SE505442C2 - Mikrobiell process för framställning av immunosuppressiva antibiotika innefattande odling av en ny Tolypocladium svamp - Google Patents

Description

505 442 tillförsel av cyklosporin A.

Vidare har cyklosporin A med framgång använts för be- handlingen av en del autoimmuna sjukdomar (uveitis, reumatoid artritis, psoriasis och myasthenia gravis).

Inom patentlitteraturen användes följande mikroorganis- mer för framställning av cyklosporinkomplex: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (schweiziska patentet 589 716), Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 8044 (enligt tidigare taxo- nomi: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai (schweizis- ka patentet 603 790) och Fusarium solani, MCI-1549, MCI-1550 (publicerade japanska patentansökningen nr 82 63093). Vid för- loppet av fermenteringsprocesser genomförda med ovanstående mikroorganismer erhölls låga produktionsniváer för cyklospo- rinerna efter långa fermenteringsperioder och isolationsut- bytena var även små.

Sökandens undersökningar fokuserades på att finna mikro- organismstammar, som kunde alstra cyklosporinantibiotikakom- plex eller dess komponenter i högre koncentrationer och med mer fördelaktiga villkor än tidigare stammar. Siktning av ett stort antal filamentsvampstammar isolerade från jord en mikro- organismstam av Tolypocladiumarten, som var i stånd att bio- syntetisera cyklosporinantibiotikakomplexet. Denna mikroorga- nism betecknad CY/93 av sökanden, kunde icke identifieras i taxonomiska studier med någon av de cyklosporinkomplexalst- rande svamparterna. Tolypocladium varium species nova CY/93 är en ny taxon av Tolypocladiumsläktet, som kan differentieras på artnivå.

Baserat på ovanstående avser uppfinningen en mikrobiell process som ger en buljong innehållande höga koncentrationer av cyklosporin genom att utnyttja en ny mikroorganism, Toly- pocladium varium species nova CY/93, deponerad hos the National Collection of Agricultural and Industrial Microorga- nisms (nationella samlingen av jordbruks- och industriella mikroorganismer), Budapest, Ungern, med numret NCAIM(P]F 001005. Fermenteringsbuljongen innehöll vid sidan av cyklo- sporin A, nämligen huvudprodukten, även små mängder cyklo- sporin B och cyklosporin C.

BNSDOCJD: BNSDOCID EUöMZC-P' 505 442 De taxonomiska kännetecknen för den nya svamparten jäm- fördes med huvuddiagnostikegenskaperna hos Tolypocladiumar- ter enligt följande: 1971 såsom ett nytt släkte av jordmonilialer. Dess kännetecknande egen- Tolypocladiumarten beskrevs först av Gams skaper var: långsam tillväxt, kuddliknande vita kolonier,ter- minala och laterala fialider utvecklade delvis på en kort sid- gren med kraftigt svullen bas och filamentös, ofta böjd hals avslutad i ett encelligt konidium. Med detta släkte differen- tierades tre nya arter enligt följande av Gams: T. geodes, inflatum. T. geodes har uttalad T. cylindrosporum och T.

Actinomycetestypensjordodör, medan den nya T. varium sp. nov.

CY/93 är fullkomligt befriad därifrån. Vidare är bärarceller- na hos T. geodes signifikant smalare än dem hos T. varium sp.

CY/93. tiskt långa och förlängda, medan de för T. varium sp. nov. Konidierna för T. cylindrosporum är karakteris- nov.

CY/93 är sfäriska och endast något avlånga. Konidierna hos T. inflatum är äggformade och längre än de som observeras i CY/93. tum är karakteristiskt alstrade i verticiler eller direkt på kulturen av T. varium sp. nov. Fialiderna hos T. infla- hyferna eller på 2-3 um långa bärarceller. T. varium sp. nov.

CY/93 visar icke något sådant mönster av verticillat-arrange- mang, varvid detta endast kan detekteras från art till art sporadiskt. På grund primärt av det vita bomullsliknande antennmyceliet är alla kända Tolypocladiumarter vita, medan motsatsen för kolonierna är gulgrå, färglösa eller gula.

