JPH02231071A - 新種トリポクラディウム・バリウム、及びそれを利用するサイクロスポリン系抗生物質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新種トリポクラデイウム・ノ｛リウム，並び
に好気発酵によるサイクロスポリン複合体、あるいはそ
の構成単位であるサイクロスポリンＡ，サイクロスポリ
ンＢ、またはサイクロスポリンＣの微生物学的製造方法
に関する。

〔従来の技術〕

サイクロスポリンは，１１個のアミノ酸から成る環状、
中性、無極性のオリゴペプチドであって、アミノ酸部分
の多少の相違によって、いくつかの種類に分けられる． 初めに、サイクロスポリンＡ、およびサイクロスポリン
Ｂが、当初トリコデルマ・ポリスポールム［Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ，リンク０エクス
０ペルソーニア（Ｌｉｎｋ　ａｘ　ｐｅｒｓ．）リファ
イ（Ｒｉｆａｉ）］として同定された真菌の一種（ＮＲ
ＲＬ　８０４４）の培地から，リュツガー（Ｒｕｅｇｇ
ｅｒ）らによって単離され［ヘルベチア・キミ力・アク
タ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５９巻（１９７
６年）１０７５ページ］，サイクロスポリンＢ，Ｄ．Ｅ
およびＧは、トラバー（Ｔｒａｂｅｒ）らによって単離
された［ヘルベチア・キミ力・アクタ、６０巻（１９７
７年）１５６８ページ］． その後、この菌株の分類は改定され、以後トリポクラデ
ィウム・インフラーツム、ガムズ（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａ
ｄｉｕｍ　ｉｎｆｌａｔｕｍ，Ｇａｍｓ）として文献中
に記載されることとなった． 現在、サイクロスポリンＡ乃至Ｚとして列挙される２５
種類の異なるサイクロスポリン系抗生物質が知られてい
る［ヘルベチア・キミ力・アクタ、７０巻（１９８７年
）１３ページ］。これらの構成単位の中では、選択的免
疫抑制作用を有するサイクロスポリンＡが，最も重要な
物質とされている。

サイクロスポリンＡは、当初は穏やかな抗真菌性抗生物
質として知られるようになり，その強力な免疫抑制作用
は、その後認められたに過ぎない［ボレル（Ｊ．Ｆ．Ｂ
ｏｒｅｌ）ら：イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）．　３２巻（１９７７年）　１０１７ページ］，，サ
イクロスポリンＡ．Ｃ、およびＧが非常に特異的な免疫
抑制剤であることは、一連のインビトロおよびインビボ
の検定試験によって確認されている。

サイダロスポリンＡは，体液性免疫反応および細胞性免
疫反応の両者を阻害する．その作用機序の研究によれば
、これはインターロイキン２の合成とともに，Ｔ細胞の
増殖をも阻害するからである。

ヒトの臓器移植におけるサイクロスポリンＡの治療的利
用は、１９７８年に報告された．最初に用いラレｆ：　
（７）　ハ．腎臓移植［カルネ（Ｒ．Ｊ．Ｃａｌｎｅ）
ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９７８年度第２号
１３２３ページ］、および骨髄移植［パウルズ（Ｒ．Ｌ
，Ｐｏｗｌｅｓ）ら、ランセット、１９７８年度第２号
１３２７ページ］においてであった． 臓器（腎臓、膵臓、肝臓、心臓、肺）および骨髄の移植
に際しては、サイクロスポリンＡの投与によって、その
臓器あるいは骨髄の拒絶反応を抑制することができる。

更に、いくつかの自己免疫疾患（葡荀膜炎、リウマチ様
関節炎，乾］、および筋無力症）の治療においても、投
与効果を発揮する。

特許文献においては、以下の微生物が、サイクロスポリ
ン複合体の製造に用いられている。

すなわち，シリンド口カルポン・ノレーシヅム（Ｃｙｌ
ｉｎｄｒｏ−ｃａｒｐｏｎ　ｌｕｃｉｄｕ＋ｓ　Ｂｏｏ
ｔｈ）．　ＮＲＲＬ　５７６０（スイス国特許第５８９
，７１６号明細書）；トリポクラディウム・インフラー
ツム、ＮＲＲＬ　８０４４（（初期の分類によればトリ
コデルマ・ポリスポールム）（スイス国特許第６０３，
７９０号明細書），ビセット（Ｂｉｓｅｔｔ）　（１９
８３年）によれば、トリポクラディウム・インフラーツ
ム（１９７１年）は，新組合せトリボクラディウム・ニ
ベウム（ロストラップ（Ｒｏｓｔｒｕｐ））と同じもの
である．）；およびフサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ　ｓｏ１ａｎｉ）、ＭＣＩ−１５４９、ＭＣＩ−１
５５０（特開昭５７−６３０９３号明細書）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の微生物を用いて発酵工程を実施した場合、発酵期
間が長くかかる上に、サイクロスポリン系物質の生産量
が低水準であり，単離の歩留まりも低い． 〔課題を解決するための手段〕 上記課題の解決にあたっては，従来の菌株におけるより
も有利な条件で、より高濃度のサイクロスポリン系抗生
物質複合体、あるいはその構成単位を生産する微生物の
菌株の発見に重点が置かれた。

