KR0143769B1 - 항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

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Description

항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조 방법 및 이를 함유하는 약학 조성물

본 발명은 신규의 폴리펩티드 화합물과 그들의 약학적 허용염에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항균 활성(특히, 항진균 활성)을 갖는 신규의 폴리펩티드 화합물과 그들의 약학적 허용염, 그들의 제조 방법, 그들을 함유하는 약학 조성물, 및 인체 또는 동물의 감염 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 제1의 목적은 다수의 병원성 미생물에 대한 활성이 높은 폴리펩티드 화합물과 그들의 약학적 허용염을 제공하는데 있다.

본 발명의 제2의 목적은 폴리펩티드 화합물과 그들의 염을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

볼 발명의 제3의 목적은 활성 성분으로서 상기 폴리펩티드 화합물 또는 그들의 약학적 허용염을 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 제4의 목적은 상기 폴리펩티드 화합물을 감연된 인체 또는 동물에 투여하는 것으로 구성되는 병원성 미생물에 의한 감염 질환의 치료 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 폴리펩티드 화합물은 신규한 것이며 하기 화학식[Ⅰ]로 표시할 수 있다:

상기 식중, R은 수소 또는 팔미토일기이다.

본 발명의 폴리펩티드 화합물[Ⅰ]은 생물학적으로 및/또는 합성에 의해 제조 할 수 있으며, 하기 반응 도식에서 예시하는 바와 같은 방법들에 의해 제조할 수 있다.

[방법 1]

[방법 2]

목적 화합물[Ⅰ]의 적합한 약학적 허용염은 종래의 비독성 모노-또는 디-염으로서, 알칼리 금속염(예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(예를 들면 칼슘염, 마그네슘염 등)과 같은 금속염, 암모늄염 유기염기염(예를 들면, 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피롤린염, 디시클로헥실아민염, N, N-디벤질에틸렌디아민염등), 유기산부가염(예를 들면, 포르메이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트 등), 무기산부가염(예를 들면, 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 황산염, 인산염 등), 아미노산과의 염(예를 들면, 아르기닌염, 아스파르트산염, 글루탐산염 등)이 포함된다.

이하 본 발명의 목적 화합물[Ⅰ]의 제조 방법을 상세히 설명한다.

[방법 1]

목적 화합물[Ia] 또는 그것의 염은 발효법에 의해 제조할 수 있다.

이하 발효법에 대해서 상세히 설명한다.

ⅰ)미생물:이하 화합물[Ia]를 제조하는데 사용된 특정 미생물을 설명한다.

균주 F-11899는 원래 일본국 후쿠시마켄 이와키시에서 채취된 토양 시료로 부터 분리된 것이다. 이 유기체를 각종 배양 배지상에서 제한적으로 성장시켜, 흑회색 내지 갈색을 띤 회색 콜로니를 형성하였다. 미우라(Miura)의 LCA 평판¹) 또는 옥수수가루 아가 평판상에 부착된 증기-멸균 잎단편상에 분리물을 접종시킴으로써 아나모프(분생자과)가 생성된 반면, 아가 배지상에서는 텔레오모프도 아나모프도 형성되지 않았다. 이것의 형태적, 배양적 및 생리적 특성은 다음과 같다.

각종 아가 배지상에서의 배양 특성은 표 1에 요약한다. 감자 텍스트로스아가상에서의 배양물은 보다 급속히 성장하였으며, 25℃에서 2주후에 직경 3.5~4.0㎝로 성장하였다. 이 콜로니 표면은 평면으로서 펠트성이며, 다소 주름이 있고 갈색을 띤 회색이었다. 콜로니의 중심은 담회색 내지 갈색을 띤 회색이며, 기중 균사로 덮여있었다. 뒷면의 색깔은 암회색이었다. 맥아 추출물 아가상의 콜로니는 더욱 제한적으로 성장하여, 동일 조건하에서 직경 2.5~3.0㎝가 되었다. 그 표면은 평면으로서, 얇고 펠트성이었으며 올리브 갈색이었다. 콜로니의 중심은 황색을 띤 회색이며, 기중 균사로 덮여있었다. 뒷면은 갈색을 띤 회색이었다.

