RU1836425C - Способ получени комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка ТоLYросLаDIUм VаRIUм - Google Patents
Способ получени комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка ТоLYросLаDIUм VаRIUмInfo
- Publication number
- RU1836425C RU1836425C SU4742791A SU4742791A RU1836425C RU 1836425 C RU1836425 C RU 1836425C SU 4742791 A SU4742791 A SU 4742791A SU 4742791 A SU4742791 A SU 4742791A RU 1836425 C RU1836425 C RU 1836425C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cyclosporin
- complex
- varium
- components
- fermentation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Использование: фармацевтическа и микробиологическа промышленность. Сущность способа: заключаетс в том, что грибок Tolypoctadlum varium NCAIM/P/F 001005 культивируют в аэробных услови х при t 25-30°C в питательной среде, содержащей в качестве источника азота пептон, сульфат аммони , трипказин, а в качестве источника углерода - глюкозу, мальтозу, сорбит. 2 с.п. ф-лы и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относитс к способу пол- учен,и комплексного антибиотика циклоспорина и/или i:ero компонентов циклоспорина А, циклоспорина В и циклоспорина С, аэробной ферментацией.
Отдельные компоненты комплекса представл ют состо щие из 11 аминокислот циклические, нейтральные, непол рные олигопептиды, которые отличаютс друг от друга только одной или двум участвующими в построении аминокислотами.
Из компонентов комплексного антибиотика циклоспорин А и циклоспорин С были выделены сначала A. Ruegger и др. и цикло- спорины В, D, Е и С R. Traber и др. из культуры идентифицированного ими раньше как Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifae грибка (NRRL 8044). Позднее была уточнена систематическа классификаци соответствующего штамма грибка (NRRL 8044), и с тех пор он был назван в литературе как Totypocladlum Inflatum Gams.
В насто щее врем известны уже 25 циклоспоринов, которые обозначаютс буквами от А до Z.
Из компонентов, самым ценным по действию вл етс имеющий избирательную иммуноподавл ющую активность циклоспорина А.
Циклоспорин был известен сначала как антибиотик со слабым противогрибковым действием, его значительное иммуноподав- л ющее действие было открыто лишь позднее .
При помощи целой серии опытов на живом организме и в пробирке можно было доказать, что циклоспорины А, С и G вл (Л
С
00
со о
Јь
К)
ел
СО
ютс более специфическими активными веществами , чем известные до сих пор имму- ноподавл ющие лекарственные средства. Оказалось, что циклоспорин А подавл ет как гуморальный, так и целлюл рный иммунный ответ. При исследовании механизма действи было установлено, что он подавл ет пролиферацию Т-клеток и прерывает синтез интерлейкина-2.
О применении циклоспорина А в качестве лекарственного средства при пересадке органов у человека сообщали в 1978. Первое применение было описано в св зи с пересадкой почки и трансплантацией костного мозга. Применением циклоспорина А при пересадке органов можно преп тствовать отторжению органа (почка, поджелудочна железа, печень, сердце, легкое), при трансплантаци х костного мозга отторжению костного мозга.
Циклоспорин А с успехом примен ли также дл лечени определенных аутоиммунных заболеваний (например, воспаление сосудистого тракта глаза, ревматический артрит, чешуйчатый лишай и т жела миастени ).
По патентной литературе дл получени содержащих комплексный циклоспорин ферментационных бульонов примен ли до сих пор культуры следуюадох штаммов микроорганизмов: Cylindocarpon lucldum Boath, NRRL5760 (патент Швейцарии № 589 716), Toiypocladlum inf latum Gams. NRRL 8044 по более старой номенклатуре: Trichoderma polysporium (Unk ex Pers) Rifai, патент Швейцарии fsfe 603790 no Bissett (1983) Toiynfeatum W, Gams, 1971 вл етс синониумом с Tolyniveum (Rostrup) Bisset COOTB, nov. и Fusarium solani, MCf-1549, MIC-1550 (опубликованна за вка на патент Японии № 82 63093). Однако промышленное использование этих штаммов микроорганизмов в способах ферментации имеет тот недостаток, что времена ферментации продолжительные (11-14 дней), получают мало комплексного циклоспорина (около-20-30 .r/мл) и коэффициент полезного действи выделени комплекса из ферментационного бульона низкий (около 40%).
В ходе исследований искали штаммы микроорганизмов, при помощи которых можно получать комплексный антибиотик циклоспорин или его компоненты в высокой концентрации и при более выгодных услови х , чем до сих-пор, В процессе серийных исследований, которые распростран лись на много тыс ч штаммов грибка, смогли выбрать принадлежащий к виду Toiypocladlum микроорганизм, который за более короткое
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
врем и в более значительном количестве биосинтезирует комплексный циклоспорин, чем известные штаммы, и который, как показали таксономические исследовани , не идентичен ни с одним из известных продуцирующих циклоспорин штаммов грибка. Новый штамм (СУ/93) - который по собственным исследовани м следует рассматривать как член нового отличительного таксона рода Tolypocladium - был описан под названием Tolypocladium varlum species nova как голотипный штамм.