土壌から単離した多数の糸状菌の菌株をふるい分けるこ
とにより，トリポクラディウム属の一菌株が、サイクロ
スポリン系抗生物質複合体の生合成能を有することが発
見された。発明者らがＣＹ−９３と命名したこの微生物
は，分類学的調査からは、従来のサイクロスポリン複合
体生産真菌種のいずれとも同定することができなかった
。したがって、この新種トリポクラディウム・バリウム
（ＴｏＬｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ　ｖａｒｉｕｍ）ＣＹ／
９３株は，種段階で分化したトリポクラディウム属の新
分類群である。

上記の知見に基すき、本発明は、ハンガリー国ブダペス
ト市所在のナシミナル・コレクション・オブ・アグリ力
ノレチュラノレ・アンド・インダストリアル・マイクロ
オーガニスムス（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に受託
番号ＮＣＡＩＭ　（Ｐ）Ｆ００１００５の下に寄託され
た新規な微生物である，新種トリポクラディウム・バリ
ウムＣＹ／９３株を用いて，高濃度のサイクロスポリン
を含有するブロス（肉汁培地）を得るための微生物学的
製造方法に関するものである．発酵させたブロスには、
主産物としてのサイクロスポリンＡの他、少量のサイク
ロスポリンＢ、およびサイクロスポリンＣも含まれる。

トリボクラディウム属の種を見分けるための主要な性状
と比較した、真菌のこの新種の分類学的特徴は，次の通
りである． トリポクラディウム属は、１９７１年に、ガムズ（ｖ，
Ｇａｓｓ）によって、土壌中の叢生不完全菌目の新しい
属として最初に記載された。その特徴的な性状は，遅い
成長速度、枕状の白いコロニー，短い側枝上に部分的に
発生し，大きく膨大した基部と繊維状のしばしば折れ曲
がった頚部とを有し、一個の単細胞分生子へと続く末端
生および側生の小梗である． この属に属するものとしては、トリポクラディウム・ゲ
オデス（Ｔ．ｇｅｏｄｅｓ）、トリボクラディウム・シ
リンド口スポルム（Ｔ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ
）、およびトリポクラディウム・インフラーツム（Ｔ．
ｉｎｆｌａｔｕｍ）の３新種がガムズによって区分され
た。

トリボクラディウム・ゲオデスには、放線菌類特有の土
壌臭があることが知られているが、新種トリポクラディ
ウム・バリウムＣＹ／９３株は、これを完全に欠いてい
る。更に、トリポクラディウム・ゲオデスの担子細胞は
、新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株のそ
れよりも明らかに細い。トリポクラディウム・シリンド
口スポルムの分生子は、特徴的に長く、引長された形状
であるが、新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９
３株のそれは、球形であって、僅かに引長されているに
過ぎない。

トリポクラディウム・インフラーツムの分生子は、特徴
的に卵形をしており、培養された新種トリポクラディウ
ム・バリウムＣＹ／９３株において観察されるそれより
も長い。トリポクラディウム・インフラーツムの小梗は
、輪生個所において直接菌糸体上に，あるいは２〜３μ
ｍの長さの担子細胞上に形成される。しかし、新種トリ
ポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株においては，そ
のような軸生配置形態は見られず，この配置は、常に、
まばらに検出されるに過ぎない。

主として白い綿状の気生菌糸体によって、既知のトリポ
クラディウムのすべての種のコロニーは白色を呈するが
、コロニーの裏面は黄色を帯びた灰色であるか，無色，
あるいは黄色である。典型的な可溶性色素の形成は皆無
である。この点に関しても、新種トリポクラディウム・
バリウムＣＹ／９３株を識別することができる．すなわ
ち、麦芽エキスおよび酵母エキスとともに、ブドウ糖お
よびペブトンを含有する培地においては、それぞれ、濃
い暗灰色で、しかも黒色の色素が、一時的な変異性を伴
って形成されるのである。

