JP6022548B2 - Pde4阻害剤を自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療及び管理に使用する方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本明細書に提供されるのは、限定されないが、脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、及び関節リウマチを含む、自己免疫性及び炎症性疾患及び障害を、他の治療法と組み合わせたホスホジエステラーゼ4(PDE4)阻害剤の投与により、治療、予防、又は管理する方法である。特に、本明細書に提供されるのは、関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、及び関節リウマチを、シクロスポリンAもしくは他のカルニニューリン(calnineurin)阻害剤、エタネルセプトもしくは他のTNF阻害剤、又はメトトレキサートもしくは他の代謝拮抗薬のいずれかと組み合わせた(S)-N-(2-(1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)アセトアミドを用いて、及び/或いはシクロスポリンA、エタネルセプト、もしくはメトトレキサートのいずれか、又は同様の薬物と組み合わせた(S)-N-(2-(1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル)-3-オキソイソインドリン-4-イル)シクロプロパンカルボキサミドを用いて、治療、予防、又は管理する方法である。
炎症は、宿主防御及び免疫媒介性疾患の進行において基本的な役割を果たしている。炎症応答は、損傷(例えば、外傷、虚血、及び外来粒子)並びに感染(例えば、細菌感染又はウイルス感染)に応答して、化学伝達物質(例えば、サイトカイン及びプロスタグランジン)並びに炎症細胞(例えば、白血球)を含む一連の複雑な事象により開始される。炎症応答は、血流の増加、毛細血管透過性の増加、及び食細胞の流入を特徴とする。これらの事象は、損傷又は感染の部位で腫脹、発赤、熱感(ヒートパターンの変化)、及び化膿を生じさせる。
本明細書に提供されるのは、PDE4阻害剤又はその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、プロドラッグ、もしくは多形を第二の活性剤と組み合わせて用いて、疾患及び障害を治療する方法である。ある実施態様において、1つ又は複数の第二の活性剤は、TNF-α阻害剤、カルシニューリン阻害剤、又は代謝拮抗薬である。ある実施態様において、該疾患又は障害としては、炎症性疾患又は自己免疫疾患、例えば、脊椎炎(例えば、強直性脊椎炎)、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、狼瘡、痛風、ベーチェット病、及び変形性関節症が挙げられるが、これらに限定されない。
(5.1.炎症に対するPDE4阻害剤を含む組合せ療法)
本明細書に提供されるのは、限定されないが、乾癬性関節炎及び関節リウマチを含む、乾癬及び/又は関節炎を治療、管理、又は予防する方法であって、そのような治療、管理、又は予防を必要としている患者に、アプレミラストとしても知られる、2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオンの(+)エナンチオマーである化合物A、又はその医薬として許容し得るプロドラッグ、代謝体、多形、塩、溶媒和物、もしくは包摂化合物の治療的又は予防的有効量を、第二の活性剤と組み合わせて投与することを含む、方法である。理論によって制限されるものではないが、2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオンの(+)エナンチオマーは、(S)-N-(2-(1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)アセトアミドであると考えられ、これは、以下の構造を有する。
本明細書で使用されるように、「化合物A」という用語は、アプレミラストとしても知られ、メタノールに溶解させたときに、平面偏光を(+)方向に回転させる、2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオンのエナンチオマー的に純粋な形態を指す。理論によって制限されるものではないが、化合物Aは、(S)-N-(2-(1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)アセトアミドであると考えられ、これは、以下の構造を有する。
本明細書に提供されるのは、乾癬及び/又は関節炎-限定されないが、関節リウマチ及び/又は乾癬性関節炎を含む-を治療、管理、及び/又は予防する方法であって、そのような治療、管理、又は予防を必要としている患者に、化合物Aもしくは化合物B、又はその医薬として許容し得るプロドラッグ、代謝体、多形、塩、溶媒和物、もしくは包摂化合物の治療的又は予防的有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、化合物A又は化合物Bの塩又は溶媒和物を使用する。他の実施態様において、化合物A又は化合物Bの遊離塩基を使用する。