미우라의 LCA 평판에 부착된 멸균 잎상에서의 배양물을 가지고 형태적 특성을 측정하였다. 분생자과(conifiomata)는 잎단편상에만 형성되었다. 이들은 분포자기성, 표면성의 분리된 원판상 내지 앰풀형으로서, 기저부는 평평하고 단방성이며, 벽이 얇고 흑색이며, 직경은 90 내지 160(내지 200)㎛, 높이는 40 내지 70㎛이었다. 소공(ostiole)은 단일성, 환형, 중심적 유두상이었으며, 직경은 10 내지 30㎛, 높이는 10 내지 20㎛이었다. 분생포자병은 내부 분포 자기성 벽의 하부층으로부터 형성되었다. 이들은 유리질로서 단순하거나 드물게 가지가 있으며, 격막이 있고 평활하였다. 분생 포자 세포는 장내 배엽성, 경자성의 명확한 앰풀형 내지 역피라밋형으로서, 유리질이었으며, 평활하였고, 그 크기는 5 내지 8×4 내지 6㎛이었으며, 금상구조(collarette)를 가졌다. 상기 금상 구조는 종형 내지 원통형이었으며, 그 크기는 14 내지 18×3 내지 5㎛이었다. 분생자는 유리질-원통형으로서 벽이 얇고, 격막이 없었으며, 평활하고 그 크기는 14 내지 16(내지 18)×2 내지 3㎛이었다.

영양 균사는 격막이 있고, 갈색이고, 평활하고 분지형이었다. 균사 세포는 원통형이었으며, 그 두께는 2 내지 7㎛이었다. 유협 포자는 없었다.

균주 F-11899는 성장 온도 범위가 0 내지 31℃이었고 감자 덱스트로스 아가상에서의 최적 온도는 23 내지 27℃이었다.

상기 특성들은 균주 F-11899가 코엘로마이세테스(Coelomycetes:체강류강)^{2), 3), 4)}에 속함을 나타내는 것이다. 따라서 본 발명자들은 상기 균주를 코엘로마이세테스 균주 F-11899로 명명하였다.

약어 G:성장, 콜로니의 직경을 측정한 것임

S:콜로니 표면

R:뒷면

이러한 특성들은 25℃에서 14일 동안 배양한 후 관찰되었다. 색깔 표현은 `Methuen Handbook of Colour' 를 근거로 한 것이다.

미우라, 케이, 및 엠, 와이, 큐도:An agar-medium for aquatic Hyphomycetes., Trans. Ycolo. Soc. 일본국, 11:116-118, 1970.

악스, 제이, 에이, 폰:The Genera of Fungi-Sporulating in Pure Culture(제3판), 315면, J. Cramer, Baduz, 1974.

서튼, 비, 씨:The Coelomycetes-Fungi Imperfecti with Pycnidia, Acervuli and Stromata., 696 면, 큐 소재의 커먼휄쓰 마이콜로지컬 인스티튜트, 1980.

혹스워드, 디, 엘., 비, 씨, 서튼 및 쥐, 씨, 에인스워드:Dictionary of the Fungi(제7판), 445 면, 큐 소재의 커먼웰쓰 마이콜로지컬 인스티튜트, 1983.

코너럽, 에이, 및 완셔, 제이, 에이취.:Methuen Handbook of Colour(제3판), 252면, 런던 메튜엔, 1983.

코엘로마이세테스 균주 F-11899의 배양물은 1989년 10월 26일자로 기탁 번호 FERM BP-2635호로서 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술연구소(일본국, 이바라키켄 305, 츠쿠바시, 히가시 1 죠메 1 반 3 고 소재)에 기탁하였다.

ⅱ)화합물[Ia]의 제조

본 발명의 화합물[Ia]는 코엘로마이세테스에 속하는 화합물[Ia] 생산 균주를 호기성 조건(예를 들면, 진탕 배양, 액침배양 등)하에서 동화가능한 탄소 및 질소 공급원을 함유하는 영양 배지중에서 성장시킬 때 생산된다.

영양 배지중의 바람직한 탄소 공급원은 글루코스, 수크로스, 전분, 프럭토스 또는 글리세린 등과 같은 탄수화물이다.

질소의 바람직한 공급원은 효모 추출물, 펩톤, 글루텐 가루, 목화씨 분말, 콩가루, 옥수수 침지액, 건조 효모, 밀의 배등과, 암모늄염(예를 들면, 질산 암모늄, 황산 암모늄, 인산 암모늄 등), 우레아 또는 아미노산 등과 같은 무기 및 유기 질소 화합물이다.

