NO301488B1 - Polyhydroksycyklopentanderivat, fremgangsmåte til fremstilling derav, samt biologisk rene stammer av mikroorganismer som er anvendelige i fremgangsmåten - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et polyhydrok-sycyklopentanderivat som har visse verdifulle biologiske virkninger. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte til fremstilling av derivatet, samt biologisk rene stammer av mikroorganismer som er anvendelige i fremgangsmåten.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen er 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol, hvis formel (II) er angitt nedenfor. Denne forbindelsen kan fremstilles ved fermentering. Men 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol gjennomgår tautomeri, og kan derfor også angis med den nedenfor viste formel (Ila):

Forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse har evnen til å inhibere aktiviteten til forskjellige sukkerhydrolaser, særlig p-glukosidase og sukrase.

Det er blitt rapportert at forbindelser som har en sterk inhiberende aktivitet mot p-glukosidase, såsom kastano-spermin og deoksynojirimycin, er anvendelige som anti-neoplastiske midler og som midler mot AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) (R.A. Gruters et al., Nature, Vol 330, 1987, p. 74-77 og M.J. Humphries et al., Cancer Res., Vol 46, 1986, p. 5215-5222). Det forventes derfor at forbindelser som har evnen til å inhibere aktiviteten til p-glukosidase vil være anvendelige som anti-neoplastiske midler eller midler mot

AIDS.

Det er også blitt rapportert at forbindelser som har en sterkt inhiberende aktivitet mot sukrase, såsom AO-128 og Acarbose, er anvendelige som anti-diabetiske midler og midler mot fettsyke (Satoshi Horii et al., Journal of Medicinal Chemistry, Vol 29, 1986, p. 1038-1046 og T. Aida et al., Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, Vol 34, (2), 1981, p. 134-139). Det forventes derfor at forbindelser som har evnen til å inhibere aktiviteten til sukrase vil være anvendelige til behandlingen og forebyggingen av sukkersyke og fettsyke.

Forbindelser som har en viss strukturell likhet med forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse er: mannostatinene som blant annet er beskrevet av T. Aoyagi et al i The Journal of Antibiotics, Vol. XLII, nr. 6, 1989, p. 883, som sies å ha evnen til å inhibere aktiviteten til a-D-mannosidase,

(IS,2R,3S,4R,5R)-metyl[2,3,4-trihydroksy-5-(hydroksy-metyl )cyklopen tyl] amin, som er blant annet beskrevet avR.A. Farr et al. i Tetrahedron Letters, Vol 31, 1990, p. 7109, som også sies å ha evnen til å inhibere aktiviteten til a-mannosidase,

allosamidin, som er beskrevet blant annet av S. Sakuda et al. i Tetrahedron Letters, Vol 27, 1986, p. 2475, som sies å ha evnen til å inhibere aktiviteten til insekt-chitinase, samt

kifunensin, som blant annet er beskrevet av H. Kaya-

kiri et al. i J. Org. Chem., Vol 54, 1989, p. 4015, som sies å være en immunmodulator med evnen til å inhibere aktiviteten til a-mannosidase.

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å frembringe en ny forbindelse som har inhiberende aktivitet mot visse sukkerhydrolaser.

Det er et annet formål med oppfinnelsen å frembringe en forbindelse som har slik aktivitet og som derfor forventes å være anvendelig i behandlingen og forebyggingen av neoplas-maer, AIDS, fettsyke og sukkersyke.

Den kjemiske forbindelse ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at den er 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]-oksazol-4,5,6-triol, samt farmasøytisk akseptable salter derav, som har den ovenfor angitte formelen (II).

Ifølge oppfinnelsen fremstilles 2-amino-4-,5, 6-triol ved en fremgangsmåte som er kjennetegnet ved dyrking av mikroorganismen Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521 eller mutanter derav med vesentlig de samme morfologiske og biokjemiske egenskaper, eller mikroorganismen Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513 eller mutanter derav med vesentlig de samme morfologiske og biokjemiske egenskaper, som er i stand til å danne 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triolen, og fraskilling av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetra-hydro-4H-cyklopent[d]-oksazol-4,5,6-triolen fra dyrkingsmediet.

Ifølge oppfinnelsen er det således også tilveiebrakt en biologisk ren stamme av en mikroorganisme av slekten Micromonospora, Micromonospora sp. SANK 62390. Denne mikroorganisme ble først deponert på deponeringsstedet til Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan den 26. juli 1990 under aksesjonsnummeret FERM P-11631, og ble deretter deponert i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology den 21. august 1991 med aksesjonsnummeret FERM BP-3521.