本明細書に提供されるように、(S)-N-(2-(1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)アセトアミド又は(S)-N-(2-(1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル)-3-オキソイソインドリン-4-イル)シクロプロパンカルボキサミドは、限定されないが、関節リウマチ及び/又は乾癬性関節炎を含む、乾癬及び/又は関節炎を治療、管理、及び/又は予防するための別の薬物(「第二の活性剤」又は「追加の活性剤」)と組み合わせて投与することができる。
医薬組成物を、個別的な、単一単位剤形の調製において使用することができる。本明細書に提供される医薬組成物及び剤形は、限定されないが、化合物Aもしくは化合物Bを含む、PDE4阻害剤、又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、水和物、包摂化合物、もしくはプロドラッグと、限定されないが、本明細書に記載の抗炎症剤を含む、第二の活性剤とを含むことができる。医薬組成物及び剤形は、1以上の担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含むことができる。
経口投与に好適である本明細書に提供される医薬組成物は、個別剤形、例えば、限定されないが、錠剤(例えば、チュアブル錠)、カプレット剤、カプセル剤、及び液体(例えば、フレーバーシロップ)として提示することができる。そのような剤形は、所定量の活性成分を含有しており、当業者に周知の薬学の方法によって調製することができる。一般に、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第20版, Mack Publishing社, Easton PA(2000)を参照されたい。
活性成分は、制御放出手段によるか、又は当業者に周知である送達装置によって投与することができる。制御放出手段又は送達装置の非限定的な例としては、その各々が引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第:3,845,770号;第3,916,899号;第3,536,809号;第3,598,123号;及び第4,008,719号、第5,674,533号、第5,059,595号、第5,591,767号、第5,120,548号、第5,073,543号、第5,639,476号、第5,354,556号、及び第5,733,566号に記載されているものが挙げられる。そのような剤形を用いて、例えば、所望の放出プロファイルを提供するためにヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、又はこれらの組合せを様々な割合で用いて、1以上の活性成分の低速又は制御放出を提供することができる。本明細書に記載されているものを含む、当業者に公知の好適な制御放出製剤は、本明細書に提供される活性成分とともに使用するために容易に選択することができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、経口投与に好適な単一単位剤形、例えば、限定されないが、制御放出に適している錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ剤、及びカプレット剤である。
非経口剤形は、限定されないが、皮下、静脈内(ボーラス注射を含む)、筋肉内、及び動脈内を含む、様々な経路によって患者に投与することができる。その投与は、通常、汚染物質に対する患者の自然防御を回避するので、非経口剤形は、滅菌されているか、又は患者に投与する前に滅菌することができることが好ましい。非経口剤形の非限定的な例としては、注射にそのまま利用可能な液剤、注射用の医薬として許容し得るビヒクルにすぐに溶解又は懸濁させることができる乾燥品、注射にそのまま利用可能な懸濁剤、及び乳剤が挙げられる。
薬物は、皮膚及びその付属器に、又は種々の粘膜に局所的に適用することができる。使用することができる経路としては、鼻腔、舌下、膣、嚢胞、直腸、包皮、眼球、口腔、又は耳が挙げられる。多くの剤形は、活性成分を適用部位に送達し、局所的効果をもたらすように開発されている。本明細書に提供される局所及び粘膜剤形の非限定的な例としては、スプレー剤、吸入剤、エアゾール剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、散布剤、ローション剤、リニメント剤、湿布剤、液剤、乳剤、懸濁剤、点眼薬もしくは他の眼科調製物、又は当業者に公知の他の形態が挙げられる。例えば、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第20版, Mack Publishing社, Easton PA(2000);及び医薬剤形入門(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms), 第4版, Lea & Febiger社, Philadelphia(1985)を参照されたい。口腔内の粘膜組織を治療するのに好適な剤形は、マウスウォッシュとしてか又はオーラルゲルとして製剤化することができる。
活性成分は、多くの場合、患者に、同時に投与されることも、同じ投与経路で投与されることもない。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、医療実践者が使用するときに、患者への適量の活性成分の投与を簡略化することができるキットである。
本明細書に提供されるいくつかの実施態様を以下の非限定的な実施例によって説明する。これらの実施例は、その範囲の限定とみなされるべきではない。
