšlené aplikační cestě. Avšak pro orální cestu je sloučenina výhodně upravena jako prášky, granule, tablety nebo kapsle, pro parenterální aplikaci je výhodně připravena jako injekce. Tyto přípravky se mohou připravit podle známých způsobů přidáním takových přídavných látek, jako jsou vehikula, pojivá, dezintegrační činidla, lybrikancia, stabilizátory a korigencia. Ačkoliv se dávkování může měnit v závislosti na symptomech a výšku pacienta, povaze a závažnosti nemocí nebo poruchy a cestě a způsobu aplikace, v případě orální aplikace dospělému člověku, sloučeniny podle vynálezu se mohou normálně aplikovat v denní dávce od 1 do 1000 mg. Sloučeniny mohou být aplikovány v jedné dávce nebo v rozdělených dávkách, například třikrát denně.

Příklady provedení vynálezu

Výroba sloučenin podle tohoto vynálezu je dále objasněna v následujících neomezujících příkladech.

Příklad 1

Výroba trehazolinu

1/A/Kultivace

Plná očkovací klička Micromonospora sp. SANK 62390 se užije k inokulaci každé ze tři 500 ml Erlenmeyerových lahví. Všechny jsou opatřeny přepážkovými destičkami a každá obsahuje médium 1 /mající níže uvedené složení/ a inokulované láhve se inkubují při 28 ’C 216 hodin na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlosti 220 otáček za minutu, k poskytnutí prvé očkované kultury.

-12CZ 281476 B6

Médium 1 glukóza glycerin ovesná mouka sacharóza sojová mouka cesaminové kyseliny stlačené kvasnice CB442 voda

1%

0,5%

1,0%

2,0%

0,5%

1,0%

0,01% do 100 % /pH 7,0 před sterilizací/.

Procenta jsou hmotnostní, založená na konečném objemu média.

Každá ze čtyř 2 litrových Erlenmeyerových láhví, každá obsahující 800 ml média 2 /majícího níže specifikované složení/, byla inokulována 40 ml kultivační tekutiny z prvých láhví, a láhve byly třepány při 28 C 96 hodin na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlostí 220 otáček za minutu, k poskytnutí druhé očkované kultlury. 1,5 litru této druhé očkované kultury se užije k inokulaci každé ze dvou 30 litrových nádob kvasných přístrojů, každá obsahující 15 litrů média 2 /majícího níže specifikované složení/, které bylo nejprve sterilizováno při 120 ’C 35 minut a chlazeno na 28 “C. Kvasné přístroje se promíchávají rychlostí 100 otáček za minutu při 28 °C 96 hodin s provzdušňováním proudem vzduchu 15 litrů za minutu.

Médium 2 glukóza 2% rozpustný škrob 1% stlačené kvasnice 0,9% masový výtažek /Kyokuto/ 0,5% polypepton 0,5%

NaCl 0,5%

CaCO₃ 0,3%

CB442 0,01% voda do 100 % /pH 7,2 před sterilizací/

Procenta jsou hmotnostní, založená na konečném objemu média. /B/ Regenerace kg Celíte 545 filtrační pomůcky /obchodní známka pro výrobek Johns Manville Products Corp./ se přidá ke 30 litrům celkové kultivační tekutiny, získané jak shora popsáno, a směs se filtruje. 29 1 filtrátu se nechá projít přes sloupec, obsahující 6 litrů Dowex SBR-P /CL“/ obchodní značka výrobku Dow Chemical/. pH eluátu se potom upraví na hodnotu 5,0, potom se roztok nechá projít přes sloupec, obsahující 6 litrů Dowex 50WX4 /H⁺/ obchodní značka výrobku bow Chemical/. Trehazolin se adsorbuje a tak se zadrží sloupcem. Sloupec se promyje 20 litry deionizované vody a pak se eluuje 30 litry 0,5N vodného amoniaku, čímž vznikne 13

-13CZ 281476 B6 litrů aktivních frakci. Celek tohoto eluátu /13 litrů/ se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a Lyofylizaci k získání