CY/93 På media innehål- Inga typiskt lösliga pigment alstras. T. varium sp. nov. kan även differentieras i detta hänseende: lande glukos och pepton lika väl som maltextrakt-jästextrakt alstras ett mörkt djupgrått respektive svart pigment med temporal variation.

Den taxonomiska bestämningen av de nya arterna jämfört med andra kända Tolypocladiumarter genomföres på basis av följande publikationer: É, 185-191 (1971) och G.L. Barron: Can. J. Bot. ÉB, 439-442 (1980).

De diagnostiska mönstren för Tolypocladium varium sp.

W. Gams: Persoonia, nov. CH/93 summeras i det följande. 505 442 Tio dagar gamla kolonier har en diameter av 10-25 mm, deras yta är täckt av vita, bomullsliknande rikt sporbildande luftmycelium. Motsatsen till kolonierna är gulgrå eller smuts- grå. I en del komplexa media alstras ett mörkgrått lösligt pig- ment. Båda terminal- och lateral sporulation observeras på hyferna hos luftmyceliet. Fialider är lokaliserade antingen ensamma eller sporadiskt, ibland i verticiler, direkt på hyfer- na eller på korta (2-3 pm) bärarceller. Fialiderna är uppbygg- da fràn en svullen bas (2-4 x 2-3 pm) och en lång trådhals (2-4 x 0,5-0,6 pm). Konidierna för huvudena är små (2-3 x 1,3-2,2 pm), vanligen sfäriska och jämna. Det specifika epi- tetet "varium“ refererar till varierbarheten hos fialiderna.

Stammen betecknad CY/93 kan icke utnyttja raffinos, men den växer väl på följande kolkällor: mannitol, inositol, sackaros, fruktos, ramnos, galaktos, dextros, arabinos och xylos i yt- odling.

Dess kulturer utvecklas dåligt på näringsmedel och maltextraktagar och utvecklas väl på sojamjölagar, Czapek- agar och potatisdextrosagar. Vetemjölsagar och dextrosjäst- extraktagar är icke lämpliga för lagring.

Vidare är den holotypa stammen (CY/93) av Tolypocladium varium n. sp. skild från den autentiska typen stam av Toly- pocladium inflatum (CBS 714.70) i det avseendet att sistnämnda stam utvecklar ett rikt luftmycelium då det odlas på maltos- agarnäringsmedium, medan Tolypocladium varium sp. nov. CH/93 icke alstrar sådana luftmycelier. Typen av stam av Tolypocla- dium inflatum alstrar rödbrun endopigmentering i sitt sub- stratmycelium på järnpeptonagarodlingsmedium, medan substrat- mycelier av Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 förblir lätt gula. Stammen Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 utnyttjar icke arabinos, medan Tolypocladium inflatum gör detta. Vid användning av natriumnitrit utvecklar sistnämnda stam rikt mycelium, medan Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 knappast växer.

Jämförelsen av Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 med autentiska stammar av andra Tolypocladiumarter, med Trichoderma polysporum ATCC 16,641 och med Cylindrocarpon lucium NRRL 5760 summeras i tabell I.