탄소 및 질소 공급원은 병용하는 것이 유리하며, 미량의 성장 인자와 상당량의 무기질 영양분을 함유하는 덜 순수한 물질도 사용하기에 적합하기 때문에 반드시 순수한 형태로 사용할 필요는 없다.

필요에 따라서, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, 마그네슘염, 구리염, 아연염, 또는 코발트염 등과 같은 무기 염을 배지에 첨가할 수 있다.

필요에 따라서, 특히 배양 배지가 심하게 기포를 형성하는 경우에, 액체 파라핀, 지방 기름, 식물 기름, 광물 기름 또는 실리콘 등과 같은 소포제를 첨가할 수 있다.

다른 생물학적 활성 물질을 다량으로 생산하는데 사용되는 바람직한 방법의 경우에서와 같이, 화합물[Ia]를 다량으로 생산하는데에는 침액 호기성 배양 조건이 바람직하다.

소량 제조를 위해서는, 플라스크 또는 병에서의 진탕 배양 또는 표면 배양이 이용된다.

또한, 대형 탱크내에서 성장이 이루어지는 경우, 화합물[Ia]의 생산 공정중에 성장 지연을 방지하기 위해서 생산 탱크에 접종할 때에는 유기체의 영양 형태를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 유기체의 포자 또는 균사체를 비교적 소량의 배양 배지에 접종하고, 이와 같이 접종된 배지를 배양하여 유기체의 영양 접종물을 먼저 생산한 다음, 배양된 영양 접종물을 대형 탱크로 옮기는 것이 바람직하다. 영양 접종물을 생산하는 배지는 화합물[Ia]의 생산에 사용되는 배지와 거의 동일하거나 다르다.

배양 혼합물의 교반 및 통기는 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치에 의해, 발효기의 회전 또는 진탕에 의해, 각종 펌핑 장치에 의해 또는 배지를 통해 멸균 공기를 통과시키므로써 수행할 수 있다. 통기는 발효 혼합물을 통해 멸균 공기를 통과시키므로써 수행할 수 있다.

발효는 통상적으로 약 10℃ 내지 40℃의 온도, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃의 온도에서, 약 50시간 내지 150시간 동안 수행되며, 발효 조건 및 규모에 따라 다를 수 있다.

발효가 완료되었을 때, 화합물[Ia]를 회수하기 위해 배양 브로쓰를 생물학적 활성 물질의 회수 및 정제에 통상적으로 사용되는 각종 공정, 예를 들면 적합한 용매 또는 몇가지 용매의 혼합물에 의한 용매 추출, 크로마토그래피 또는 적합한 용매 또는 몇가지 용매의 혼합물로부터의 재결정화 등으로 처리한다.

본 발명에 의하면, 일반적으로 화합물[Ia]는 배양 균사체 및 배양 브로쓰 모두에서 발견된다. 따라서, 아세톤 또는 에틸아세테이트와 같은 적합한 유기 용매 또는 이러한 용매들의 혼합물등을 이용하여 전체 브로쓰로부터 화합물[Ia]를 추출 분리한다.

이 추출물을 통상의 방법으로 처리하여 화합물[Ia]를 수득한다. 예를 들면, 증발 또는 증류에 의해 추출물을 소량으로 농축시키고 활성 물질, 즉 화합물[Ia]를 함유하는 생성 잔류물을 통상의 정제 방법, 예를 들면 크리마토그래피 또는 적합한 용매 또는 몇가지 용매 혼합물로부터 재결정화시켜서 정제한다.

화합물[Ia]는 통상의 방법에 의해 적합한 약학적 허용염으로 전환시킬 수 있다.

ⅲ)화합물[Ia]의 물리-화학적 특성:전술한 방법에 의해 수득한 화합물[Ia]의 나트륨 염은 하기의 물리-화학적 특성을 갖는다.