この新種を、トリポクラディウムの他の既知種と比較す
る分類学的評価は、ガムズの論文［ペルソーニア（Ｐｅ
ｒｓｏｏｎｉａ）、６巻（１９７１）１８５　〜１９１
ぺ一ジ］；バロン（Ｇ．Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ）の論文［カ
ナディアン・ジャーナル・オブ・ボタニー（Ｃａｎ．Ｊ
．Ｂｏｔ．　）．５巻Ｒ（１９８０年）４３９〜４４２
ページ］、およびビセット（Ｂｉｓｅｔｔ．　Ｊ．）の
論文［カナディアン・ジャーナル・オブ・ボタニー、６
１巻（１９８３年）１３１１〜１３２９ページコに基す
いて行なったものである。

新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株の特徴
的形態は，要約すると次の通りである．ｌＯ日間経過後
のコロニーは直径１０〜２５ｍに達し、その表面は、白
色、綿状の、胞子形成の盛んな気生菌糸体で覆われてい
る。コロニーの裏面は，黄色を帯びた灰色、または濁っ
た灰色である．複合培地においては暗灰色の可溶性色素
が形成されることがある．気生菌糸においては，末端お
よび側面の双方の胞子形成が観察される。

小梗は、ときおり、軸生個所において、直接菌糸上に、
あるいは（２〜３μｍの）短い担子細胞上に密集するこ
となく、まばらに存在する。小梗は、膨大した基部（２
〜４ｘ２〜３μｍ）と、長く、繊維状の頭部（２〜４ｘ
０．５〜０．６μｍ）とから成る。頭頂部の分生子は、
小さ＜　（２〜３ｘｌ．３　〜２．２μｍ）、通常、球
形、かつ滑らかである．種名を示すバリウム（＋ａｒｉ
ｕｍ）なる小名は、小梗が変化に富むことに因んでいる
。

トリポクラディウム・バリウムは，別のところでも述べ
るが、ハルポスポリウム（Ｈａｒｐｏｓｐｏｒｉｕｍ）
と同じ生活環を示す． ＣＹ／９３と命名された菌株は、ラフィノースを利用す
ることができないが，表面培養においては、マンニトー
ル、イノシトール、庶糖、果糖、ラムノース、ガラクト
ース、デキストロース、アラビノース、およびキシロー
スを炭素源として活発に増殖する。培養に際して、この
菌株は、栄養寒天培地および麦芽エキス培地においては
あまり発育が良好ではないが、大豆粥寒天培地，ツアベ
ック寒天培地、および馬鈴薯デキストロース寒天培地上
では充分に発育する。オートミール寒天培地およびデキ
ストロース・酵母エキス寒天培地は保存に適さない。

トリポクラディウム・バリウムは、面が三角形でかつ縁
部が若干くぼんでいる分生子を産生ずるトリボクラディ
ウム・トリゴノスポルムとは、明らかに異なっている．
トリポクラディウム・バリウムはまた、トリポクラディ
ウム・パラノイデスとも異なっている。後者のトリボク
ラディウム・パラノイデスは、壷状の側小梗を形成する
。

更に、新種トリポクラディウム・バリウムの正基準型菌
株（ＣＹ／９３）は、トリボクラディウム・インフラー
ツム（ＣＢＳ　７１４．７０）の正統型菌株とは異なる
ものである。つまり、マルトース寒天培地を用いて培養
した際、トリボクラディウム・インフラーツムの菌株が
、多数の白色気中菌糸体を生ずるのに対して、新種トリ
ポクラディウム・バリウムＣＹ／９３は、そのような気
中菌糸体を形成しない．トリポクラディウム・インフラ
ーツムの菌株は、鉄一ペプトン寒天倍地で菌糸基体中に
赤褐色の内色素を生成させるが，新種トリポクラディウ
ム・バリウムＣＹ／９３の菌糸体は、淡黄色のままであ
る。

新種トリボクラディ６ム・バリウムＣＹ／９３の菌株は
、アラビノースを利用しないが、トリポクラディウム・
インフラーツムは利用する。亜硝酸ナトリウムを利用し
た場合、トリポクラディウム・インフラーツム菌株は、
多くの菌糸体を発生するのに対して、新種トリポクラデ
ィウム・バリウムＣＹ／９３は，殆んど成長しない。

新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３を、他の
トリポクラディウムの正統型菌株、トリコデルマ・ボリ
スポルムＡＴＣＣ１６，６４１．およびシリンド口カル
ポン・ルーシヅムＮＲＲＬ５７６０と比較したものを、
表Ｉに示す。