BNSDOCID: 505 442 5 TABELL I E E å E å E E<: C Dfi Du :nu :a :af\ U "am -- 'o\ Uno U non o UN E 5-- ß* rv>~ ro mß m mß m r\ mN n.. 3 *LJ fl-'O - ~4O --< --|r\ (DL-v: U c U uuß Ungcnu -fo 'Doo .O “Û OE OD-c OUMOWN Om 051,-. --Ef\ 3.:: Q:r~ uzßguß am cm DIV* >~--l >~--4 >...4 >_~Ü >.'O U >_(_J. L-'CJ f-fl-J f-dfwçfj pop-agjpçouj -10 .-4,_4[_) 'PM-OJ Om o>~cn o>~cnomcn omL-:m- “Om *-> r-ULJ >-uz..:>-cr>c_:.*-O'1>-o.< *Då Cellulosasönderdelning ' “ " - ' *** *** Luftmycelier: gröna eller blågröna " ' * - +++ ++, Alstrandet av rött lösligt pigment pà King-agar ° ' - - - _ +++ Alstrandet av brunt pigment pa jarn-pepton-agar T ' - - ~ _ ++, Alstrandet av mörkbrunt pigment på syntetisk glycerol~agar ' - - - - +++ _ Sackarosutnyttjnlng +++ +++ +++ +++ lll _ +,+ Insulinutnyttjning _ ' “ - - - +++ Til æm '<1 soc l V V1 ++4' +++ +++ §++ ++§ - _ Tillväxt vid 37°c _ " ' - - + +++ Mots ' d mot värmebehandling vid SO C under 60 minuter +++ ' 'f - - +++ +++ Syraproduktion från glukos +++ +++ i i +++ 'P+-O 4-++ Natriumsalicilat- utnyttjnlng - _ _. _ _ HW +++ Natriunnalonat- utnyttjning ++ ++ ++ _ _ ,+ ++ Natriumtartrat- utnyttjning * +* ** ' ' +* ++ Alstrandet av lila-lösligt pigment pà tyrosin- och leucin- _ _ _ +++ +** _ _ agar 505 442 6 Baserat på ovanstående resultat avser uppfinningen en process för framställning av cyklosporinantibiotiska komplex och/eller dess komponenter, cyklosporin A, cyklosporin B och cyklosporin C genom aerobisk fermentering av en trådsvampstam med biosyntetisering av ovanstående antibiotika i ett närings- medium innehållande utnyttjningsbara kol- och kvävekällor li- kaväl som mineralsalter, och genom att isolera de bildade produkterna, vilket omfattar odling av en stam av den nya Tolypocladium varium fungus-arten alstrande cyklosporinanti- biotikakomplexet, företrädesvis Tolypocladium varium sp. nov.

CY/93 inlämnat hos den nationella samlingen av jordbruks- och industriella mikroorganismer, Budapest, Ungern under nummer NCAIM(P)F O01005,på ett näringsmedium innehållande kolkällor, organiska och oorganiska kvävekällor likaväl som mineralsalter under aerobiska förhållanden vid en tempera- tur inom området 25-30OC och om så önskas isolering och re- ning av cyklosporinantibotikakomplexet eller dess framställ- da komponenter.

Enligt en föredragen utföringsform av föreliggande upp- finning alstras cyklosporinantibotikakomplexet med den nya stammen Tolypocladium varium sp. nov. CY/93. Den valda stam- men är i hög grad fördelaktig på grund av dess snabba till- växt. Det är ett gynnsamt kännetecken att stammen kan utnytt- ja sackaros, glukos, sorbos, maltos, fruktos, stärkelse, glycerol likaväl som olika fetter och oljor såsom kolkällor och ett stort antal organiska och oorganiska kvävekällor, sådana som majsstöpolym pepton, jästextrakt, köttextrakt, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat likaväl som olika aminosyror. Utöver ovanstående kol- och kvävekällor kan näringsmedierna som användes för framställning av cyklo- sporinantibiotikakomplexet även innehålla mineralsalter (kaliumklorid, magnesiumsulfat eller kaliumdivätefosfat), spàrelement (koppar, mangan, järnsalter) och vidare vitami- ner och antiskummedel.

BNSDOCID: 505 442 Enligt en föredragen metod vid föreliggande uppfinning inokuleras ett vätskemedium med en suspension av konidier och mycelier tillverkade från agarsnedkultur av Tolypocladium CY/93. Efter erhållna förkulturen för att varium sp. nov. odling i 3 dagar användes den inokulera mediet som användes för antibiotikaproduktionen, som därefter inkuberades vid 25-30OC, företrädesvis vid 25OC under 5-7 dagar. Under fer- menteringen hölls pH inom området 6,0 till 2,5, företrädesvis vid 5,2. under kraftig omröring (750-1000varv/min) och luftning med 300 liter/timme.

Fermenteringen genomfördes under aeroba förhållanden Under fermenteringen övervakades cyklosporininnehållet hos buljongen genom mikrobiologiska försök och högtrycksväts- kekromatografi. Så snart som maximimängden av antibiotika alstrats erhålles dessa från odlingsvätskan på känt sätt med extraktiva och/eller adsorptiva metoder.

Cyklosporinkoncentrationen hos buljongerna mättes pà basis av antifungusaktiviteten hos cyklosporinerna genom platt- diffusionsprov. Aspergillus niger, Aspergillus japonicus och Curvularia lunata kan med fördel användas såsom testorganis- (M. 125- 133 /1976/). Analysen HPLC av cyklosporinkoncentrationen hos buljongen genomfördes från buljongprover spädda tio gånger in, 181/1984/1.