Изобретение основываетс , следовательно , на том открытии, что з результате ферментации неизвестного до сих пор штамма типа Tolypocladium varlum species nova (домашнее название: СУ/93), который был депонирован под номером NCAIM(P)F 001005 в Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохоз йственных и промышленных микроорганизмов, можно получать ферментационный бульон с очень высокой концентрацией циклоспорина. Ферментационный бульон нар ду с основным продуктом циклоспорина А содержит в небольших количествах циклоспорин В и циклоспорин С.
Используемые дл систематизации признаки выделенного нового штамма грибка сравнивают ниже с важнейшими из диагностических характеристик известных видов Tolypocladium.
Род Toiypocladlum был описан в 1971 Gams как новый вид насел ющих почву Monilales. Его характерными свойствами вл ютс : медленный рост, полушкообрэзные белые или беловатые бактериальные колонии , конечные и боковые, расположенные частично на коротких боковых ветв х фиали- ды с сильно разбухшим основанием, на котором можно различить нитевидную, часто дугообразно наклоненную шейку, котора оканчиваетс маленькой одноклеточной конидией (головкой). Внутри этого рода Gams различал 3 следующих новых вида: Т. geodes, T. cylindrosporum, T. inflatum имеет поразительный, напоминающий об актино- мицетах запах земли, который полностью отсутствует у нового Т.varlum sp. nov. СУ/93. Кроме того, клетки носител Т. geodes значаительно уже, чем клетки носител Т. varium sp. nov, СУ/93. Конидии Т, cylindrosporum характерно длинные и раст нутые , конидии Т. varium sp. nov. СУ/93, напротив, шаровидные или слабо раст нутые . Конидии Т, inflatum эллиптические и длиннее, чем конидии Т. varium sp, nov.
СУ/93. Фиэлиды Т. Inflatum расположены или непосредственно на гифе или не клетках держател длиной 2-3 м клубком.
Дл фиалидов Т. varium sp. nov. СУ/93 расположение клубком не вл етс характерным и наблюдаетс только в отдельных случа х. Бактериальные колонии всех известных до сих пор видов Tolypocladium белые , что объ сн етс , в первую очередь, белым, ватообразным воздушным мицелием . Нижн сторона бактериальных колоний желтовато-сера , бесцветна или желта , характерный растворимый пигмент не производитс . И в этом отношении Т. varium sp. nov. СУ/93 отличаетс от известных видов: на питательных средах с глюкозой и пептоном, также на питательных средах с солодовым экстрактом/дрожжевым экстрактом грибок вырабатывает темный , варьируемый во времени от густого серого до черного цвета, пигмент.
Диагностические признаки Tolypocladium varium sp. nov. СУ/93 можно сообщить следующим образом. Бактериальные колонии возрастом 10 дней имеют диаметр 10-25 мм, их поверхность покрыта ватообразным белым, насыщенным спорами воздушным мицелием. Нижн сторона бактериальных колоний желтовато-сера или гр зно-сера . На многих комплексных питательных средах образуетс темно-серый растворимый пигмент. На гифах воздушного мицели спорообразование протекает как конечное, так и боковое. Фиалиды расположены местами или иногда также пучком на гифах или на коротких (длиной 2-3 fi м) клетках держател . Фиалиды состо т из разбухшей основной части (2-4 х х2-3 fi м) и длиной нитевидной шейки (3-4 х 0,5-0,6 /и м). Колонии головок небольшие (2-3 х 1,3-2,2 /г м), в общем, шаровидные и ровные. Видовое определение Variun относитс к изменчивости фиалидов .Tol. varium про вл ет в своем жизненном цикле определенную схожесть с Genus harposporium, о чем позже еще будет говоритьс . Штамм СУ/93 не использует рафи- нозу, однако хорошо растет в присутствии источников углерода: Маннит, инозит, сахароза , фруктоза, рамноза, галактоза, глюкоза , арабиноза и ксилоза. На питательном агаре и солодовом агаре его культуры развиваютс слабо, на соевом агаре, агаре С арек и картофельном агаре они растут усиленно . Овс но-дрожжевой экстракт, глюко- зо-дрожжевой экстракт и овс ный агар не слишком подходит дл сохранени .