43,4 g surového prášku, obsahujícího trehazolin. Surový prášek se rozpustí ve 2 litrech 10 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného (pH 6,0/ a roztok se adsorbuje na sloupec, obsahující 1,5 litru Dowex 50WX4 /obchodní název/, který byl předtím ekvilibrován 20 mM pufrovým roztokem mravenčanu amonného /pH 6,0/. Sloupec se promyje 3 litry stejného 20 mH pufrového roztoku mravenčanu amonného, potom 2 litry deionizované vody a potom se eluuje 0,2N vodným amoniakem. Eluát se frakcionuje v 500 ml porcích. Frakce 2 až 4, které obsahují prakticky všechen trehazolin, se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Produkt se pak lyofilizuje, čímž vznikne 2,55 g surového prášku, Surový prášek, připravený opakováním stupňů do tohoto bodu, se přitom užije bez dalšího přečištění v příkladu 3.

Tento surový prášek se adsorbuje na sloupci, naplněném 200 ml Avicelu /obchodní známka pro výrobek Asahi Chemical Industry Co., Ltd/ s použitím 80 % objem/objem vodného acetonitrilu. Sloupec se promyje 700 ml 80 % objem/objem vodného acetonitrilu a pak se nejprve eluuje 500 ml 75 % objem/objem vodného acetonitrilu a pak 700 ml 70 % objem/objem vodného acetonitrilu. Eluát se frakcionuje v 19 porcích. Frakce 35 až 50, obsahující trehazolin, se smísí a koncentrují se odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se pak lyofilizuje, čímž vznikne 658 mg prášku. Všechen tento prášek se rozpustí ve 150 ml vody a pH výsledného roztoku se upraví na hodnotu 6,0. Roztok se pak adsorbuje na sloupci, naplněném 300 ml Amberlite CG-50/H⁺:NH⁺ ₄ = 2:3, obchodní známka/. Tento sloupec se promyje 500 ml deionizované vody a eluuje se 0,lN vodným amoniakem. Eluát se frakcionuje ve 20 ml porcích. Frakce 92 až 121, obsahující trehazolin, se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Výsledný zbytek se pak lyofilizuje, čímž vznikne 102,8 mg prášku. Všechen tento prášek se rozpustí v 10 ml 2 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného /pH 6,0/ a výsledný roztok se adsorbuje na sloupci, naplněném 400 ml Diaion CHP20P /obchodní známka pro výrobek Mitsubishi Kasei Co./, s použitím stejného 2 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného. Eluát se frakcionuje v 5 ml porcích. Frakce 50 až 73, obsahující trehazolin, se smísí a koncentrují se odpařením za sníženého tlaku. Výsledný zbytek se pak lyofilizuje, čímž vznikne 18 mg prášku, který se dále čistí eluci přes Diaion CHP20P s použitím stejného 2 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného jako eluens, čímž vznikne 6,2 mg bezbarvného prášku.

Tento prášek se přečistí preparativní chromatografii na tenké vrstvě, jak dále uvedeno, 6,2 mg prášku se rozpustí v malém množství vody a aplikuje se na 3 silikagelové destičky /Měrek Art 5715, 20x20 cm/. Destičky se vyvinou se směsí 6:1:3 /objemové/ acetonitrilu, kyseliny octové a vody na výšku 15 cm. Svazek mezi Rf 0,42 a 0,5 se odškrábe z destiček a naplní se do sloupce. Sloupec se eluuje 100 ml deionizované vody. Eluát se nechá projít přes sloupec, obsahující 5 ml Dowexu 50WX4 /H⁺/, kde se trehazolin adsorbuje a tak se zadrží. Sloupec se promyje deionizovanou vodou a pak se eluuje 50 ml 0,5N vodného amoniaku. Eluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a výsledný zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 5,1 mg trehazolinu jako bezbarvého

-14CZ 281476 B6 prášku, pro který vysokotlaká kapalinová chromatografia ukazuje jediný pík.