Ifølge oppfinnelsen er det videre tilveiebrakt en biologisk ren stamme av en mikroorganisme av slekten Amycolatopsis, Amycolatopsis sp. SANK 60791, som ble deponert i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan den 14. august 1991 med aksesjonsnummeret FERM BP-3513.

Karakterisering av mikroorganismer

Micromonospora sp. SANK 62390

Stammen Micromonospora sp. SANK 62390 har følgende mykologiske egenskaper:

1. Morfologiske karakteristika

Stamme SANK 62390 vokser normalt eller litt dårlig under dyrking ved 28°C i et tidsrom på fra 7 til 14 dager på et vanlig agar dyrkingsmedium anvendt for identifisering av stammen. Substrathyfer forlenges skikkelig og forgrener seg med en lys orange, orange til mørkebrunaktig grå farge, men uten innsnittene eller de skarpe svinger som iakttas i stammer av slekten Nocardia. Luftmycelier er rudimentære og er farget hvite til brunhvite. Sporer iakttas bare på substrathyfer og dannes én etter én på en forholdsvis kort sporangiofor. Spore-formen er sfærisk og sporeoverflaten er glatt. Ingen spesielle organer, såsom sporangia, hviteknoller, snurringer eller lignende iakttas.

2. Vekst på forskjellige medier

Stammen ble dyrket ved 28°C i 14 dager på forskjellige dyrkingsmedier og oppviste de egenskaper som er vist i tabell 1. Angivelse av fargetonene er indikert med fargetupp-tallet i "Guide to Color Standard" utgitt av Japan Color Research Institute.

I tabellen benyttes følgende forkortelser:

G: vekst, AM: luftmycelium, R: omvendt, SP: løselig pigment.

Stammen SANK 62390 ble også dyrket ved 28"C under anvendelse av Pridham-Gottlieb agar (ISP 9) som dyrkingsmedium. Assimileringen av karbonkilder som ble iakttatt etter dyrking i 14 dager er vist i tabell 3.

4. Cellebestanddeler

Celleveggene til stammen SANK 62390 ble analysert ved fremgangsmåten til B. Becker et al., Applied Microbiology, Vol 12, 1984, p. 421-423, og viste seg å inneholde meso-diamino-pimelinsyre. Dessuten ble sukkerbestanddelene i hele celleveggene til stammen SANK 62390 analysert ved fremgangsmåten til M.P. Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine, Vol 71, 1968, p. 934, og viste seg å inneholde arabinose og xylose, men ikke mykolinsyre. Peptidet glykan av acyltype i cellen viste seg å være av glykolyltypen. Hovedmekaninonbe-standdelene som ble påvist var MK-10(H6), MK-10(H4) samt MK-10(H8).

Det er derfor klart at denne mikroorganisme skal klassifiseres som en ny art som hører til slekten Micromonospora av familien Actinomycetes. På denne basis ble den betegnet som mikromonospora sp. SANK 62390.

Amycolatopsis sp. SANK 60791

Stammen Amycolatopsis sp. SANK 60791 har følgende mykologiske egenskaper:

1.Morfologiske karakteristika

Stamme SANK 60791 vokser normalt eller litt dårlig under dyrking ved 28°C i et tidsrom på fra 7 til 14 dager på et vanlig agar dyrkingsmedium anvendt for identifisering av stammen. Substrathyfer forlenges skikkelig og forgrener seg jevnt eller uregelmessig med en brunaktig hvit, lys gulaktig brun til svak gul farge. Luftmycelier er få eller rudimentære med hvit, lysegul til svakt orange farge. På senere stadier av inkuberingen delte substrathyfer og lyftmycelier seg i seksjo-ner, og det iakttas til tider luftmycelier med bacillstruktur. Hyfene forlenges uten de skarpe svinger som iakttas i stammer av slekten Nocardia. Ingen spesielle organer, såsom sporangia, hviteknoller, snurringer eller lignende iakttas.

2. Vekst på forskjellige medier

Stammen ble dyrket ved 28°C i 14 dager på forskjellige dyrkingsmedier og oppviste de egenskaper som er vist i tabell 4. Angivelse av fargetonene er indikert med fargetupp-tallet i "Guide to Color Standard" utgitt av Japan Color Research Institute.

I tabellen benyttes følgende forkortelser:

G: vekst, AM: luftmycelium, R: omvendt, SP: løselig pigment.

3. Fysiologiske egenskaper

Stammen SANK 60791 sine fysiologiske egenskaper iakttatt i tidsrommet fra dag 2 til dag 21 etter begynnelsen av dyrkingen ved 28°C er vist i tabell 52.

Stammen SANK 60791 ble også dyrket ved 28°C under anvendelse av Pridham-Gottlieb agar (ISP 9) som dyrkingsmedium. Assimileringen av karbonkilder som ble iakttatt etter dyrking i 14 dager er vist i tabell 6.