Tol. varium резко отличаетс от Tot. Trogonosporum так как последний продуци5
0
рует Trigonale conidia, который имеет слабо изогнутые кра , Tol. varium отличаетс также от Tot. balanoldes, так как последний продуцирует боковые фиамиды. 5Кроме того, отличаетс голотипный
штамм (СУ/93) Tolypocladium varium n. sp. от зарегистрированного тикового штамма (CBS 714.70) Т. Inflatum также тем, что последний образует на солодовом агаре 0 обильный белый воздушный мицеллий, в противоположность этому Т. varium sp. nov. СУ/93 не образует никакого мицели . Тиковый штамм Т. Inflatum производит в субстрате мицелли на железо-пептоновом агаре красновато-коричневый конечный пигмент.
В противоположность этому мицеллий- субстрат Т. varium sp. nov. СУ/93 остаетс бледножелтым.
Т.. varium sp. nov. СУ/93 не перерабаты вает араблюзу, в противоположность Т. inflatum.
5 Т. Inflatum дает с нитритом натри обильный мицеллий, в противоположность этому Т. varium sp. nov. СУ/93 едва растет.
Сравнение с зарегистрированными
штаммами других видов Tolypocladluma, a
Q также со штаммами Trichoderma polysporum
АТСС 16641 и Cullndrocarpon lucidum MRRL
5760 приведено в таблице .
Предметом изобретени вл етс спо5 соб получени комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов: циклоспорина А, циклоспорина В и циклоспорина С культивированием бйосинтезирующего названные антибиотики штамма грибка в со0 держащей усваиваемые источники углерода и азота и минеральные соли питательной среде , при аэробных услови х, и отделением образованных продуктов, Дл способа отли- .чительной чертой вл етс то, что продуци5 рующий комплексный антибиотик циклоспорин штамм нового вида грибка Tolypocladium varium, предпочтительно депонированный под номером NCAIM(P)F 001005 в Будапештском Университете садо0 водства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохоз йственных и промышленных микроорганизмов штамм Totypocladium varium sp. nov, СУ/93, культивируют в содержащей источники углерода, а
5 также органические и неорганические источники азота и минеральные соли питательной среде, при аэробных услови х, при температуре 25-30°С, в случае необходимости выдел ют образованный комплексный антибиотик или его компоненты из ферментационного бульона и в случав необходимости очищают.
По изобретению дл получени комплексного антибиотика циклоспорина примен ют предпочтительно культуру нового штамма Tolypocladlum varlifm -epv-nov-.- СУ/93. Этот штамм вследствие своего быстрого роста вл етс особенно выгодным. Сахарозу, глюкозу, сорбозу, мальтозу, фруктозу , крахмал, глицерин и различные жиры и масла он хорошо использует как источник углерода. В качестве источников азота при нимают в расчет различные органические и неорганические источники азота, например , воду набухани кукурузы, пептон, дрожжевой экстракт, м сной экстракт, нитрат натри , нитрат аммони , сульфат аммони и различны© аминокислоты. Кроме этих источников углерода и азота питательна среда может содержать еще минеральные соли (например, хлористый калий, сульфат магни или кислый фосфорнокислый калий), микроэлементы (например, медь, марганец и железо), а также витамины и пеногас щие вещества.
По предпочтительному варианту осуществлени способа по изобретению от депонированного под номером NCA1M(P)F 001005 В Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохоз йственных и промышленных микроорганизмов штамма Tolypqclaclium varium sp. nov. СУ/93 делают посев культуры на косом агаре, суспензией спор и суспензией мицели которого прививают питательную среду инокул та, затем добавл ют культуру инокул та возрастом 3 дн к приблизительно дес тикратному количеству среды продуцировани и инкубируют среду продуцировани при 25-30°С, предпочтительно 25°С, в течение 5-7 дней. Во врем ферментации поддерживают величину рИ между 6,0 и 2,5, предпочтительно при 5,2. Ферментаци происходит при аэробных услови х и при интенсивном перемешивании (950-1000 ). Потребность культуры в воздухе составл ет около 300 л/час.
Во врем ферментации за содержанием активного вещества в ферментационном бульоне наблюдают путем микробиологического измерени величии и путем жидкостной хроматографии при высоком давлении (НИХ). Когда содержание активного вещества достигло своего максимума, ферментацию прекращают и антибиотик выдел ют методами экстракции и/или адсорбции.
Дл микробиологического измерени величин используют оказанное циклоспорином А на многие гифомицеты избирательное торможение роста. В качестве тест-организмов наиболее подход щим вл ютс AspergiHus nigor, Asperglllus japanlcus и Сип/uiarfa lunata. Дл анализа жидкостной хроматографией при высоком давлении (HPLC) ферментационного бульона приме:
0 н ют фильтрат разбавленных в отношении 1:10 метанолом проб (аппарат: 1KB, модель насоса 2150, модель ультрафиолетового детектора 2151; измерение при 220 нм; колонка BST - ЮС-Сз, 7 /и м; высота колонки 25 ° см, внутренний диаметр 0,4 см; жидкий элю- ент: ацетонитрил и триэтиламин фосфорной кислоты (рЫ 6,8) в отношении 65:35).