（以下余白） 上記の知見に基ずき、本発明は、無機塩類とともに利用
可能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で、サ
イクロスポリン系抗生物質複合体、またはその構成単位
である、サイクロスポリンＡ，サイクロスポリンＢ、お
よびサイクロスポリンＣの生合成を行なう糸状菌の菌株
の好気発酵、および、生成産物の単離による上記抗生物
質の製造方法に関係することとなる． その方法とは，ハンガリー国ブダペスト市所在のナショ
ナル・コレクション・オブ・アグリカルチュラル・アン
ド・インダストリアル・マイクロオーガニスムスに受託
番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１００５の下に寄託された
新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株である
ことが好ましい、サイクロスポリン系抗生物質複合体を
生産するトリポクラディウム・バリウムなる新真菌種の
一菌株を、無機塩類とともに炭素源、および有機および
無機窒素源を含有する栄養培地において、２５〜３０℃
の温度範囲の好気的条件のもとで培養する段階と、所望
の場合における生成サイクロスポリン系抗生物質複合体
またはその構成単位の単離および精製段階とから成る． 本発明の好適実施例によれば、サイクロスポリン系抗生
物質複合体は、新規である新種トリポクラディウム・バ
リウムＣＹ／９３株を用いて生産される．選択された菌
株は，増殖が速やかであることによる非常な利点がある
。

この菌株が，炭素源として，庶糖、ブドウ糖，ソルボー
ス，麦芽糖、果糖，澱粉、グリセロール、あるいは油脂
を、また、トウモロコシ浸出液、ベブトン、酵母エキス
、肉エキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、あるいは各種アミノ酸のような多様な有
機および無機窒素源を利用できることは、好都合な特徴
である．上記の炭素および窒素源に加え、サイクロスポ
リン系抗生物質複合体の生産に用いられる栄養培地には
、無機塩類（塩化カリウム、硫酸マグネシウム、あるい
は燐酸二水素カリウム）、微量元素（銅，マグネシウム
、鉄塩）、更にビタミン、および消泡剤を加えることが
できる。