Enligt sökandens experiment framställes cyklosporinantibio- mer Dreyfuss m.fl.: European J. Appl. Microbiol. 2, med metanol enligt F. Kreuzig (J. Chromat. tikakomplexet innehållande cyklosporin A såsom huvudprodukt och cyklosporin B och cyklosporin C såsom mindre komponenter, med högt utbyte (950 mcg/ml) genom den nya stammen Tolypocla- CY/93.

Extraktionsmetoder kan med fördel tillämpas för isole- diumxariwn sp. nov. ring av cyklosporinkomplexet från fermenteringsbuljongen.

Före extrahering separeras myceliet antingen genom filtrering eller centrifugering. Antibiotika alstrade under fermentering kan med fördel urtvättas från mikroorganismcellerna med lägre alkanoler, företrädesvis med metanol och med organiska keto- ner, företrädesvis med aceton, medan cyklosporinerna i bul- jongfiltratet kan extraheras med organiska med vatten icke 505 442 blandbara lösningsmedel, sådana som etylacetat, n-butylacetat, diklorometan, 1,2-dikloroetan eller kloroform, företrädesvis med n-butylacetat. Ràprodukten som erhålles genom extrahering är förorenad med röda och violetta pigment alstrade av svampen, vilka kan avlägsnas genom adsorption pà aktivt kol eller kisel- gel. Möjliga lipida föroreningar (dvs. antiskummedel) kan se- pareras genom fördelning i ett system av petroleumeter och metanol innehållande 10% vatten, där föroreningarna överföres till petroleumeterfasen.

Den vattenhaltiga metanolfasen koncentreras vid reduce- rat tryck och därefter extraheras vattenresten med dikloro- metan, som förångas för att ge renad cyklosporin. Cyklosporin A separeras frán de mindre cyklosporinkomponenterna genom kolonn- kromatografi och omkristallisation.

Strukturen för de isolerade produkterna bestämdes genom UV-, IR- 1H NMR-, 13C NMR- och mass-spektroskopi samt amino- syraanalys.

Följande exempel är illustrativa men icke begränsande med avseende på uppfínningens omfång.

Exempel 1 En konidium- eller myceliumsuspension framställes med 5 ml av en 0,9 % natriumkloridlösning erhållen från maltextrakt- jästextraktagar-snedkultur av Tylopocladium varium nov. sp.

CY/93. 1 ml av denna suspension användes för att inokulera 100 ml sterilt inoculum-medium IC i en 500 ml Erlenmeyer-kolv.

Sammansättning av mediet IC: Glukos 40 g Kasein-pepton 5 g Natriumnitrat 3 g Kaliumdivätefosfat 2 g Kaliumklorid 0,5 g Magnesiumsulfat x 7 H20 0,5 g Järn(II)sulfat x 7 H20 0,01 g i 1000 mlvattenledningsvatten.

BNSDOCID: BNSDOCID ÉWSÅ-ÄLEGZ 505 442 pH för näringsmediet justerades till 5,2 före sterili- sering och blandningen steriliserades vid 121OC under 25 minu- ter. Odlingen inkuberades vid ZSOC i en roterande skakanord- ning (340 varv/min) och sedan användes 5 ml-delar av detta inoculummedium för att inokulera 15 500 ml Erlenmeyer-kolvar innehållande 100 ml sterilmedia FC vardera. 1 Sammansättning av mediet FC1: Glukos 80 g Trypton 40 g Urea 2 g Ammoniumsulfat 12 g Natriumnitrat 3 g Kaliumdivätefosfat 2 g Kaliumklorid 0,5 g Magnesiumsulfat x 7 H20 0,5 g Järn(II)sulfat x 7 B O 0,01 g 2 i 1000 ml vattenledningsvatten. pH för näringsmediet justerades till 5,2 före sterili- sering och blandningen steriliserades vid 121OC under 25 mi- nuter.

Kolvarna inkuberades på en roterande skakanordning (340 varv/min) vid 25OC. Under fermentering övervakades anti- biotikakoncentrationen genom plattdiffusionsprov.