Экспериментальные опыты показали,
р. что новый штамм Tofypocladium varium sp. nov. СУ/93 дает с очень высоким выходом (950 i г/мл) комплексный антибиотик, содержащий в качестве основного продукта циклоспорин А и нар ду с ним в качестве
g небольших компонентов циклоспорин В и циклоспорин С.
Выделение комплексного циклоспорина из ферментационного бульона целесообразно проводить экстракцией. Выгодно
0 перед экстракцией удэл ть.;мицелий из питательной среды фильтрованием или центрифугированием . От.отдельной биомассы прилипший антибиотик целесообразно промывать низшими спиртами, особенно мета5 нолом, или кетонами, особенно ацетоном, в то врем как дл экстракции растворенных в питательной среде циклоспоринов наход т применение несмешиваемые с водой растворители, например, этилацетат, ri-бу0 тилацетат, i-бутилацетат, дихлорметан, 1,2- дихлорэтанилихлороформ,
предпочтительно n-бутилацетат. Полученный экстракцией сырой продукт загр знен продуцированными грибком красными и ли5 левыми пигментами. Последние можно удал ть адсорбцией на. активном угле или силикагеле. Имеющиес при случае в ферментационном бульоне примеси липидного характера (например, антивспениватели)
0 можно удал ть диспергированием сырого продукта в петролейном эфире и содержащим 10% воды метаноле. Липидообразные примеси переход т в фазу петролейного эфира. Из воднометаноловой фазы метанов удал ют выпариванием в вакууме, остающуюс водную фазу экстрагируют дихлормета- ном и выпаривают экстракт. Из полученного таким путем очищенного продукта можно отдел ть циклоспорин А и другие образо5
ванные в меньшем количестве компоненты циклоспорина хроматографией на колонне или перекристаллизацией.
При сравнении с известными до сих пор способами способ по изобретению имеет р д преимуществ, которые можно суммировать следующим образом:
1.Основное преимущество способа состоит в том, что штамм Tolypocladlum varlum sp. nov. СУ/93 дает в несколько раз более количество комплексного циклоспорина, получаемого известными до сих пор методами , при лабораторных услови х количества достигают до 950 р, г/мл.
2.Новый штамм дает комплексный циклоспорин благопри тного состава (около 85% комплекса состо т из циклоспорина А), и поэтому ферментационный бульон можно проще и экономичнее перерабатывать чем это имеет место при известных способах.
Выделенные продукты идентифицировали исследовани ми ультрафиолетового спектра, инфракрасного спектра, спектра - дерного магнитного резонанса и 13О дерного магнитного резонанса, анализом аминокислот и жидкостной хроматографией при высоком давлении.
Изобретение по сн ют подробнее на основании следующих примеров.
Пример 1. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Toiypocladium varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовл ют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натри суспензию спор. При помощи 1 мл этой суспензии спор засевают 100 мл питательной среды с инокул том, котора находитс в колбе Эрленмейера объемом 500 мл.
Состав питательной среды с инокул том 1C
глюкза40 г
казеиновый
пептон- 5 г
нитрат натри 3 г
кислый фосфорнокислый
калий2 г
хлористый
калий0,5 г
сульфат
магни 7Н200,5 г
сульфат железа (II) 7НаО0,01 г
в 1000 г водопроводной воды
Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121°С в течение 25 минут.
Культуру встр хивают на аппарате дл встр хивани (340 мин1, отклонение 3.5 см) при 25°С в течение 3 дней. При помощи 5 мл полученной культуры инокул та засеивают 15 колб Эрленмейера объемом 500 мл, в которых наход тс по 100 мл стерильной питательной среды FCi.
Состав питательной среды FCi глюкоза80 г
трипказин40 г
мочевина2 г
сульфат аммони 12 г
нитрат натри 3 г
кислый фосфорнокислый калий2 г
хлористый калий0,5 г
сульфат магни 7Н200,5 г
сульфат железа (И) 7Н200,01 г
в 1000 мл водопроводной воды. Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121°С в течение 25 минут.
Колбы встр хивают на аппарате дл встр хивани (340 мин 1, отклонение 3,5 см) при 25°С. За изменением содержани антибиотика в ферментационном бульоне наблюдают при помощи микробиологического метода диффузии в агаре. Метод диффузии в агаре дл микробиологического измерени величин основываетс на противогрибковом действии циклоспорина А, В качестве тест-организма примен ют Asperglllusntger. Активность об- разованного комплексного циклоспорина измер ют относительно циклоспорина А- стандарта. Содержащие 2-8 /л г/мл циклоспорина А, приготовленные с водным спиртом стандартные растворы дают на со- держащей дрожжевой экстракт и глюкозу агаровой среде зоны торможени диаметром 16-25 мм.