4. Cellebestanddeler

Celleveggene til stammen SANK 60791 ble analysert ved fremgangsmåten til B. Becker et al., Applied Microbiology, Vol 12, 1984, p. 421-423, og viste seg å inneholde meso-diamino-pimelinsyre. Dessuten ble sukkerbestanddelene i hele celleveggene til stammen SANK 60791 analysert ved fremgangsmåten til M.P. Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine, Vol 71, 1968, p. 934, og viste seg å inneholde arabinose, men ikke mykolinsyre. Peptidet glykan av acyltype i celleveggen viste seg å være av acetyltypen. Hovedmekaninonbestanddelen som ble påvist var MK-9(H4).

Det er derfor klart at denne mikroorganisme skal klassifiseres som en ny art som hører til slekten Amycolatopsis av familien Actinomycetes. På denne basis ble den betegnet som Amycolatopsis sp. SANK 60791.

Identifisering av stammene SANK 62390 og SANK 60791 ble gjort i overensstemmelse med standardene til ISP (The International Streptomyces Project), Bergey's Manual of Syste-matic Bacteriology, Vol 4, The Actinomycetes, Vol 2 og annen nyere litteratur vedrørende Actinomycetes.

Det er blitt fastslått at stammene SANK 62390 og SANK 60791 danner trehazolin og 2-amino-4-(hydroksymetyl)- 3a, 5, 6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol. Men som kjent kan egenskapene til sopp generelt og actinomycet-mikroorganismer spesielt variere betydelig, og slike sopper kan lett gjennomgå mutasjon, både på grunn av naturlige år-saker og som resultatet av anvendelse av kunstige midler, f.eks. ultrafiolett stråling, radioaktiv stråling, kjemisk behandling etc. Følgelig omfatter den foreliggende oppfinnelse anvendelsen av enhver mikroorganisme som kan klassifiseres innen slekten Micromonospora eller Amycolatopsis og som deler med stammene SANK 62390 og SANK 60791 den karakteristiske evne å danne trehazolin og 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol. De nye mikroorganismer, stammene SANK 62390 og SANK 60791 forventes ikke å være en unntagelse, og betegnelsene "SANK 62390" og "SANK 60791" omfatter alle mutanter av disse stammer som deler med stammene SANK 62390 og SANK 60791 den karakteristiske evne å danne trehazolin og 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a, 5,6,6a-tetra-hydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5, 6-triol. Dessuten omfatter disse mutanter alle de som oppnås ved hjelp av genetiske metoder, f.eks. rekombinering, transduksjon, transformasjon eller lignende. Det er en enkel forsøkssak å bestemme, på grunnlag av den informasjon som gis her når det gjelder egenskapene til trehazolin og 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6, 6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol, om en vilkårlig gitt stamme danner disse forbindelser eller danner dem i tilstrekkelig mengde til å gjøre stammen av mulig kommersiell interesse.

Trehazolin og 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4, 5, 6-triol ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved dyrking av disse stammer av sopp i dyrkingsmedier av den type som vanligvis anvendes til fremstillingen av andre fermenteringsprodukter fra lignende mikroorganismer. Slike medier inneholder nødvendigvis mikrobiolo-gisk assimilerbare kilder for karbon og nitrogen samt uorganiske salter, slik det er velkjent for fagfolk på området.

Foretrukne eksempler på karbonkilder omfatter: glukose, fruktose, maltose, sukrose, mannitol, glycerol, dek-strin, havre, rug, maisstivelse, potetstivelse, maismel, soya-bønnemel, bommullsfrøkake, bommullsfrøolje, melasse, sitronsyre, vinsyre og lignende. Slike forbindelser kan anvendes alene eller i enhver egnet kombinasjon. Generelt kan mengden som anvendes variere i området fra 1 til 10 vekt% av dyrkingsmediet.

Foretrukne nitrogenkilder er vanligvis proteinholdige materialer, såsom de som vanligvis anvendes i en fermenter-ingsprosess. Eksempler på slike nitrogenkilder omfatter: soya-bønnemel, hvetekli, peanøttmel, bommulsfrøkake, bommulsfrø-olje, bommulsfrømel, kaseinhydrolysater, farmamin, fiskemel, maisstøpevæske, pepton, kjøttekstrakt, gjær, gjærekstrakt, maltekstrakt, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og lignende. Disse nitrogenkilder kan anvendes alene eller i enhver kombinasjon. Vanligvis foretrekkes det å anvende dem i en konsentrasjon på mellom 0,2 og 6 vekt% av dyrkingsmediet.