Aspergillus niger utnyttjades såsom testorganism. Kon- centrationen av cyklosporinantibiotikakomplexet i buljongen provades med användning av cyklosporin A såsom standard.

Fermenteringen fortsatte under 168 timmar, då buljongen innehöll 400 pg/ml cyklosporinantibiotikakomplex_ Cyklosporin- komplexet isolerades i enlighet med följande metod.

Cellerna i en liter av buljongen filtrerades och anti- biotikumet tvättades bort två gånger med 200 ml metanol. Den vattenhaltiga metanollösningen koncentrerades under reduce- rat tryck och därefter extraherades antibiotikakomplexet från vattenkoncentratet med 2 x 50 ml n-butylacetat. Cyklosporin- innehållet hos buljongfiltratet extraherades med 200 ml torkades över n-butylacetat. n-butylacetatextrakten utvanns, 505 442 10 vattenfritt natriumsulfat och föràngades sedan vid reducerat tryck vid 4OOC. De 3,7 g av råprodukten som erhölls upplöstes i 10 ml metanol och överfördes på toppen av en gelkolonn av Sephadex LH-20 (kolumnlängd 40 cm, diameter 2,5 cm) prepare- rad med metanol. Lipidföroreningarna separerades då genom eluering med metanol. Fraktionerna innehållande cyklosporin- komplexet föràngades under reducerat tryck vid 40OC. Separa- tion av komponenterna hos det erhållna cyklosporinkomplexet (1,05 g} genomfördes genom kromatografi på en kiselgelstapel tillverkad av 20 g Kieselgel 40 (Reanal, Budapest) genom eluering med kloroform-metanollösningsblandningar innehållan- de gradvis ökande volymer metanol. Elueringen startade med 100 ml kloroform och fortsattes sedan med kloroform-metanol- blandningar där metanolinnehållet för varje 100 ml-del ökades med 0,5%. Cyklosporininnehållet hos fraktionerna övervakades genom tunnskiktskromatografi (platta: Kieselgel 60 F254, DC Alufoil /Merck/, framkallningslösningsmedel: etylacetat-iso- propanol 95:5, detektering: jodångor). Cyklosporinerna A, B och C eluerades från kolonnen genom metanol-kloroformbland- ningar innehållande 2,0%, 2,5% respektive 3,0% metanol. Frak- tioner innehållande de rena komponenterna föràngades under reducerat tryck vilket gav 225 mg cyklosporin A (smältpunkt: 137-140oC, /Qin: -1890 /metanol/), 25 mg cyklosporin B (smältpunkt: 149-151°C) och 52 mg cyklosporin C (smältpunkt: 150-152°c).

Exempel 2 Fem liter inoculum-medium IC steriliserat vid 121°C under 45 minuter i en 10-liters laboratoriefermentor inoku- lerades med 200 ml av en inoculum-skakkultur tillverkad så- som beskrivits i exempel 1, och inkuberades därefter vid 25°C, omrördes vid 750 varv/min och luftades med 300 1/h luft.

Fermenteringen fortsattes under 72 timmar och sedan användes 500 ml av detta inoculum för att inokulera 5 liter medium FC2, steriliserat vid 121OC under 45 minuter i en 10-liters laboratoriefermentor.

BNSDOCID: 505 442 11 Sammansättning av mediet FC Glukos 80 g 2 Trypton 40 g Urea 2 g Ammoniumsulfat 12 g Natriumnitrat 3 g Kaliumdivätefosfat 2 g Kaliumklorid 0,5 g Magnesiumsulfat x 7 H20 0,5 g Koppar(II)sulfat x 5 H20 0,01 g Mangan(II)sulfat x 7 H20 0,01 g Järn(II)sulfat x 7 H20 0,01 g i 1000 ml vattenledningsvatten. pH för mediet justeras till 5,2 före sterilisering.

Den inokulerade kulturen inkuberades vid 25oC, omrördes med 750 varv/min och luftades med 300 l/h.

Fermentering fortsattes under ovanstående villkor under 144 timmar tills toppcyklosporintetrar uppnàddes, varefter buljongen skördades.

Cyklosporin A isolerades från 4,8 liter fermenterings- buljong innehållande 500 pg/ml av cyklosporinkomplexet me- delst följande metod.

Mikroorganismcellerna centrifugerades och cyklosporin- komplexet uttvättades från cellerna med 2 x 1 liter metanol.

Den vattenhaltiga metanollösningen koncentrerades under re- ducerat tryck och därefter extraherades antibiotikakomplexet från vattenkoncentratet med 2 x 250 ml n-butylacetat.

Cyklosporinkomplexet extraherades från filtratet av fermenteringsbuljongen med 2 x 500 ml n-butylacetat. Alla n-butylacetatextrakten utvanns, torkades över vattenfritt natriumsulfat och därefter föràngades lösningen under redu- cerat tryck vid 40OC. Den preliminära reningen av den erhåll- na råprodukten (19,2 g) genomfördes genom kromatografi på en kolonn tillverkad av 100 g Kieselgel 60 (partikelstorlek 0,063 - 0,2 mm) med ett framkallningsutvecklingsmedel av kloroform-metanol-aceton (92:4:4). Delarna innehållande BNSÛCCIÜ 505 442 12 cyklosporinkomplexet (tunnskiktskromatografianalys: plåt: Kieselgel 60 F254, DC Alufoil /Merck/; framkallningslös- ningsmedel: hexan-aceton 2:1, detektering: klor/tolidinrea- gens) förángades till torrhet. Förångningsresten (5,28 9) utsattes för kolonnkromatografi för att ge cyklosporin A.

Kolonnen tillverkas av 115 g Kieselgel 60 (partikelstorlek 0,063-0,2 mm) och den eluerades med blandningar av hexan- aceton innehållande gradvis ökande volymer aceton. Cyklospo- rin A eluerades från kolonnen med en blandning innehållande 23% aceton. Genom förångning av fraktionerna innehållande cyklosporin A erhölls 1,46 g cyklosporin A.

Exemgel 3 En konidium- eller myceliumsuspension framställdes med 5 ml av en 0,9% natriumkloridlösning från maltextrakt-jäst- extrakt agarsnedultur av Tolypocladium varium nov. sp. CY/93 och användes för att inokulera 800 ml inoculum-medium IC beskrivet i exempel 1 och steriliserades i en 3-liters Erlen- meyer-kolv. Kolven inkuberades på ett roterande skakorgan (340 varv/min) vid 25oC under 2,5 dagar och därefter steri- liserades 5 liter av ett medium FC3 i en 10-liters laboratorie- fermentor vid 121OC under 45 minuter och inokulerades med det.

Sammansättning av mediet FC Sorbos 60 g 3 Trypton 40 g Urea 2 g Ammoniumsulfat 12 g Natriumnitrat 3 g Kaliumdivätefosfat 2 g Kaliumklorid 0,5 g Magnesiumsulfat x 7 H20 0,5 g Mangan(II)sulfat x 7 H20 0,01 g Järn(II)sulfat x 7 H20 0,01 g i 1000 ml vattenledningsvatten. pH hos mediet justerades till 5,2 före sterilisering.

Den inokulerade kulturen inkuberades vid 25°C, omrördes med 1000 varv/min och luftades med 300 l/h.

BNSDOCID: BNSDCCWJ -ISR 5~§ï15~l~LåíI2 i I- 5Û5 442 13 Fermenteringen fortsattes under 168 timmar, varvid fermenteringsbuljongen innehöll 600 mcg/ml cyklosporinkom- plex enligt det mikrobiala försöket.

Genom isclering såsom beskrives i exempel 2 erhölls 310 mg cyklosporin A från 1 liter av buljongen.

Exempel 4 En konidium- eller myceliumsuspension framställdes med 5 ml av en 0,9% natriumkloridlösning från 5 till 7 dagar gam- mal maltextrakt-jästextrakt agarsnedultur av Tolypocladium sp. CY/93 (NCAIM(P)F 001005) inokulera 500 ml inoculum-medium IC beskrivet i exempel 1 varium nov. och användes för att och steriliserades i en 3-liters Erlenmeyer-kolv. Kolven in- kuberades på en roterande skakanordning (340 varv/min) vid 25OC under 3 dagar och därefter inokulerades 5 liter av ett 10-liters laboratoriefermentor medium FC steriliserat i en 4 vid 121OC under 45 minuter, med detsamma.

Sammansättning av mediumet FC4: Maltos 80 g Trypton 40 g Urea 2 g Ammoniumsulfat 12 g Natriumnitrat 3 g Kaliumdivätefosfat 2 g Kaliumklorid 0,5 g Magnesiumsulfat x 7 H20 0,5 g Mangan(II)sulfat x 7 H20 0,01 g Koppar(II)sulfat x 5 H20 0,01 g Järn(II)sulfat x 7 H O 0,01 g 2 i 1000 ml vattenledningsvatten. pH för mediet justerades till 5,2 före sterilisering.

Efter inokulering inkuberades fermenteringsbuljongen vid 25OC, omrördes vid 1000 varv/min och luftades med 300 l/h.

Fermenteringen fortsatte under 144 timmar, varvid fer- menteringsbuljongen innehåller 620 mcg/ml cyklosporinkomplex enligt det mikrobiala försöket. 505 442 14 Isolering genomfördes genom den metod som beskrives i exempel 1. Sålunda erhölls 305 mg cyklosporin A från 1 liter buljong.

Exempel 5 En konidium- eller myceliumsuspension preparerades med 5 ml av en 0,9% natriumkloridlösning från 5 till 7 dagar gam- mal maltextrakt-jästextrakt-agarsnedultur av Tolypocladium varium nov. sp. CY/93 (NCAIM(P)F 001005) och användes för att inokulera 500 ml av inokuleringsmediet IC beskrivet i exempel 1 och steriliserades i en 3-liters Erlenmeyer-kolv. Kolven inkuberades på en roterande skakanordning (340 varv/min) vid 25°C under 2 dagar och därefter inokulerades 5 liter av ett medium FC1 steriliserat i en 10-liters laboratoriefermentor vid 121°C under 45 minuter med densamma. Efter inokuleringen omrördes fermenteringsbuljongen vid 750 varv/min vid 25OC och luftades med 300 l/h. Efter odling under 96 timmar tillsattes en steriliserad vattenlösning av 100 g maltos och fermente- ringen fortsattes till den 144:e timmen, varvid buljongen innehöll 950 mcg/ml cyklosporinkomplex enligt mikrobialför- söket. Tillsammans skördades 4,8 liter av buljongen. Isola- tion genomfördes enligt metoden beskriven i exempel 2 och gav 2,75 g cyklosporin A.

BNSDOCID:

Claims (3)

BNSDCCID :SE l5 505 442 Patentkrav

1. Mikrobiell process för framställning av ett cyklo- sporinkomplex eller dess komponenter, nämligen cyklosporin A, cyklosporin B och cyklosporin C, genom aerob fermentering av en tràdartad svampstam, som biosyntiserar ovanstående anti- biotika i ett näringsmedium innehållande utnyttjningsbara kol- isolering av den bildade produkten, och kvàvekàllor likaväl som mineralsalter, och genom kännetecknad av att den- samma innefattar odling av en stam av de nya Tolypocladium varium-svamparterna alstrande cyklosporinantibiotikakom- CY/93 depo- nerat vid nationella samlingen av jordbruks- och indust- plexet, nämligen Tolypocladium varium sp. nov. riella mikroorganismer, Ungern, med nummer NCAIM(P)F 001005, på ett näringsmedium innehållande kol- källor, mineralsalter under aeroba förhållanden vid 25-30°C och, Budapest, organiska och oorganiska kvävekällor likaväl som om sä Önskas, isolering och rening av det framställa cyklo- sporinantibiotikakomplexet eller dess komponenter.

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att fer- menteringen genomföres i ett odlingsmedium innehållande pep- ton, ammoniumsulfat och trypton såsom kvàvekälla och glukos, maltos och sorbitol såsom kolkälla. CY/93 deponerat vid den

3. Tolypocladium varium sp. nov. nationella samlingen av jordbruks- och industriella mikroor- ganismer, Budapest, Ungern, med nummer NCAIM(P)F 001005 för användning vid framställning av ett cyklosporinkomplex eller cyklosporin B och dess komponenter, nämligen cyklosporin A, cyklosporin C. SCIàMZC/E' » 1-