Ферментацию продолжают 168 часов, потом выдел ют образованный комплекс- ный антибиотик из ферментационного бульона .
Из одного литра ферментационного бульона, который при прекращении ферментации содержал 400 /и. г/мл комплекс- ного циклоспорина, получают антибиотики следующим образом;
Клетки удал ют фильтрованием из ферментационного бульона и прилипшие антибиотики отмывают 2 х 200 мл метанола. Из водно-метаноловой промывочной жидкости удал ют метанол при пониженном давлении и экстрагируют полученный водный концентрат 2 х 50 мл n-бутилацетата. Из фильтрата ферментационного бульона экстрагируют комплексный циклоспорин 200 мл п-бутилацетата. Экстракты соедин ют, сушат над безводным сульфатом натри и выпаривают при пониженном давлении при 40°С. Полученный сырой продукт(3,7 г)раствор ют в 10 мл метанола, и липофмльные примеси удал ют элюированием с метанолом на слое гел из Sephadex LH-2Q (высота 40 см, диаметр 2,6 см). Содержащие комплексный циклоспорин фракции выпаривают при пониженном давлений при 40°С, Полученный комплексный циклоспорин раздел ют на его компоненты на приготовленной из 20 г силикагел (силикагель 40, Реанал, Будапешт) колонке элюированием повышающим градиенты хлороформа-метанола содержанием метанола. Элюирование начинают с 100 мл хлороформа и продолжают с 100 мл - количествами элюента, в котором содержание метанола при каждой стадии повышают на 0,5%. За содержанием циклоспорина в хроматографических фракци х след т при помощи тонкослойной хроматографии (пластины с силикэгелем 60 F254, DC алюминиева фольга, Мерк; конструктор: зтилацетат м изопропанол 95:5, окраска: пары йода). Циклоспорин А отдел ют от колонки содержащим 2,0% метанола хлороформом , циклоспорин В идет при 2,5% содержани метанола, и циклоспорин С можно найти во фракции с 3,0% метанола, Хроматографические фракции, содержащие отдельные компоненты циклоспорина в чистом виде, выпаривают в вакууме. Таким путем получают 225 мг циклоспорина А (точка плавлени : 137-140°С; : - 189° (метанол); 25 мг циклоспорина В (точка плавлени : 149-151°С)и 52 мг циклоспорина С (точка плавлени :- 150-152°С).
При м е р 2. Описанным а примере 1 способом приготовл ют на аппарате дл встр хивани культуру инокул та. 200 мл этой культуры засевают 5 литров питательной среды с инокул том 1C, которые наход тс в лабораторной установке дл ферментации объемом 10 литров, и стерилизуют при 1210Сэтечение 45 минут. Культуру перемешивают при 25°С с числом оборотов 750 и при этом аэрируют количеством воздуха 300 л/чае.
После 72 часов ферментации 500 мл полученной культуры инокул та примен ют дл засевани 5 литров питательной среды FC2, котора находитс в лабораторной установке дл ферментации объемом 10 л, и стерилизуют при 121°С в течение 45 минут. Состав питательной среды FC2 глюкоза80 г
трип казн н40-г-
мочевина2 г
сульфат
аммони 12 г
нитрат натри 3 г
кислый
фосфорнокислый
калий2 г
хлористый
калий0,5 г
сульфат
магни 7Н200,5 г
сульфат
меди -7Н200,01 г
сульфат марганца (II) ,01 г
сульфат
железа (II) 7Н200,01 г
в 1000 мл водопроводной воды.
Величину рН питательной среды уста- навливают перед стерилизацией до 5,2. Посевную культуру перемешивают при 25°С с числом оборотов 750 и при этом аэрируют количество воздуха 300 л/час. Ферментацию продолжают в течение 144-168 часов и прекращают после достижени максимальной концентрации циклоспорина.
Из 4,8 литра ферментационного бульона , который к концу ферментации содержит 500 fi г/мл комплекстного циклоспорина, выдел ют циклоспорин А следующим образом .
Клетки удал ют из ферментационного бульона фильтрованием, прилипшее на клетках содержание антибиотика вымывают 2x1 литром метанола. Из промывочной жидкости метанол удал ют при пониженном давлении и активное вещество экстрагируют из концентрата 2 х 250 мл п-бутилацетата.