De uorganiske næringssalter som kan tilsettes til dyrkingsmediet er konvensjonelle salter som er i stand til å

frembringe forskjellige ioner som er nødvendige for mikroorga-nismenes vekst, såsom natrium, ammonium, kalsium, fosfat, sul-fat, klorid og karbonat. I tillegg bør mediet inneholde mindre mengder essensielle sporelementer, såsom kalium, kalsium,

kobolt, mangan, jern og magnesium.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres ved hjelp av en metode med væskeformet kultur anvendes det fortrinnsvis et anti-skummingsmiddel, såsom en silikonolje, planteolje, eller overflateaktivt stoff, i dyrkingsmediet. pH i dyrkingsmediet til fremstilling av trehazolin eller 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol ved dyrkingen av mikroorganismer av slektene Micromonospora og Amycolatopsis, særlig stammene SANK 62390 og SANK 60791, varierer fortrinnsvis i området fra 5,0 til 8,0, mer foretrukket fra 6,5 til 7,5.

Dyrkingen kan utføres ved enhver temperatur i området fra 15 til 38°C, selv om en temperatur på fra 22 til 38°C foretrekkes for god vekst, og en temperatur på fra 22 til 28°C foretrekkes for å optimalisere dannelsen av trehazolin og 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent-[d]oksazol-4,5,6-triol.

Disse forbindelser fremstilles under aerobiske kulturbetingelser og ved konvensjonelle aerobiske kultur-metoder, såsom fast kultur, rystet kultur og kultur med lufting og omrøring (neddykket). Ved dyrking i liten skala er rystet kultur i noen få dager ved 28°C typisk. Ved en slik kulturmetode i liten skala kan kulturen initieres med ett eller to for-formeringstrinn, hvor det fremstilles kimkulturer i f.eks. Erlenmeyer-kolber utstyrt med skilleplater som funk-sjonerer som en væskestrømsregulator. Mediet for kimkul-turtrinnene inneholder fortrinnsvis både karbon- og nitrogenkilder. I den foretrukne sekvens av operasjoner ved slik dyrking i liten skala rystes kimkulturkolbene i en inkubator med en konstant temperatur på 28°C i 7 dager inntil det er oppnådd tilstrekkelig vekst. Den vokste kimkultur overføres deretter til et andre kimmedium eller til produksjonsmediet. Når det benyttes en mellomliggende vekstfase benyttes stort sett samme fremgangsmåte for vekst, og en prøve av det resulterende mel-lomprodukt inokuleres i produksjonsmediet. Den inokulerte kolbe kan deretter inkuberes i atskillige dager under rysting, og etter fullføring av inkuberingen kan innholdet i kolben sentrifugeres eller filtreres.

Ved produksjon i stor skala foretrekkes det å anvende en egnet fermentor utstyrt med en rører og et lufteapparat. I dette tilfelle kan næringsmediet fremstilles inne i fermentoren. Mediet steriliseres fortrinnsvis ved økning av temperaturen til 125°C. Etter avkjøling kan det steriliserte medium inokuleres med en forhåndsfremstilt kimkultur. Dyrkingen fort-setter deretter under omrøring og lufting ved f.eks. 28°C. Denne fremgangsmåte er egnet for oppnåelse av forbindelsen ifølge oppfinnelsen i store mengder.

Fremskridelsen av dyrkingen og mengden av det ønskede 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a, 5, 6, 6a-tetrahydro-4H-cyklopent-[d]oksazol-4,5,6-triol som dannes etter hvert som dyrkingen skrider frem, kan bestemmes ved måling av de biologiske virkninger av forbindelsen eller ved høytrykksvæskekromatografi eller gasskromatografi/massespektrometri av en renset prøve av forbindelsen fra dyrkingsmediet, slik som beskrevet mer detal-jert nedenfor. Trehazolin har en inhiberende aktivitet mot silkeorm-trehalase, og dannelsen av det kan overvåkes ved å følge dyrkingsmediets aktivitet mot silkeorm-trehalase under anvendelse av metoder som den som er vist i det etterfølgende testeksempel 3.

På den annen side overvåkes dannelsen av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol best ved høytrykksvæskekromatografi eller gasskromatografi/massespektrometri. Dette kan utføres ved å bringe dyrkingsmediet i kontakt med en egnet adsorberende harpiks [f.eks. den som selges under handelsnavnet "Amberlite IRC-50"

(NH^)] for å adsorbere 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4, 5, 6-triol i f.eks. en kro-matografikolonne. Dette kan etterfølges av: Vasking med vann, eluering med et egnet elueringsmiddel, f.eks. en 0,5 N vandig løsning av ammoniakk, konsentrering av eluatet, f.eks. ved inndampning under senket trykk, samt lyofilisering av resten til fremstilling av et pulver. Mengden 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol i pulveret kan måles ved høytrykksvæskekromato-graf! . Alternativt kan forbindelsen først acetyleres, og mengden 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklo-pent[d]oksazol-4,5,6-triol i pulveret kan måles ved gasskromatografi/massespektrometri.