本発明の好適な方法によれば、新種トリポクラディウム
・バリウムＣＹ／９３株の寒天斜面培養によって調製し
た分生子と、菌糸体の懸濁液を用いて液体培地に接種が
行なわれる．３日間の培養後に得られた前培地を用いて
、抗生物質生産用の培養液に接種を行ない、その後、こ
れを２５〜３０℃、好ましくは２５℃の温度で５〜７日
間温置する．発酵の間、ｐＨは６．０〜２．５の範囲、
好ましくはｐＨ５．２に保つ．発酵は，活発な攪拌（７
５０〜１０００ｒｐ■）および毎時３００リットルの通
気による好気的条件下で行なわれる． 発酵中は、微生物学的検定法、および高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてブロス中のサイクロス
ポリン含量を監視する．抗生物質の最大生産量達成後は
，直ちに公知の抽出または吸着方法を用いて、培養液か
らこれらの抗生物質を回収する． ブロス中のサイクロスポリン濃度は、プレート拡散試験
を用い、サイクロスポリンの抗真菌活性を目安として測
定する．試験用生物としては、ク口カビ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｎｉｇａｒ）、アスペルギルス・ジャポニ
クス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）
、およびクルブラリア・ルナータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉ
ａ　ｌｕｎａｔａ）を用いるのが有利である［ドレイフ
ス（Ｍ．Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）ら，ユーロピアン・ジャー
ナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．）
、３巻（１９７６年）１２５　〜１３３ページ］．ブロ
ス中のサイクロスポリン濃度のＨＰＬＣ分析は，クロイ
ツィッヒ（Ｆ．Ｋｒｅｕｚｉｇ）に従って、メタノール
で１０倍に希釈したブロス試料に対して行なう［ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィ−（Ｊ．Ｃｈｒｏａ＋ａ
ｔ．）、２９０巻（１９８４年）１８１ページ］．発明
者らの実験によれば、新種トリポクラディウム・バリウ
ムＣＹ／９３株によって、主産物としてサイクロスポリ
ンＡ、および少量構成単位としてサイクロスポリンＢお
よびサイクロスポリンＣを含有するサイクロスポリン系
抗生物質複合体は高い歩留まりで（９５０μｇ／＋ｎ）
生産される．発酵ブロスからのサイクロスポリン複合体
の単離については、抽出法を用いて有利に行うことがで
きる．抽出の前に，濾過または遠心分離のいずれかを用
いて菌糸体を分離する．微生物の細胞からは、メタノー
ルであることが好ましい低級アルコール，あるいは，ア
セトンであることが好ましい有機ケトン体を用いて，発
酵中に生産された抗生物質を洗い出すのが有利である．
一方、ブロス濾液中のサイクロスポリンは，酢酸エチル
，ｎ一酢酸ブチル、ジクロルメタン、１．２−ジクロル
エタン，あるいはクロロホルムのような水に混和されな
い有機溶媒，好ましくはｎ一酢酸ブチルを用いて抽出す
ることができる．抽出によって得られた粗生成物には、
真菌によって生成された赤色あるいは紫色の色素が混入
しているが、これは，活性炭またはシリカゲルに吸着さ
せて除去することができる．混入した恐れのある脂質（
すなわち消泡剤）は，石油エーテル、および１０％の水
を含むメタノールの系を用いた分配により、不純物を石
油エーテル相に移動させ，分離することができる．メタ
ノール水溶相を，減圧下で濃縮し、次いでジクロメタン
を用いて抽出し，これを蒸発させて，精製サイクロスポ
リンが得られる．サイクロスポリンＡは，カラムクロマ
トグラフイーおよび再結晶法を用いて、他の少量サイク
ロスポリン構成単位から分離することができる． 単離された生成物の構造は，紫外線、赤外線、１Ｈ核磁
気共鳴，および１’ＪＣ核磁気共鳴を利用した分光分析
法、質量分光分析法，およびアミノ酸分析法を用いて解
明される． 〔実施例〕 以下，実施例を用いて本発明を説明するが、これらは、
本発明の対象範囲を限定するものではな（）． 夫Ｋ旌よ 麦芽エキスと酵母エキスを用いた新種トリポクラディウ
ム・バリウムＣＹ／９３株の寒天斜面培養から、分生子
及び菌糸体の０．９％塩化ナトリウム懸濁液５ｍｌを調
製する．この懸濁液１ｍｌを用いて，５００鵬ｌ入りエ
ーレンマイヤーフラスコ中の滅菌ＩＣ移植片培養液ｔｏ
ｏｍｌに播種を行なう．匹ｙｂ４戒ｆＩわ波 タップウォーター１０００＋ｏｌ中に ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇカゼ
イン・ペブトン　　　　　　　　　　５ｇ硝酸ナトリウ
ム　　　　　　　　　　　　　３ｇ燐酸二水索カリウム
　　　　　　　　　　２ｇ塩化カリウム　　　　　　　
　　　　　　０．５ｇ硫酸マグネシウム（結晶水７分子
含有）　　　０．５ｇ硫酸鉄（ＩＩ）（結晶水７分子含
有）　　　　　０．０１　ｇ栄養培地のｐＨは、滅菌前
にＰＨ５．２に調整し，混合液を１２１’Ｃにて２５分
間滅菌する．培地を回転振盪器（３４０ｒｐｍ）におい
て、２５℃で温置し、次いで，各々ＦＣ，滅菌培養液１
００＋ａｌの入った５００ｍｌ入りエーレンマイヤーフ
ラスコ１５本に、この移植片培養液各５ｍｌを加えて播
種を行なう． （以下余白） 匹、鹿１ｊＪｌ（戊 タップウォーター１０００＋ｓｌ中に ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　８０ｇトリ
プトン　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ尿１４　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ硫酸アンモニウ
ム　　　　　　　　　　　１２ｇ硝酸ナトリウム　　　
　　　　　　　　　３ｇ燐酸二水素カリウム　　　　　
　　　　　２ｇ塩化カリウム　　　　　　　　　　　　
　０．５ｇ硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有）　　
　０．５ｇ硫酸鉄（■）（結晶水７分子含有）　　　　
　０．０１　ｇ栄養培地のＰ｝ｌは、滅菌前にＰＨ５．
２に調整し、混合液をｔｘｔ’ｃにて２５分間滅菌する
。