Из фильтрата ферментационного бульона комплексный циклоспорин экстрагируют 2 х 500 мл л-бутилацетатом. Экстракты соедин ют , сушат над безводным сульфатом натри и выпаривают при пониженном давлении при 40°С. Полученный сырой продукт (19,2 г) предварительно очищают методом хроматографии на колонне на 100 г силикагел 60 (размер частиц: 0,,2 мм) с хло- реформой: метанолом; ацетоном 92:4:4 в качестве элюента. Содержащие комплексный циклоспорин фракции (тонкослойна хроматографи на пластинах из силикагел 80 F254, DC-алюминиева фольга (Мерк); конструктор: гексан и ацетон в отношении 2:1, окраска: хлор и толидин) выпаривают досуха. Из остатка от выпаривани (5,28 г) отдел ют методом хроматографии на колонне циклоспорин. Колонна содержит 115 г
силикагел 60 (размер частиц: 0,063-0.2 мм). В качестве растворител примен ют содержание ацетона, повышающее градиент гек- сана-ацетона. Циклоспорин А промывают содержащим 23 % ацетона n-гексаном из ко- лонны. Выпариванием содержащих циклоспорин А фракций получают 1,46 г циклоспорина А.
Пример 3. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Toiypocladium varlum sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовл ют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натри суспензию спор. Суспензию спор примен ют дл посева 800 мл питательной среды 1C указанного в примере 1 состава,- котора находитс в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и котора предварительно была стерилизована. Колбу встр хивают в аппарате дл встр хивани (340 , отклонение3 ,5 см) при 25°С в течение 2,5 дней. Полученной культурой инокул та засевают 5 литров питательной среды РСз. Питательна среда находитс в лабораторной установке дл ферментации объемом 10 л и была предварительно стерилизована при 121°С в течение 45 минут.
Состав питательной среды РСз
сорбоза60 г
трипказин40 г
мочевина2 г
сульфат
аммони 12 г
нитрат натри 3 г
кислый фосфор-.
нокислый
калий2 г
хлористый
калий0,5 г
сульфат
магни 7Н200,5 г
сульфат
марганца (II) 7НгО0,01 г
сульфат
железа(Н) 7Н200,01 г
в 1000 мл водопроводной воды.
Посевную культуру поддерживают тер- мостатом при 25°С, перемешивают (1000 ) и аэрируют 300 литрами/час воздуха. Культуру ферментируют 120-168 часов, после этого ферментационный бульон по микробиологическим измерени м величин содержит 600 / г/мл комплексного циклоспорина . Из одного литра ферментационного бульона описанным в примере 2 способом получают 310 мг циклоспорина А.
0
° с
0
5
0
5
o 5
Пример 4. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladlufri varlutn sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовл ют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натри суспензию спор, Суспензию спор примен ют дл посева 500 мл питательной среды 1C указанного в примере 1 состава, котора находитс в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и была предварительно стерилизована. Колбу встр хивают в аппарате дл встр хивани (340 , отклонение 3,5 см) при 25°С в течение 3 дней. Полученной культурой инокул ра засевают 5 литров питательной среды FC. Питательна среда находитс в лабораторной установке дл ферментации объемом 10 литров и она была предварительно стерилизована npw 121°C в течение 45 минут.
Состав питательной среды FC4
мальтоза80 г
трипказин40 г
мочевина2 г
сульфат
аммони 12 г
нитрат натри 3 г
кислый фосфорнокислый
калий2 г
хлористый
калий0.5 г
сульфат
магни 7НаО0,5 г .
сульфат
меди (Я) -7Н2О0,01 г
сульфат
марганца (Н) 7H2U0,01 г
сульфат
железа (II) 7Н200,01 г
в 1000 мл водопроводной воды.
Питательную среду перед стерилизацией устанавливают до величины рН 5,2. Посевную культуру подвергают ферментации при 25°С и при перемешивании (1000 ) и аэрации (300 л/час) в течение 144 часов. В конце ферментации ферментационный бульон по микробиологическим измерени м величин содержит 620 ц г/мл комплексного циклоспорина. Из одного литра ферментационного бульона описанным в примере 1 способом получают 305 мг циклоспорина А.
Пример 5. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Toiypocladium varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовл ют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого
натри суспензию спор. Суспензию спор примен ют дл засевани 500 мл питательной среды 1 С указанного в примере 1 состава , котора находитс в колбе Эрленмейера объемом 3 литра. Колбу встр хивают при 25°С на вибрационной машине с мельничным ситом (430 мин 1, отклонение 3,5 см) в течение 2 дней. Полученной культурой ино- кул та засевают 5 литров питательной среды FCi. Питательна среда находитс в лабораторной установке дл ферментации объемом 10 литров и она была предварительно стерилизована при 121 °С в течение 45 минут. Посевную культуру подвергают ферментации при 25°С при перемешивании (750 ) и аэрации (300 л/час). В .96-й час добавл ют 2% отдельно стерилизованной мальтозы, затем производ т ферментацию до 144-го часа. Ферментационный бульон содержит к этому моменту по микробиологическим измерени м величин 950 ft г/мл комплексного циклоспорина. Из 2,8 литра ферментационного бульона описанным в
0
0
примере 2 способом выдел ют 2,75 г циклоспорина А.