Vanligvis når mengden trehazolin et maksimum mellom 72 og 150 timer etter startingen av fermenteringen, mens mengden 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklo-pent[d]oksazol-4,5,6-triol når et maksimum mellom 96 og 168 timer etter startingen av fermenteringen. Men det nøyaktige tidspunkt vil variere avhengig av temperaturen og andre fermenteringsbetingelser, og det nøyaktige optimale tidspunkt for ethvert sett betingelser kan lettvint bestemmes ved å følge dannelsen av den ønskede forbindelse, slik som antydet ovenfor.

Når det anvendes en stamme av slekten Micromonospora dannes det normalt både trehazolin og 2-amino-4-(hydroksy-metyl )-3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol, og disse kan separeres på vanlig måte under utvin-ningen, slik som beskrevet nedenfor. Stammer av slekten Amycolatopsis danner vanligvis bare 2-amino-4-(hydroksymetyl )-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol. Begge forbindelser frigjøres i væskefasen, selv om de begge også foreligger i myceliet. De utvinnes meget lettvint fra væskefasen.

Etter fullføring av dyrkingen kan det ønskede 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklo-pent[d]oksazol-4,5,6-triol, som foreligger i dyrkingsmediets væskefase, fraksjoneres ved avfiltrering av myceliet og andre faste stoffer, fortrinnsvis under anvendelse av diatomejord som filtreringshjelpemiddel, eller ved sentrifugering. Denne forbindelsen, som deretter foreligger i filtratet eller i supernatanten, kan utvinnes ved ekstrahering og kan deretter renses på vanlig måte under utnyttelse av deres fysikalsk-kjemiske egenskaper.

F.eks kan denne forbindelsen utvinnes fra filtratet eller supernatanten ved å lede den gjennom en kolonne som inneholder et adsorbsjonsmiddel, såsom en ionebytterharpiks, f.eks. "Amberlite" IRC-50 eller CG-50, eller "Dowex" 50WX4 eller SBR-P, slik at enten urenhetene holdes tilbake av har-piksen og derved utvinnes, eller den ønskede forbindelse holdes tilbake og deretter utvinnes ved eluering, f.eks. med vandig ammoniakk. Eksempler på andre adorbsjonsmidler omfatter aktivt trekull eller andre adsorberende harpikser, såsom "Amberlite" XAD-2 eller XAD-4, eller "Diaion" HP-10, HP-20, CHP-20 eller HP-50. En løsning som inneholder trehazolinet og/eller 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triolen ledes gjennom et adsorberende lag som inneholder en av disse andre adsorbsjons-midler, som er beskrevet ovenfor, slik at enten urenhetene holdes tilbake av adsorbsjonsmidlet og derved utvinnes, eller den ønskede forbindelse holdes tilbake og deretter utvinnes ved eluering, f.eks. med vandig metanol, vandig aceton eller lignende.

2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triolen som derved oppnås kan renses ytterligere ved forskjellige kjente metoder, f.eks. absorp-sjonskolonnekromatografi under anvendelse av en bærer, såsom silikagel eller "Florisil", fordelingskolonnekromatografi under anvendelse av "Avicel" eller "Sephadex" LH-20, eller høytrykksvæskekromatografi under anvendelse av en normal, omvendt fase eller ionebytterkolonne.

Forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse, 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]- oksazol-4,5,6-triol, inneholder minst et basisk nitrogenatom og kan derved danne syreaddisjonssalter. Der er ingen spesiell begrensning på naturen til disse salter under forutsetning av at de er farmasøytisk akseptable. Eksempler på slike syreaddisjonssalter omfatter: salter med mineralsyrer, særlig hydro-halogensyrer, såsom fluorsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre eller saltsyre, perklorsyre, salpetersyre, karbonsyre, svovel-syre eller fosforsyre; salter med lavere alkylsulfonsyrer, såsom metansulfonsyre, trifluormetansulfonsyre eller etansul-fonsyre; salter med arylsulfonsyrer, såsom benzensulfonsyre eller p-toluensulfonsyre; salter med organiske karboksylsyrer, såsom eddiksyre, fumarsyre, vinsyre, oksalsyre, maleinsyre, eplesyre, ravsyre eller sitronsyre samt salter med aminosyrer, såsom glutaminsyre eller aspartinsyre.

Forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder flere asymmetriske karbonatomer i molekylet og kan derved danne optiske isomerer. Selv om disse her alle er angitt med én eneste molekylformel omfatter oppfinnelsen både de individuelle, isolerte isomerer og blandinger, også racemater, derav. Når det benyttes stereospesifikke syntesemetoder eller det anvendes optisk aktive forbindelser som utgangsmaterialer kan individuelle isomerer fremstilles direkte. Dersom det på den annen side fremstilles en blanding av isomerer kan de individuelle isomerer oppnås ved konvensjonelle spaltningsme-toder.

2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a, 5,6, 6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5, 6-triol har evnen til å inhibere aktiviteten til sukrase og har lav toksisitet og kan derfor forventes å være anvendelig i behandlingen og forebyggingen av sukkersyke og fettsyre.

Når denne forbindelsen er beregnet for terapeutisk anvendelse, kan den administreres alene eller i et egnet far-masøytisk preparat som i tillegg til den aktive forbindelse inneholder ett eller flere konvensjonelle tynningsmidler, bærere eller eksipienser. Naturen til preparatet vil selvføl-gelig avhenge av den tiltenkte administreringsmåte. Men for oral administrering vil forbindelsen fortrinnsvis formuleres som pulver, granulat, tablett eller kapsel. For parenteral administrering formuleres det fortrinnsvis som en injeksjon. Disse preparater kan fremstilles på kjent måte ved tilsetning av slike tilsetningsmidler som vehikler, bindemidler, oppsmul-dringsmidler, smøremidler, stabilisatorer og korregentia. Selv om doseringen kan variere avhengig av symptomene og alderen til pasienten, sykdommens eller forstyrrelsens natur og hvor alvorlig den er, samt administreringsveien og -måten, kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved oral administrering til et voksent menneske som pasient vanligvis administreres i en dag-lig dose på fra 1 til 1000 mg. Forbindelsene kan administreres i én eneste dose eller i delte doser, f.eks. to eller tre ganger per dag.

Fremstillingen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen vil bli ytterligere belyst i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av 2- amino- 4-( hydroksymetyl)- 3a, 5, 6, 6a-tetrahydro- 4H- cyklopentTdloksazol- 4, 5, 6- triol

( A) Dyrking

En prøve tatt fra skråsubstrat av Amycolatopsis sp. SANK 60791 ble anvendt til å inokulere hver av to 500 ml Erlenmeyer-kolber som hver var utstyrt med skilleplater og som hver inneholdt 80 ml Medium 1 (som hadde den sammensetning som er angitt ovenfor i eksempel 1), og de inokulerte kolber ble inkubert ved 28°C i 96 timer på en roterende ristemaskin som roterte med en hastighet på 210 omdr./min, hvorved det ble oppnådd et kimdyrkingsmedium.

To 30 liter krukkefermentorer som hver inneholdt 15 liter Medium 2 (som hadde den sammensetning som er angitt i eksempel 1) ble sterilisert ved 120°C i 30 minutter. De ble deretter avkjølt til 28<6>C, og 75 ml av kimdyrkingsmediet ble inokulert i hver krukkefermentor. Krukkefermentorene ble deretter omrørt ved 28°C med en hastighet som ble regulert i området fra 100 til 400 omdr./min. (for å opprettholde 2 ppm løst oksygen) i 144 timer og med lufting ved en luftstrøm på 7,5 liter per minutt.

( B) Utvinning

1,5 kg "Celite 545" filterhjelpemiddel ble tilsatt til 25 liter av hele mediet [oppnådd slik som beskrevet under

(A)] ovenfor, og blandingen ble filtrert, hvorved det ble oppnådd 23 liter filtrat. Filtratets pH ble regulert til en verdi

på 6,0 ved tilsetning av vandig saltsyre, og løsningen ble ledet gjennom en kolonne som var pakket med 3 liter "Amberlite IRC-50" (NH4) for å adsorbere 2-amino-4-(hydroksymetyl )-3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triolen. Kolonnen ble vasket med 15 liter avionisert vann og deretter eluert med 0,5 N vandig ammoniakk. Etter at eluatet var blitt alkalisk ble 4,5 liter av eluatet oppsamlet og konsentrert ved inndampning under senket trykk til et volum på 200 ml. Konsentratet ble ledet gjennom en kolonne pakket med 450 ml "Dowex 1X2" (0H~), og kolonnen ble eluert med avionisert vann. De første 800 ml av eluatet ble fjernet, og det etterfølgende eluat ble fraksjonert i 20 ml porsjoner. Det ble bestemt ved kvantitativ analyse, enten under anvendelse av høytrykks-væskekromatografi, slik som beskrevet nedenfor, eller gasskromatografi/massespektrometri, at fraksjonene 60-90 inneholdt den ønskede 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a, 5, 6, 6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol, og derfor ble disse fraksjoner kombinert og konsentrert ved inndampning under senket trykk. Konsentratet ble lyofilisert, hvorved det ble oppnådd 16,6 mg 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5, 6, 6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol som et fargeløst pulver som hadde de egenskaper som er beskrevet nedenfor.