フラスコは、回転振盪器（３４０ｒｐｍ）において，２
５℃で湿置する．ブロスにおける抗生物質濃度の監視は
、プレート拡散試験を用いて行なう．試験用生物として
は，クロカビ（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇａｒ）
を使用する．ブロス中のサイクロスポリン系抗生物質複
合体の濃度は、サイグロスポリンＡを標準物質として用
いて検定する． 発酵を１６８時間継続させると、ブロス中には、１耐あ
たり４００μｇのサイクロスポリン系抗生物質複合体が
含まれるようになる．サイクロスポリン複合体を単離す
る方法は、次のとおりである．ブロスｌリットルから細
胞を濾し取り、メタノール２００■ｌを２回用いて，抗
生物質を洗い落とす．メタノール水溶液を減圧下で濃縮
し、次いで，この濃縮水溶液から，ｎ一酢酸ブチル５０
■１を２回用いて、抗生物質複合体を抽出する．ブロス
濾液中のサイクロスポリン含有物は、ｎ一酢酸ブチル２
００＋ａｌを用いて抽出する．ｎ一酢酸ブチルの抽出液
を加え併せ，無水硫酸ナトリウムを用いて完全に脱水し
，次いで、４０℃の減圧下で蒸発させる．得られた粗生
成物３．７ｇをメタノール１０■ｌに溶かし、メタノー
ルを用いて作成されたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）ＬＨ−２０番ゲル力ラム（カラム長４０１，カラム
径２．５ｍ）の頂部に注ぐ。その結果、不純脂質は、メ
タノールへの溶出によって分離される．サイクロスポリ
ン複合体を含有する分画は、４０℃にて減圧下で蒸発さ
せる．得られたサイクロスポリン複合体（１．０５　ｇ
　）からの各構成単位の分離は，キーゼルゲル（Ｋｉｅ
ｓｅｌｇｅｌ）４０番［レアナル（ｌ｛ｅａｎａｌ｝社
、ブダペスト］２０ｇを用いたシリカゲル力ラムによる
クロマトグラフィーを用い，メタノール容積を漸増させ
つつカラムを通したクロロホルム／メタノール混合液中
に溶出させることによって行なわれる．すなわち、溶出
は、クロロホルム１００■ｌを用いて開始し、１００ａ
＋１ごとにメタノール含量を０．５容量％ずっ増加させ
たクロロホルム／メタノール混合液を１００ｍｌずつ用
いて，これを続けるのである． 分画中のサイクロスポリン含量の監視は、薄層クロマト
グラフィー［プレート二Ｆ２５４キーゼルゲル６０番、
ＤＣアルホイル（Ａｌｕｆｏｉｌ）　（メルク（Ｍｅｒ
ｃｋ）社）、展開液：酢酸エチル／イソプロパノール９
５：５混合液、検出試薬：沃素蒸気］を用いて行なう．
サイクロスポリンＡ．Ｂ．およびＣは、メタノール含量
がそれぞれ２．０、２．５、および３．０容量％のクロ
ロホルム／メタノール混合液によって溶出する．純粋な
構成単位を含有する分画を減圧下で蒸発させ、サイクロ
スポリンＡ［融点：１３７〜１４０℃、［α］ｏ：−１
８９℃（メタノール）］２２５■、サイクロスポリンＢ
（融点１４９〜１５１℃）２５■、および、サイクロス
ポリンＣ（融点：１５０〜１５２℃）５２■が得られる
６大鳳菫又 １０リットル入り研究室用発酵器内で１２１’Ｃにて４
５分間滅菌を施したＩＣ移植片培養液５リットルに、実
施例１に記載の方法で調製した振盪培養による移植片培
地２００＋ｓｌを用いて播種を行い，次いで、７５０ｒ
ｐｍで攪拌し、かつ、毎時３００リットルの通気を行な
いつつ、２５℃にて温置する．発酵は７２時間継続させ
、次いで、ｌθリットル入りの研究室用発酵器内で、１
２１’Ｃにて４５分間滅菌されたＦＣ，培養液５リット
ルに，この移植片培養液５００ｍｌを用いて播種を行な
う。

（以下余白） ＦＣ培“液の組成 タップウォーター１０００ｍｌ中に ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　８０ｇトリ
プトン　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ尿素　　
　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ硫酸アンモニウム
　　　　　　　　　　　１２ｇ硝酸ナトリウム　　　　
　　　　　　　　　３ｇ燐酸二水素カリウム　　　　　
　　　　　２ｇ塩化カリウム　　　　　　　　　　　　
　０．５　ｇ硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有）　
　　０．５ｇ硫酸銅（■）（結晶水５分子含有）　　　
　　０．０１　ｇ硫酸マンガン（■）（結晶水７分子含
有）　　０．０１ｇａ酸鉄（■）（結晶水７分子含有）
　　　　　ｏ．ｏｔ　ｇ培養液のｐｔ＋は、滅菌前にｐ
Ｈ５．２に調整する。播種を行った培地を７５Ｏｒｐｍ
にて攪拌し、かつ、毎時３００リットルの通気を行いつ
つ，２５℃にて温置する． 上記の条件下で発酵を１４４時間継続して、サイグロス
ポリンの最大力価を達成し、次いで、ブロスからの回収
を行なう。