Claims (3)
1.Способ получени комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов , включающий культивирование продуцента при аэробных услови х в питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и минеральной соли с последующим выделением целевых продуктов, отличающийс тем, что в качестве продуцента используют грибок Tolypocladium varlum NCAiM(P)F 001005, при этом культивирование осуществл ют при температуре 25-30°С.
2.Способ по п. 1,отличающийс тем, что в качестве источника азота примен ют пептон, сульфат аммони , трипказин, в качестве источника углерода - глюкозу, мальтозу, сорбит.
3.Штамм грибка Tolypocladium varium NCAIM(P)F 001005 - продуцента комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов.
Продолжение таблицы
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU886497A HU201577B (en) | 1988-12-20 | 1988-12-20 | Process for producing cyclosporin antibiotics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU1836425C true RU1836425C (ru) | 1993-08-23 |
Family
ID=10971727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4742791A RU1836425C (ru) | 1988-12-20 | 1989-12-19 | Способ получени комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка ТоLYросLаDIUм VаRIUм |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5156960A (ru) |
| EP (1) | EP0379708B1 (ru) |
| JP (1) | JPH0763356B2 (ru) |
| AT (1) | AT393135B (ru) |
| BG (1) | BG60274B1 (ru) |
| CA (1) | CA2006144C (ru) |
| CZ (1) | CZ283557B6 (ru) |
| DD (1) | DD290356A5 (ru) |
| DE (1) | DE58908740D1 (ru) |
| DK (1) | DK174719B1 (ru) |
| FI (1) | FI92603C (ru) |
| FR (1) | FR2640641B1 (ru) |
| GB (1) | GB2227489B (ru) |
| HU (1) | HU201577B (ru) |
| IT (1) | IT1237799B (ru) |
| LV (2) | LV10102B (ru) |
| NO (1) | NO175873C (ru) |
| PL (1) | PL162959B1 (ru) |
| RU (1) | RU1836425C (ru) |
| SE (1) | SE505442C2 (ru) |
| SK (1) | SK279768B6 (ru) |
| UA (1) | UA13320A (ru) |
| YU (1) | YU47100B (ru) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE158022T1 (de) * | 1991-01-25 | 1997-09-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Prozess zur produktion von cyclosporin-a und/oder c |
| DE59106428D1 (de) * | 1991-04-06 | 1995-10-12 | Dresden Arzneimittel | Verfahren zur fermentativen Herstellung und Isolierung von Cyclosporin A sowie neue Cyclosporin- bildende Stämme. |
| FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
| SI9300303A (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-31 | Krka Tovarna Zdravil | Process for isolation of hypolipemic effective substance |
| KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
| KR100341355B1 (ko) * | 1994-10-14 | 2002-10-25 | 주식회사종근당 | 사이클로스포린a의제조방법 |
| KR0126610B1 (ko) * | 1994-10-18 | 1997-12-29 | 김충환 | 고생산 세포융합변이균주에 의한 사이클로스포린 a의 제조방법 |
| EP0725076B1 (en) * | 1995-02-01 | 2001-06-06 | National Research Development Corporation of India | A process for the preparation of cyclosporin A from tolypocladium species |
| EP0846699A1 (en) * | 1995-06-29 | 1998-06-10 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Substance wf16616, process for production thereof, and use thereof |
| DE19611094C2 (de) | 1996-03-21 | 1999-06-17 | Dresden Arzneimittel | Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens |
| US5709797A (en) * | 1996-06-05 | 1998-01-20 | Poli Industria Chimica S.P.A. | Method of isolating cyclosporins |
| US5747330A (en) * | 1996-06-05 | 1998-05-05 | Poli Industria Chimica | Antibiotic producing microbe |
| DK1154759T3 (da) | 1998-12-30 | 2008-12-08 | Dexcel Ltd | Dispergerbart koncentrat til indgift af cyclosporin |
| US7732404B2 (en) | 1999-12-30 | 2010-06-08 | Dexcel Ltd | Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin |
| CA2401700A1 (en) | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Biocon India Limited | Manufacture and purification of cyclosporin a |
| US7696166B2 (en) | 2006-03-28 | 2010-04-13 | Albany Molecular Research, Inc. | Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders |
| US7696165B2 (en) | 2006-03-28 | 2010-04-13 | Albany Molecular Research, Inc. | Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders |
| EP2151450A1 (de) | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
| JP6022548B2 (ja) * | 2011-04-28 | 2016-11-09 | セルジーン コーポレイション | Ｐｄｅ４阻害剤を自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療及び管理に使用する方法及び組成物 |
| GB201319791D0 (en) * | 2013-11-08 | 2013-12-25 | Sigmoid Pharma Ltd | Formulations |