1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-メチルスルホニルエチルアミン(1.0g、3.7mmol)及び無水3-アセトアミドフタル酸(751mg、3.66mmol)の酢酸(20mL)撹拌溶液を還流状態で15時間加熱した。溶媒を真空中で除去すると、油状物が得られた。得られた油状物のクロマトグラフィーにより、生成物が黄色の固体(1.0g、59%収率)として得られた: mp、144℃;
(6.2.1. 3-アミノフタル酸の調製)
10%Pd/C(2.5g)と3-ニトロフタル酸(75.0g、355mmol)とエタノール(1.5L)の混合物を、2.5LのParr水素化装置に、窒素雰囲気下で仕込んだ。水素を該反応容器に55psiまで仕込んだ。水素圧を50〜55psiに維持して、混合物を13時間振盪させた。水素を放出させ、混合物を窒素で3回パージした。懸濁液をセライト床に通して濾過し、メタノールですすいだ。濾液を真空中で濃縮した。得られた固体をエーテル中で再スラリー化させ、真空濾過により分離した。該固体を真空中で一定重量まで乾燥させると、54g(84%収率)の3-アミノフタル酸が黄色の生成物として得られた。
1Lの3つ口丸底フラスコに、機械撹拌器、温度計、及び冷却器を装備し、3-アミノフタル酸(108g、596mmol)及び無水酢酸(550mL)を仕込んだ。反応混合物を3時間加熱還流させ、周囲温度に冷却し、さらに0〜5℃までもう1時間冷却した。結晶性固体を真空濾過により収集し、エーテルで洗浄した。固体生成物を真空中で周囲温度で一定重量まで乾燥させると、75g(61%収率)の無水3-アセトアミドフタル酸が白色の生成物として得られた。
3Lの3つ口丸底フラスコに、機械撹拌器、温度計、及び冷却器を装備し、2-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-1-(メチルスルホニル)-エト-2-イルアミン(137.0g、500mmol)、N-アセチル-L-ロイシン(52g、300mmol)、及びメタノール(1.0L)を仕込んだ。撹拌スラリーを1時間加熱還流させた。撹拌混合物を周囲温度に冷却させておき、周囲温度でさらに3時間、撹拌し続けた。スラリーを濾過し、メタノール(250L)で洗浄した。固体を風乾させ、その後、真空中で周囲温度で一定重量まで乾燥させると、109.5g(98%収率)の粗生成物(85.8%ee)が得られた。粗固体(55.0g)及びメタノール(440mL)を1時間還流させ、室温に冷却し、周囲温度でさらに3時間撹拌した。スラリーを濾過し、濾過ケーキをメタノール(200mL)で洗浄した。固体を風乾させ、その後、真空中で30℃で一定重量まで乾燥させると、49.6g(90%回収)の(S)-2-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-1-(メチルスルホニル)-エト-2-イルアミン-N-アセチル-L-ロイシン塩(98.4%ee)が得られた。キラルHPLC(1/99 EtOH/20mM KH2PO4 @pH 7.0、Agilent Technologies社製のUltron Chiral ES-OVS、150mm×4.6mm、0.5mL/分、@240nm):18.4分(S-異性体、99.2%)、25.5分(R-異性体、0.8%)。
500mLの3つ口丸底フラスコに、機械撹拌器、温度計、及び冷却器を装備した。該反応容器に、(S)-2-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-1-(メチルスルホニル)-エト-2-イルアミンN-アセチル-L-ロイシン塩(25g、56mmol、98%ee)、無水3-アセトアミドフタル酸(12.1g、58.8mmol)、及び氷酢酸(250mL)を仕込んだ。混合物を一晩還流させ、その後、<50℃に冷却した。溶媒を真空中で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解させた。得られた溶液を水(250mL×2)、飽和水性NaHCO3(250mL×2)、ブライン(250mL×2)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させると、残渣が、エタノール(150mL)及びアセトン(75mL)を含む二成分溶媒から再結晶化した。固体を真空濾過により分離し、エタノール(100mL×2)で洗浄した。生成物を真空中で60℃で一定重量まで乾燥させると、19.4g(75%収率)のS-{2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-イノイソインドリン-1,3-ジオンが98%eeで得られた。キラルHPLC(15/85 EtOH/20mM KH2PO4 @pH .5、Agilent Technology社製のUltron Chiral ES-OVS、150mm×4.6mm、0.4mL/分、@240nm):25.4分(S-異性体、98.7%)、29.5分(R-異性体、1.2%)。
(+)-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオン(「(+)異性体」;化合物A)の抗関節炎活性をmAB/LPS誘導性実験的マウス関節炎発症モデルで評価した。マウスに、1、5、及び25mg/kgの1日1回の経口(PO)強制飼養を連続5日間の処置日にわたって施した。処置群は、1群当たりn=8匹のBALB/c雄マウスを含んでいた。2つの同じ大きさの群を、それぞれ、陽性対照又はビヒクル対照としての役割を果たす、デキサメタゾン(1mg/kg)、又は0.5%CMC/0.25%Tween 80懸濁液のいずれかで処置した。