Produkt má následující vlastnosti:

1. Povaha a vzhled zásaditý bezbarvý prášek.

2. Rozpustnost: rozpustný ve vodě a methanolu, nerozpustný v acetonu a chloroformu.

3. Barevný test: pozitivní na kyselinu sírovou.

4. Molekulární vzorec: C₁₃H₂2ⁿ2°io·

5. Molekulární hmotnost: 366 /určeno FAB-hmotnostní spektroskopie - FAB je Fast/rychlé/-Atomové-Bombardment/bombardování/.

6. Specifická rotace: [α]²⁵θ + 99,5’ /c=0,41, H₂0/.

7. Ultrafialové absorpční spektrum: A_nax nm /E i_cin/, ultrafialové absorpční spektrum, měřené ve vodě, nevykazuje žádná charakteristická absorpční maxima nad 220 nm.

8. Infračervené absorpční spektrum: Ý ^ci¹ /v KBr/, 3367, 2938, 1663, 1552, 1384 a 1056.

9. ^H-nukleární magnetické rezonanční spektrum: δ ppm, ^H-nukleární magnetické rezonanční spektrum /400 MHz/ bylo měřeno v deuterium oxidu, s užitím TMS /tetramethylsilanu/ jako externího standardu a vykazovalo následující signály:

3,22 /1H, dublet dubletů, J=8,98 a 10,31 Hz/,

3,38 /1H, multiplet, J = 2,44, 5,26 a 10,31 Hz/,

3,46	/1H,	dublet dubletů, J	= 8,98	a	9,	99	Hz/,
3,53	/1H,	dublet, J = 11,96	Hz/,
3,55	/1H,	dublet dubletů, J	= 5,26	a	12	,21	Hz/,
3,57	/1H,	dublet dubletů, J	= 5,38	a	9,	99	Hz/,
3,62	/1H,	dublet dubletů, J	= 2,44	a	12	,21	• HZ/,
3,63	/1H,	dublet, J = 11,96	Hz/,
3,77	/1H,	dublet, J = 4,89 :	HZ/,
4,02	/1H,	dublet dubletů, J	= 2,08	a	4,	09	Hz/,
4,17	/1H,	dublet, J = 8,55	Hz/,
4,77	/1H,	dublet dubletů, J	= 2,08	a	8,	55	Hz/,
5,15	/1H,	dublet, J = 5,38	Hz/.

10.¹³C-nukleárni magnetické rezonanční spektrum: δ ppm, ¹³C-nukleární magnetické rezonanční spektrum /100 MHz/ bylo měřeno v deuterium oxidu, s použitím tetramethylsilanu jako externího standardu a vykazovalo následující signály:

60,7, 61,9, 69,6, 72,0, 73,0, 80,1, 80,3, 80,6, 82,8, 37,3 a 161,1

11.Vysokotlaká kapalinová chromatografie: sloupec pro oddělení: Senshu Pak ODS-H-2151 /Senshu Scientific Co./ 6φ x 150 mm /5, u/;

mobilní fáze: 10 % /objem/objem/ acetonitril-voda, obsahující

-15CZ 281476 B6

0,5 % PIC 88 /výrobek Xaters Inc./; rychlost proudu: 1,5 ml/minutu;

monitorovaná vlnová délka: ultrafialová 210 nm;

pík, mající retenční čas 6,9 minut, byl pozorován při teplotě sloupce 25 ’C,

12.Chromatografie na tenké vrstvě:

Rf hodnota: 0,44

Adsorbent: silikagel na skleněné destičce /Měrek Art 5715/, vyvíjecí rozpouštědlo: 6:1:3 /objemově/ směs acetonitrilu, kyseliny octové a vody.

Příklad 2

Výroba 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetrazolu

Roztok 19,3 mg trehazolinu /připraveného jak popsáno v příkladu 1/, rozpuštěného v 1 ml 4N vodné kyseliny chlorovodíkové, se umístí do ampule a hydrolyzuje se zahříváním při 100 °C 2) hodin. Na konci této doby se reakční směs smísí s vodou a potom se koncentruje do sucha odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se opět smísí s vodou a koncentruje do sucha odpařením za sníženého tlaku k oddestilování kyseliny chlorovodíkové. Zbytek z této destilace se rozpouští ve 20 ml vody a pH roztoku se upraví na 6,0. Výsledný roztok se nechá projít přes sloupec 20 ml Amberlitu CH-50 /NH⁺ ₄/ - obchodní známka - a sloupec se promyje ml deionizované vody a pak se eluuje 0,2N vodným amoniakem. Eluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 5,1 mg nečistého 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetrazolu jako bezbarvého prášku.