サイクロスポリンＡは、Ｌｍｌあたリサイクロスポリン
複合体５００μｇが含まれる発酵ブロス４．５リットル
から単離されるが，その方法は次のとおりである． 微生物細胞は遠心分離を施し、メタノール１リットルを
用いた細胞からのサイクロスポリン複合体の洗い落とし
を２回行なう．メタノー水溶液を減圧下で濃縮し、次い
でｎ一酢酸ブチル２５０■ｌを用いた抽出を２回行なっ
て、濃縮水溶液から抗生物質複合体を抽出する．発酵ブ
ロスの濾液からのサイクロスポリン複合体の抽出は、ｎ
一酢酸ブチル５００■ｌを２回用いて行なう．ｎ一酢酸
ブチルによる抽出液をすべて加え併せ、無水硫酸ナトリ
ウムを用いて完全に脱水し，次いで、溶液を４０℃にて
減圧下で蒸発させる．得られた粗生成物（１９．２ｇ）
の予備的精製は，展開用溶媒としてクロロホルム／メタ
ノール／アセトン（９２：４：４）混合液を用い、キー
ゼルゲル６０番（粒子径０．０６３〜０．２■）１００
ｇを用いて作成したカラムによるクロマトグラフィーに
よって行なう． 薄層クロマトグラフィー分析［プレ−１”：ＦＺ５４キ
ーゼルゲル６０番、ＤＣアルホイル（メルク社）；展開
用溶媒：ヘキサン／アセトン／（２：１）混合液；検出
試薬：塩索／トリジン試薬］によって得られたサイクロ
スポリン複合体含有分画を蒸発、乾燥させる。

蒸発残渣（５．２８　ｇ　）にカラムクロマトグラフィ
ーを施して、サイダロスボリンＡを得る．カラムは、キ
ーゼルゲル６０番（粒子径０．０６３〜０．２＋＋ｎ＋
）１１５　ｇを用いて作成し、アセトンの容積を漸増さ
せつつヘキサン／アセトン混合液をカラムに通して溶出
を行なう．サイクロスポリンＡは、２３容量％のアセト
ンを含む混合液によってカラムから溶出する。

サイクロスポリンＡ含有の分画の蒸発により、サイクロ
スポリンＡ　１．４６　ｇが得られる．ヌ』１四表一 新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株の、麦
芽糖エキスと酵母エキスを用いた寒天斜面培養から、分
生子及び菌糸体の０．９％塩化ナトリウム懸濁液５＋ｗ
ｌを調製して、実施例１に記載され，３リットル入りエ
ーレンマイヤーフラスコ内で滅菌したＩＣ移植片培養液
８００ｍｌへの播種に用いる。フラスコは、回転振盪器
（３４０ｒｐｍ）において２５℃にて２．５日間温置し
、次いで、１０リットル入り研究室用発酵器内で，１２
１℃にて４５分間滅菌を施したＦＣ，培養液５リットル
に播種する。