Kvantitativ analyse under anvendelse av høytrykksvæskekromato-qrafi: Kolonne for separering: Asahi pak ES-502C (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.).

Mobil fase: 20 mM ammoniumacetat (pH 8,5) 0 50 mM saltlake. Strømningshastighet: 1 ml/min.

Bølgelengde for bestemmelse: 210 nm.

Temperatur: 25°C.

Oppholdstid: 8,39 minutter.

Kvantitativ analyse av 2- amino- 4-( hydroksymetyl)- 3a, 5, 6, 6a-tetrahydro- 4H- cyklopentTdloksazol- 4, 5, 6- triol under anvendelse av qasskromatografi/ massespektrometri

Den kvantitative analyse som det er referert til

ovenfor ble utført på følgende måte:

En prøve ble løst i et løsningsmiddel (vann) med kjent væskevolum. 10 pl av den resulterende løsning ble anbrakt i en prøveflaske og inndampet til tørr tilstand for ace-tylering. 30 ul eddiksyreanhydrid og 50 ul pyridin ble tilsatt til resten, og den resulterende blanding ble oppvarmet ved 60°C i 40 minutter. Eventuelt overskudd av reaktanten ble fjernet ved at en strøm av nitrogengass ble blåst gjennom reaksjonsblandingen. Resten ble blandet med en kjent mengde av en intern standard (pentaacetyl-l-amino-l-deoksy-p-D-glukose), og blandingen ble løst i 100 ul etylacetat for å fremstille en prøve for gasskromatografi-/massespektrometrianalyse. Analysen ble utført under anvendelse av en kapillær kolonne med smeltet silika (et produkt fra J & W Scientific Co., DB-5, 15 meter) som gasskromatografikolonne. En prøve, 2 pl, ble innført, og kolonnens temperatur ble økt fra 60°C til 280°C med en hastighet på 25°C/min. Negative ioner ble påvist ved en kjemisk ioniseringsmetode under anvendelse av metangass med et quadru-pole massespektrometer Trio-1 (et produkt fra VG). Topper for negative ioner ved m/z 388 (som svarte til den interne standard pentacetylforbindelsen) og ved m/z 413 [som svarte til pentaacetatet av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetra-hydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4, 5,6-triol] ble anvendt til kvantitativ analyse. Innholdet av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triolen ble beregnet ved hjelp av en intern standardmetode.

Eksempel 2

Fremstilling av 2- amino- 4-( hydroksymetyl)- 3a, 5. 6. 6a-tetrahydro- 4H- cyklopent Tdloksazol- 4, 5, 6- triol

( A) Dyrking

Et skråsubstrat av Micromonospora sp. SANK 62390 ble homogenisert i 10 ml fysiologisk saltløsning, hvorved det ble dannet en suspensjon. 1 ml av suspensjonen ble inokulert i hver av to 2 liter Erlenmeyer-kolber, som hver var utstyrt med skilleplater og som hver inneholdt 500 ml Medium 3 (som hadde den sammensetning som er angitt nedenfor), og de inokulerte kolber ble inkubert ved 28°C i 96 timer på en roterende ristemaskin som roterte med en hastighet på 210 omdr./min., hvorved det ble fremstilt et første kimdyrkingsmedium.

Medium 3:

Prosentandelene er etter vekt, regnet av mediets endelige volum. 30 liter av Medium 3 ble anbrakt i en 60 liter krukkefermentor og sterilisert ved 120°C i 30 minutter. Det ble deretter avkjølt til 28°C, og 600 ml av det første kimdyrkingsmedium ble inokulert i det. Fermentoren ble omrørt med en hastighet på 165 omdr./min. ved 28"C i 48 timer med lufting ved en luftstrøm på 15 liter per minutt for å fremstille et andre kimdyrkingsmedium.

En 600 liter beholder som inneholdt 300 liter av Medium 4, med den nedenfor angitte sammensetning, ble sterilisert ved 120°C i 35 minutter. Det ble deretter avkjølt til 28°C, og 15 liter av det andre kimdyrkingsmedium ble inokulert i det. Beholderen ble deretter omrørt ved 28°C med en hastighet som var regulert i området fra 82 til 142 omdr./min. (for å opprettholde 2 ppm løst oksygen) i 144 timer med lufting ved en luftstrøm på 150 liter per minutt og et indre trykk på 0,5 kg/cm"6.