| CN117025407B (zh) * | 2023-06-28 | 2024-06-18 | 中国人民解放军海军特色医学中心 | 一株弯颈霉属真菌及其在制备抗辐损伤药物中的应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4117118A (en) * | 1976-04-09 | 1978-09-26 | Sandoz Ltd. | Organic compounds |
| DE2819094A1 (de) * | 1977-05-10 | 1978-11-23 | Sandoz Ag | Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung |
| US4215199A (en) * | 1978-06-05 | 1980-07-29 | Sandoz Ltd. | Antibiotic production |
| SE448386B (sv) * | 1978-10-18 | 1987-02-16 | Sandoz Ag | Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem |
| US4764503A (en) * | 1986-11-19 | 1988-08-16 | Sandoz Ltd. | Novel cyclosporins |
-
1988
- 1988-12-20 HU HU886497A patent/HU201577B/hu unknown
-
1989
- 1989-12-18 DK DK198906409A patent/DK174719B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-12-19 SE SE8904262A patent/SE505442C2/sv unknown
- 1989-12-19 UA UA4742791A patent/UA13320A/ru unknown
- 1989-12-19 RU SU4742791A patent/RU1836425C/ru active
- 1989-12-20 IT IT22765A patent/IT1237799B/it active IP Right Grant
- 1989-12-20 AT AT2891/89A patent/AT393135B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 JP JP1328529A patent/JPH0763356B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-20 PL PL28287689A patent/PL162959B1/pl unknown
- 1989-12-20 BG BG090701A patent/BG60274B1/bg unknown
- 1989-12-20 YU YU241589A patent/YU47100B/sh unknown
- 1989-12-20 GB GB8928715A patent/GB2227489B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 DE DE58908740T patent/DE58908740D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 EP EP89123535A patent/EP0379708B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 CA CA002006144A patent/CA2006144C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 FR FR898916878A patent/FR2640641B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 SK SK7225-89A patent/SK279768B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 DD DD89335977A patent/DD290356A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 CZ CS897225A patent/CZ283557B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 US US07/454,005 patent/US5156960A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 NO NO895160A patent/NO175873C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 FI FI896157A patent/FI92603C/fi active IP Right Grant
-
1992
- 1992-05-04 LV LVP-92-10A patent/LV10102B/en unknown
-
1993
- 1993-06-28 LV LVP-93-708A patent/LV10500B/lv unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1836425C (ru) | Способ получени комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка ТоLYросLаDIUм VаRIUм | |
| Dreyfuss et al. | Cyclosporin A and C: new metabolites from Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai | |
| JP3111470B2 (ja) | 新規ポリペプチド化合物およびその製造法 | |
| RU2112807C1 (ru) | Способ получения иммунодепрессанта циклоспорина а и штамм tolypocladium species свs630.92, продуцирующий циклоспорин а | |
| EP0021684A1 (en) | Process of producing A-42355 antibiotic mixture and A-30912 antibiotics as well as a pure culture of the producing micro organism | |
| EP0933422A1 (en) | Cyclic lipopeptide acylase | |
| US5747330A (en) | Antibiotic producing microbe | |
| EP0568698B1 (en) | Process for producing cyclosporin a and/or c | |
| US5854276A (en) | Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof | |
| US6423530B1 (en) | Process for preparing FR900482 and compounds analogous thereto | |
| Kobayashi et al. | FR227244, a novel antifungal antibiotic from Myrothecium cinctum No. 002 I. Taxonomy, fermentation, isolation and physico-chemical properties | |
| RU2066687C1 (ru) | Способ получения циклоспорина а, штаммы гриба sesquicilliopsis rosariensis g.arnold - продуценты циклоспорина а, штамм гриба tolypocladium inflatum - продуцент циклоспорина а | |
| EP0525846A1 (en) | Sporomiella intermedia and processes therefrom | |
| KR820001433B1 (ko) | 항생물질 c-15003 p-4의 제조법 | |
| RU2256701C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus fumigatus - продуцент индольных алкалоидов и способ их получения | |
| SI8912415A (sl) | Mikrobni postopek za proizvodnjo imunosupresivnih antibiotikov | |
| JPH05306272A (ja) | 新規化合物ｂｘ８６、その使用および製造 | |
| HU211026B (en) | Process for the microbiologically preparation and the isolation of cyclosporin a |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| REG | Reference to a code of a succession state |
Ref country code: RU Ref legal event code: PD4A |