匹−ＬｉｌΔ糺腹 タップウォーター１０００＋ｏｌ中に ソルボース　　　　　　　　　　　　　　６０ｇトリプ
トン　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ尿素　　　
　　　　　　　　　　　　　　２ｇ硫酸アンモニウム　
　　　　　　　　　　１２ｇ硝酸ナトリウム　　　　　
　　　　　　　　３ｇ燐酸二水素カリウム　　　　　　
　　　　　２ｇ塩化カリウム　　　　　　　　　　　　
　０．５ｇ硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有）　　
　０．５ｇ硫酸マンガン（■）（結晶水７分子含有）　
　０．０１ｇ硫酸鉄（■）（結晶水７分子含有）　　　
　　ｏ．ｏｔ　ｇ培養液のｐ｝ｌは，滅菌前にＰＨ５．
２に調整する．播種を行った培地は、ｌ０００ｒｐ■で
攪拌し、かつ、毎時３００リットルの通気を施しつつ、
２５℃にて温置する． 発酵は１６８時間継続し、発酵ブロスには、微生物学的
検定によれば１鵬１あたり６０μｇのサイクロスポリン
複合体が含まれるようになる．実施例２に記載の単離方
法を用いて，ブロス１リットルからサイクロスポリンＡ
３１０■が得られる． 去】１』乞 新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株（ＮＣ
ＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１００５）の，麦芽糖エキスと酵母
エキスを用いた５〜７日経過後の寒天斜面培養から、分
生子及び菌糸体の０．９％塩化ナトリウム懸濁液５＋ｓ
ｌを調製し、実施例１に記載の、３リットル入り二一レ
ンマイヤーフラスコ中で滅菌したＩＣ移植片培養液５０
０＋ｓｌへの播種に用いる．フラスコは、回転振盪器（
３４０ｒｐｍ）において２５℃にて３日間湿置し、次い
で、ｌＯリットル入り研究室用発酵器中で、１２１”Ｃ
にて４５分間滅菌を施したＦＣ．培養液５リットルにこ
れを用いて播種する． ？■穐養ｍ辰 タップウォーター１０００ｓｌ中に 麦芽糖　　　　　　　　　　　　　　　　８０ｇトリプ
トン　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ尿素　　　
　　　　　　　　　　　　　　２ｇ硫酸アンモニウム　
　　　　　　　　　　１２ｇ硝酸ナトリウム　　　　　
　　　　　　　　３ｇ燐酸二水素カリウム　　　　　　
　　　　　２ｇ塩化カリウム　　　　　　　　　　　　
　０．５ｇ硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有）　　
　０．５ｇ硫酸マンガン（■）（結晶水７分子含有）　
　０．０１ｇ硫酸銅（■）（結晶水５分子含有）　　　
　　０．０１　ｇ硫酸鉄（■）（結晶水７分子含有）　
　　　　０．０１ｇ培養液のｐＨは、滅菌前にｐＨ５．
２ｒｐｍに調整する．播種後，発酵ブロスを．　１００
０ｒｐｍで攪拌し，かつ、毎時３００リットルの通気を
施しつつ、２５℃にて温置する． 発酵は１４４時間継続し，発酵ブロスには、微生物学的
検定によればｌｍｌあたり６２０μｇのサイクロスポリ
ン複合体が含まれるようになる．実施例１に記載の方法
を用いて単離を行なう．このようにして、ブロス１リッ
トルからサイクロスポリンＡ３０５．が得られる． 去１ｌ』− 新種トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３株（ＮＣ
ＡＩＭ（Ｐ）ＦＯＯＩＯ０５）の，麦芽糖エキスと酵母
エキスを用いた５〜７日経過後の寒天斜面培養から，分
生子及び菌糸体の０．９％塩化ナトリウム懸濁液５■ｌ
を調製し，実施例１に記載の、３リットル入りエーレン
マイヤーフラスコ中で滅菌したＩＣ移植片培養液５００
■ｌへの播種に用いる． フラスコは，回転振盪器（３４０ｒｐｍ）において２５
℃にて２日間温置し、次いで、１０リットル入り研究室
用発酵器の中で，１２１℃にて４５分間滅菌を施したＦ
Ｃ，培養液５リットルにこれを用いて播種する．播種後
，発酵ブロスは、７５０ｒｐｍで攪拌し、がっ、毎時３
００リットルの通気を行ないながら、２５℃にて温置す
る．９６時間培養した後に，麦芽糖１００　ｇを溶かし
た滅菌水溶液を加え、培養を１４４時間まで継続すると
，このブロスには，微生物学的検定によれば、ｌｍｌあ
たり９５０μｇのサイクロスポリン複合体が含まれるよ
うになる．全部で４．８リットルのブロスが回収に用い
られる．実施例２に記載の方法を用いて単離を行なうと
，サイクロスポリンＡ２．７５ｇが得られる．

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）真菌の一種であるトリポクラディウム・バリウム
   。
2. （２）ハンガリー国ブダペスト市所在のナショナル・コ
   レクション・オブ・アグリカルチュラル・アンド・イン
   ダストリアル・マイクロオーガニスムスにおいて、受託
   番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１００５の下に寄託された
   トリポクラディウム・バリウムＣＹ／９３なる真菌株。
3. （３）サイクロスポリン系抗生物質複合体を生産する糸
   状菌の新種トリポクラディウム・バリウムの一菌株の、
   炭素源、有機および無機窒素源を無機塩類とともに含有
   する栄養培地における２５〜３０℃の好気的条件下での
   培養段階と、所望の場合における生成サイクロスポリン
   系抗生物質複合体、あるいはその構成単位であるサイク
   ロスポリンＡ、サイクロスポリンＢ、またはサイクロス
   ポリンＣの単離および精製段階とから成る、無機塩類並
   びに利用可能な炭素源および窒素源含有の栄養培地にお
   けるこれら抗生物質を生合成する糸状菌株の好気発酵、
   および生成産物の単離によるサイクロスポリン系抗生物
   質複合体またはその構成単位の微生物学的製造方法。
4. （４）真菌株として、ハンガリー国ブダペスト市所在の
   ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチュラル
   ・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニスムス
   において、受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１００５の
   下に寄託されたトリポクラディウム・バリウムＣＹ／９
   ３なる一菌株を用いる請求項（３）記載の免疫抑制性抗
   生物質の微生物学的製造方法。
5. （５）窒素源として、ペプトン、硫酸アンモニウム、ま
   たはトリプトンを、また炭素源として、ブドウ糖、麦芽
   糖、またはソルビトールをそれぞれ含有する培地におい
   て、発酵を行なう請求項（３）記載の免疫抑制性抗生物
   質の微生物学的製造方法。