Medium 4:

( B) Utvinning

15 kg "Celite 545" filterhjelpemiddel ble tilsatt til 300 liter av hele mediet som ble fremstilt slik som beskrevet ovenfor, og blandingen ble filtrert, hvorved det ble oppnådd 290 liter av et filtrat. pH i 20 liter av filtratet ble regulert til en verdi på 6,0 ved tilsetning av vandig saltsyre. Den resulterende løsning ble ledet gjennom en kolonne pakket med 3 liter "Amberlite IRC-50" (NH4), og den ønskede 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol ble holdt tilbake i kolonnen ved adsorpsjon. Kolonnen ble vasket med 15 liter avionisert vann og eluert med 0,5 N vandig ammoniakk. Etter at eluatet var blitt alkalisk ble 4,5 liter av eluatet oppsamlet og konsentrert ved inndampning under senket trykk til et volum på 150 ml. Konsentratet ble ledet gjennom en kolonne som var pakket med 500 ml "Dowex 1X2" (0H~) og eluert med avionisert vann. Den første hele liter ble fjernet og det etterfølgende eluat ble fraksjonert i 20 ml porsjoner. Hver fraksjon ble undersøkt ved den kvantitative analyse som er beskrevet i eksempel 1. Fraksjonene 58-80 viste seg å inneholde den aktive forbindelse, og disse fraksjoner ble kombinert og konsentrert ved inndampning under senket trykk. Resten ble lyofilisert, hvorved det ble oppnådd 9,6 mg av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol som et råpulver. Pulveret ble renset igjen ved kolonnekromatografi under anvendelse av en kolonne som var pakket med 100 ml "Dowex 1X2" (0H~) eluert med avionisert vann, hvorved det ble oppnådd 4,8 mg av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol som et fargeløst pulver som hadde de egenskaper som er beskrevet ovenfor.

FORSØKSEKSEMPEL

BIOLOGISK AKTIVITET

Inhiberende aktivitet av 2- amino- 4-( hydroksymetyl)- 3a, 5, 6, 6a-tetrahydro- 4H- cyklopentTdloksazol- 4, 5, 6- triol rforbindelse ( 11) 1 mot rottesukrase

Ved fremgangsmåten til M. Kessler et al. (Biochimica et Biophysica Acta, Vol 506, 1978, p. 136-154) ble det fremstilt en børstegrense-membranenzymløsning av en rottetynntarm fra tynntarmene fra tre hannrotter av Wistar-stammen og suspendert i 3 ml fysiologisk saltløsning.

En prøve av 4-aminoantipyrin (A 4383) ble levert av Sigma Chemical Co., og prøver av peroksidase (kvalitet I) og glukoseoksidase (kvalitet I) ble levert av Boehringer Mannheim Co. En buffer løsning (pH 6,2) som inneholdt 20 mM sitronsyre og 40 mM dinatriumfosfat ble anvendt som tynningsmiddel i det etterfølgende forsøk.

Hver brønn i en mikro-titerplate med 96 brønner (et produkt fra Falcon Co.) ble fylt med 130 ul totalt av en blanding som inneholdt 0,2 mg bovinserumalbumin (Sigma,

A 7906), 3 enheter glukoseoksidase, 0,132 enheter peroksidase, 20 mg 4-aminoantipyrin, 40 ug fenol, 3 umol sukrose og 1 testforbindelse. Til brønnen ble det tilsatt 20 ul av en 100 ganger tynnet løsning av en børstegrense-membranenzymløsning fra rottetynntarm. Blandingen fikk reagere ved 37 "C og mengden glukose som ble frigjort ble overvåket ved absorbsjon ved 492 nm.

Når enzymreaksjonene ble utført uten tilsetning av en testforbindelse og uten tilsetning av en enzymløsning ble kon-sentrasjonen av glukose antatt å være henholdsvis 0% og 100% inhibering. Den konsentrasjon av forbindelsen med formelen (II) som var nødvendig for å inhibere aktiviteten til rottesukrase med 50% (IC^q) viste seg å være 18 ug/m.

Claims (6)

1. Kjemisk forbindelse, karakterisert vedat den er 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol, samt farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triol, karakterisert veddyrking av mikroorganismen Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521 eller mutanter derav med vesentlig de samme morfologiske og biokjemiske egenskaper, eller mikroorganismen Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513 eller mutanter derav med vesentlig de samme morfologiske og biokjemiske egenskaper, som er i stand til å danne 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oksazol-4,5,6-triolen, og fraskilling av 2-amino-4-(hydroksymetyl)-3a,5,6,6a-tetra-hydro-4H-cyklopent[d]-oksazol-4,5,6-triolen fra dyrkingsmediet.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2,karakterisert vedat mikroorganismen er Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2,karakterisert vedat mikroorganismen er Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513.

5. Biologisk ren stamme, karakterisert vedat den er Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521.

6. Biologisk ren stamme, karakterisert vedat den er Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513.