(+)-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオン(「(+)異性体」;化合物A)の潜在的な抗関節炎活性を明らかにするために、合計16匹の動物をビヒクル対照又は25mg/kgの(+)異性体を用いて組織病理学的評価のために試験した。左後肢を10%中性緩衝ホルマリン中で1週間固定し、その後、緩衝無機酸中に移し(約48時間の脱灰プロセス)、10%ホルマリン中に戻した後、貯蔵した。足関節、すなわち、脚と足の間の関節(脛骨-足根関節)を含むように、脛骨の真ん中及び遠位から得られた各々の肢を、真ん中で縦方向に切断し、両半分をパラフィンに包埋し、6ミクロン厚のスライドを切り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。これらの関節の組織病理学的変化を記載し、変化の重症度(0=目立たない、1=最小限、2=軽度、3=中程度、4=顕著)を考慮して、5つの等級(0〜4)の半定量的等級付けを用いてスコア化した。個々の所見を表1に示す。これらの結果は、等級3(中程度)の重症度を達成する、関節炎モデルの誘導の成功を示している。この関節炎で特徴的に見られる全ての典型的な変化範囲を記述した。試験化合物Aで処置した動物由来の全ての試料には、関節炎が事実上存在せず、関節炎発症を阻害する極めて強力な能力が示された。
潜在的な抗関節炎活性を、5及び25mg/kgで、1日1回、反復経口投与により連続11日間の処置日にわたって投与された(+)-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオン(「(+)異性体」;化合物A)のmAb/LPS誘導性実験的マウス関節炎発症モデルで評価した。試験品で処置した群は、1群当たりn=8匹のBALB/c雄マウスを含んでいた。さらに、4つの同じ大きさの群を、Enbrel(5もしくは6.25mg/kg、陽性対照)、0.5%CMC/0.25%Tween 80の懸濁液(5ml/kg、ビヒクル対照)、又はEnbrelと化合物Aの組合せ(各5mg/kg、陽性対照-試験品群)のいずれかで処置した。
T細胞における化合物Aの抗炎症活性を、単独で、並びにエタネルセプト(ETN)、シクロスポリンA(CsA)、及びメトトレキサート(MTX)を含む、他の抗リウマチ剤との併用で測定した。化合物Aを、単独及び併用で、コラーゲン抗体誘導性関節炎(CAIA)のマウスモデルで試験した。
健常ドナー(n=5)由来のヒト末梢血全T細胞を磁気ビーズ上での陰性選択により単離し、1.25×10e6細胞/mLで抗CD3抗体で2日間刺激した。サイトカイン及びケモカインのタンパク質レベルをLuminex 100でのサイトメトリックビーズアレイにより解析した。CAIAモデル:雄のBALB/cマウス(1群当たりn=10)に、4種のモノクローナル抗体のカクテルを100mg/kgの用量で静脈内注射し、3日後に、LPSを2.5mg/kgで腹腔内注射(IP)した。化合物A及びETNを、1日1回、3〜13日目に投与した。化合物Aは、1、5、又は25mg/kg qdの懸濁液として経口投与した。ETNは、5又は6.25mg/kgでIP注射した。各動物の両後足(左右)を関節炎発症応答の兆候について盲検様式で調べた。関節炎反応をスコア化し、重症度の低い順に0〜4の尺度に従って記録した。後足厚を、Mitutoyo製の電子デジタルキャリパーを用いてmm単位で測定した。両後足を足関節の真上で切り離し、10%中性緩衝ホルマリン中で固定し、組織病理について解析した。
化合物Aは、測定した全てのT細胞サイトカイン及びケモカイン(IL-2、IL-4、IL-13、IFN-γ、TNF-α、CXCL10、CCL3、及びCCL4)の産生を15〜360ng/mLの50%阻害濃度(IC50)で阻害した。CsAも全ての解析物を4.7〜140ng/mLのIC50で阻害した。一方、ETNは、TNF-αを強く阻害し(IC50=1.5ng/mL)、それには及ばない程度にIL-13及びIP-10を阻害したが(16〜62ng/mL)、他の全ての解析物のIC50は、>1600ng/mLであった。MTX IC50は、全て>1600ng/mLであった。相乗的阻害は、化合物A+ETNの組合せ及び化合物A+CsAの組合せについて観察された。CAIAモデルにおいて、後足の関節炎反応スコア及び厚さは、5及び25mg/kgの化合物Aによって、及び試験した両方の用量のETNによって有意に低下した(p<0.01)。高用量では、化合物Aは、滑膜過形成、滑膜絨毛形成、フィブリン沈着、滑膜における炎症性浸潤、パンヌス形成、軟骨破壊、並びに軟骨下骨破壊(破骨細胞による吸収/浸食及び骨の損失に反映される)を阻害した。各々5mg/kgの化合物A+エタネルセプトの組合せは、関節炎モデルにおいて相加的〜相乗的であった。
(6.5.1.メチル2-メチル-6-ニトロベンゾエートの調製)
2-メチル-6-ニトロ安息香酸(300.0g、1.66モル、Acros Organics社、Morris Plains、NJ製)とオルト酢酸トリメチル(298.3g、2.48モル、Aldrich Chemicals社、Milwaukee、WI製)の混合物を窒素下で約20〜25℃で3Lの3つ口フラスコに仕込んだ。反応混合物を徐々に加熱し、反応中に生成した低沸点成分を95〜100℃の内部温度まで留去した。2時間後、反応混合物を1〜2時間かけて20〜25℃に冷却した。ヘプタン(1.50L、Aldrich Chemicals社製)を1.0〜1.5時間かけて反応混合物に仕込んだ後、該反応混合物が混濁してきたときに、それにメチル2-メチル-6-ニトロベンゾエート(0.5g)をシードした。懸濁液を0.5〜1時間かけて0〜5℃に冷却し、0〜5℃でさらに1.5〜2時間保持した。固体を真空下での濾過により収集し、ヘプタン(3×300mL)で洗浄し、100〜120トールの真空下、30〜35℃でトレイ中で一定重量まで乾燥させた。メチル2-メチル-6-ニトロベンゾエートの収量は、300.0gの2-メチル-6-ニトロ安息香酸に基づくと、292.0g(91%)であった。生成物は、面積率に基づいてHPLCにより測定された>99%の純度、及びカール・フィッシャー滴定により測定された<0.1%の水含有量を有することが分かった。
メチル2-メチル-6-ニトロベンゾエート(200.0g、1.02モル、先に調製したもの)と1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン(DBH、162.0g、0.57モル、Aldrich Chemicals社製)と酢酸メチル(1.20L、Aldrich Chemicals社製)の混合物を窒素下で約20〜25℃で3Lの3つ口フラスコに仕込んだ。反応混合物を0.5〜1時間還流させた後、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル(AIBN、8.6g、52mmol、Aldrich Chemicals社製)の100mLの酢酸メチル溶液を15〜30分間かけて仕込んだ。未反応の2-メチル-6-ニトロベンゾエートの量が5〜10%未満になるまで、反応混合物を6.5〜8時間還流させた。該反応混合物を15〜18℃に冷却し、15〜18℃で50〜60分間保持した。固体を濾過し、該固体中に残るメチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートが3%未満になるまで、冷たい(すなわち、5〜10℃の)酢酸メチル(2×100mL)で洗浄した。次に、ヘプタン(1.00L)を濾液に仕込んだ後、上層の有機相を、HPLCによる測定によって未反応の5,5-ジメチルヒダントインが0.5%(210nmでの面積率)未満になるまで2%のブライン(2×500mL)及び脱イオン水(1〜2×500mL)で洗浄した。該溶液を減圧下で濃縮して、約1.80〜1.90Lの酢酸メチルを除去した後、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE、300mL)を仕込んだ。反応混合物を65〜70℃で10〜15分間還流させた後、溶液を0.5〜1時間かけて50〜55℃に冷却し、500mgのメチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートを45〜50℃でシードした。懸濁液を20〜25℃に冷却し、20〜25℃で2〜3時間保持した。固体を濾過により収集し、5〜10℃の1:2の容量比のヘプタンとMTBEの冷たい混合物(2×100mL)で洗浄し、100〜120トールの真空下で20〜25℃で一定重量まで乾燥させた。メチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートの収量は、200.0gの投入量のメチル2-メチル-6-ニトロベンゾエートに基づくと、185.2g(66%)であった。生成物は、面積率に基づいてHPLCにより測定された>98%の純度、及びカール・フィッシャー滴定により測定された<0.1%の水含有量を有することが分かった。
(1S)-1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メタンスルホニル-エチルアミンN-アセチル-L-ロイシン塩(1.10kg、2.46モル)と脱イオン水(4.40L)とジクロロメタン(DCM、5.50L)の混合物を反応容器に仕込んだ後、水酸化ナトリウム(196.0g、4.90モル)の1.00Lの脱イオン水溶液を15〜25℃で約5分間かけて該反応容器に仕込んだ。得られた混合物を15〜25℃で少なくとも10分間撹拌し、その後、水相及び有機相を分離させておいた。上部の水相のpHをpH 13〜14に維持又は調整した。該相を分離し、上部の水相をDCM(2×4.4L)で抽出した。抽出の間ずっと、該水相のpHを13〜14に維持した。DCM抽出物を合わせ、該水相のpHが11以下に達するまで脱イオン水(3.3L)で洗浄した。DCMを真空下で35℃未満で除去した。残留固体の水含有量は、カール・フィッシャー滴定で測定したとき、<0.1%w/wであるものとした。該残留固体をさらなるDCMで共沸乾燥させた。該固体を真空中で30〜35℃で一定重量まで乾燥させると、(1S)-1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メタンスルホニル-エチルアミンが白色の粉末(639.0〜672.0g、95〜100%収率)として得られた。
(1S)-7-ニトロ-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]イソインドリン-1-オンを以下の手順により調製した。メチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエート(100.0g、365mmol、先に実施例6.5.2.で調製したもの)と(1S)-1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メタンスルホニルエチルアミン(104.7g、383mmol、先に実施例6.5.3.で調製したもの)と炭酸水素ナトリウム(67.5g、8.03モル、Aldrich Chemicals社製)とジメチルホルムアミド(500mL)の混合物を窒素下で室温で1Lの3つ口フラスコに仕込んだ。反応混合物を、未反応のメチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートが<2%未満になるまで、70〜75℃の内部温度まで2時間、徐々に加熱した。該反応混合物を95〜100℃の内部温度まで18時間、徐々に加熱した。該反応混合物を20〜25℃に冷却し、1Lの滴下漏斗に移した。精製水(1500mL)を5Lの3つ口フラスコに仕込んだ後、滴下漏斗中の反応混合物を、内部温度を30℃未満に維持しながら、室温で1〜2時間かけて5Lの3つ口フラスコ中の水に添加した。該反応混合物を室温で2時間撹拌した。固体を真空下で完全に濾過し、水(3×300mL)及びメタノール(2×400mL)で洗浄し、その後、2Lの3つ口フラスコに仕込み、その後、メタノール(1000mL)を仕込んだ。混合物を1時間還流させた。該混合物を室温に冷却した。固体を真空下での濾過により収集し、200mLのメタノール(2 vol)で洗浄し、100〜120トールの真空下で40〜45℃で一定重量まで乾燥させた。(1S)-7-ニトロ-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]イソインドリン-1-オンの収量は、100.0gの投入量のメチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートに基づくと、123.0g(78%)であった。生成物は、面積率に基づいてHPLCにより測定された>99%の純度、及びカール・フィッシャー滴定により測定された<0.1%の水含有量を有することが分かった。
(1S)-7-ニトロ-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]イソインドリン-1-オンを以下の手順によっても調製した。メチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエート(100.0g、365mmol、先に実施例6.5.2.で調製したもの)と(1S)-1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メタンスルホニル-エチルアミン(104.7g、383mmol、先に実施例6.5.3.で調製したもの)と炭酸カリウム粉末(100.8g、730mmol、Aldrich Chemicals社製)の混合物を室温でアセトニトリル(500mL)に懸濁させた。反応混合物を、未反応のメチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートが2%未満になるまで81〜83℃で約2時間還流させた。該反応混合物を45〜50℃に冷却した後、メタノール(200mL)を5〜10分間かけて仕込んだ。該混合物を20〜25℃に冷却させておき、2時間撹拌した後、脱イオン水(1.40L)を0.5〜1時間かけて仕込み、20〜25℃で30分間、及び0〜5℃で1〜2時間撹拌した。固体を濾過し、脱イオン水(3×300mL)で洗浄し、カール・フィッシャー滴定で測定したとき<10%の水含有量になるまで乾燥させた。該固体をメタノール(750mL)に懸濁させ、1〜1.5時間還流させた。懸濁液を1.5〜2時間かけて0〜5℃に冷却し、0〜5℃で1〜1.5時間保持した。固体を濾過し、0〜5℃のメタノール(2×200mL)及びヘプタン(200mL)で洗浄し、その後、真空下で40〜45℃で一定重量まで乾燥させた。(1S)-7-ニトロ-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]イソインドリン-1-オンの収量は、100.0gの投入量のメチル2-ブロモメチル-6-ニトロベンゾエートに基づくと、148.0g(93%)であった。生成物は、面積率に基づいてHPLCにより測定された>99%の純度、及びカール・フィッシャー滴定により測定された<1.0%の水含有量を有することが分かった。
(1S)-7-ニトロ-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]イソインドリン-1-オン(60g、138mmol、先に実施例6.5.5.で調製したもの)と10%Pd/C(50%水分、2.4g、4wt%、Johnson Matthey社、London、UK製)と酢酸エチル(780mL)の混合物を窒素下で室温でParr容器に仕込んだ。該混合物を窒素で3回及び水素で3回パージした後、反応混合物を40℃に加熱し、その後、熱を除去した。該反応混合物を、ヒドロキシルアミン中間体が≦3%になるまで、40〜45psiの圧力で4〜6時間かけて水素とともに撹拌した。該反応混合物を20〜25℃に冷却した。該反応混合物をセライト床(1インチ厚)に通して濾過し、その後、床を酢酸エチル(120mL)で洗浄した。濾液を、50mLの滴下漏斗を備えた3Lの3つ口フラスコに移した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(29mL、165mmol)を該フラスコに仕込んだ後、滴下漏斗にシクロプロピルカルボニルクロリド(13.0mL、145mmol、Aldrich Chemicals社製)を仕込んだ。該シクロプロピルカルボニルクロリドは、室温で1〜2時間かけて、30℃未満の内部温度で添加した。反応混合物を室温で2〜4時間撹拌した。ヘプタン(300mL)を添加した後、反応混合物を4〜6時間撹拌した。固体を真空下での濾過により収集し、2N HCl(2×300mL)、水(2×300mL)、及びその後、ヘプタン(2×300mL)で洗浄した。粗生成物を100〜120トールの真空下で40〜45℃で一定重量まで乾燥させた。粗化合物Bの収量は、60.0gの投入量の(1S)-7-ニトロ-2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]-イソインドリン-1-オンに基づくと、58g(88%)であった。
粗化合物B(95.2g、先に実施例6.5.6.で調製したもの)とテトラヒドロフラン(THF、1.43L)の混合物を窒素下で20〜25℃で3Lのフラスコに仕込んだ。懸濁液を溶解が達成されるまで60〜65℃に加熱した。該懸濁液を45〜50℃で濾過し、固体を、45〜55℃で予め温めておいた95mLのTHFですすいだ。約950〜1150mLのTHFを標準圧力で30〜60分間かけて留去した後、無水エタノール(950mL)を55〜60℃で5〜10分間かけて仕込んだ。約350〜400mLの溶媒を、内部温度が72〜74℃に上昇するまで、標準圧力で除去した。得られた懸濁液を72〜75℃で30〜60分間還流させ、1〜2時間かけて20〜25℃に冷却し、20〜25℃でさらに1〜2時間保持した。固体を真空下での濾過により収集し、無水エタノール(240〜280mL)及びヘプタン(240〜280mL)で洗浄し、その後、130〜140トールの真空中、50〜55℃でトレイ中で一定重量まで乾燥させた。オフホワイト色の結晶性生成物の収量は(88.0〜91.0g、92〜96%)であった。
(6.6.1.末梢血単核細胞のマルチプレックスアッセイの手順)
ヒト末梢血単核細胞の純化
ヒトT細胞の純化及び処理
・ヒツジ抗マウスIgGビーズ(600μl; Dynal Cat. No 110.31)、
・抗CD16(30μl; BD Pharmingen Cat. No. 555404)、
・抗CD33(30μl; BD Pharmingen Cat. No. 555449)、
・抗CD56(30μl; BD Pharmingen Cat. No. 555514)。
サイトカインのIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IP-10、MIP-1α、MIP1β、及びTNF-αを、ニートの上清を用いて9プレックスフォーマットで解析した。データ解析をUpstate Beadviewソフトウェアを用いて実施した。データをPrism v5(GraphPad)を用いて%対照(DMSO)としてグラフ化した。まず、潜在的な薬物組合せ相乗作用を、曲線の直線部分に沿うグラフ化したデータの目視検査によって確認した。相乗作用を確認した後、グラフ化したデータをCompusyn Program(Combosyn社)に入力した(表3)。このプログラムは、各データ点についての組合せ指標(CI)を濃度曲線に沿って算出するものである。
高いサイトカインレベルを有するドナーに由来する抗CD3 mAb刺激T細胞において、化合物AとCsA又はETCのいずれかとの組合せ効果は、IFN-γ(図3A)、IL-13(図7A)、IP-10(図8A)、MIP-1α(図9A)、MIP-1β(図10A)、及びTNF-α(図11A)産生を、試験濃度の1つの最小値で相乗的に阻害した(表4)。前述のサイトカインについての化合物AとMTXの組合せ阻害効果は、判定不能(ND)であったINF-γを除いて、非相加的であった(表4)。相乗的阻害は、IL-10産生についても、化合物AとCsA又はMTXの組合せで、試験濃度の1つで観察されたが、化合物A/ETCの組合せについてはNDであった(図6及び表4)。最大試験濃度(1600ng/ml)で、化合物A/MTXの組合せは、IL-2産生を相乗的に阻害した;しかしながら、ETC又はCsAと組み合わせた化合物Aは、IL-2産生の阻害について非相加的であった。特に、化合物A/CsAの組合せは、実際には拮抗的であった(図4A及び表4)。IL-4産生の阻害は、化合物AとETC又はMTXの組合せに応答して非相加的であったが、化合物A/CsAの組合せについては相加的であった(図5A及び表4)。
低レベルドナー(n=5)由来の抗CD3 mAb刺激T細胞において、化合物AとCsAとの組合せ効果は、IFN-γ(図12A)、IL-4(図14A)、IL-10(図15A)、IL-13(図16A)、IP-10(図17A)、MIP-1α(図18A)、MIP-1β(図19A)、及びTNF-α(図20A)産生を、試験濃度の1つの最小値で相乗的に阻害し、IL-2(図13A)産生の阻害について非相加的であった(表5)。ETCと組み合わせた化合物Aもまた、IL-4(図14A)、IL-10(図15A)、IL-13(図16A)、IP-10(図17A)、及びMIP-1α(図18A)産生を、試験濃度の1つの最小値で相乗的に阻害し、IFN-γ(図12A)、IL-2(図13A)、MIP-1β(図19A)、及びTNF-α(図20A)産生の阻害について非相加的であった(表5)。化合物A/MTXの組合せは、プロファイリングされた全てのサイトカインの阻害について非相加的であった(表5)。
SEBで処理したPBMC試料(n=6)において、CsAと組み合わせた化合物A又は化合物Bは、IL-10(図21A及びB)、IP-10(図22A及びB)、MIP-1α(図23A及びB)、MIP-1β(図24A及びB)、並びにTNF-α(図25A及びB)産生を、少なくとも試験濃度の1つについて相乗的に阻害した(表6)。また、ETCと組み合わせた化合物A又は化合物Bは、少なくとも1つの試験濃度について、IL-10(図21A及びB)、IP-10(図22A及びB)、並びにMIP-1α(図23A及びB)産生を相乗的に阻害し、MIP-1β(図24A及びB)並びにTNF-α(図25A及びB)産生の阻害について非相加的効果を示した(表6)。化合物A/MTXの組合せは、本アッセイでプロファイリングされたサイトカインの全てについて非相加的阻害を示した;しかしながら、化合物B/MTXの組合せは、400ng/mlの濃度で阻害的相乗作用を示したTNF-α産生を除き、プロファイリングされたサイトカインの全てについて非相加的阻害を示した(図25B及び表6)。
T細胞調節性サイトカインIL-7は、軟骨細胞及び滑膜細胞によって産生され、関節炎などの炎症性関節疾患、及び骨の損傷において役割を果たす。Long, D.の文献、Arthritis Res Ther., 2008, 10(1): R23。特に、IL-7のメッセンジャーリボ核酸(mRNA)及びタンパク質のレベルは、脊椎関節炎及び関節リウマチ(RA)患者の滑液で増大した。Rihl, Mらの文献、Arthritis Rheum., 2008, 58(11): 3430-3435。IL-1、IL-6、及びIL-6受容体(IL-6R)で刺激した正常初代ヒト軟骨細胞において、化合物A(0.1〜10μM)は、IL-7遺伝子発現を用量依存的な様式で相乗的に阻害した。このアッセイにおいて、化合物Aは、それらのそれぞれの最大血漿濃度(Cmax-MTX=400及びETC=1600ng/ml)を包含する用量範囲内のメトトレキサート及びエタネルセプトよりも効果的なIL-7遺伝子発現の阻害剤であった。刺激した初代ヒト正常軟骨細胞において、化合物Aは、滑膜組織のバイオマーカーである、細胞間接着分子1(ICAM-1)の発現及びα-v-β-3(αvβ3)インテグリン発現を阻害した。同様に、IL-1、IL-6、及びIL-6Rで刺激した関節リウマチ滑膜線維芽細胞において、化合物A(0.1〜10μM)は、IL-7遺伝子発現を用量依存的な様式で相乗的に阻害したが、MTX及びETCには顕著な効果がなかった。
IL-7遺伝子発現アッセイ: IL-7産生に対するエタネルセプト、メトトレキサート、及びプレドニゾンと組み合わせた化合物Aの効果を関節リウマチ患者由来の滑膜線維芽細胞で試験した。Asterand社(Detroit, MI)から購入した正常初代ヒト軟骨細胞及び関節リウマチ滑膜線維芽細胞を解凍してT-75フラスコに入れ、コンフルエンシーに達するように2〜3週間培養した。培地は、20%高品質非熱非働化FBS-DMEM/F-12(Invitrogen 11330-032)+1%pen/strep及び1%L-グルタミンであった。細胞(1.5〜2.0×105細胞)を2mlの完全培地を含む6ウェルプレートにプレーティングした。90%コンフルエンシーに達した後(通常、プレーティングして1〜2日後)、完全培地を2mlの無血清培地と交換することによって、細胞を20時間血清飢餓状態にした。細胞を試験化合物で37℃で1時間処理した(0.25%最終DMSO濃度)。薬物処理の後、細胞を、刺激性サイトカインのIL-1β(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、及びIL-6R(20ng/ml)とともに、37℃で18時間インキュベートした。その後、細胞を冷PBSで洗浄した。600μlのRLT溶解バッファー(Qiagen RNAEasyキット cat# 74104)を添加し、細胞をQiashredder(Qiagen cat# 23800)に通し、その後、製造業者の指示(Qiagen RNAEasyキット)に従ってRNAを単離することによって、リボ核酸(RNA)を単離した。精製されたRNAを、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RTPCR)解析用に、サーマルサイクラーでcDNAに逆転写した。インターロイキン-7遺伝子発現アッセイを、7500リアルタイムPCRシステムを用いて実施した。GAPDH遺伝子発現アッセイ対照を各試料について実行し、正規化対照として使用した。各遺伝子について、各実験内の試料を0.25%DMSO処理に対して正規化した。
ヒト骨髄細胞を、化合物Aで、及び10nMデキサメタゾンと10nMビタミンDで処理して、細胞を破骨細胞に分化させた。新鮮な培地及び化合物Aを3日毎に添加した。7日目で上清を収集し、接着細胞を単離して、RNAを得た。7日目の細胞をTRAP5で染色し、破骨細胞の数を計数した。
Claims (9)
- 前記第一の活性剤の治療的有効量が、1日に約10mg〜約200mgである、請求項1記載の使用。
- 前記活性剤の1つ又は複数が、経口投与される、請求項1記載の使用。
- 前記第一の活性剤が、錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与される、請求項3記載の使用。
- 前記活性剤の1つ又は複数が、局所投与される、請求項1記載の使用。
- 前記局所投与が、ローション剤又は液剤の形態である、請求項5記載の使用。
- 前記第一の活性剤の治療的有効量が、1日に患者の体重1kg当たり約0.01mg〜約100mgである、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用。
- 前記第一の活性剤の治療的有効量が、1日に10、20、30、50及び100mgからなる量から選択される、請求項2記載の使用。
- 前記第一の活性剤が、1日に2回投与される、請求項8記載の使用。
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