Celý objem 5,1 mg /nečistého prášku 5-amino-l-/hydroxy-methyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetrazolu, získaného jak shora popsáno, se rozpustí v malém množství vody a přečistí se pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě, jak dále uvedeno. Roztok se aplikuje na dvě silikagelové destičky (Měrek Art 5715, 20 x 20 cm/ a vyvine se s užitím 6:1:3 /objemově/ směsi acetonitrilu, kyseliny octové a vody až do výšky 15 cm. Svazek mezi Rf 0,36 a 0,47 se odškrábe z destičky a naplní se do sloupce, který se pak eluuje 50 ml deionizované vody. Eluát se nechá projít přes 10 ml Amberlitu CG-50 /NH⁺ ₄/, 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetrazol se adsorbuje na sloupci. Sloupec se pak promyje 50 ml deionizované vody a eluuje 50 ml 0,2N vodného amoniaku. Eluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a lyofilizuje, čímž vzniknou 3 mg žádaného 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetrazolu jako bezbarvého prášku, který má následující vlastnosti:

1. Barva a vzhled: zásaditý bezbarvý prášek.

2. Rozpustnost: rozpustný ve vodě, nerozpustný v acetonu a chloroformu.

3. Barevný test: pozitivní na ninhydrinovou reakci.

-16CZ 281476 B6

4. Molekulární vzorec: C₆H₁₃NO₅.

5. Molekulární hmotnost: 179 /určena FAB hmotovou spektroskopii/.

6. Specifická rotace [a]^D ₂₅ = - 3,7’ /c = 0,51, H₂0/.

7. Ultrafialové absorpční spektrum: A _max ^nm /^E1%icn/^; ultrafialové absorpční spektru, měřené ve vodě, nevykazuje žádná charakteristická absorpční maxima nad 210 nm.

8. Infračervené absorpční spektrum: Ý __ /v KBr/, 3358, 1668,

1397 a 1066.

9. ^-H-nukleární magnetické rezonanční spektrum: δ ppm, ¹H-nukleární magnetické rezonanční spektrum /400 MHz/bylo měřeno v deuterium oxidu, s použitím tetramethylsilanu jako externího

standardu a vykazovalo následující signály:
3,12	/1H,	dublet, J = 7,1	Hz/,
3,56	/1H,	dublet, J = 11,	98 Hz/,
2,62	/1H,	dublet J = 12,2	Hz/,
3,62	/1H,	dublet, J = 6,8	Hz/,
3,78	/1H,	dublet dubletu,	J = 5,5	a 6,8 Hz/
3,90	/1H,	dublet dubletů,	J = 5,5	a 7,1 Hz/

10.¹³C-nukleární magnetické rezonanční spektrum δ ppm, ¹³c-nukleární magnetické rezonanční spektrum /100 MHz/ bylo měřeno v deuterium oxidu, s použitím tetramethylsilanu jako externího standardu a vykazovalo následující signály: 57,8, 61,0, 73,6, 79,4, 31,5 a 81,7.

11.Chromatografie na tenké vrstvě:

Rf hodnota: 0,39, adsorbent: silikagel na skleněné destičce /Měrek Art. 5715/, vyvíjející rozpouštědlo: 6:1:3 /objemově/ směs acetonitrilu, kyseliny octové a vody.