외관:백색 분말

융점:215-221℃(분해)

고유광회전[α]D -20.3(C:0.5, H2O)

분자식:CHNSONa

CHNSONa에 대한 원소 분석

계산치:C 51.17, H 6.77, N 9.36, S 2.68(%)

실측치:C 49.61, H 7.58, N 7.65, S 2.14(%)

용해도:

용해:메탄올, 물

약간 용해:에틸 아세테이트, 아세톤

불용해:클로로포름, n-헥산

색채 반응:

양성:요오드 증기 반응, 황산 세륨 반응, 염화 제2철 반응, 닌히드린 반응

음성:드라겐도르프 반응, 엘리히 반응

박층 크로마토그래피(TLC):

실리카겔 60(이. 머크사 제품)

자외선 흡수 스펙트럼:

적외선 흡수 스펙트럼

¹H 핵자기 공명 스펙트럼

(CD₃OD, 400㎒)

δ:7.30(1H, d, J=2㎐), 7.03(1H, dd, J=8 및 2㎐), 6.85(1H, d, J=8㎐), 5.23(1H, d, J=3㎐), 5.06(1H, d, J=4㎐, 4.93(1H, d, J=3㎐), 4.59~4.51(3H, m), 4.47-4.35(5H, m), 4.29(1H, dd, J=6 및 2㎐), 4.17(1H, m), 4.07(1H, m), 3.95-3.89(2H, m), 3.76(1H, 넓은 d, J=11㎐), 3.36(1H, m), 2.75(1H, dd, 16 및 4㎐), 2.50(1H, m)), 2.47(1J, dd, J=16 및 9㎐), 2.38(1H, m), 2.21(2H, m), 2.03-1.93(3H, m), 1.57(2H, m), 1.45-1.20(24H, m), 1.19(3H, d, J=6㎐), 1.08(3H, d, J=6㎐), 0.90(3H, t, J=7㎐)

상기 물리적 및 화학적 특성의 분석 및 화학적 구조의 확인을 위한 추가 연구 결과로부터, 화합물[Ia]의 화학적 구조를 확인하였으며 다음과 같이 표시하였다.

[방법 2]

목적 화합물[Ib] 또는 그것의 염은 화합물 화합물[Ia] 또는 그것의 염을 팔미토일기 제거 반응시켜서 제조할 수 있다.

이 반응은 가수분해, 환원, 효소에 의한 반응 등과 같은 종래 방법에 따라 수행된다.

가수분해는 염기 또는 루이스산을 비롯한 산의 존재하에 수행되는 것이 바람직하다. 적합한 염기에는 무기 염기 및 유기 염기, 예를 들면 알칼리 금속(예를 들면, 나트륨, 칼륨 등), 알칼리 토금속(예를 들면, 마그네슘, 칼슘 등), 이들의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염, 트리알킬아민(예를 들면, 트리 메틸아민, 트리에틸아민 등), 피콜린, 1, 5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔, 1, 4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 1, 8-디아자비시클로[5.4.0]-운데크-7-엔 등이 포함된다.

적합한 산에는 유기산(예를 들면, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 트리클로로 아세트산, 트리플루오로아세트산 등)과 무기산(예를 들면, 염산, 브롬산, 황산, 염화수소, 브롬화 수소 등)이 포함된다. 트리할로아세트산(예를 들면, 트리클로로 아세트산, 트리플루오로 아세트산 등)과 같은 루이스산을 사용하는 제거 공정은 양이온 포획제(예를 들면, 아니솔, 페놀 등)의 존재하에 수행되는 것이 바람직하다.

반응은 통상적으로 물, 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올 등), 메틸렌 클로라이드, 테트라히드로푸란, 그들의 혼합물과 같은 용매, 또는 반응에 역영향을 미치지 않는 기타 용매중에서 수행된다. 액체 염기 또는 산도 용매로서 사용할 수 있다. 반응 온도는 중요하지 않으며, 이 반응은 통상적으로 냉각 내지 가온하에 수행된다.

제거 반응에 이용할 수 있는 환원 방법은 화학적 혼원 방법과 촉매적 환원 방법이 포함된다.

화학적 환원에 사용되는 적합한 환원제는 금속(예를 들면, 주석, 아연, 철 등) 또는 금속 화합물(예를 들면, 염화 크롬, 아세트산 크롬 등)과 유기 또는 무기산(예를 들면, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 트리플루오로 아세트산, p-톨루엔설폰산, 염산, 브롬산 등)의 혼합물이다.

촉매적 환원에 사용되는 적합한 촉매는 백금 촉매(예를 들면, 백금 플레이트, 스폰지 백금, 백금 블랙, 콜로이드 백금, 산호 백금, 백금선 등), 팔라듐 촉매(예를 들면, 스폰지 팔라듐, 팔라듐 블랙, 산화 팔라듐, 탄소상 팔라듐, 콜로이드 팔라듐, 황산 바륨상의 팔라듐, 탄산 바륨상의 팔라듐), 니켈 촉매(예를 들면, 환원 니켈, 산화 니켈, 라니 니켈 등), 코발트 촉매(예를 들면, 환원 코발트, 라니코발트 등), 철 촉매(예를 들면, 환원 철, 라니 철 등), 구리 촉매(예를 들면, 환원 구리, 라니 구리, 울만 구리 등) 등과 같은 통상적인 촉매들이다.

환원 반응은 통상적으로 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, N, N-디메틸포름 아미드, 또는 그들의 혼합물과 같이 반응에 역영향을 미치지 않는 통상의 용매중에서 수행된다. 또한, 화학적 환원에 사용되는 전술한 산들이 액체인 경우에, 이들 또한 용매로서 사용할 수 있다. 또한, 촉매적 환원 반응에 사용되는 적합한 용매는 전술한 용매, 및 디에틸 에테르, 디옥산, 테트라 히드로푸란 등, 또는 이들의 혼합물과 같은 기타 통상의 용매들이다.

이 환원 반응의 온도는 중요하지 않으며 이 반응은 통상적으로 냉각 내지 가온하에 수행된다.

효소에 의한 반응은 화합물[Ia] 또는 그것의 염을 팔미토일기의 제거 반응에 적합한 효소와 반응시키므로써 수행할 수 있다.

상기 효소의 적합한 예에는 액티노플라나시아(Actinoplanaceae), 예를 들면 액티노플라네스 우타헨시스(Actinoplanes utahensis) IFO-13244, 액티노플라네스 우타헨시스 ATCC 12301, 액티노플라네스 미주리엔시스 NRRL 12053 등의 특정 미생물 등에 의해 제조된 것들이 포함된다.

이 제거 반응은 통상적으로 인산염 완충액, Tris-HCl 완충액과 같은 용매 또는 반응에 역영향을 미치지 않는 기타 다른 용매중에서 수행한다.

반응 온도는 중요하지 않으며 이 반응은 실온에서 또는 가온하에 수행될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 화합물[I]의 생물학적 특성

본 발명의 폴리펩티드 화합물[I]의 유용성을 입증하기 위해서, 하기에 대표적인 화합물의 소정의 생물학적 데이타를 설명한다.

[시험 1]

항균 활성:화합물[Ia]의 나트륨 염(이하, FR 901379 물질로 언급함)의 항균 활성은 효모 질소가 주성분인 덱스트로스 배지를 사용하는 96 웰 복수-트레이에서 미량-브로쓰 희석법을 이용하여 측정하였다. 연속 2배 희석된 50㎕ 시료 용액에 염수중의 미생물 현탁액 50㎕를 첨가하여 최종 농도가 1×105 콜로니 형성 단위/㎖가 되도록 하였다. 칸디다(Candida) 및 아스페르길러스(Aspergillus) 배양물을 37℃에서 22시간 동안 항온 배양시키고, 크립토코커스(Cryptococcus) 배양물을 30℃에서 48시간 동안 항온 배양시켰다. 항온 배양 후, 각 웰의 미생물 성장을 혼탁도를 측정하므로써 평가하였다. 결과는 혼탁도가 시료를 함유하지 않은 웰의 혼탁도의 절반인 농도에서의 IC50 값으로서 나타내었다. 그 결과는 표 2에 나타냈다.

[시험 2]

칸디다 알비칸스의 전신성 감염에 대한 FR 901379 물질의 보호 효과:ICR 생쥐(암컷, 생후 4주, 군당 5마리로 구성)에 2.5×106 칸디다 알비칸스 FP633을 정맥내 주사하였다. 감염 1시간 후에 치료제를 피하 투여하고 3일 동안 계속 1일 1회 투여하였다. 감염 9일 후에 결과를 관찰하였다. 그 결과는 표 3에 나타낸다.

[시험 3]

FR 901379 물질의 급성 독성:FR 901379 물질의 급성 독성은 ICR 생쥐(암컷, 생후 4주)에 1회 복강내 주사함으로써 평가하였다. 투여량 500㎎/㎏에서 독성 증상이 관찰되지 않았다.

시험 결과들로부터, 본 발명의 폴리펩티드 화합물[I]은 항균 활성(특히, 항진균 활성)을 가짐으로 알 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 제제 형태, 예를 들면 외용, 내용 또는 비경구용으로서 적합한 유기 또는 무기 담채 또는 부형제와 함께 활성 성분으로서 폴리펩티드 화합물[I] 또는 그것의 약학적 허용염을 함유하는 고체, 반고체 또는 액체 형태로 사용할 수 있다. 활성 성분은 정제, 펠릿, 캡슐, 좌약, 용액, 유탁액, 현탁액, 및 기타 사용하기에 적합한 다른 형태를 위해 통상의 비독성, 약학적 허용 담체와 혼합할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 보조제, 안정제, 점도 부여제, 착색제 및 향료를 사용할 수 있다. 폴리펩티드 화합물[I] 또는 그것의 약학적 허용염은 질병의 진행 또는 상태에 따라 소정의 항균 효과를 얻기에 충분한 양으로 약학 조성물에 포함된다.

인체에 상기 조성물을 사용하는 경우에는, 정맥내, 근육내 또는 경구 투여에 의해 사용하는 것이 바람직하다. 폴리펩티드 화합물[I]의 치료학적 유효 용량은 치료하고자 하는 각 환자들의 연령 및 상태에 따라 다르지만, 감염 질환의 치료릉 위해서 정맥내 투여의 경우에는 인체 체중 1㎏당 폴리펩티드 화합물[I]의 1일 투여량은 0.01 내지 10㎎이고, 근육내 투여의 경우에는 인체 체중 1㎏당 폴리펩티드 화합물[I]의 1일 투여량은 0.1 내지 10㎎이며, 경구 투여의 경우에는, 인체 체중 1㎏당 폴리펩티드 화합물[I]의 1일 투여량은 0.5 내지 50㎎이다.

하기 실시예에 의거하여 본 발명을 일층 상세히 설명한다.

[실시예 1]

수크로스 4%, 목화씨 분말 2%, 건조 효모 1%, 펩톤 1%, KHPO, 0.2%, CaCO0.2% 및 Tween 80(나카라이 케미컬즈 리미티드) 0.1%로 구성되는 종자 배지(160㎖)를 2개의 500㎖들이 엘렌마이어 플라스크에 각각 장입하고 121℃에서 30분간 멸균시켰다. 코엘로마이세테스 균주 F-11899의 백금 이량의 사면 배양물을 각 배지에 접종하고 25℃의 진탕 조건하에서 4일 동안 배양하였다.

Pine Dex #3(마쯔타니 케미컬 리미티드 제품) 3%, 글루코스 1%, 밀의 배아 1%, 목화씨 분말 0.5%, KHPO2%, NaHOP·12HO 1.5%, ZnSO·7HO 0.001% 및 Adekanol(소포제, 아사히 덴카 컴퍼니 리미티드 제품) 0.05%로 구성되는 생산 배지(20ℓ)를 30ℓ-단자형 발효기에 장입하고 121℃에서 30분 동안 멸균시켰다.

생성된 종자 배양 브로쓰(320㎖)를 생산 배지에 접종시키고, 25℃에서 4일 동안 배양한 후, 200rpm으로 교반시키고 20ℓ/분으로 통기시켰다. 이렇게 수득된 배양 브로쓰(20ℓ)에 동부피의 아세톤을 첨가하였다. 실온에서 잠시동안 가끔씩 교반한 후에, 브로쓰를 여과하였다. 여과액을 진공 농축시켜서 아세톤을 제거하였다. 수성 여과액(10ℓ)를 동부피의 에틸 아세테이트로 2회 세정하고 n-부탄올(10ℓ)로 2회 추출하였다. 합친 n-부탄올 층을 진공 농축시키고 잔류물을 실리카겔 60(이. 머크사 제품) 컬럼(300㎖)에 가하고 디클로로메탄-메탄올로 구성되는 단계적 유기 용매 혼합물로 용출시켰다. 항-칸디다 활성을 갖는 분획을 용매 혼합물(3:1 내지 1:1)로 용출시켰다. 활성 분획을 합치고 진공하여 농축 건조시켰다. 잔류물을 50% 메탄올 수용액(15㎖)에 용해시키고 ODS YMC GEL(야마무라 케미컬 래버러토리 제조)의 컬럼(250㎖)에 가하였다. 컬럼을 50% 메탄올 수용액으로 세정하고 80% 메탄올 수용액으로 용출시켰다. 용출액을 농축시키고 하행 방식으로 상부 고정상과 하부 이동상의 용매계 n-부탄올:메탄올:물(4:1:5)을 사용하여 원심분리 분배 크로마토그래피(CPC)상에서 추가 정제하였다. 화합물[Ia]를 함유하는 혼합 분획을 진공 농축시키고, 실리카겔 60의 컬럼(35㎖)상에 가하였다. 컬럼은 n-부탄올:아세트산:물(6:1:1)로 전개시켰다. 활성 분획을 합치고 진공하에 농축 건조시킨 후, 소량의 50% 메탄올 수용액에 용해시켰다. 이 용액을 ODS YMC GEL 컬럼(3.5㎖)을 통과시켰다. 컬럼을 50% 메탄올 수용으로 세정하고, 메탄올로 용출시켰다. 용출액을 농축 건조시키고, 소량의 물에 용해시킨 후 0.01N의 NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하였다. 이 용액을 동결 건조시켜서 백색 분말상의 화합물[Ia]의 나트륨 염(FR 901379 물질)(11㎎)을 수득하였다.

[실시예 2]

FR 901379 물질의 팔미토일기를 효소와의 반응에 의해 제거하였다. 하기에서 이 제거 반응을 상세히 설명한다.

(1)액티노플라네스 우타헨시스의 발효

FR 901379 물질의 팔미토일기를 제거하는데 유용한 효소는 액티노플라나시아의 특정 미생물, 바람직하게는 미생물 액티노플라네스 우타헨시스 IFO-13244에 의해 생성된다.

액티노플라네스 우타헨시스 IFO-13244의 원료 배양물을 제조하여 아가 사면상에서 유지시켰다. 백금이량의 사면 배양물을 전분 1%, 수크로스 1%, 글루코스 1%, 목화씨 분말 1%, 펩톤 0.5%, 콩가루 0.5% 및 CaCO3 0.1%로 구성되는 종자 배지에 접종시켰다. 접종된 영양 배지를 회전 진탕기상의 225㎖용 광구엘렌마이어 플라스크에서 30℃로 약 72시간 동안 항온 배양하였다.

상기 접종된 영양 배지를 수크로스 2%, 땅콩 분말 1%, KHPO0.12%, KHPO0.05% 및 MgSO·7HO 0.025%로 구성되는 생산 배지에 접종시켰다. 접종된 생산 배지를 30ℓ-단지형 발효기내에서 30℃의 온도에서 약 80시간 동안 발효시켰다. 발효 배지를 종래의 교반기에 의해 250rpm으로 교반시키고 20ℓ/분으로 통기시켰다. 영양 균사체를 여과에 의해 발효 브로쓰로부터 수집하고 물로 1회 세정하였다. 세정된 균사체를 효소원으로서 FR 901379 물질의 팔미토일기를 제거하는데 직접 사용하였다.

(2)제거 반응 조건

FR 901379 물질을 0.9㎎/㎖ 농도의 0.25M 인산염 완충액(pH 6.5)에 용해시켰다. 용액 36ℓ에 습윤 중량 2㎏의 세정된 액티노플라네스 우타헨시스 IFO-13244 균사체를 첨가하였다. 제거 반응은 37℃에서 23시간 동안 수행하였다. FR 901379 물질의 감소 및 탈아실화된 FR 901379 물질(이하, FR 133303 물질로 언급함)의 증가는 역상 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 측정하였다. FR 901379 물질 30g으로부터, 상기 반응 혼합물에서 FR 133303 물질 22.2g이 형성되었다.

(3)FR 133303 물질의 분리

전술한 반응 혼합물을 여과 보조제와 함께 여과하였다. 균사체 덩어리를 제거하였다. 이렇게 해서 수득한 여과액을 활성 탄소(2ℓ) 컬럼을 통해 통과시켰다. 컬럼을 6ℓ의 물로 세정하고 12ℓ의 50% 아세톤 수용액으로 용출시켰다. 용출액을 진공 증발시켜서 아세톤을 제거한 후 YMC GEL ODS-AM 120-S50(야마무라 케미컬 래버러토리즈) 컬럼(4ℓ)을 통해 통과시켰다. 컬럼을 물로 세정하고 50mM의 NaHPO를 함유하는 2% 아세토니트릴 수용액으로 용출시켰다. Lichrospher 100 RP-18(시카-머크) 컬럼 및 1㎖/분 유속의 0.5% NHHPO를 함유하는 3% 아세토니트릴 수용액 용매계를 사용하는 분석용 HPLC에 의해 용출을 모니터하고, 210㎚의 UV 모니터에 의해 FR 133303 물질을 검출하였다. FR 133303 물질을 함유하는 분획을 합치고 활성탄(400㎖) 컬럼을 통해 통과시켰다. 컬럼을 물로 세정하고 50% 아세톤 수용액으로 용출시켰다. 용출액을 진공하에 농축시켜서 아세톤을 제거하고 동결 건조시켜서 백색 분말상의 FR 133303 물질 16.4g을 수득하였다.

FR 133303 물질의 물리-화학적 특성은 다음과 같다:

외관:백색 분말

융점:150-160℃(분해)

고유광회전도:[α]D -31.17°(C:1.0, HO)

분자식:CHNSONa

CHNSONa에 대한 원소 분석:

계산치:C 43.84, H 5.36, N 11.69, S 3.34(%)

실측치:C 41.14, H 5.74, N 10.88, S 3.10(%)

용해도:

용해:물

약간 용해:메탄올

불용해:n-헥산

색채 반응:

양성:요오드 증기 반응, 황산 세륨 반응, 닌히드린 반응

음성:몰리쉬 반응

박층 크로마토그래피(TLC):

^*실리카겔 60(이. 머크사 제품)

자외선 흡수 스펙트럽:

적외선 습수 스펙트럼:

¹H 핵자기 공명 스펙트럼:(D₂O, 400㎒)

δ:7.31(1H, d, J=2㎐), 7.12(1H, dd, J=2㎐ 및 8㎐), 7.06(1H, d, J=8㎐), 5.40(1H, d, J=3㎐), 5.04(1H, d, J=3.5㎐, 4.94(1H, d, J=6㎐), 4.73-4.55(3H, m), 4.51-4.38(4H, m), 4.31-4.23(3H, m), 4.11-4.06(2H, m), 3.94-3.89(2H, m), 3.41(1H, m), 2.60-2.34(5H, m), 2.14(1H, m0, 2.03(1h, M), 1.28(3h, d, J=6㎐), 1.01(3H, d, J=6.5㎐)

¹³C 핵자기 공명 스펙트럼:(D₂O, 100㎒)

δ:178.3(s), 175.9(s), 174.3(s), 174.2(s), 174.0(s), 171.8(s), 171.3(s), 150.9(s), 141.5(s), 134.4(s), 128.2(d), 124.5(d), 120.3(d), 78.1(d), 77.0(d), 76.9(d), 76.6(d), 72.9(d), 72.8(d), 71.2(d), 69.3(d), 69.2(d), 63.7(d), 60.1(d), 58.3(t), 58.0(d), 56.9(d), 55.3(d), 54.7(t), 41.8(t), 39.7(d), 39.5(t), 33.5(t), 21.4(q), 13.3(q)

FR 133303 물질의 화학적 구조는 다음과 같은 것으로 확인하였다.

Claims (4)

1. 하기 화학식[I]의 폴리펩티드 화합물 또는 그것의 약학적 허용염:

   [화학식 1]

   

   상기 식중, R은 수소 또는 팔미토일기 이다.
2. ⅰ)하기 화학식[Ia] 화합물을 생산할 수 있는 코엘로마이세테스(Coelomycetes) 속에 속하는 균주를 영양 배지중에서 발효시키고 화합물[Ia] 또는 그것의 염을 회수하여 화합물[Ia] 또는 그것의 염을 수득하거나, ⅱ)이렇게 해서 수득횐 화합물[Ia] 또는 그것의 염으로부터 팔미토일기를 제거 반응시켜서 하기 화학식[Ib]의 화합물을 수득하는 것을 포함하는 하기 화학식[I]의 폴리펩티드 화합물 또는 그것의 염의 제조 방법:

   [화학식 I]

   

   [화학식 Ia]

   

   [화학식 Ib]

   

   상기 식중, R은 수소 또는 팔리토일기이다.
3. 활성 성분으로서 제1항의 화합물 또는 그것의 약학적 허용염을 약학적 허용 담체와 함께 포함하는 항균성 약학 조성물.
4. 미생물 코엘로마이세테스 균주 F-11899(FERM BP-2635).