CZ722589A3

CZ722589A3 - Plísňový kmen Tylypocladium varium a způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu za použití tohoto kmene

Info

Publication number: CZ722589A3
Application number: CS897225A
Authority: CZ
Inventors: Antonia Dr. Jekkel; Gabor Dr. Ambrus; Eva Dr. Toth; Agota Huelber; Attila Andor; Karoly Albrecht; Kalman Dr. Koenczoel; Valeria Dr. Szell; Eva Dr. Tomori; Imre Moravcsik; Kalman Dr. Polya; Janos Dr. Erdei; Lajos Kiss; Karoly Nagy; Bela Palotas; Etelka Dr. Deli; Karoly Buzasi; Aniko Dr. Molnar; Gyoergy Santha; Vilma Szaszhegyesi
Original assignee: BIOGAL Gyógyszergyár
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1998-01-14
Also published as: CA2006144A1; SE8904262L; HUT52164A; DK174719B1; UA13320A; DK640989A; IT1237799B; HU201577B; SE8904262D0; GB2227489B; DD290356A5; JPH0763356B2; FI92603C; BG60274B2; NO175873B; DE58908740D1; NO895160D0; FI92603B; LV10102B; LV10500B

Description

Vynalez se tyká nového plísňového kmene To“l’ýp'ďciadium varium a jeho použití při mikrobiální přípravě cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinu A cyklosporinu B a cyklosporinu C, aerobní fermentaci.

Dosavadní stav techniky

Cyklosporiny jsou cyklické, neutrální, apolární jedenác, 0, ticlenne eligopeptidy, kde některe ze skupin aminokyselin jsou rozdílné. Cyklosporin A a cyklosporin B byly izolovány nejprve A. Rúegerem et al. (Helv. Chim. Acta 59, 1075 /1976/), zatímco cyklosporiny B, D, E a G R. Traberem et al.(Helv. Chim. Acta 60, 1568 /1977/) z kultury plísní /NRRL 8044/, identifikované nejprve jako Trichoderma polysporum /Ling. ex. Pers./ Rifai. Později byla provedena taxonomií revize uvedeného kmene a byl potom popsán v literatuře jako Tolypocladium inflatum Gams.

V současnosti je známo 25 různých cyklosporinových antibiotik uvedených jako cyklosporiny A až Z (Helv. Chim. Acta 70, 13 /1987/). Z těchto složek je nejcennější cyklosporin A mající selektivní imunosupresivní účinek.

Cyklosporin A byl nejprve znám jako mírné antifungicidní antibiotikum, jeho význačný imunosupresivní účinek byl potvrzen teprve později (J. F. Borel et al.: Immunology 32, 1017 /1977/).

- -4α V sériích zkoušek in vitro a in vivo bylo potvrzeno, že cyklosporiny A, C a G jsou velmi specifické imunosupresivní látky. ’

Cyklosporin A inhibuje očekávanou humorální a tkáňovou imunitní odezvu. Při studium jeho způsobu účinku bylo zjištěno, že inhibuje T buněčnou proliferaci a také syntézu interleukinu 2.

Terapeutické použití cyklosporinu A při transplantaci lidských orgánů bylo uveřejněno v r. 1978. Nejprve byl aplikován při transplantaci ledvin /R.J. Calne et al.: Lancet 197.8/2. 1323/ a kostní dřeně /R.L.Povles et al.: Lancet 1978/2, 1327/ transplantations.

V průběhu transplantace orgánů /ledvin, slinivky, jater, srdce, plic/ a kostní dřeně byla negaltivní reakce orgánů potlačena ai>likací cyklosporinu Λ.

Dále byl cyklosporin A úspěšně aplikován při léčení některých autoimunních onemocnění /uveitidy, revmatická artritidy, p?o«riázy, a těžká myastenie/.

v

V pa ten tni- literatuře byly použity pro produkci cyklosporinového komplexu následující mikroorganismy *.

Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 /švýcarský patentní přihláško č. 589, 716/} Tolypocladium inflatura Gams, MžRL 8044 /l-iodie dřív§jší taxonomie: Trichoderma polysporum /Link ex Pers./ Rifai /švýcarský patentní přihláška č, 603,790 podle Bisetta /1983/: Tol.inflatum v.Gams, 1971 je synonymní a ιοί. niveum /rostrup/ Bisett com.mov. a Pusarium solani, MCI-1549, MCi-1550 /publikovaná japonská patentní přihláška č. 82 63093// V průběhu fermentačního procesu prováděného s výše uvedenými mikroorganismy byla získána po dlouhá době fermantace nízká hladina produkce cyklosporinu a výtěžek izolace byl také nízký.

Výzkum byl proveden za účelem nalezení kmenů mikroorganismů, která by produkovaly cyklosporinový antibiotikový komplex nebo jeho složky ve vyšší koncentraci a při výhodnějších podmínkách než u dřívějších kmenů. Při třídění velkého počtu vláknitých plíšnových kmenů izolovaných z půdy byl nalezen kmen mikroorganismu Tolypocladík genus, který je

72 Γ schopen biosyntézy cyklosporinového antibiotikového komplexu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je jednak tento mikroorganismus označený CY/93, který nemohl být identifikován při taxonomické studii žádným druhem plísní produkujícím cyklosporinový komplex. Tolypocladium species nova CY 93 je nový taxon kmene Tolypocladium genus, který se může diferencovat na úrovni druhu.

Předmětem vynálezu je dále také způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinu A, cyklosporinu B a cyklosporinu C, aerobní fermentací vláknitého plísňového kmene vedoucí k biosyntéze výše uvedeného antibiotika /antibiotik/ v živném prostředí obsahujícím využitelné zroje uhlíku a dusíku a minerální soli a isolací vytvořených produktů, který se vyznačuje tím, že se kmen výše uvedeného druhu plísně Tolypocladium varium produkující cyklosporinový antibiotikový komplex kultivuje v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální látky, za aerobních podmínek při 25 až 3 0 °C a případně se vyrobený cyklosporinový antibiotikový komplex nebo jeho složky isolují a čistí.

Fermentace se provádí v prostředí obsahujícím pepton, síran amonný a trypton, jako zdroj dusíku a glukózu, maltózu a sorbit, jako zdroj uhlíku.

Taxonomické znaky nového druhu plísně byly srovnány s hlavními diagnostickými vlastnostmi druhu Tolypocladium následujícím způsobem.

1/ Ρ

Tolypocladium geneus byl nejprv© popsán Gamsem v r.1971 jako nový rod Moniliales. Jeho charakteristické vlastnosti jsou: pomalý růst, poduškovité bílé kolonie, koncové a postranní fialidy rozvinuté částečné na krátkém postranním větvení, se silně nabobtnalou bází a vláknitým, čaito skloněným hrdlem, končícím v jednobuněčném konidiu. 7 tomto rodu byly rozlišeny Gamsera následující tři nové druhy :

T. geod.es, T.cylindrosporům a T.inflatura.

T.geodes se vyznačoval půdní vůní typu actinomycetes,zatímco nový T.va-irium splnov. CY/93 je toho zcela zbaven. Dále jsou nosičové buňky T.geodes značně užší než buňky T.varium sp. nov. 0Ϊ/93. Konidia T.eylindrosporum jsou charakteristicky dlouhé a prodloužené, zatímco konidia T.varium splnov.CX/93 jsou sférické a pouze nepatrně prodloužené. Konidia T.inllatum jsou vejčité a delší než pozorované v kultuře T.variam splnov. Oy/93. Fialidy T.inflatum jsou charakteristicky produkovány v

ve verticilech bud přímo na hyfách nebo na 2 až 3dlouhých v

nosičových buňkách. T.variam sp.nov. CY/93 neukazuje žádné vzory vorticilátového uspořádání, je detektovatelné pouze čas od času ojediněle. V důsledku bílého chmýřítého vzdušného

I mycelia jsou kolonie všech známých druhů Tolypocladium bílé, zatímco rub kolonií je žlutavě šedý, bezbarvý nebo žlutý.

Nejsou produkovány žádné typicky rozpustné pigmenty. T.varium sp.nov. CY/93 může se také odlišit v tomto ohledu: v prostředí obsahujícím glukózu a pepton a sladový a kvasničný výtažek je produkován tmavý, tmavošedý /a černý/ s časovou proměnlivostí.

Taxonoraické hodnocení nových druhů ve srovnání s jinými

4a známými druhy Tolypocladium bylo provedeno na základě následujících publikací: W.Gams: Perseonia, 6, 185-191 /1971/, O.L.Barron: Can. u.Dot. 5R, 439-442 /1980/ a Bisett J,,

Can.J.Dpt.&l, 1311-1329 /1983/.

Diagnostické vzory Tolyxjoc ladium varium spinov. CY/93 jsou shromážděny v následujícím :

dní staré kolonie mají průměr 10 až 25 mm, jejich povrch je pokryt bílým, chmýřovitým, bohatě sporulujícím vzdušným myceliem. Rub kolonií je žlutavě až špinavě šedý* V některých

- 5 prostředcích se produkuje tmavě šedý, rozpustný pigment.

Na hyfách vzdušného mycelia se pozoruje koncová a postranní sporulace. Fialidy jsou umístěny bud osaměle nebo sporadicky, nahodile ve verticilech, přímo na hyfách nebo na krátkých /2 až 3 yum/ nosičových buňkách. Fialidy jsou vytvořeny z nabobtnalé báze /2 až 4 x 2 až 3 paa/ a dlouhého, vláknitého hrdla /2 až 4 x 0,5 až 0,6/um/. Konidia hlaviček jsou malé /2 až 3 · 1,3 až 2,2Jim/, obvykle sférické a hladké. Specifický epiteton varium se týká variability fialid. Tol.valrium ukazuje ve svém životním cyklu určitou podobnost s Bodem Harptsporium, o ktežém bude zmíněno jinde. Kměn označený CT/93 nemůže využívat Xafinózu, ale roste dobře na následujících zdrojích uhlíku: mannitu, inositu, sacharóze, / Z ► z z z z fruktoze, rhamnoze, galaktoze, dextroze, arabinoze a xyloze v povrchových kulturách. Tyto kultury se špatně vyvíjejí na živné půdě a agaru se sladovým výtažkem adobře se vyvíjí na agaru se sojovou moukou, Czapekově agaru a agaru s bramborovou dextrózou. Pro uskladnění není vhodný agar s ovesnou moukou a agar s dextrozou a kvasničnýra výtažkem.

Tol.varium se ostře ^odlisuje od Tol. trigonosporům, které produkuje konidia trojhranná na povrchu se slabě vydutými okraji. Tol. varium se také odlišuje od Tol. balanoides. Poslední produkuje lahvovité postranní fialidy.

Kromě toho kmen /CT/93/ Tolypocladium varium n.sp.se odlišuje od autentického typu kmene Tolypocladium inflatum /CBS 714.70/ s ohledem na to, že posledně jmenovaný kmen vyvíjí bohaté bílé vzdušné myceliura při kultivaci na živné půdě

- 5a moltóza-agar., zatímco Tolypocladium varium sp.nov.CY/93 neprodukuje toto vzdušné mycelium. Typ kmene Tolypocladium inflatum produkuje v mycelin, v živné půdě železo-pepton červenavě hnědý konečný pigment, zatímco mycelium Tolypocladium varium sp.nov.CY/93 zůstane světle žluté. Kmen Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 nevyužívá arabinózu, zatímco Tolypocladium inflatum využívá. Při použití dusitanu o

sodného vyvíjí posledně jmenovaný kmen Bohaté mycelium, zatímco Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 roste obtížně.

Srovnání Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 s autentickými kmeny jiných Tolypocladium species, Trichoderma polysporum ATCC 16,641 a Cylindrocarpon lucium NKRL 5760 je uvedeno v tab.l.

Tab. I

	a 3 m •h cr\ ot M l-t O O S ^ε 34 3 ι-l ÍM O eS	Tolypocladium cylindrosporum CBS 717.70	Tolypocladium cylindrosporum CBS 718.70	Tolypocladium geodes CBS 721 70	S O 3 b•rt · CO <M «Μ tO O « Pc Φ r-l O O Φ ε-ι fao	Trichoderma pólysporům ATCC 16641	3 o 1=4 «0 O O O VO 4 Sb3 3 •rl ·Η »-3 r-l y ca >> 3 fS O r-i g
Rozklad celulózy		-	-	-	-	+++	+++
vzdukšné mycelium: zelené nebo modravě zelené	—	—	—	—		+++	+++
červený rozpustný pigment produkce na Ringově agaru	—	-	-	—	MB	—	+++
Hnědý pigment produkce na agaru se železem	-	-	-	-	-	-	+++
Tmavě hnědý pigment produkce na agaru se syntetickým glycerinem	-	-	-	-	-	+++	-
Využití sacharózy	+++	+++	+++	+++	4-++	-	+++
Využití inulinu	-	-	-	-	-	-	4-++
Růst při 5°C	+++	+++	+++	+++	+++	-	-
Růst při 37°C	-	«·	-	-	-	+	+++
Odolnost proti zahř-ívání při 50°C po 60 minut	+++	-	-	-	-	+++	+4~+
Produkce kyseliny z glu- kózy	4-++	+++	+	-r	+++	+++	+++
Využiti salicylátu sodného	-	-	-	-	-	+++	+++
Využití malonátu sodného	++	++	++	-	-	44~	44
Využití vinanu sodného		++	++	-	-	++	44-
Fialový rozpustný pigment produkce na agaru s tyrosinem a leučinem	-	-	-	++4-	+++	-	-

- 5c Na základě výše uvedených poznatků se vynález týká způsafou přípravy cyklosporinového antibiotíkového komplexu a/nebo jeho složek, cyklosporinu A, cyklosporinu B a cyklosporinu C, aerobní fermentaci vláknitého plísnového kmene, který vede k biosyntéze výše uvedeného antibiotika /antibiotik/ v živném prostředí obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku a také minerální soli a izolací vytvořených produktů, který spočívá v kultivaci kmene nového druhu plísně Tolypocladium varium produkujícího cyklosporinový antibiotikový komplex, zejména Tolypocladium varium sp.nov.

- 6 CY/93, uloženého v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Madarsko pod číslem NCAIM/P/P 001005, v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální soli, za aerobních podmínek, při teplotě v rozmezí 25 až 30 °C a případně izolaci a čištění cyklosporinového antibiotikového komplexu nebo jeho složek»

Podle výhodného provedení vynálezu se cyklosporinový antibiotikový komplex vyrobí za použití nového kmene Tolypop.adium varium sp.nov.CY/93» Vybraný kmen je velmi výhodný vzhledem k rychlému rustu. Je příznivým znakem, že kmen může využít sacharozu, glukózu, sorbozu, maltozu, fruktozu, škrob, glycerin a také tuky a oleje jako zdroje uhlíku a různé organické a anorganické zdroje dusíku, jako kukuřičný výluh, pepton, kvasničný výtažek, masový výtažek, dusičnan sodný, dusičnan amonný, síran amonný, a různé aminokyseliny. Kromě výše uvedených - zdrojů uhlíku a dusíku mohou živná prostředí použitá pro produkci cyklosporinového antibiotikového komplexu také obsahovat mi&nerální soli /chlorid draselný, síran hořečnatý nebo dihydrogen-fosforečnan draselný/, stopové prvky /soli mědi, manganu, železa /, dále v

vitaminy a odpěnovadla.

Podle výhodné metody podle vynálezu se kapalné prostředí naočkuje suspenzí konidia a mycelia připraveného z kultury Tolypocladium varium sp.nov. CY/9S na šikmém agaru. Po třídenní kultivaci se získaná předkultura použije k naočkování prostředí použitého pro výrobu antibiotika, které se potom inkubuje při 25 až 30 °C, s výhodou při 25 °C, po dobu _v 5 až dní. Během fermantace ss pK udržuye v rozmezí 6,0 až

2,5, s výhodou při 5,2« Fermantace se provádí za aerobních podmínek, za intenzivního míchání /750 až 1C00 otáček za minutu/ a provzdušnování 30C l/h.

Během fermantace se obsah cyklosporinů živné půdy monitoruje mikrobiální zkouškou a vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Jakmile se vyrobí maximální množství antibiotika, získají se tato z kultury známým způsobem extrakční a/nebo absorpční metodou.

Cyklosporinová koncentrace živné půdy se máří na základě antifungicidní účinnosti cyklosporinů deskovým difuzním testem. Jako zkoušené organismy se mohou s výhodou použít Aspergillus niger, Aspergillus japonicus a Curvularia lunata /M.Dreyfuss et al.: European J.Appl.Microbiol.3, 125-133 /1976//. Vysokotlaká kapalinová chromatografie cyklosporinová koncentrace živné půdy se provádí na vzorku půdy zředěním desetinásobně methanolem podle P.Kreuziga /J.Chromát.290,181 /1284//. Podle těchto pokusů se vyrobí cyklosporinový antibiotikový komplex obsahující cyklosporin A jako hlavní produkt a cyklosporin B a cyklosporin C jako menší složky ve vysokém výtěžku /950 mcg/ml/ za použití nového kmane Tolypocladium varium sp.nov.C7/93.

Pro izolaci cyklosporinového komplexu z fermantační živné půdy se s výhodou může použít extrakční metoda. Před H V extrakcí se mycelium oddělí bud filtrací nebo odstředěním.

Antibiotika vyrobená během fermentace se mohou výhodně vymýt z buněk mikroorganismu nižšími alkanoly, s výhodou metanolem, nebo organickými ketony, s výhodou acetonem, zatímco cyklosporiny ve filtrátu se mohou extrahovat organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou, jako ethylacetátem, n-butylacetátem, dichlormethanem, 1,2-dichlorethanem nebo chloroformem, s výhodou n-butylacetátem. Surový produkt získaný extrakcí je znečištěn červenými a fialovými pigmenty produkovanými plísní, které se mohou odstranit adsorpcí na aktivním uhlí nebo silikagelu. Případné lipidové znečištěniny /t.j. odpenovadlo/ se mohou oddělit distribucí do systému petroletheru a methanolu obsahujícího 10 % vody, kde se nečistoty převedou do petroletherové fáze.

Vodná methanolová fáze se koncentruje za sníženého tlaku, potom se vodný zbytek extrahuje dichlormethanem, ⁰ který se ^dpaří a získá se čištěný eyklosporin. Cyklosporin A se může oddělit od menších cyklosporinových složek sloupcovou chromatografii a překrystalováním.

Struktura izolovaných produktů byla objasněna ultraV 1 , fialovou, infračervenou, H nukleární magnetickou rezonanční, 13 z z

G nukleární magnetickou rezonanční a hmotovou spektroskopií a analýzou aminokyselin. ''Dvli,! ι i , ,_Λ 'ι

......... ............ '“V ¹

Vynález bude objasněn v následujících příkladech, aniž by byl omezen jeho rozsah.

Příklad 1

Suspenze konidia are-tro mycelia se připraví s 5 ml 0,9/« roztoku chloridu sodného_;získaného z kultury Tolypocladium varium nov.sp. Ca/93 na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kva^sničným výtažkem. 1 ml této suspenze se použije k naočkování 100 ml sterilního IC inokulačního prostředí v 500 ml. Erlenm.eyerove bance.

- 9 0,5 g

0,01 g upraví před sterilizací

Složení IC prostňedí :

glukóza 40 g kasein-pepton 5 g dusičnan sodný 3 g dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný síran hořečnatý x 7 H_o0 síran železnatý x 7 í^O v 1000 ml vodovodní vody.

plí živného prostředí se na 5,2 a směs se steriluje 25 minut při 121 °C. Kultura se inkubuje při 25 °C na rotační třepačce /340 otáček za minutu/, potom se použije 5 ml tohoto inokulačního prostředí k naočkování 15 500 ml. Srlenmeierových baněk obsahujících 100 ml sterilního prostředí.

Složení FC^ prostředí

glukóza	SC	g
trypton	40	g
močovina	2	g
síran amonný	12	g
dusičnan amonný	3	g
dihydrogenfosforečnan
draselný	2	g
chlorid draselný		s
síran hořečnatý x 7 E^O	0,5	a o
síran železnatý x 7 ELO	0,01	g

v 1000 ml vodovodní vody.

pH živného prostředí se upraví před sterilizací na 5,2 a směs se steriluje 25 minut při 121 °C.

Baňky se inkubují při 25 °C na rotační třepačce /340 to tácek za minutu/. Během fermentace se monitoruje antibiotiková koncentrace živné půdy deskovým difuzním testem.

Jako zkoušený organismus se použije Aspergillus niger. Koncentrace cyklosporinového antibiotikového komplexu v živné í

půdě se stanoví za použití cyklosporinu A jako standardu. !

fermentace probíhá 168 hodin, kdy živná půda obsahuje , ti

400 Aig/ml cyklosporinového antibiotikového komplexu. Cyklosporinový komplex se izoluje podle následující metody.

Buňky jednoho litru živné půdy se filtrují a antibiotika se promyjí dvakrát 200 ml methanolu. Vodný methanolový roztok se koncentruje za sníženého tlaku, potom se antibiotikový komplex extrahuje ? vodného koncentrátu 2x 50 ml n-butylacetátu. Cyklosporinový obsah filtrátu se extrahuje 200 ml n-butylacetátu. n-butylacetátové extrakty se shromáždí, í suší bezvodým síranem sodným, potom se odpaří za sníženého tlaku při 40 °C. 3,7 g získaného surového produktu se rozpustí v 10 ml melthanolu a převede se na vrcholek gelové kolony i

Sephadex LK-20/délka kolony 40 cm, průměr 2,5 cm/ připravené j s methanolem. Potom se lipidové nečistoty oddělí elucí <

?

methanolem. frakce obsahující cyklosporinový komplex se ;

odpaří za sníženého tlaku při 40 °C. Oddělení složek získá- ;

ného cyklosporinového komplexu /1,05 g/ se provádí chromatografií na silikagelové koloně připravené z 20 g silikagelu 40 /Reanal,Budapest/, elucí směsí chlorof orm-metlianol obsahující postupně se zvyšující objem methanolu. Eluce začíná se 100 ml chloroformu, potom pokračuje se směsí chloroformmethanol, kde obsah methanolu každé 100 ml části se · zvýší o 0,5 /»· Cyklosporinový obsah frakcí se monitoruje chromatografií na tenké vrstvě /deska: silikagel óO

Alufoil /Merck/, eluční činidlo: ethyl_acetat/-isopropanol 95 : 5, detekce: jodové páry/. Cyklosporiny A,3 a C se eluují z kolony směsí raethanoljbhlorof orm obsahující 2,0

2,5 fí a 3,0 ýo methanolu. Frakce obsahující čisté složky se odpaří za sníženého tlaku a získá se 225 mg cyklosporinu A /t.t.: 137-140 °C, -189 ° /methanol//, 25 mg cyklosporinu B /t.t.:149-151 °C/ a 52 mg cyklosporinu C /t.t.: 150-152 °C/o

Příklad 2

1 IC inokulačního prostředí sterilovaného 45 minut při 121 oC. v 10 1. laboratorním fermentorů se naočkuje 200 ml inokulační kultury připravené jak popsáno v příkladu 1, potom se inkubuje při 25 °C, míchá se při 750 otáček za minutu a provzdušňuje se 300 l/h vzduchu.

Fermentace se dále provádí 72 hodin, potom se použije 500 ml tohoto inokulačního prostředí k naočkování 5 1 FC_n prostředí, steriluje se 45 minut při 121 °C v 10 1.

4a laboratorním fermentolu.

	Složení	FC₉ prostředí
glukóza		80	g
trypton		40	g
v ·
močovina			g
síran amonný	12	g

dusičnan sodný 3 g dihydrogenfos£orečnan draselný 2 g chlorid draselný 0,5 g síran hořečnatý x 7 H^O 0,5 g v

síran mednatý x 5 H^O 0,01 g síran man^anatý x 7 H_?0 0,01 g síran železnátý x 7 H^O 0,01 g v 1000 ml vodovodní vody.

pil prostředí se upraví před starilací na 5,2. Naočkovaná kultura se inkubuje při 25 °C, míchá se při 750 otáček za v

minutu a prcvzdušnuje se 300 l/h.

Fermentace se provádí za výše uvedených podmínek 144 hodiny až se dosáhne vrcholu cyklosporinového titru, potom je živná půda bohatá a může se zpracovat.

Cyklosporin A se izoluje z 4,3 1 fermentační živné půdy obsahující 5CC ^ug/ml cyklosporinového komp^lexu následujícím způsobem.

V

Buňky mikroorganismu se odstředí a cyklosporinový komplex se vymyje z buněk 2x 1 litrem methanolu. Vodný methanolový roztok se koncentruje za sníženého tlaku, potom se antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2x 250 ml nbutylacetátu.

Cyklosporinový komplex se extrahuje z filtrátu fermentační^ živné půdy 2x 500 ml n-butylacetátu<> Všechny n-butylacetátové extrakty se shromáždí, suší bezvodým síatanem sodným, potom se roztok odpaří za sníženého tlaku při 40 °C. P^ředběžné čištění získaného surového produktu /19>2 g/ se provádí chromatografií na koloně připravené se 100 g silikagelu 60 /velikost částic 0,063 až 0,2 mm/, se směsí chloroformmethanol-aceton /92 :4:4/ jako elučním činidlem. Frakce obsahující cyklosporinový komplex /chromatografie na tenké vrstvě: deska: bsilikagel 60 ^254* Alufoil /Merck/; eluční činidlo: hexan-aceton 2 : 1; detekce: chlor/tolidin/ se odpaří do sucha. Odparek /5,28 g/ se podrobí sloapcové chromatografií a získá se cyklosporin A. Kolona se připraví ze 115 g silikagelu 60 /velikost částic 0,063 až 0,2 mm/ a eluuje se směsí hexan-aceton obsahující postupně se zvyšující objem acetonu. Cyklosporin A se eluuje z kolony směsí obsahující 23 ϊ<> acetonu. Odpařením frakcí obsahujících cyklosporin A se získá 1,46 g cyklosporinu A.

Příklad 3

A

Suspenze konidia nebo mycelia se připraví s 5 ml 0,9 roztoku chloridu sodného,získaného z kultury Tolypocladium varium nov.sp. 0Σ/93 na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasniČným výtažkem.a použije se k naočkování 800 ml IC inokulačního prostředí pox^sansho v příkladu 1 v v a steriluje se v 3 1.Srlenmeyerově bance. Banka se inkubuje při 25 °C na rotační třepačce /340 otáček za minutu/ po dobu

2,5 dní, potom se tímto prostředím naočkuje 5 1 FC^ prostředí sterilovaného v 10 litrovém laboratorním fermentoru při 121 °C po 45 minut.

Složení FC^ prostředí:

Z

sorboza	60	g
trypton		40	g
močovina		2	g
síran amonný		12	g
dusičnan sodný		3	g
dihydrogenfosforečnan draselný	2	g
chlorid draselný		0,5	g
síran hořečnatý x 7	rr ^Ai2°	0,5	g
síran manganatý x 7	h₉o	0,01	σ o
síran železnatý x 7	SfyO	0,01	σ o
v 1000 ml vodovodní vody«

pH prostředí se upraví před vana kultura se inkubuje při 25 ⁰ sterilací na 5,2.

za míchání při 1

KaočkoΓ' n rU V v otáček za minutu a provzdušnuje se 300 l/h.

Fermentace se dále provádí 168 hodin, kdy obsahuje podle mikrobiální zkoušky fermentační živná půda 600 mcg/ml cyklosporinového komplexu.

Izolací podle příkladu 2 se získá z jednoho litru živné půdy 310 mg cyklosporinu .4.

Příklad 4

Suspenze konidia neb-o mycelia se připraví s 5 ml

0,9 / roztoku chloridu sodného₍získaného z pěti až sedmidenní kultury Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 /NCAIM/F/F ν'

001005/ na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasničným výtažkem a použije se k naočkování 500 ml IC inokulačního prostředí popsaného v příkladu 1 a steriluje se v 3 1. Erlenmeyerovč bance. Banka se inkubuje na rotační třepačce /340 otáček za minutu/ po 3 dny při 25 °Q, potom se toto prostředí použije k naočkování 5 1 prostředí sterilovaného v 10 1. laboratorním fermentoru při 121 °C po 45 minut.

Složení prostředí maltoza trypton močovina síran amonný dusičnan sodný dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný 0,5 g síran hořečnatý x 7 H₂0 0,5 g síran manganatý x 7 b^O 0,01 g v

síran mědnatý x 5 H^O 0,01 g síran železnatý x 7 0,01 g v 1000 ml vodovodní vody.

pH. prostředí se upraví před sterilací na 5,2.

Po naočkování se fermentační živná půda inkubuje při 25 °G, míchá se při 1000 otáček za minutu a provzdušnuje se 300 1/h.

Permentace se dále provádí 144 hodiny, kdy fermentační živná půda obsahuje 520 mcg/ml cyklosporinového komplexu podle mikrobiální zkoušky.

Izolace se provádí metodou popsanou v příkladu 1.

Z 1 litru živná půdy se získá 305 mg cyklosporinu A.

Příklad 5

A

Suspenze konidia neb-o mycelia se připraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného z 5 až 7 denní kultury Tolypocladium varium nov» sp. Ci/93 /NCAIM/P/P 001005/, na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasničným výtažkem a použije se k naočkování 500 ml IC inokulačního prottředí popsaného v příkladu 1 a steriluje se v 3 1. Srlenmeyerově

V v bance. Banka se inkubuje na rotační třepačce /340 otáček za minutu/ při 25 °C po dva dny, potom se tímto prostředím naočkuje 5 1 FGj prostředí sterilovaného v 10 1. laboratorním fermentoru při 121 °C po 45 minut. Po naočkování se fermentační ^ivná půda míchá při 25 °C při 750 otáček za minutu a provzdušnuje se 300 l/h. Po 96 hodinové kultivaci se přidá sterilovaný vodný roztok 100 g maltozy a fermentace pokračuje 144 hodiny, kdy živná půda obsahuje podle mikrobiální zkoušky

950 me$/ml cyklosporinového komplexu. Získá se celkem 4,8 1 S c\ živné půdy. Izolace se provádí podle metody poprané v příkladu 2 a získá se 2,75 g cyklosporinu A.

Claims

1. Plísňový kmen Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 uložený v Národní sbírce změdělských a průmyslových mikroll organismů {National Collection of Agricultural and Industrial Microorganismspod číslem NCAIm|p|f 001005.

2. Způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinů 1, cyklosporinů B a cyklosporinu C, aerobní fermentaci vláknitého plísňového kmene vedoucí k biosyntéze výše uvedeného antibiotika nebo antibiotik v živném prostředí obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli a isolací vytvořených produktů, vyznačující se tím, že se plísňový kmen Tolypocladium varium podle nároku 1, produkující cyklosporinový antibiotikový komplex, kultivuje v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální soli, za aerobních podmínek při 25 až 30 °C a případně se vyrobený cyklosporinový antibiotikový komplex nebo jeho složky isolují a čistí.

3. Způsob podle nároku 2,vyznačuj ící se tím, že se fermentace provádí v prostředí obsahujícím pepton, síran amonný a trypton, jako zdroj dusíku a glukózu, maltózu a sorbit, jako z^roj uhlíku.