Příklad 3

Výroba 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetrazolu

Roztok 16 mg prášku 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu, rozpuštěného ve 2 ml 6N vodné kyseliny chlorovodíkové, se uzavře v ampuli a pak se hydrolyzuje zahříváním na 100 ’C po 24 hodin. Na konci této doby se k hydrolyzátu přidá voda a výsledná směs se koncentruje do sucha odpařením za sníženého tlaku k odstranění kyseliny chlorovodíkové, a pak se výsledný zbytek rozpustí ve 20 ml vody a pH roztoku se upraví na 6,0 přidáním IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Roztok se nechal projít přes 20 ml Amberlitu CG-50 /NH⁺ ₄/ k zadržení 5-amino-l-/hydroxymethyl/-cyklopentan-l,2,

3,4-tetrazolu adsorpci a sloupec se promyje 60 ml deionizované vody a pak se eluuje 0,2N vodným roztokem amoniaku. Eluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku, aby se získalo 5 ml koncentrátu. Tento koncentrát se umístí na sloupec, naplněný

-17CZ 281476 B6 ml Dowexu 1x2 /OH^-/, a sloupec se promyje 200 ml deionizované vody a pak se eluuje 20 % objemu/objem vodným mechanolem. Eluát se frakcionuje v 5 ml porcích. Frakce 5 až 23, které vykazují inhibiční aktivitu proti beta-glukosidáze, se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Koncentrát se lyofilizuje, čímž vznikne 6,2 mg 5-amino-l-/hydroxymethyl/-cyklopenten-l,2,3,4-tetrazolu jako bezbarvého prášku, majícího shora popsané vlastnosti .

Testovací příklad 1

Biologická aktivita

Inhibiční aktivita 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetrazolu proti beta-glukosidáze

Vzorky beta-glukosidázy /oddělená od mandlí/, p-nitrofenyl-beta-O-glukopyranosidu, deoxynojirimycinu a castanosperminu, užité v tomto pokuse, byly všechny zakoupeny od Sigma Chemical Co.

Užité testované sloučeniny byly 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopenten-1,2,3,4-tetrazol [sloučenina /1/] a deoxynojirimycin nebo castanospermin, obě jsou známé sloučeniny s tímto typem aktivity.

Směs 0,01 jednotky/ml beta-glukosidázy a 100 μΐ roztoku pufru /pH 5,6/, tvořeného 20 ml kyseliny citrónové, 40 mH hydrogenfosforečnanu sodného s testovanou sloučeninou se ponechá stát při 37 ’C 15 minut. Na konci tohoto období se přidá ke smési 50 μΐ roztoku pufru, obsahujícího 3 mg/ml p-nitrofenyl-beta-0-glukopyranosidu, směs se pak ponechá reagovat při 37 C 20 minut. K reakční smési se přidá 20 μΐ roztoku pufru 1M glycin/hydroxid sodný /pH 10,4/ a množství uvolněného p-nitrofenolu se monitoruje absorbanci při 405 nm. Tabulka 7 uvádí koncentrace každé testované sloučeniny, potřebné inhibovat aktivitu beta-glukosidázy na 50 % /IC₅₀/.

Tabulka 7 inhibitor

50% inhibiční koncentrace beta-glukosidázy sloučenina /1/ deoxynoj irimycin castanospermin

1,0 μg/ml μg/ml

4,3 μg/ml

-18CZ 281476 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4-tetrazol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.
2. Způsob výroby 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4- tetrazolu, vyznačující se tím, že se hydrolyžuje trehazolin při použití koncentrovaného roztoku kyseliny, po dobu 1 hodiny až 2 dnů.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se hydrolýza provede s použitím 4N vodné kyseliny chlorovodíkové po období od 20 hodin do 24 hodin.
4. Způsob výroby 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4-tetrazolu, vyznačující se tím, že se hydrolyzuje 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se hydrolýza uskutečňuje ve vodném médiu s užitím kyseliny nebo zásady.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že užitá kyselina je kyselina chlorovodíková.
7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že množství užité kyseliny je od 1 do 20 mmol na mol 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5-6-triolu.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že množství užité kyseliny je od 5 do 10 mmol na mol 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu.
9. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se užije jako zásada hydroxid lithný, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid barnatý, uhličitan sodný, uhličitan draselný, jodid sodný, bromid sodný, jodid draselný, amoniak, triethylamin, morfolin, N-ethylpiperidin nebo pyridin.
10. Způsob podle nároku 5 nebo 9, vyznačující se tím, že množství použité zásady je od 0,01 do 10 mol na mol 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že množství užité zásady je od 1 do 5 mol na mol 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu.