CN103635188B

CN103635188B - 使用pde4抑制剂用于治疗和控制自身免疫性疾病和炎性疾病的方法和组合物

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Publication number: CN103635188B
Application number: CN201280032656.0A
Authority: CN
Inventors: 彼得·谢弗; 阿尼塔·甘地; 洛里·卡波尼
Original assignee: Celgene Corp
Current assignee: Amgen Europe GmbH
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2032-04-27
Also published as: IL229079A0; US9272035B2; MX367335B; NZ616875A; MX2013012472A; US20120276087A1; AU2012249536B2; KR20140038434A; CN103635188A; AU2012249536A1; JP2014516942A; CA2834355A1; ES2661583T3; WO2012149251A1; EP2701701B1; ZA201307918B; EP2701701A1; JP6022548B2; KR101889757B1; IL229079A

Abstract

本发明公开了通过给予与其它治疗剂组合的磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂以治疗、预防或控制自身免疫和炎性疾病和病症的方法，所述疾病和病症包括但不限于脊椎炎、幼年型类风湿关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和类风湿性关节炎。本发明还公开了适用于所述方法的药物组合物、剂型和试剂盒。

Description

使用PDE4抑制剂用于治疗和控制自身免疫性疾病和炎性疾病的方法和组合物

本申请要求2011年4月28日提交的美国临时专利申请号61/480,263的优先权，所述申请的整体通过引用结合到本文中。

1.领域

本文提供通过给予与其它治疗剂组合的磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂治疗、预防或控制自身免疫性疾病和炎性疾病和病症的方法，所述疾病和病症包括但不限于脊椎炎、幼年型类风湿关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和类风湿性关节炎。具体地说，本文提供使用与环孢素A或其它calnineurin抑制剂、依那西普或其它TNF抑制剂或者甲氨蝶呤或其它抗代谢药组合的(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺和/或使用与环孢素A、依那西普或甲氨蝶呤或类似药物组合的(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺，治疗、预防或控制关节炎、银屑病、银屑病性关节炎和类风湿性关节炎的方法。

2.背景

炎症在宿主防御和免役介导性疾病的进程中起重要作用。炎症反应通过一系列复杂事件对损伤(例如创伤、缺血和杂质粒子)和感染(例如细菌或病毒感染)起反应而被启动，所述事件包括化学介质(例如细胞因子和前列腺素类)和炎性细胞(例如白细胞)。炎症反应的特征在于血流量增加、毛细管渗透性提高和吞噬细胞大量涌入。这些事件导致损伤或感染部位肿胀、发红、发热(变化的热形式)和脓形成。

细胞因子和前列腺素类控制炎症反应，并以有序的自限性级联释放到血液或受累组织中。细胞因子和前列腺素类的这种释放增加血液流向损伤或感染部位，并可导致发红和发热。这些化学物质中的一些引起液体渗入组织，导致肿胀。这种保护性过程可刺激神经并引起疼痛。这些改变当在有关部位发生持续有限的时间时，对机体产生益处。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由单核吞噬细胞在响应免疫刺激物时释放的细胞因子。TNF-α能够促进大多数的细胞过程，例如分化、募集、增殖和蛋白水解性降解。在低水平下，TNF-α提供针对感染因素、肿瘤和组织损伤的保护。但是TNF-α也在许多疾病中起作用。当给予哺乳动物或人时，TNF-α引起或加重炎症、发热、心血管作用、出血、凝血和类似于急性感染和休克状态期间所见的急性期反应。TNF-α产生提高或上调涉及多种疾病和医学病况，例如癌症，例如实体瘤和血源性肿瘤；心脏病，例如充血性心力衰竭；以及病毒性、遗传性、炎性、变应性和自身免疫性疾病。

环腺苷3',5'-一磷酸(cAMP)也在许多疾病和病况中起作用，例如但不限于哮喘和炎症和其它病况(Lowe和Cheng,Drugs of the Future,17(9)，799-807，1992)。已经表明，炎性白细胞中cAMP的升高抑制其活化和炎症介质(包括TNF-α和NF-κB)的随后释放。cAMP水平提高还导致气道平滑肌松弛。

一般认为cAMP失活的主要细胞机制是cAMP被称为环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的同工酶家族分解(Beavo和Reitsnyder，Trends in Pharm.，11，150-155，1990)。有11个已知的PDE家族。例如，PDE IV型的抑制被公认为在抑制炎症介质释放和气道平滑肌松弛两者中特别有效(Verghese等,Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,272(3)，1313-1320，1995)。因此，明确抑制PDE4的化合物，可以最小的有害副作用抑制炎症并有助于气道平滑肌松弛，例如心血管或抗血小板作用。目前所用的PDE4抑制剂在可接受的剂量下缺乏选择性作用。

炎性疾病例如关节炎、相关关节炎病况(例如骨关节炎、类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)、炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、脓毒症、银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和慢性阻塞性肺病、慢性炎症性肺病也是普遍和成问题的疾病。TNF-α产生提高或不受调节在炎症反应中起主要作用，在炎性疾病动物模型中给予其拮抗剂阻滞慢性和急性反应。

关节炎是全身性自身免疫性疾病，可能涉及参与机体关节损害的一类病况。有超过100种不同形式的关节炎。最普遍的形式是骨关节炎(退行性关节病)，其它关节炎形式为类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和相关自身免疫性疾病例如狼疮和痛风。类风湿性关节炎的特征是慢性关节炎症。滑膜组织和滑液两者被导致细胞因子产生的炎性细胞侵入。浸润关节的T细胞和单核细胞显示1型和2型免疫应答标志物的活化增加。

银屑病是发生在皮肤上的慢性全身性自身免疫性疾病。有5种类型的银屑病：斑块状银屑病、银屑病滴状银屑病、皮褶银屑病、脓疱性银屑病和红皮性银屑病。最常见的形式斑块状银屑病，通常观察到出现在表皮最上面第一层的红白色鳞屑斑。但是，一些患者没有皮肤病症状。在斑块状银屑病中，皮肤在这些部位上快速积累，这使皮肤呈现银白色外观。斑块通常出现在肘和膝的皮肤上，但可累及任何部位，包括头皮、手掌和足底及生殖器。与湿疹形成对比，银屑病更可能发生在关节外侧。该病症是慢性复发性病况，其严重程度从少量局部斑块到全身覆盖而变化。指甲和趾甲常常受累(银屑病性甲营养不良)，并可观察到孤立性症状。银屑病还可引起称为银屑病性关节炎的关节炎症。在银屑病中，一种假设是T细胞变得有活性，迁移至真皮，并引发细胞因子(特别是TNF-α)释放，这引起炎症和角质形成细胞快速增殖。

银屑病性关节炎是累及皮肤、关节、肌腱、韧带和筋膜附着部位的慢性炎症性关节病况。Gladman，Current Opinion in Rheumatology，“Current concepts in psoriaticarthritis(银屑病性关节炎中的现代观念),”2002，14:361-366和Ruddy等，Rheumatology，第2卷，第71章，第1071页，第6版，2001。银屑病性关节炎通常与银屑病有关。出处同上。约7%的银屑病患者发生银屑病性关节炎。The Merck Manual，448(第17版，1999)。

银屑病性关节炎可以多种临床形式出现。有5种普通形式的银屑病性关节炎：远端指/趾节间关节关节炎、破坏性关节炎、难与类风湿性关节炎区别的对称性多关节炎、不对称性少关节炎(oligoarthritis)和脊椎关节病。Ruddy等，第1073页。在60-80%的患者中，银屑病似乎先于银屑病性关节炎的发生。关节炎和银屑病偶尔似乎同时发生。关节病可先于皮疹之前发生。

银屑病性关节炎的症状包括额外骨形成、关节僵硬、指趾炎、附着点病变、肌腱炎和脊椎炎。Gladman，第362页。大多数患者具有典型银屑病形式的皮肤病变。Ruddy等，第1075页。鳞屑性红斑、滴状病变、脓湖和红皮病是可见于银屑病性关节炎患者的银屑病性皮肤病变。甲病变、包括凹陷、博氏线、白甲病、甲剥离、油斑、甲床角化过度、裂片形出血、有斑点弧影(spotted lunulae)和开裂是银屑病性关节炎发生明显有关的临床特征。Ruddy等，第1076页。银屑病性关节炎的眼部症状包括结膜炎、虹膜炎、巩膜外层炎、干燥性角膜结膜炎和主动脉瓣关闭不全。

虽然银屑病性关节炎的确切病因未知，但是遗传、环境、免疫和血管因素是造成易染病体质的原因之一。Ruddy等，第1071-72页和Gladman，第363页。与普通人群相比，该疾病更可能发生在受疾病侵袭的一级亲属中。Ruddy等，第1071页。人口研究表明，关系到多种人白细胞抗原(HLA)。British Society for Rheumatology，Rheumatology，2001；40:243以及Gladman，第362页。大量证据表明T细胞介导的过程驱动银屑病性关节炎的病理生理学。Ruddy等，第1071和1077页以及Gladman，第363页。活化T细胞可促使存在于滑液中的细胞因子的产生增加。Th1细胞因子(例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1-β和IL-10)在银屑病性关节炎中比在类风湿性关节炎更普遍，这就表明两种疾病可能由不同的机制引起。Ruddy等，第1071页。单核细胞也在银屑病性关节炎中起作用，并负责基质金属蛋白酶的产生，该酶可介导银屑病性关节炎患者关节中的破坏性变化。Gladman，第364页。

在国际上，银屑病性关节炎的发病率为1-40%。银屑病性关节炎通常发生在生命的第40-60年间，但也可发生在几乎所有年龄。男性和女性均等受累，但男性优势发生在脊椎炎形式中，而女性优势发生在类风湿性形式中。Ruddy等，第1077页。

存在对用于治疗、预防和控制银屑病性关节炎、特别是对常规治疗不应的患者的安全有效方法的重大需要。另外，存在在治疗这类疾病同时降低或避免与常规疗法有关的毒性和/或副作用的需要。

因此，可阻断活性或抑制PDE4和某些细胞因子(包括TNF-α)产生的化合物和组合物，可能是有益的治疗剂。已证实许多小分子抑制剂治疗或预防涉及PDE4或TNF-α的炎性疾病的能力(有关综述见Lowe，1998Exp.Opin.Ther.Patents8:1309-1332)。这类分子的一种是描述于美国专利号6,020,358、6,962,940、7,208,526和7,659,302及美国专利申请号2008/0234359(其全部通过引用以其整体结合到本文中)的取代的苯乙基砜类。例如，Apremilast是一种新的口服多能免疫调节剂，其特异性抑制PDE4，抑制人类风湿滑膜细胞自发产生TNF-α并改善实验性关节炎。(McCann等,Arthritis Res.Ther.2010，12(3):R107)。另外，依那西普()是有用的TNF-α抑制剂。

炎症反应中体液和细胞免疫成分微妙匀称的相互作用使得能够消除有害因子并引发受损组织修复。当这种微妙平衡的相互作用遭破坏时，炎症反应可导致对正常组织相当大的损害，并且可能引起比开始反应的最初损伤更大的损害。在这些不受控制的炎症反应的情况下，需要临床介入以防止组织损伤和器官功能障碍。银屑病、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、克罗恩病、哮喘、变态反应或炎性肠病等疾病的特征是慢性炎症。

炎性病症的现有治疗包括对症施药和免疫抑制剂以控制症状。例如非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、布洛芬、非诺洛芬、奈普生、托美丁、舒林酸、甲氯芬那酸钠、吡罗昔康、氟比洛芬、双氯芬酸、奥沙普秦、萘丁美酮、依托度酸和酮洛芬具有止痛和抗炎作用。然而，NSAID被认为不能够改变疾病的进展。(Tierney等(主编)，Current MedicalDiagnosis&Treatment，第37版，Appleton&Lange(1998)，第793页)。此外，NSAID常常引起胃肠副作用，引起穿孔或加重炎性肠病而累及下肠道，产生肾毒性，并延长出血时间。皮质甾类是另一类常用于控制炎症性症状的药物。皮质甾类，像NSAID一样，并不改变疾病的自然进展，因此，当药物中断时，活动性疾病的临床表现重新出现。由长期皮质甾类疗法引起的不利反应的严重问题(例如骨质疏松症、感染风险增加、食欲增加、高血压、水肿、消化性溃疡、精神病)极大地限制了其长期使用。

低剂量的免疫抑制剂(例如细胞毒性剂)可用于治疗炎性病症。例如，银屑病和关节炎的一些治疗基于改善病情抗风湿药(DMARD，例如环孢素A和甲氨蝶呤)、抗炎药(TNF-α抑制剂例如依那西普)和镇痛药。

持续不断地寻求针对炎症性和自身免疫性病症的新疗法。具体地说，持续不断地寻求减少给予目前所用药剂的剂量和/或频率或者能够使目前所用治疗更有效的任何新方法。虽然在白血病和皮肤癌模型中已经有PDE4抑制剂和皮质甾类的组合的报道，但是PDE4抑制剂与TNF-α抑制剂、钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂或抗代谢药组合用于炎性疾病的治疗尚未被使用。参见例如Dong，H.等,Biochem Pharmacol.，2010，79(3)：321-329；Kowalczyk P.等,Eur J Pharmacol.，2009，610(1-3)：29-36；Meyers，J.A.等,Clin CancerRes.，2007，13(16)：4920-4927。

3.概述

本文提供使用与第二活性剂组合的PDE4抑制剂或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、包合物、前药或多晶型物治疗疾病和病症的方法。在某些实施方案中，一种或多种第二活性剂是TNF-α抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂或抗代谢药。在某些实施方案中，疾病或病症包括但不限于炎症性疾病或自身免疫性疾病，例如脊椎炎(例如强直性脊柱炎)、幼年型类风湿关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、狼疮、痛风、贝切特病(Behcet’s disease)和骨关节炎。

在一个实施方案中，提供治疗银屑病或关节炎的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物和治疗有效量的一种或多种选自以下的其它活性剂：抗炎药(例如NSAID)、改善病情抗风湿药(DMARD)例如环孢素A或甲氨蝶呤、麦考酚酸酯、生物制剂(例如依那西普)、TNF-α抑制剂(例如依那西普)、Cox-2抑制剂和镇痛药。

在另一个实施方案中，提供治疗银屑病或关节炎的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物和治疗有效量的一种或多种选自以下的其它活性剂：抗炎药(例如NSAID)、改善病情抗风湿药(DMARD)例如环孢素A或甲氨蝶呤、麦考酚酸酯、生物制剂(例如依那西普)、TNF-α抑制剂(例如依那西普)、Cox-2抑制剂和镇痛药。

在某些实施方案中，关节炎的形式选自类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、狼疮和痛风。

在一个实施方案中，第一活性剂是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物，其它活性剂是环孢素A。

在一个实施方案中，第一活性剂是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物，其它活性剂是甲氨蝶呤。

在一个实施方案中，第一活性剂是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物，其它活性剂是依那西普。

在一个实施方案中，第一活性剂是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物，其它活性剂是环孢素A。

在一个实施方案中，第一活性剂是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物，其它活性剂是甲氨蝶呤。

在一个实施方案中，第一活性剂是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺或其药学上可接受的前药、多晶型物、盐或溶剂合物，其它活性剂是依那西普。

4.附图简述

图1显示(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(化合物A)和地塞米松对小鼠后爪厚度的作用。

图2显示(+)-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(化合物A)和依那西普对小鼠后爪厚度的作用。

图3显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时干扰素-β的产生。

图4显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-2的产生。

图5显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-4的产生。

图6显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-10的产生。

图7显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-13的产生。

图8显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时干扰素诱导蛋白10的产生。

图9显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时巨噬细胞炎性蛋白-1α的产生。

图10显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时巨噬细胞炎性蛋白-1β的产生。

图11显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时TNF-α的产生。

图12显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时干扰素-β的产生。

图13显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-2的产生。

图14显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素4的产生。

图15显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-10的产生。

图16显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-13的产生。

图17显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时干扰素诱导蛋白10的产生。

图18显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时巨噬细胞炎性蛋白-1α的产生。

图19显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时巨噬细胞炎性蛋白-1β的产生。

图20显示在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时TNF-α的产生。

图21显示在葡萄球菌肠毒素B处理的外周血(perpherial blood)单核细胞中在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时白介素-10的产生。

图22显示在葡萄球菌肠毒素B处理的外周血单核细胞中在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时干扰素诱导蛋白-10的产生。

图23显示在葡萄球菌肠毒素B处理的外周血单核细胞中在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时巨噬细胞炎性蛋白-1α的产生。

图24显示在葡萄球菌肠毒素B处理的外周血单核细胞中在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时巨噬细胞炎性蛋白-1β的产生。

图25显示在葡萄球菌肠毒素B处理的外周血单核细胞中在响应与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的PDE4抑制剂时TNF-α的产生。

图26显示在响应仅化合物A和与甲氨蝶呤组合的化合物A时IL-7的产生。

图27显示在响应仅化合物A和与依那西普组合的化合物A时IL-7的产生。

图28显示在响应仅化合物A和与泼尼松组合的化合物A时IL-7的产生。

5.详述

5.1.包含用于炎症的PDE4抑制剂的组合疗法

本文提供治疗、控制或预防银屑病和/或关节炎，包括但不限于银屑病性关节炎和类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给予需要这类治疗、控制或预防的患者治疗或预防有效量的与第二活性剂组合的化合物A，其是2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(亦称为Apremilast)的(+)对映异构体或其药学上可接受的前药、代谢物、多晶型物、盐、溶剂合物或包合物。虽不受理论限制，但认为2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮的(+)对映异构体是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺，其具有下列结构：

化合物A可按照公开于以下专利的方法制备：美国专利号6,962,940，标题为“(+)-2-[1-(3-Ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-methylsulfonylethyl]-4-acetylaminoisoindoline-1,3-dione:Methods Of Using And Compositions Thereof((+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮：使用方法及其组合物),”或美国专利申请号2010/0168475，其每一份均通过引用结合到本文中。通常，可采用描述于美国专利号6,020,358(其通过引用结合到本文中)的方法容易地制备外消旋的2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮。可通过本领域已知技术自外消旋化合物中分离相应的(+)对映异构体。实例包括但不限于手性盐的形成和手性或高效液相色谱法“HPLC”的使用和手性盐的形成和结晶。参见例如Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,NewYork,1981)；Wilen,S.H.等,Tetrahedron33:2725(1977)；Eliel,E.L.,Stereochemistryof Carbon Compounds(McGraw Hill,NY,1962)；以及Wilen,S.H.,Tables of ResolvingAgents and Optical Resolutions第268页(E.L.Eliel主编,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN,1972)。

在具体方法中，2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮的(+)对映异构体自3-乙酰氨基邻苯二甲酸酐和(S)-2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺的手性氨基酸盐合成。(S)-2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺的手性氨基酸盐包括但不限于与以下氨基酸的L异构体形成的盐：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸和N-乙酰基-L-亮氨酸。一种具体的手性氨基酸盐是(S)-2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺N-乙酰基-L-亮氨酸盐，其自甲醇中的2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺和N-乙酰基-L-亮氨酸解析。

本文还提供治疗、控制或预防银屑病和关节炎，包括但不限于银屑病性关节炎和类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给予需要这类治疗、控制或预防的患者治疗或预防有效量的与第二活性剂组合的化合物B，化合物B是指对映异构体纯的环丙烷甲酸{2-[(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基-苯基)-2-甲磺酰基-乙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基}-酰胺。虽不受理论限制，但化合物B被认为是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺，其具有下列结构：

在一些实施方案中，PDE4抑制剂(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺(“化合物A”)或(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺(“化合物B”)的任一种与选自以下的第二活性剂组合用于治疗涉及T细胞、软骨细胞和滑膜细胞的炎症性疾病和免疫性疾病：抗TNF生物制剂例如依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗或赛妥珠单抗(certolizumab)；钙调磷酸酶抑制剂例如环孢素A、他克莫司和vaclosporin；皮质甾类例如泼尼松、甲基泼尼松、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、氟氢可的松、去氧皮质酮和醛固酮和/或抗代谢药例如甲氨蝶呤。在某些实施方案中，炎症性疾病或免疫性疾病选自类风湿性关节炎、脊柱关节炎(包括银屑病性关节炎和强直性脊柱炎)、骨关节炎、银屑病、特应性皮炎、贝切特病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肤红斑狼疮和系统性红斑狼疮。在一个实施方案中，疾病是类风湿性关节炎或银屑病。

在一些实施方案中，PDE4抑制剂(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺(“化合物A”)或(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺(“化合物B”)的任一种与环孢素A(“CsA”)、依那西普(“ETC”或“ETN”)或甲氨蝶呤(“MTX”)的至少一种的组合提供用于抑制类风湿性关节炎和银屑病相关细胞因子的协同效应。如本文所提供的，在人抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激的T细胞和葡萄球菌肠毒素B(SEB)处理的PBMC中，对以下测定结果进行了评价，即与由CsA、MTX或ETC单独产生的细胞因子相比，加入化合物A或化合物B的任一种是否抑制细胞因子产生。经概况分析的细胞因子包括干扰素-β(IFN-γ)、白介素(IL)-2、IL-4、IL-10、IL-13、干扰素诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)和巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。

5.2.定义

本文所用术语“化合物A”是指2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰基异二氢吲哚-1,3-二酮(亦称为Apremilast)的对映异构体纯的形式，且当溶于甲醇时使平面偏振光以(+)方向旋转。虽不受理论限制，但化合物A被认为是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺，其具有下列结构：

本文所用术语“化合物B”是指对映异构体纯的环丙烷甲酸{2-[(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基-苯基)-2-甲磺酰基-乙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基}-酰胺。虽不受理论限制，但化合物B被认为是(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺，其具有下列结构：

本文使用的且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括但不限于自药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和碱及有机酸和碱)制备的盐。合适的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制备的金属盐或由赖氨酸、N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)和普鲁卡因制备的有机盐。合适的无毒酸包括但不限于无机和有机酸，例如乙酸、藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸。具体的无毒酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和甲磺酸。因此具体的盐的实例包括盐酸盐和甲磺酸盐。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“水合物”意指另包括通过非共价分子间力结合的化学计算量的或非化学计算量的水的本文提供的化合物或其盐。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“溶剂合物”意指一个或多个溶剂分子与本文提供的化合物缔合所形成的溶剂合物。术语“溶剂合物”包括水合物(例如一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等)。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“多晶型物”意指本文提供的化合物或其络合物的固体晶型。所述化合物的不同多晶型物可显示不同的物理、化学和/或光谱性质。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“前药”意指可水解、氧化或另在生理条件下(体外或体内)起反应的化合物的衍生物以提供所述化合物。前药的实例包括但不限于包括可生物水解的部分的(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮的衍生物和代谢物，可生物水解的部分例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。前药通常可采用众所周知的方法制备，例如1Burger’sMedicinal Chemistry and Drug Discovery,172-178,949-982(Manfred E.Wolff主编,第5版,1995)所述方法。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“对映异构体”、“同分异构体”或“立体异构体”包括本文提供的所有对映异构体纯的/立体异构体纯的和对映异构体富集的/立体异构体富集的化合物。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“立体异构体纯的”或“对映异构体纯的”意指化合物包含一种立体异构体且基本不含其相反的立体异构体或对映异构体。例如，当化合物含有大于或等于80%、90%、95%、98%或99%的一种立体异构体和20%、10%、5%、2%、1%或更少的相反的立体异构体时，该化合物是立体异构体纯的或对映异构体纯的。术语立体异构体纯的或对映异构体纯的包括“基本不含其(-)对映异构体”。

本文所用术语“不良反应”包括但不限于胃肠、肾和肝毒性、白细胞减少例如血小板减少所致出血时间延长和妊娠期延长、恶心、呕吐、嗜眠、虚弱、眩晕、致畸性、锥体外系症状、静坐不能、心脏毒性包括心血管失调、炎症、男性性功能障碍和血清肝酶水平升高。术语“胃肠毒性”包括但不限于胃肠溃疡和糜烂。术语“肾毒性”包括但不限于诸如乳头坏死和慢性间质性肾炎等病况。

本文所用术语“患者”是指哺乳动物，特别是人。在一些实施方案中，患者为女性。在其它实施方案中，患者为男性。在其它实施方案中，患者为儿童。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“医治”、“治疗”和“处理”预期在患者患有特定的疾病或病症期间发生的作用，其减轻疾病或病症的严重程度或症状，或者延迟或减缓疾病或病症的进展或症状。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“预防”、“防治”和“防止”预期在患者开始罹患特定疾病或病症之前的作用，其抑制或减轻疾病或病症的严重程度或症状。

本文使用的且除非另有说明，否则术语“管理”、“管治”和“控制”包括预防已患有疾病或病症的患者的特定疾病或病症复发，和/或延长患有疾病或病症的患者保持缓解的时间。该术语包括调节疾病或病症的阈值、发展和/或持续时间，或改变患者对疾病或病症起反应的方式。

5.3.治疗方法

本文提供治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的方法，所述方法包括给予需要这类治疗、控制或预防的患者有效量的化合物A或化合物B或其药学上可接受的前药、代谢物、多晶型物、盐、溶剂合物或包合物。在一些实施方案中，使用化合物A或化合物B的盐或溶剂合物。在其它实施方案中，使用化合物A或化合物B的游离碱。

本文提供的方法包括在银屑病性关节炎和/或类风湿性关节炎的症状开始之后，给予基本不含其(-)对映异构体的化合物A或化合物B的任一种或其药学上可接受的前药、代谢物、多晶型物、盐、溶剂合物或包合物。

本文提供的方法还包括在症状开始之前通过给予化合物A或化合物B或其药学上可接受的前药、代谢物、多晶型物、盐、溶剂合物或包合物抑制或防止银屑病性关节炎和/或类风湿性关节炎的症状以及克服疾病本身。在一些实施方案中，通过本文提供的方法治疗的患者有银屑病或关节炎史。在某些实施方案中，方法包括将化合物A或化合物B的任一种或其药学上可接受的前药、代谢物、多晶型物、盐、溶剂合物或包合物给予患有或可能患有银屑病和/或关节炎(包括但不限于银屑病性关节炎和/或类风湿性关节炎)的患者(例如人)。

PDE4抑制剂(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺和(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺可用于治疗、控制或预防银屑病和/或关节炎，包括但不限于类风湿性关节炎和银屑病性关节炎。然而，在关节炎的急性或慢性控制中，特定活性成分的预防或治疗剂量的幅度将随疾病或病况的性质和严重程度及给予活性成分的途径而变化。剂量及或许剂量频率也将随个别患者的年龄、体重和反应而变化。合适的给药方案可由本领域技术人员在适当考虑这类因素的情况下容易地选择。

一般而言，为本文所述病况推荐的每日剂量范围在约0.1mg-约1,000mg/天的范围内，作为单独的一天一次剂量或作为分剂量在一天内给予。更具体地说，一日量可每日以相同的分剂量给予一次、两次、三次或四次。具体地说，一日量范围可为约1mg-约500mg/天，更具体地说，介于约10mg和约200mg/天之间。具体地说，一日量可以1mg、5mg、6.25mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg或500mg剂型(Q.D.或B.I.D.)给予。在管理患者时，疗法可以较低剂量开始，或许约1mg-约25mg，如有需要，可作为单剂量或分剂量增加到约200mg-约1,000mg/天，这取决于患者的总体反应。在其它实施方案中，化合物A或化合物B的一日量为约0.01mg-约100mg/kg患者体重。在一些实施方案中，所选化合物的一日量为约1mg/kg、5mg/kg、6.25mg/kg、10mg/kg或25mg/kg。在某些实施方案中，治疗有效量的本文所提供的第一活性剂为约1、5或25mg/kg患者体重/天，治疗有效量的本文所提供的其它活性剂为约1、5或6.25mg/kg患者体重/天。

5.3.1.组合疗法

如本文所提供的，(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺可与另一种药物(“第二活性剂”或“其它活性剂”)组合给予用于治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)。

在本文提供的方法中，化合物A或化合物B的任一种可与一种或多种第二活性剂组合。在一些实施方案中，本文提供用于治疗、预防和/或控制银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)的协同组合。在一些实施方案中，化合物A或化合物B的任一种还可用于减轻与某些第二活性剂有关的不良反应。或者，在一些实施方案中，某些第二活性剂可用于减轻与化合物A或化合物B的任一种有关的不良反应。

可用于本文提供的方法的与化合物A或化合物B组合的第二活性剂包括但不限于改善病情抗风湿药(DMARD例如环孢素A和甲氨蝶呤)、抗炎药例如非甾体抗炎药(NSAID)、免疫抑制剂、麦考酚酸酯、生物制剂、TNF-α抑制剂(例如依那西普)、Cox-2抑制剂和镇痛药。

第二活性剂可在化合物A或化合物B的任一种之前或之后给予或与之同时给予。

在一些实施方案中，第二活性剂可包括但不限于抗炎药例如NSAID，包括但不限于双氯芬酸(例如)、二氟尼柳(例如)、依托度酸(例如)、非诺洛芬(例如)、布洛芬(例如ADVIL、儿童用ADVIL/MOTRIN、MEDIPREN、MOTRIN、NUPRIN或PEDIACARE)、吲哚美辛(例如)、酮洛芬(例如)、酮咯酸(例如)、磷霉素氨丁三醇(例如)、甲氯芬酯(例如、萘丁美酮(例如)、奈普生(例如 DS、或)、奥沙普秦(例如、吡罗昔康(例如)、舒林酸(例如)和托美丁(例如DS或)。

在其它实施方案中，第二活性剂可包括但不限于改善病情抗风湿药(DMARD)或免疫抑制剂，例如但不限于甲氨蝶呤()、柳氮磺吡啶()和环孢菌素(或环孢素A)。

在其它实施方案中，第二活性剂可包括但不限于麦考酚酸酯()，一种广泛用于器官移植和在治疗自身免疫和炎性皮肤病症中获益的免疫抑制剂。

在其它实施方案中，第二活性剂可包括但不限于生物制剂，例如依那西普()、英利昔单抗()和阿达木单抗()。

在其它目标实施方案中，第二活性剂可包括但不限于Cox-2抑制剂，例如塞来考昔()、伐地考昔()和美洛昔康()。

在一些实施方案中，化合物A或化合物B的任一种与选自依那西普、环孢素A和甲氨蝶呤之一一起给予。

在一些实施方案中，给予化合物A和依那西普的组合导致治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的协同效应。

在一些实施方案中，给予化合物A和环孢素A的组合导致治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的协同效应。

在一些实施方案中，给予合物A和甲氨蝶呤的组合化导致治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的协同效应。

在一些实施方案中，给予化合物B和依那西普的组合导致治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的协同效应。

在一些实施方案中，给予化合物B和环孢素A的组合导致治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的协同效应。

在一些实施方案中，给予化合物B和甲氨蝶呤的组合导致治疗、控制和/或预防银屑病和/或关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎)的协同效应。

将(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺和第二活性剂(包括但不限于依那西普、环孢素A和/或甲氨蝶呤)的任一种给予患者可通过相同或不同的给药途径同时或序贯发生。应用于具体第二活性剂的具体给药途径的适合性将取决于第二活性剂本身(例如它可在进入血流前不论是口服给予还是局部给予都无分解)和待治疗的受试者。2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮的(+)对映异构体的具体给药途径是以片剂或胶囊剂的剂型口服给予。本文提供的第二活性剂或成分的具体给药途径为本领域普通技术人员所知。参见例如The Merck Manual，448(第17版，1999)。

可根据所用的具体药剂、待治疗的受试者、疾病的严重程度和病期及同时给予患者的化合物A或化合物B的任一种的量和任何其它的第二活性剂，来确定所给予的第二活性剂的量。本领域的普通技术人员可按照本领域已知的常规程序确定具体的量。开始时，可从常规用于治疗的第二活性剂的量开始，并按照上述因素调整该用量。参见例如Physician’sDesk Reference(第56版，2004)。

在某些情况下，可能需要使用本文公开的范围以外的活性成分的剂量，正如对本领域普遍技术人员而言是显然的。而且，要注意，临床医师或主治医师根据各个患者反应，将清楚如何且何时中断、调整或终止治疗。

本文所用短语“治疗有效量”、“预防有效量”和“治疗或预防有效量”包括上述剂量和剂量频率方案。不同的治疗有效量可适用于不同的疾病和病况，正如本领域普遍技术人员将容易了解的一样。同样地，足以治疗或预防这类病症但不足以引起或足以减少化合物A或化合物B的任一种的外消旋体的不良反应的量也包括在本文所述剂量和剂量频率方案内。

5.4.药物组合物和剂型

药物组合物可用于制备单独的单一单位剂型。本文提供的药物组合物和剂型可包含PDE4抑制剂(包括但不限于化合物A或化合物B或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、包合物或前药)和第二活性剂(包括但不限于本文所述的那些抗炎药)。药物组合物和剂型还可包含一种或多种载体、赋形剂或稀释剂。

本文提供的单一单位剂型适于口服、粘膜(例如经鼻、舌下、阴道、囊、直肠、包皮、眼、口腔或耳)、胃肠外(例如皮下、静脉内、推注、肌内或动脉内)、局部(例如滴眼剂或其它眼用制剂)、透皮或经皮给予患者。剂型的非限制性实例包括片剂；囊片剂；胶囊剂，例如软的弹性明胶胶囊剂；扁囊剂；糖锭；锭剂；分散剂；栓剂；散剂；气雾剂(例如鼻喷雾剂或吸入器)；凝胶剂；适于口服或粘膜给予患者的液体剂型包括混悬剂(例如水性或非水液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液剂和酏剂；适于胃肠外给予患者的液体剂型；滴眼剂或适于局部给药的其它眼用制剂以及可以复溶以提供适于胃肠外给予患者的液体剂型的无菌固体剂(例如结晶或非晶形固体剂)。

本文提供的剂型的组成、形状和类型通常可随其用途而变化。例如，比用于疾病长期治疗的剂型所包含的量相比，用于相同疾病急救治疗的剂型可含有较大量的一种或多种活性成分。同样地，与治疗相同疾病所用的口服剂型所包含的量相比，胃肠外剂型可含有较少量的一种或多种活性成分。其中本文提供的具体剂型可相互变化的这些和其它方式对本领域技术人员而言是容易明白的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing，Easton PA(2000)。

典型的药物组合物和剂型包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂为药学领域技术人员所熟知，本文提供合适赋形剂的非限制性实例。特定赋形剂是否适于掺入药物组合物或剂型中取决于本领域众所周知的各种因素，包括但不限于其中可将剂型给予患者的方式。例如，口服剂型(例如片剂)可含有不适用于胃肠外剂型的赋形剂。特定赋形剂的适合性还取决于剂型中的具体活性成分。例如，可通过一些赋形剂(例如乳糖)或当暴露于水中时，加快某些活性成分的分解。包含伯胺或肿胺的活性成分对这种加快的分解特别敏感。因此，本文提供含有少量(如有的话)乳糖其它单糖或双糖的药物组合物和剂型。本文所用术语“无乳糖”意指存在的乳糖的量(如有的话)，不足以显著提高活性成分的降解速率。

本文提供的无乳糖组合物可包含本领域众所周知的和列于例如U.S.Pharmacopeia(USP)25-NF20(2002)中的赋形剂。一般而言，无乳糖组合物包含药学上相容的和药学上可接受的量的活性成分、粘合剂/填充剂和润滑剂。具体的无乳糖剂型包含活性成分、微晶纤维素、预胶化淀粉和硬脂酸镁。

本文还提供包含活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可促使一些化合物降解。例如，加入水(例如5%)作为模拟长期保存从而确定例如制剂随时间推移的存放期或稳定性等特征的手段为药学领域广泛接受。参见例如Drug Stability:Principles&Practice,第2版,Marcel Dekker,NY,NY,1995,第379-80页。实际上，水和热加快一些化合物分解。因此，水对制剂的作用可能具有重大意义，因为在制剂的生产、处理、包装、贮存、装运和使用期间通常遇到水分和/或湿度。

可采用无水或含有低水分的成分及低水分或低湿度条件，制备本文提供的无水药物组合物和剂型。如果预期在生产、包装和/或贮存期间与水分和/或湿度实质接触，则包含乳糖和至少一种包含伯胺或肿胺的活性成分的药物组合物和剂型优选是无水的。

应如此制备和贮存无水药物组合物，使得保持其无水性质。因此，无水组合物优选使用已知防止暴露于水的材料包装，使得将其装入合适的处方试剂盒中。合适包装的非限制性实例包括密封箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、泡罩包装和小袋包装(strippack)。

本文还提供包含降低活性成分将分解的速率的一种或多种化合物的药物组合物和剂型。这类化合物，本文称为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂。像赋形剂的量和类型一样，剂型中活性成分的量和具体类型可随例如但不限于将其给予患者的途径等因素而不同。然而，本文提供的典型剂型包含量为约1-约1,000mg的(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺的任一种或其药学上可接受的盐或溶剂合物。典型剂型包含化合物A或化合物B的任一种或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其量为约1、2、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、50、100、150或200mg。在一个具体实施方案中，剂型包含化合物A或化合物B的任一种，其量为约1、5、10、15、20、25、30、50、100或200mg。

当然，抗关节炎药具体的量将取决于所用的具体药剂、待治疗或控制的关节炎的类型和本文提供的PDE4抑制剂和同时给予患者的任何其它活性剂的量。

5.4.1.口服剂型

本文提供的适于口服给约的药物组合物可作为分立剂型提供，例如但不限于片剂(例如咀嚼片剂)、囊片剂、胶囊剂和液体制剂(例如调味糖浆剂)。这类剂型含有预定量的活性成分，并可通过本领域技术人员熟知的药剂学方法制备。一般参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing，Easton PA(2000)。

本文提供的典型口服剂型按照常规药物调配技术将活性成分与至少一种赋形剂密切混合来制备。赋形剂可呈多种形式，这取决于需要给予的制剂形式。适用于口服液体剂或气雾剂剂型的赋形剂的非限制性实例包括水、二醇、油、醇、矫味剂、防腐剂和着色剂。适用于固体口服剂型(例如散剂、片剂、胶囊剂和囊片剂)的赋形剂的非限制性实例包括淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。

因为其易于给药，所以片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式，在此情况下使用固体赋形剂。如有需要，片剂可通过标准水法或非水法技术包衣。这类剂型可通过任何制药方法制备。一般而言，通过将活性成分与液体载体、细碎的固体载体或两者均匀紧密地混合，然后必要时使产品成为所需外观形状，来制备药物组合物和剂型。

例如，可通过压制或模制来制备片剂。可将自由流动形式的活性成分(例如粉末或颗粒)，任选与赋形剂混合后，在合适的机器中压制来制备压制片。可以将用惰性液体稀释剂湿润的化合物粉末的混合物在合适的机器中进行模制来制备模制片。

可用于本文提供的口服剂型的赋形剂的非限制性实例包括粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的粘合剂的非限制性实例包括玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉、明胶、天然和合成的树胶例如阿拉伯树胶、藻酸钠、藻酸、其它藻酸盐、粉状西黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如No.2208、2906、2910)、微晶纤维素及其混合物。

微晶纤维素的合适形式的非限制性实例包括以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(可获自FMC Corporation，American ViscoseDivision，Avicel Sales，Marcus Hook，PA)销售的原料及其混合物。具体的粘合剂是以AVICEL RC-581销售的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物。合适的无水或低水分赋形剂或添加剂包括AVICEL-PH-103^TM和Starch1500LM。

适用于本文公开的药物组合物和剂型的填充剂的非限制性实例包括滑石粉、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露糖醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉及其混合物。药物组合物中的粘合剂或填充剂通常以占药物组合物或剂型的约50-约99重量%存在。

崩解剂可用于本文提供的组合物以提供当暴露于水性环境时崩解的片剂。含有太多崩解剂的片剂可能在贮存中崩解，而含有太少的片剂可能在所需速率或在所需条件下不崩解。因此，应使用既不太多也不太少而无不利影响活性成分释放的足量的崩解剂以形成固体口服剂型。所用崩解剂的量根据制剂的类型而变化，并且对于本领域普通技术人员是可容易识别的。典型的药物组合物包含约0.5-约15重量%的崩解剂，优选约1-约5重量%的崩解剂。

可用于本文提供的药物组合物和剂型的崩解剂的非限制性实例包括琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、聚维酮、聚克立林钾、羟基乙酸淀粉钠、马铃薯或木薯淀粉、其它淀粉、预胶化淀粉其它淀粉、粘土、其它藻胶、其它纤维素、树胶及其混合物。

可用于本文提供的药物组合物和剂型的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。其它润滑剂包括例如syloid硅胶(AEROSIL200，由W.R.Grace Co.，Baltimore,MD制造)、合成二氧化硅的凝聚型气溶胶(由Degussa Co.，Plano,TX销售)、CAB-O-SIL(一种由Cabot Co.，Boston,MA销售的生热二氧化硅产品)及其混合物。如果以任何程度使用，则润滑剂通常以小于其药物组合物或剂型约1重量%的量使用。

在一个实施方案中，本文提供的固体口服剂型包含化合物A或化合物B的任一种、无水乳糖、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸、胶态无水二氧化大声和明胶。

5.4.2.迟释剂型

可通过本领域普通技术人员熟知的控释方法或递送装置给予活性成分。控释方法或递送装置的非限制性实例包括描述于以下美国专利号的方法和装置：3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123和4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566，所述每个专利均通过引用结合到本文中。使用例如以不同比例提供所需释放特征的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、透性膜、渗透系统、多层包衣材料、微粒、脂质体、微球或其组合，这类剂型可用来提供缓释或控释的一种或多种活性成分。可容易地选择与本文提供的活性成分一起使用的本领域普通技术人员已知的合适控释制剂，包括本文所述控释制剂。因此，在一些实施方案中，本文提供适于控释且适于口服给药的单一单位剂型，例如但不限于片剂、胶囊剂、软胶囊剂和囊片剂。

相对于其不受控制的对应物所达到的目的，所有控释药物产品都具有改进的药物疗法的共同目的。理想的是，在医学治疗中使用最优设计的控释制剂的特征是最少的药物物质被用于在最少量的时间内治愈或控制病况。控释制剂的优势包括药物活性延长、剂量频率降低和患者顺应性提高。另外，控释制剂可用来影响开始作用的时间或其它特性，例如药物的血液水平，因此可影响副(例如不良)作用的发生。

大多数控释制剂被设计成最初释放一定量的药物(活性成分)，其立即产生所需治疗作用，并且逐渐和连续地释放其它量的药物以保持随时间推移的这种治疗或预防作用的水平。为了保持药物在体内的这种恒定水平，必须以可代替被代谢和从体内分泌的药物的量的速率，从剂型中释放出药物。活性成分的控释可受以下各种条件刺激，包括但不限于pH、温度、酶、水或其它生理条件或化合物。

5.4.3.胃肠外剂型

可通过各种途径包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌内和动脉内，将胃肠外剂型给予患者。由于其给药通常绕过患者针对污染物的天然防御，因此胃肠外剂型优选为无菌的或能够在给予患者之前灭菌。胃肠外剂型的非限制性实例包括现成用于注射的溶液剂、以备溶解或悬浮于药学上可接受的注射用溶媒中的无水制品、现成用于注射的混悬剂和乳剂。

可用于提供胃肠外剂型的合适溶媒为本领域技术人员所熟知。合适溶媒的非限制性实例包括注射用水USP；水性溶媒例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸盐林格氏注射液；水混溶性溶媒例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；及非水性溶媒例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

还可将提高本文公开的一种或多种活性成分的溶解度的化合物掺入本文提供的胃肠外剂型中。例如，可使用环糊精及其衍生物以提高(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-1,3-二氧代异二氢吲哚-4-基)乙酰胺或(S)-N-(2-(1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基)-3-氧代异二氢吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺的任一种及其衍生物的溶解度。

5.4.4.局部和粘膜剂型

可将药物可局部施用于皮肤及其附器或各种粘膜上。可采用的途径包括经鼻、舌下、阴道、囊、直肠、包皮、眼、口腔或耳。已开发出许多剂型以将活性成分递送到施用部位以产生局部作用。本文提供的局部和粘膜剂型的非限制性实例包括喷雾剂、吸入器、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、撒粉剂、洗剂、搽剂、泥敷剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、滴眼剂或其它眼用制剂或本领域技术人员已知的其它形式。参见例如Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,第4版,Lea&Febiger,Philadelphia(1985)。适于治疗口腔内粘膜组织的剂型可配制成漱口剂或口用凝胶剂。

可用于提供局部和粘膜剂型的合适赋形剂(例如载体和稀释剂)和其它物质为药学领域技术人员所熟知，并取决于给定的药物组合物或剂型将施用的特定组织。典型赋形剂的非限制性实例包括水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1,3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油及其混合物以形成溶液剂、乳剂或凝胶剂，其是无毒的和药学上可接受的。

如有需要，还可将增湿剂例如闭合剂(occlusives)、湿润剂、润肤剂和蛋白质再生剂(protein rejuvenator)加入药物组合物和剂型中。这类额外成分的实例是本领域众所周知的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing，Easton PA(2000)。

闭合剂是物理性阻断角质层的水分流失的物质。闭合剂的非限制性实例包括矿脂、羊毛脂、矿物油、硅酮例如二甲硅油、氧化锌及其组合。优选闭合剂为矿脂和羊毛脂，更优5%最小浓度的选矿脂。

湿润剂是当施用于皮肤时吸收水分并且从理论上说改善角质层水化作用的物质。然而，被吸引到皮肤上的水是来自其它细胞的水，并非大气水。在这种增湿剂类型的情况下，从皮肤中的蒸发可持续，并且实际上可使干燥恶化。湿润剂的非限制性实例包括甘油、山梨糖醇、脲、α羟基酸、糖及其组合。优选湿润剂为α羟基酸，例如乙醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸和酒石酸。

润肤剂是通过用油滴填充皮肤鳞片间的空隙来平滑皮肤，并且除非大量使用否则并非是通常闭合性的物质。当与乳化剂组合时，可有助于保持角质层中的油和水。维生素E是常见的添加剂，其似乎除作为润肤剂以外没有作用。同样地，亦加入其它维生素例如A和D，但其作用是有疑问的。润肤剂的非限制性实例包括矿物油、羊毛脂、脂肪酸、胆固醇、角鲨烯、结构脂质及其组合。

蛋白质再生剂是通过补充必需的蛋白质而使皮肤恢复活力的物质。蛋白质再生剂的非限制性实例包括胶原、角蛋白、弹性蛋白及其组合。

还可调节药物组合物或剂型的pH以改进一种或多种活性成分的递送。同样地，可调节溶剂载体的极性、其离子强度或张度以改进递送。例如，也可通过封闭敷料、涂擦剂或使用二甲亚砜作为载体来提高通过皮肤的吸收。还可将化合物例如金属硬脂酸酯(例如硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸镁、硬脂酸钠、硬脂酸锂、硬脂酸钾等)加入药物组合物或剂型中以有利地改变一种或多种活性成分的亲水性或亲油性以改进递送。在这一方面，硬脂酸酯可用作制剂的脂质溶媒、乳化剂或表面活性剂和作为递送增强剂或渗透增强剂。可以使用活性成分的不同的盐、水合物或溶剂合物以进一步调节所得组合物的性质。

在某些实施方案中，本文提供的一种或两种活性剂经胃肠外、透皮、粘膜、经鼻、口腔、舌下、局部或口服给予。在某些实施方案中，第一活性剂是以片剂或胶囊剂形式口服给予。在某些实施方案中，一种或多种活性剂经局部给予(例如以洗剂或液体的剂型给予)。

5.4.5试剂盒

活性成分通常不是在同一时间或通过相同给药途径给予患者的。在一些实施方案中，本文提供当医生使用时，可以简化使适当量的活性成分给予患者的试剂盒。

典型的试剂盒包含化合物A或化合物B的单位剂型或者化合物A或化合物B的药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、包合物、多晶型物或前药和第二活性成分的单位剂型。第二活性成分的实例包括但不限于本文所列的那些活性成分，例如依那西普、甲氨蝶呤和环孢素A。

试剂盒还可包含用来给予活性成分的装置。这类装置的实例包括但不限于注射器、滴液袋、胶布和吸入器。

试剂盒还可包含可用来给予一种或多种活性成分的药学上可接受的溶媒。例如，如果活性成分以必需复溶以用于胃肠外给药的固体形式提供，则试剂盒可包含合适溶媒的密封容器，可将活性成分溶于所述溶媒中以形成适于胃肠外给予的无粒子无菌溶液。药学上可接受的溶媒的实例包括但不限于：注射用水USP；水性溶媒例如但不限于氯化钠注射液、林格式注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液及乳酸盐林格式注射液；水混溶性溶媒例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；及非水性溶媒例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

6.实施例

通过下列非限制性实施例说明本文提供的一些实施方案。实施例不应解释为限制其范围。

6.1.实施例1：2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮的合成

将1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-甲基磺酰基乙胺(1.0g，3.7mmol)和3-乙酰氨基邻苯二甲酸酐(751mg，3.66mmol)在乙酸(20mL)中的搅拌溶液在回流下加热15小时。真空除去溶剂，得到油状物。对所得油状物进行色谱法，得到产物，为黄色固体(1.0g，收率59%)：mp，144℃；¹H NMR(CDCl₃)δ1.47(t,J=7.0Hz,3H,CH₃),2.26(s,3H,CH₃),2.88(s,3H,CH₃),3.75(dd,J=4.4,14.3Hz,1H,CHH),3.85(s,3H,CH3),4.11(q,J=7Hz,2H,CH2),5.87(dd,J=4.3,10.5Hz,1H,NCH),6.82-6.86(m,1H,Ar),7.09-7.11(m,2H,Ar),7.47(d,J=7Hz,1H.,Ar),7.64(t,J=8Hz,1H,Ar),8.74(d,J=8Hz,1H,Ar),9.49(br s,1H,NH)；¹³C NMR(CDCl₃)δ14.61,24.85,41.54,48.44,54.34,55.85,64.43,111.37,112.34,115.04,118.11,120.21,124.85,129.17,130.96,136.01,137.52,148.54,149.65,167.38,169.09,169.40；C₂₂H₂₄NO₇S的分析计算值：C，57.38；H，5.25；N，6.08。实测值：C，57.31；H，5.34；N，5.83。

6.2.实施例2：(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(“化合物A”)的制备

6.2.1.3-氨基邻苯二甲酸的制备。

在氮气氛下，将10%Pd/C(2.5g)、3-硝基邻苯二甲酸(75.0g，355mmol)和乙醇(1.5L)的混合物装入2.5L Parr氢化器中。将氢气充入反应容器中直到55psi。将混合物振荡13小时，保持氢压力介于50和55psi之间。放出氢气，将混合物用氮气吹扫3次。使悬浮液通过硅藻土床过滤后，用甲醇冲洗。将滤液真空浓缩。将所得固体在乙醚中再调成浆后，通过真空过滤分离。将固体真空干燥至恒重，得到54g(收率84%)的3-氨基邻苯二甲酸，为黄色产物。¹H-NMR(DMSO-d6)δ:3.17(s,2H),6.67(d,1H),6.82(d,1H),7.17(t,1H),8-10(brs,2H)。¹³C-NMR(DMSO-d6)δ：112.00,115.32,118.20,131.28,135.86,148.82,169.15,170.09。

6.2.2.3-乙酰氨基邻苯二甲酸酐的制备。

给1L3颈圆底烧瓶备机器搅拌机、温度计和冷凝器，并装入3-氨基邻苯二甲酸(108g，596mmol)和乙酸酐(550mL)。将反应混合物加热至回流3小时后，冷却至环境温度，并再冷却至0-5℃又1小时。结晶固体经真空过滤，用乙醚洗脱。在环境温度下将固体产物经真空干燥至恒重，得到75g(收率61%)3-乙酰氨基邻苯二甲酸酐，为白色产物。¹H-NMR(CDCl₃)δ：2.21(s,3H),7.76(d,1H),7.94(t,1H),8.42(d,1H),9.84(s,1H)。

6.2.3.2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺的拆分。

给3L3颈圆底烧瓶配备机器搅拌机、温度计和冷凝器，并装入2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺(137.0g，500mmol)、N-乙酰基-L-亮氨酸(52g，300mmol)和甲醇(1.0L)。将搅拌的浆液加热至回流1小时。使搅拌的混合物冷却至环境温度后，在环境温度继续再搅拌3小时。将浆液过滤，并用甲醇(250L)洗涤。将固体风干，然后在环境温度下真空干燥至恒重，得到109.5g(收率98%)的粗产物(85.8%ee)。使粗制固体(55.0g)和甲醇(440mL)回流1小时，冷却至室温，在环境温度下再搅拌3小时。浆液经过滤，滤饼用甲醇(200mL)洗涤。将固体风干，然后在30℃下真空干燥至恒重，得到49.6g(回收率90%)的(S)-2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺-N-乙酰基-L-亮氨酸盐(98.4%ee)。手性HPLC(1/99EtOH/20mM KH₂PO₄(pH7.0)，得自Agilent Technologies的Ultron Chiral ES-OVS，150mm x4.6mm，0.5mL/分钟，在240nm处)：18.4分钟(S-同分异构体，99.2%)，25.5分钟(R-同分异构体，0.8%)。

6.2.4.(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮的制备。

给500mL3颈圆底烧瓶配备机器搅拌机、温度计和冷凝器。向反应容器中装入(S)-2-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-1-(甲基磺酰基)-乙-2-基胺N-乙酰基-L-亮氨酸盐(25g，56mmol，98%ee)、3-乙酰氨基邻苯二甲酸酐(12.1g58.8mmol)和冰醋酸(250mL)。使用混合物回流过夜，然后冷却至<50℃。真空除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯中。所得溶液用水(250mL x2)、饱和NaHCO₃水溶液(250mL x2)、盐水(250mL x2)洗涤，经硫酸钠干燥。使溶剂真空蒸发，残余物自含有乙醇(150mL)和丙酮(75mL)的二元溶剂重结晶。将固体通过真空过滤分离后，用乙醇(100mL x2)洗涤。将产物在60℃下真空干燥至恒重，得到98%ee的19.4g(收率75%)的(S)-{2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-inoisoindoline-1,3-二酮。手性HPLC(15/85EtOH/20mM KH₂PO₄(pH.5)，得自AgilentTechnology的Ultron Chiral ES-OVS，150mm x4.6mm，0.4mL/分钟，在240nm处)：25.4分钟(S-同分异构体，98.7%)，29.5分钟(R-同分异构体，1.2%)。¹H-NMR(CDCl₃)δ:1.47(t,3H),2.26(s,3H),2.87(s,3H),3.68-3.75(dd,1H),3.85(s,3H),4.07-4.15(q,2H),4.51-4.61(dd,1H),5.84-5.90(dd,1H),6.82-8.77(m,6H),9.46(s,1H)。¹³C-NMR(DMSO-d6)δ：14.66,24.92,41.61,48.53,54.46,55.91,64.51,111.44,112.40,115.10,118.20,120.28,124.94,129.22,131.02,136.09,137.60,148.62,149.74,167.46,169.14,169.48。

化合物A的特定晶型可按照美国专利号7,893,101(其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)制备。

6.3.实施例3：对mAB/LPS诱导的实验性鼠关节炎形成模型中对抗关节炎活性的评价

在mAB/LPS诱导的实验性鼠关节炎形成模型中，对(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(“(+)异构体”；化合物A)的抗关节炎活性进行了评价。在5个连续治疗日期间，一天一次经口(PO)管饲法给予小鼠1、5和25mg/kg。治疗组包括n=8只BALB/c雄性小鼠/组。两个相同大小的组用地塞米松(1mg/kg)或0.5%CMC/0.25%Tween80的悬浮液治疗，分别用作阳性对照或溶媒对照。

最初在研究的第0天，通过静脉内(IV)注射4种剂量为100mg/kg的单克隆抗体(mAB)混合物，来诱导实验性关节炎，约72小时后，接着腹膜内(IP)注射LPS2.5mg/kg。

在6个时刻(第0、4、5、6、7和9天)用电子数字卡尺测定爪厚度，表示为左和右后爪两个平均数的组平均值。结果见图1。数据清楚表明有高度统计显著性(相对于溶媒对照p<0.01)，且在化合物A治疗组的最大剂量(25mg/kg)中爪肿胀的不变抑制，与阳性对照地塞米松组的相等。给予5mg/kg的(+)异构体(中间剂量)的动物中显示较小程度(相对于溶媒对照p<0.05)，但限于第9天测量时。

在该研究中，在5个连续日以一日一次25mg/kg的剂量经口给予化合物A，表明出相当于通过相同给药方案施用地塞米松(1mg/kg)所达到的爪肿胀统计显著性减少所体现的潜在抗关节炎活性。

6.3.1.组织病理学评价

为了测定(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(“(+)异构体”；化合物A)的潜在抗关节炎活性，用溶媒对照或25mg/kg的(+)异构体对共16只动物进行了组织病理学评价。将左后肢在10%中性缓冲福尔马林中固定1周，然后转移到缓冲无机酸(脱钙过程达约48小时)中，在保存前返回10%福尔马林中。对自胫骨中部和远侧以包括踝关节即腿与脚之间的关节(胫骨-跗骨关节)的各肢进行中间纵向修剪，将两个对半包埋在石蜡中，切取6微米厚度切片，用苏木精和伊红染色。采用5等级(0–4)的半定量分级，考虑变化程度(0=寻常，1=最小，2=轻微，3=中度，4=明显)，对关节的组织病理学变化进行描述和评分。表1提供各研究结果。结果表明关节炎模型成功引入，达到3级(中度)严重程度。注意到在该关节炎中特征性所见变化的所有典型范围。用试验化合物A治疗的动物的所有样品几乎都不存在关节炎，这就表明抑制关节炎发生的极有效的能力。

表1：在用溶媒(对照)或化合物A治疗的关节炎小鼠胫跗关节中观察到的组织病理学特征

6.3.2.小鼠中抗体诱导的关节炎

在mAb/LPS诱导的实验性鼠关节炎形成模型中，在11个连续治疗日期间，针对以5和25mg/kg一日一次通过重复经口给药给予(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-乙酰氨基异二氢吲哚-1,3-二酮(“(+)异构体”；化合物A)，对潜在抗关节炎活性进行了评价。试验项目治疗组包括n=8只BALB/c雄性小鼠/组。另外，4个相同大小的组用恩利(Enbrel)(5或6.25mg/kg，阳性对照)、0.5%CMC/0.25%Tween80(5ml/kg，溶媒对照)的悬浮液或恩利和化合物A的组合(各5mg/kg，阳性对照-试验项目组)治疗。

最初在研究的第0天，通过以100mg/kg的剂量水平单次静脉内注射4种单克隆抗体(mAb)混合物，约72小时后，接着单次腹膜内(IP)注射LPS2.5mg/kg，来诱导实验性关节炎。

在整个14天观察期间，在所有化合物A治疗的动物中未记录到明显的治疗相关性不良反应，不包括LPS注射的典型反应，其特征是立毛、自发运动活性减少和轻微腹泻。

在8个时刻(在第0、4、5、6、7、9、11和14天)用电子数字卡尺测量后爪厚度，并表示为左和右后爪两者平均数的组平均值。结果见图2。数据清楚表明在研究第5、7、9、11和14天，在重复给予5或25mg/kg化合物A的动物中极显著地降低(P<0.0l相对于溶媒对照)，等于阳性对照治疗的动物(5或6.25mg/kg恩利)或恩利-化合物A组合治疗的情况。

研究第7、9、11和14天，与溶媒对照组中记录的相比，在经受恩利-化合物A组合的动物和经受6.25mg/kg恩利的动物中，两个后爪(左和右平均值/动物)的平均组关节炎形成计分值在统计上非常低到极低(分别为p<0.01和p<0.00l)。另外，相对于溶媒对照组，经受25mg/kg化合物A的动物中，在第9、11和14天，分别显示统计显著性到极显著性的降低(p<0.05，p<0.0l，p<0.001)。

在第7、9、11和14天，在整个肿胀期内，与溶媒对照组相比，在经历重复给予5或25mg/kg的(+)异构体、5或6.25mg/kg的恩利或在恩利-化合物A组合的治疗组的动物中，发现后爪厚度相对于关节炎诱导引发(在研究的第0天应用)的平均组百分比变化非常显著的较低(P<0.0l)。

在该研究中，在11个连续治疗日，以5和25mg/kg一日一次经口给予化合物A显示相当于通过施用相同的给药方案，由恩利5或6.25mg/kg达到的爪肿胀的统计显著性降低所体现的潜在抗关节炎活性。

6.4.实施例4：体外针对T细胞和胶原抗体诱导的关节炎小鼠模型中单独和组合的化合物A的抗炎活性

在T细胞中测量单独和与其它抗风湿药包括依那西普(ETN)、环孢素A(CsA)和甲氨蝶呤(MTX)组合的化合物A的抗炎活性。在胶原抗体诱导的关节炎小鼠模型(CAIA)中单独和组合测试化合物A。

6.4.1.方法

通过磁珠上的负选择，自健康供体(n=5)分离人外周血总T细胞，并用抗CD3抗体刺激1.25x.10e6个细胞/mL2天。在Luminex100上通过流式细胞磁珠阵列对细胞因子和趋化因子蛋白质水平进行了分析。CAIA模型：以100mg/kg的剂量，用4种单克隆抗体混合物给雄性BALB/c小鼠(n=10只/组)静脉内注射，3天后用2.5mg/kg的LPS腹膜内(IP)注射。在3-13天内，一日一次给予化合物A和ETN。化合物A作为1、5或25mg/kg的悬浮液qd经口给药。以5或6.25mg/kg IP注射ETN。以盲式方式检查每只动物的两个后爪(左和右)关节炎形成反应的体征。对关节炎反应评分，按严重程度的递升次序以0-4分记录。使用Mitutoyo电子数字卡尺，以mm为单位测量后爪厚度。恰在踝上方切离两个后爪，在10%中性缓冲福尔马林固定，并进行组织病理学分析。

6.4.2.结果

化合物A抑制所有所测量的T细胞细胞因子和趋化因子(IL-2、IL-4、IL-13、IFN-γ、TNF-α、CXCL10、CCL3和CCL4)的产生，其50%抑制浓度(IC₅₀)为15-360ng/mL。CsA还抑制全部分析物，其IC₅₀为4.7-140ng/mL。相比之下，ETN有效抑制TNF-α(IC₅₀=1.5ng/mL)，对IL-13和IP-10的程度较低(16-62ng/mL)，但对所有其它分析物的IC₅₀>1600ng/mL。MTX IC₅₀均>1600ng/mL。对于化合物A+ETN和化合物A+CsA的组合观察到协同抑制。在CAIA模型中，通过5和25mg/kg的化合物A和两种所测剂量的ETN，后爪关节炎反应分值和厚度显著降低(p<0.01)。在高剂量下，化合物A抑制滑液增生、滑膜绒毛形成、血纤蛋白沉积、滑膜中的炎性浸润、血管翳形成、软骨破裂和软骨下骨破裂(反映在破骨细胞的吸收/蚀解和骨丢失)。各为5mg/kg的化合物A+依那西普的组合在关节炎模型中是相加到协同性的。

人T细胞用化合物A处理导致IL-2、IL-4、IL-13、IFN-γ、TNF-α、CXCL10、CCL3和CCL4的抑制。与ETN或CsA组合时，化合物A协同性地抑制若干细胞因子和趋化因子。在CAIA模型中，通过组织病理学分析，化合物A减轻爪肿胀并降低关节炎反应分值，在25mg/kg下几乎不存在关节炎。化合物A和依那西普在这种关节炎模型中有利地组合。

6.5实施例5：环丙烷甲酸{2-[(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基-苯基)-2-甲烷-磺酰基-乙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基}-酰胺(“化合物B”)的制备

6.5.1.2-甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的制备

在约20-25℃、氮气下，将2-甲基-6-硝基苯甲酸(300.0g，1.66摩尔，得自AcrosOrganics，Morris Plains，NJ)和原乙酸三甲酯(298.3g，2.48摩尔，得自AldrichChemicals，Milwaukee，WI)的混合物装入3-L三颈烧瓶。将反应混合物渐渐加热，在反应期间产生的低沸点组分被馏出到95-100℃的内部温度。2小时后，在1-2小时内使反应混合物冷却至20-25℃。在1.0-1.5小时内将庚烷(1.50L，得自Aldrich Chemicals)装入反应混合物中后，当其变得混蚀时，向反应混合物中加入2-甲基-6-硝基苯甲酸甲酯(0.5g)晶种。使悬浮液在0.5-1小时内冷却至0-5℃，再保持在0-5℃下1.5-2小时。固体经真空过滤收集，用庚烷(3x300mL)洗涤，在30-35℃、100-120乇真空下。在托盘中干燥至恒重，2-甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的收率为292.0g(91%)，以300.0g2-甲基-6-硝基苯甲酸为计。发现通过HPLC测量以面积百分比计的产物纯度为>99%，通过Karl Fisher滴定测量的含水量为<0.1%。

6.5.2.2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的制备

在约20-25℃、氮气下，将2-甲基-6-硝基苯甲酸甲酯(200.0g，1.02摩尔，先前制备)、1,3-二溴-5,5-二甲基乙内酰脲(DBH，162.0g，0.57摩尔，得自Aldrich Chemicals)和乙酸甲酯(1.20L，得自Aldrich Chemicals)的混合物装入3-L三颈烧瓶中。在反应混合物回流0.5-1小时后，在15-30分钟内，装入2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN，8.6g，52mmol，得自Aldrich Chemicals)的100mL乙酸甲酯溶液。使反应混合物回流6.5-8小时，直到未反应的2-甲基-6-硝基苯甲酸酯的量小于5-10%。使反应混合物冷却至15-18℃，保持在15-18℃50-60分钟。固体经过滤后，用冷的(即5-10℃)乙酸甲酯(2x100mL)洗涤直到固体中保留的2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯小于3%。接下来，将庚烷(1.00L)加入滤液中后，上层有机相用2%盐水(2x500mL)和去离子水(1-2x500mL)洗涤直到按HPLC测量未反应的5,5-二甲基乙内酰脲小于0.5%(210nm处的面积百分比)。将溶液减压浓缩以除去约1.80-1.90L乙酸甲酯后，装入甲基叔丁基醚(MTBE，300mL)。将反应混合物在65-70℃下回流10-15分钟后，使溶液在0.5-1小时内冷却至50-55℃，在45-50℃下加入500mg2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯晶种。使悬浮液冷却至20-25℃，并保持于20-25℃2-3小时。固体经过滤收集，用5-10℃冷的庚烷和MTBE的混合物(1:2的体积比(2x100mL))洗涤，在20-25℃、100-120乇真空下干燥至恒重。2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的收率为185.2g(66%)，以200.0g2-甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的投入计。发现通过HPLC测量以面积百分比计的产物纯度为>98%，通过Karl Fisher滴定测量的含水量为<0.1%。

6.5.3.(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基-乙胺的制备

在将(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基-乙胺N-乙酰基-L-亮氨酸盐(1.10kg，2.46摩尔)、去离子水(4.40L)和二氯甲烷(DCM，5.50L)的混合物装入反应容器后，在15-25℃下在约5分钟的时间内，将含氢氧化钠(196.0g，4.90摩尔)的1.00L去离子水溶液装入反应容器中。在15-25℃下搅拌所得混合物至少10分钟，然后使水相和有机相分隔开。保持上层水相的pH或在pH13-14下调节。分离各相，上层水相用DCM(2x4.4L)萃取。在整个萃取中，保持水相pH为13-14。DCM萃取物经合并，用去离子水(3.3L)洗涤直到水相pH达到11或更小。在35℃以下，真空除去DCM。残留固体的含水量应<0.1%w/w，通过Karl Fisher滴定测量。将残留固体用更多DCM共沸干燥。在30-35℃下将固体真空干燥至恒重，得到(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基-乙胺，为白色粉末(639.0-672.0g，收率95-100%)。

6.5.4.(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮的制备

(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮通过下列方法制备。在室温、氮气下，将2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯(100.0g，365mmol，之前在实施例6.5.2.中制备)、(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基乙胺(104.7g，383mmol，之前在实施例6.5.3.中制备)、碳酸氢钠(67.5g，8.03摩尔，得自Aldrich Chemicals)和二甲基甲酰胺(500mL)的混合物装入1-L三颈烧瓶中。将反应混合物渐渐加热至70-75℃的内部温度达2小时，直到未反应的2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯小于<2%。将反应混合物渐渐加热至95-100℃的内部温度达18小时。使反应混合物冷却至20-25℃，并转移至1-L加料漏斗中。将纯净水(1500mL)装入5-L三颈烧瓶中后，在室温下，在1-2小时内，将加料漏斗中的反应混合物加入5-L三颈烧瓶的水中，保持内部温度低于30℃。在室温下搅拌反应混合物2小时。真空下滤除固体，用水(3x300mL)和甲醇(2x400mL)洗涤，然后装入2-L三颈烧瓶中，接着装入甲醇(1000mL)。使混合物回流1小时。使混合物冷却至室温。固体经真空过滤收集，用200mL甲醇(2vol)洗涤，在40-45℃、100-120乇真空下干燥至恒重。以100.0g2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的投入计，(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮的产量为123.0g(78%)。发现通过HPLC测量以面积百分比计的产物纯度为>99%，通过Karl Fisher滴定测量的含水量为<0.1%。

6.5.5.(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮的替代性制备

(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮亦通过下列方法制备。在室温下，将2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯(100.0g，365mmol，之前在实施例6.5.2.中制备)、(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基-乙胺(104.7g，383mmol，之前在实施例6.5.3.中制备)和碳酸钾粉末(100.8g，730mmol，得自Aldrich Chemicals)的混合物悬浮于乙腈(500mL)中。使反应混合物在81-83℃下回流约2小时，直到未反应的2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯小于2%。在反应混合物冷却至45-50℃后，在5-10分钟之内，装入甲醇(200mL)。在使混合物冷却至20-25℃后，搅拌2小时，在0.5-1小时内装入去离子水(1.40L)，在20-25℃下搅拌30分钟后，在0-5℃下搅拌1-2小时。固体经过滤，用去离子水(3x300mL)洗涤后，干燥至含水量<10%，通过Karl Fisher滴定测量。将固体悬浮于甲醇(750mL)中，回流1-1.5小时。在1.5-2小时内使悬浮液冷却至0-5℃，并保持在0-5℃下1-1.5小时。固体经过滤，用0-5℃甲醇(2x200mL)和庚烷(200mL)洗涤，然后在40-45℃下真空干燥至恒重。以100.0g2-溴甲基-6-硝基苯甲酸甲酯的投入计，(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮的产量为148.0g(93%)。发现通过HPLC测量以面积百分比计的产物纯度为>99%，通过Karl Fisher滴定测量的含水量为<1.0%。

6.5.6.化合物B的制备

在室温、氮气下，将(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]异二氢吲哚-1-酮(60g，138mmol，之前在实施例6.5.5.中制备)、10%Pd/C(50%湿，2.4g，4wt%，得自Johnson Matthey，London，UK)、乙酸乙酯(780mL)的混合物装入Parr容器中。在混合物用氮气吹扫3次并用氢气吹扫3次后，将反应混合物加热至40℃，然后散热。在4-6小时内，在40-45psi的压力下，用氢气搅拌反应混合物，直到羟胺中间体≤3%。使反应混合物冷却至20-25℃。反应混合物经硅藻土床(1英寸厚度)过滤，然后用乙酸乙酯(120mL)洗涤床。将滤液转移至配备50-mL加料漏斗的3-L三颈烧瓶。在将N,N-二异丙基乙胺(29mL，165mmol)装入烧瓶中后，将环丙基碳酰氯(13.0mL，145mmol，得自Aldrich Chemicals)装入加料漏斗中。在室温下，在1-2小时内，在内部温度低于30℃时加入环丙基碳酰氯。在室温下搅拌反应混合物2-4小时。在加入庚烷(300mL)后，搅拌反应混合物4-6小时。固体经真空过滤收集，依次用2N HCl(2x300mL)、水(2x300mL)和庚烷(2x300mL)洗涤。在40-45℃、100-120乇真空下将洗涤粗产物干燥至恒重。以60.0g(1S)-7-硝基-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]-异二氢吲哚-1-酮的投入计，粗制化合物B的产量为58g(88%)。

6.5.7.化合物B的再结晶

在20-25℃、氮气下，将粗制化合物B(95.2g，之前在实施例6.5.6.中制备)和四氢呋喃(THF，1.43L)的混合物装入3L烧瓶中。将悬浮液加热至60-65℃直到达到溶解。将悬浮液在45-50℃下过滤后，固体用在45-55℃下预热的95mL THF冲洗。在30-60分钟内，在常压下馏出约950-1150mL的THF后，在5-10分钟内，在55-60℃下装入无水乙醇(950mL)。在常压下除去约350-400mL溶剂，直到内部温度升至72-74℃。使所得悬浮液在72-75℃下回流30-60分钟，在1-2小时内冷却至20-25℃，并再在20-25℃下保持1-2小时。固体经真空过滤收集，用无水乙醇(240-280mL)和庚烷(240-280mL)洗涤，然后在50-55℃、130-140乇真空下，在托盘中干燥至恒重。灰白色结晶产物的产量为(88.0-91.0g，92-96%)。

本文所述化合物还可按照描述于美国专利申请号2010/0168475(其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)的方法制备。

6.6.实施例6：与环孢素A、甲氨蝶呤和依那西普组合的PDE4抑制剂化合物A和化合物B对活化T细胞中类风湿性关节炎和银屑病相关细胞因子产生的作用。

6.6.1.用于外周血单核细胞多道测定的方法

人外周血单核细胞的纯化

将50毫升(50mL)人血沉棕黄层在装有25mL无菌Hank缓冲盐溶液(HBSS)的2个锥形管中分成2个25mL等分部分。通过倒转几次将管客轻轻混合。将15毫升(15mL)的室温Ficoll-Paque Plus(Amersham Bioscience；目录号17-1440-02)等分至4个50mL锥形管中。然后将25mL血沉棕黄层/HBSS混合物轻缓地置于Ficoll的顶层。将样品在450rpm下(RotorA-4-81)离心(Eppendorf Centrifuge5810R)35分钟。弃去含有血浆的顶层。将含有单核细胞的界面转移到2个50mL锥形管中。两个锥形管用HBSS装满整个体积(50mL)，在1200rpm下离心10分钟。将细胞再次在HBSS中洗涤后，在1000rpm下离心10分钟。将人红细胞裂解缓冲液(5mL)(Boston Bioproducts目录号IBB-197)加入细胞沉淀中，在室温下温育5分钟。将磷酸缓冲盐溶液(PBS；45mL)加入锥形管后，在1200rpm下离心10分钟。合并细胞沉淀，重新悬液于20mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI)完全培养基(RPMI/5%人血清/1x青霉素/链霉素[pen/strep]/L-谷氨酰胺[L-gln])中后，对细胞计数。

用于葡萄球菌肠毒素B(SEB)处理的PBMC

将分离的PBMC接种在96孔板中，在37℃下加入化合物(始于1600ng/ml并1:4稀释)1小时。然后以100ng/ml的终浓度加入葡萄球菌肠毒素B(Sigma)，将细胞在37℃下温育18小时。

然后收获上清液用于luminex测定。

6.6.2.抗CD3单克隆抗体刺激的T细胞多道测定的程序

人T细胞的纯化和处理

组织培养板(96孔平底)用抗CD3mAb(2.5μg/mL)包被，在37℃下温育4小时。恰在加入T细胞前，将板用100μl/孔完全培养基(RPMI1640w/10%热灭活的胎牛血清(FBS)、1%pen/strep/1%L-gln)洗涤3次。将外周血单核细胞(5x10⁸个细胞；如上所述制备)接种在5个10cm组织培养皿(各10mL)中。通过在37℃下温育30-60分钟，排除贴壁单核细胞部分。培养皿用培养基冲洗以取出所有未贴壁PBMC。对未贴壁PBMC计数后，取2x10⁸个细胞，在1200rpm下离心10分钟，使用完全培养基调整体积至4.0mL。通过在Falcon管(5mL)中在振荡器中于室温(RT)混合30分钟，来制备下列抗体混合物：

·羊抗小鼠IgG珠粒(600μl；Dynal目录号110.31)，

·抗CD16(30μl；BD Pharmingen目录号555404)，

·抗CD33(30μl；BD Pharmingen目录号555449)，

·抗CD56(30μl；BD Pharmingen目录号555514)。

在完成时，将抗CD19珠粒(460μl；Dynal目录号111.43)和抗CD14珠粒(112μl；Dynal目录号111.49)加入Falcon管/抗体混合物。使用磁体和吸管吸入，将混合物用完全培养基洗涤3次。加入未贴壁PBMC(2x10⁸个细胞，4.0mL)，使管在4℃下转运30分钟。使用负选择的磁体，自珠粒分离细胞。然后收集T细胞、计数并重新悬浮于完全培养基中。调整T细胞浓度至2.5x10⁵个细胞/180μl(1.39x10⁶个细胞/mL)，加入板孔(180μl/孔)。立即将试验化合物(20μl，10x浓度)加入含有T细胞的孔中。自400ng(1600ng/ml，1:4稀释)起，测定化合物A、化合物B、环孢素A(Sigma)、甲氨蝶呤(Sigma)和恩利(通过处方获得)。根据RA患者中进行的药代动力学研究，确定用于该测定中的药物浓度(表2)。将T细胞板在37℃、5%CO₂下温育2天。然后将各孔的50μl上清液转移至3个新的圆底96孔板中，保存在-20℃下用于Luminex分析。对每种样品以一式两孔进行。参见Fox等，“Combined oral cyclosporin andmethotrexate therapy in patients with rheumatoid arthritis elevatesmethotrexate levels and reduces7-hydroxymethotrexate levels when comparedwith methotrexate alone(类风湿性关节炎患者中联合口服环孢菌素和甲氨蝶呤疗法当与单独的甲氨蝶呤相比时提高甲氨蝶呤水平并降低7-羟基甲氨蝶呤水平).”Rheumatology(Oxford).2003;42(8):989-94。

表2:研究药物的药代动力学数据

RA=类风湿性关节炎。

6.6.3.Luminex分析

使用纯净上清液以9道形式对细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IP-10、MIP-1α、MIP1β和TNF-α进行了分析。应用Upstate Beadview软件进行了数据分析。使用Prism v5(GraphPad)，对数据按%对照(DMSO)作图。通过目视检查沿曲线上线性部分的图表数据，先鉴定出潜在药物组合协同作用。在协同作用鉴定时，将图表数据输入CompusynProgram(Combosyn，Inc.)，该程序计算浓度曲线上各数据点的联合指数(combinationindex,CI)(表3)。

表3:联合指数值的含义

CI	描述
		<1.0	协同
=1.0	加性
		>1.0	非加性

CI=联合指数；<=小于；>=大于

6.6.4.抗CD3单克隆刺激的人T细胞中与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的磷酸二酯酶4抑制剂：高细胞因子水平供体的反应

在来源于具有高细胞因子水平的供体的抗CD3mAb刺激的T细胞中，在最小的一个所测浓度下，化合物A与CsA或ETC任一种的联合作用协同性地抑制IFN-γ(图3A)、IL-13(图7A)、IP-10(图8A)、MIP-1α(图9A)、MIP-1β图10A)和TNF-α(图11A)产生(表4)。化合物A和MTX对上述细胞因子的联合抑制作用是非加性的，只是无法测定的(ND)INF-γ除外(表4)。在试验浓度之一下，用化合物A和CsA或MTX组合还观察到对IL-10产生的协同抑制，但对化合物A/ETC组合是ND(图6和表4)。在最大试验浓度(1600ng/ml)下，化合物A/MTX组合协同性地抑制IL-2产生；然而，与ETC或CsA组合的化合物A对IL-2产生的抑制是非加性的。值得注意的是，化合物A/CsA组合实际上是拮抗性的(图4A和表4)。在响应化合物A和ETC或MTX组合时，IL-4产生的抑制是非加性的，但是对于化合物A/CsA组合是加性的(图5A和表4)。

在来源于具有高细胞因子水平的供体的刺激T细胞中且在最小的一个受测浓度下，与CsA、ETC或MTX组合的化合物B协同性地抑制MIP-1α(图9B)产生(表4)。化合物B/CsA组合对抑制IFN-γ(图3B)、IL-4(图5B)、IL-10(图6B)和IL-13(图7B)、IP-10(图8B)、MIP-1β(图10B)和TNF-α(图11B)产生至少在试验浓度之一下也是协同性的，但是对IL-2产生的作用是非加性的(图4B)(表4)。另外，化合物B/MTX组合协同性地抑制IL-2(图4B)、IL-4(图5B)和MIP-1β(图10B)产生(表4)，但是该组合的作用对IL-10(图6B)、IL-13(图7B)、IP-10(图8B)和TNF-α(图11B)产生的抑制是非加性的，而对IFN-γ产生(图3B)无法测定(表4)。除MIP-α(如上述；图9B)以外，该研究中未针对已进行概况分析的细胞因子对化合物B/ETC进行测试(表4)。

表4:与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的磷酸二酯酶4抑制剂的作用概要：来自高水平供体的T细胞

CI=联合指数；IL=白介素；INF-γ=干扰素-β；IP-10=干扰素诱导蛋白10；MIP-1α(β)=巨噬细胞炎性蛋白-1α(β)；ND=无法测定；TNF-α=肿瘤坏死因子-α。

非加性：与另一种药物组合的PDE4抑制剂的百分比≤任一种药物单独起作用；CI>1。

加性：[(100-%PDE4抑制剂)+(100-%组合药物)]=(100-%连同组合药物的PDE4抑制剂)；CI=1.0。

协同：[(100-%PDE4抑制剂)+(100-%其它药物)]<(100-%连同组合药物的PDE4抑制剂)；CI<1。

6.6.5.抗CD3单克隆刺激的人T细胞中与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的磷酸二酯酶4抑制剂：低细胞因子水平供体的反应

在来自低水平供体的抗CD3mAb刺激的T细胞中(n=5)，在最小的一个受测浓度下，化合物A与CsA的组合作用协同性地抑制IFN-γ(图12A)、IL-4(图14A)、IL-10(图15A)、IL-13(图16A)、IP-10(图17A)、MIP-1α(图18A)、MIP-1β(图19A)和TNF-α(图20A)产生，而对IL-2(图13A)产生的抑制是非加性(表5)。在最小的一种试验浓度下，与ETC组合的化合物A也协同性地抑制IL-4(图14A)、IL-10(图15A)、IL-13(图16A)、IP-10(图17A)和MIP-1α(图18A)产生，而对IFN-γ(图12A)、IL-2(图13A)、MIP-1β(图19A)和TNF-α(图20A)产生的抑制是非加性的(表5)。化合物A/MTX组合对所有进行概况分析的细胞因子的抑制是非加性的(表5)。

与CsA、ETC或MTX组合的化合物B在低水平供体刺激的T细胞样品(n=5)中且在最小的一个受测浓度下协同性地抑制MIP-1α(图18B)(表5)。在试验浓度之一下，化合物A/CsA组合显示对IFN-γ(图12B)、IL-2(图13B)、IP-10(图17B)和MIP-1β(图19B)产生的抑制性协同作用(表5)。用化合物A/CsA组合获得对TNF-α(图20B)产生的非加性反应，而IL-4、IL-10和IL-13未测试。与ETC组合的化合物B亦显示至少一种试验浓度对IFN-γ(图12B)、IL-4(图14B)、IL-10(图15B)和IP-10(图17B)产生的协同性抑制反应(表5)，并且显示对IL-2(图13B)、IL-13(图16B)、MIP-1β(图179B)和TNF-α(图20B)产生的非加性抑制反应(表5)。化合物B/MTX组合对所有进行概况分析的细胞因子显示非加性抑制反应，MIP-1α除外(如上所述；表5)。

表5:与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的磷酸二酯酶4抑制剂的作用概要：来自低水平供体的T细胞

CI=联合指数；IL=白介素；INF-γ=干扰素-β；IP-10=干扰素诱导蛋白10；MIP-1α(β)=巨噬细胞炎性蛋白-1α(β)；TNF-α=肿瘤坏死因子-α。

协同作用：[(100-%PDE4抑制剂)+(100-%其它药物)]<(100-%连同组合药物的PDE4抑制剂)；CI<1。

6.6.6.与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的磷酸二酯酶4抑制剂：在葡萄球菌肠毒素B处理的外周血单核细胞中的反应

在SEB处理的PBMC样品(n=6)中，对于至少一种所测浓度，与CsA组合的化合物A或化合物B协同性地抑制IL-10(图21A和B)、IP-10(图22A和B)、MIP-1α(图23A和B)、MIP-1β(图24A和B)和TNF-α(图25A和B)产生(表6)。此外，对于至少一种试验浓度，与ETC组合的化合物A或化合物B协同性地抑制IL-10(图21A和B)、IP-10(图22A和B)和MIP-1α(图23A和B)产生，而对MIP-1β(图24A和B)和TNF-α(图25A和B)产生的抑制显示非加性作用(表6)。化合物A/MTX组合对该测定中进行概况分析的所有细胞因子显示非加性抑制；然而，化合物B/MTX组合表明对所有进行概况分析的细胞因子为非加性抑制，只是TNF-α产生除外，其在400ng/ml浓度下显示抑制性协同作用(图25B和表6)。

6.6.7.化合物A抑制T细胞调节性细胞因子IL-7基因表达

由软骨细胞和滑膜细胞产生的T细胞调节性细胞因子IL-7，在炎性关节疾病例如关节炎和骨损伤起作用。Long,D.等,Arthritis Res Ther.,2008,10(1):R23。具体地说，IL-7信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质水平在椎关节炎和类风湿性关节炎(RA)患者的滑液中提高。Rihl，M.等，Arthritis Rheum.,2008,58(11):3430-3435。在用IL-1、IL-6和IL-6受体(IL-6R)刺激的正常原代人软骨细胞中，化合物A(0.1-10μM)以剂量依赖性方式显著抑制IL-7基因表达。在该测定中，在包括其各自最大血浆浓度(C_max-MTX=400和ETC=1600ng/ml)的剂量范围内，化合物A是比甲氨蝶呤和依那西普更有效的IL-7基因表达抑制剂。在经刺激的原代人正常软骨细胞中，化合物A抑制滑膜组织生物标志物细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达和α-v-β-3(αvβ3)整联蛋白表达。同样地，在用IL-1、IL-6和IL-6R刺激的类风湿性关节炎滑液成纤维细胞中，化合物A(0.1-10μM)以剂量依赖性方式显著抑制IL-7基因表达，而MTX和ETC没有显著作用。

表6:葡萄球菌肠毒素B处理的外周血单核细胞中与环孢菌素、依那西普或甲氨蝶呤组合的磷酸二酯酶4抑制剂的作用概要

CI=联合指数；IL=白介素；IP-10=干扰素诱导蛋白10；MIP-1α(β)=巨噬细胞炎性蛋白-1α(β)；TNF-α=肿瘤坏死因子-α。

非加性：与另一种药物组合的PDE4抑制剂的百分比≤任一种药物单独起作用；CI>1。加性：[(100-%PDE4抑制剂)+(100-%组合药物)]=(100-%连同组合药物的PDE4抑制剂)；CI=1.0。

6.6.8.与依那西普、甲氨蝶呤和泼尼松组合的化合物A：在T细胞调节性细胞因子IL-7测定法中的反应

IL-7基因表达测定法：在类风湿性关节炎患者来源的滑液成纤维细胞中，测定了与依那西普、甲氨蝶呤和泼尼松组合的化合物A针对IL-7产生的作用。将购自Asterand(Detroit，MI)的正常原代人软骨细胞和类风湿性关节炎滑液成纤维细胞在T-75烧瓶中融化，并培养2-3周以达到汇合。培养基为20%特级非热灭活的FBS-DMEM/F-12(Invitrogen11330-032)+1%pen/strep和1%L-谷氨酰胺。将细胞(1.5-2.0x105个细胞)接种至含有2ml完全培养基的6孔板上。在达到90%汇合时(通常在接种后1-2天)，通过将完全培养基用2ml无血清培养基更换，使细胞血清饥饿20小时。将细胞在37℃下用试验化合物处理1小时(0.25%最终DMSO浓度)。在药物处理后，将细胞在37℃下与经刺激的细胞因子IL-1β(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IL-6R(20ng/ml)一起温育18小时。细胞然后用冷的PBS洗涤。如下分离核糖核酸(RNA)：加入600μl RLT裂解缓冲液(Qiagen RNAEasy试剂盒目录号74104)，使细胞通过Qiashredder(Qiagen目录号23800)，接着按照生产商说明书(QiagenRNAEasy试剂盒)进行RNA分离。用循环变温加热器，使纯化的RNA反转录至cDNA用于实时反转录酶聚合酶链式反应(RTPCR)分析。采用7500实时PCR系统进行白介素-7基因表达测定。对每个样品运行GAPDH基因表达测定对照，并用作归一化对照。对于每个基因，将各实验内的样品归一化至0.25%DMSO处理。

细胞表面蛋白质表达测定：使正常原代人软骨细胞在T-75烧瓶中融化，并在20%特级非热灭活的FBS-DMEM/F-12(Invitrogen11330-032)+1%pen/strep和1%L-谷氨酰胺中生长2-3周以达到汇合。将细胞接种(1.0x10⁶个细胞/10ml完全培养基)在100x20mm组织培养板中。次日，培养基用10ml无血清培养基更换20分钟以使细胞血清饥饿。加入化合物A(0.1-10μM)在37℃下达1小时(0.25%最终DMSO)。另外，加入细胞因子IL-1β(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IL-6R(20ng/ml)，使细胞在37℃下继续温育过夜(18小时)。细胞用非酶细胞分离溶液(Millipore S-004-B)分离，然后在冷的染色缓冲液(BD Pharmigen554656)中以300x g洗涤一次达5分钟。将细胞重新悬浮，并等分至3个5ml圆底瓶中加2个另外的等分部分用于对照。细胞在冷的染色缓冲液中以300x g再次洗涤5分钟。将细胞用PE小鼠抗人:CD54(ICAM-1)(BD Pharmigen555511)和IntegrinαVβ3抗(Millipore MAB1976H)染色。将样品涡旋，在4℃下在避光的同时温育30分钟。在未处理DMSO样品中也测定了两种同种型对照PE小鼠IgG1k(BD Pharmigen555749)和IgG1(Millipore CBL600P)。将样品在染色缓冲液中以300x g洗涤两次达5分钟。在最后的洗涤后，将500μl染色缓冲液加入各样品中，并通过流式细胞术分析。

将正常原代人软骨细胞在含20%特级非热灭活的FBS-DMEM/F-12(Invitrogen11330-032)+1%pen/strep和1%L-谷氨酰胺的T-75烧瓶中融化。将细胞分别接种(1.0x10⁶个细胞/10ml或5000个细胞/100μL完全培养基)在100x20mm组织培养板或96孔板中。次日，将培养基用10ml或100μl无血清培养基更换20分钟以使细胞血清饥饿。加入化合物A在37℃下达1小时(0.25%最后的DMSO)。另外，加入细胞因子IL-1β(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IL-6R(20ng/ml)，使细胞在37℃下继续温育过夜(18小时)。在24和48小时时，收获上清液，在-20℃下冰冻。次日，进行了人CXCL8/IL-8人MMP-3和pro-MMP-13酶联免疫吸附测定法(ELISA)。结果见图26-28。

总之，这些数据表明，使PDE4抑制剂化合物A或化合物B与核准的类风湿性关节炎和银屑病治疗选项CsA、ETC或MTX(特别是CsA或ETC)组合，具有大范围的抑制作用包括协同作用，这取决于组合浓度，以进一步阻断若干炎症性和疾病相关细胞因子。

6.6.9.化合物A抑制RANKL的破骨细胞生成和成骨细胞产生

人骨髓细胞用化合物A和用10nM地塞米松和10nM维生素D处理以使细胞分化成破骨细胞。每隔3天加入新鲜培养基和化合物A。在第7天，收集上清液，分离贴壁细胞以获得RNA。第7天，细胞用TRAP5染色，统计破骨细胞的数目。

结果：发现化合物A抑制破骨细胞形成，这提供了化合物A可抵销皮质甾类的骨代谢分解作用的证据。这提供了作为关节炎(包括类风湿性关节炎)治疗的潜在优势。

化合物A还显著抑制由维生素D和皮质甾类处理的骨髓单核细胞诱导的破骨细胞生成。将正常人成骨细胞(nHOST，来源：Lonza)接种到6孔板中，温育过夜以便细胞贴壁。细胞用化合物A和用10nM地塞米松和10nM维生素D处理7天。每3-4天更新化合物和培养基。在第7天，收集上清液用于通过ELISA进行RANKL和OPG。

结果：发现在以1μM和10μM化合物A的浓度处理正常人成骨细胞细胞后，化合物A引起sRANKL显著下降。在用化合物A处理后还发现OPG增加。在正常人成骨细胞中，化合物A的确显著抑制RANKL/OPG比率。

上述实施方案仅仅是示例性的，本领域技术人员应了解或只是采用常规实验便能够确定特定化合物、材料和方法的多种等同物。所有这类等同物被视为在本发明的范围内，并被随附权利要求书所包括。

Claims

1.治疗有效量的第一活性剂和环孢素A在制备用于治疗患者中的类风湿性关节炎的药物中的用途，所述第一活性剂具有式(I):

或是其药学上可接受的盐。

2.权利要求1所述的用途，其中所述第一活性剂的治疗有效量介于10mg/天和200mg/天。

3.权利要求1所述的用途，其中口服给予所述第一活性剂或环孢素A。

4.权利要求3所述的用途，其中以片剂或胶囊剂形式口服给予所述第一活性剂。

5.权利要求1所述的用途，其中局部给予所述第一活性剂或环孢素A。

6.权利要求5所述的用途，其中所述局部给药是呈洗剂的形式。

7.权利要求5所述的用途，其中所述局部给药是呈液体的形式。

8.权利要求1-7中任一项所述的用途，其中第一活性剂的治疗有效量选自0.01mg-100mg/kg患者体重/天。

9.权利要求2所述的用途，其中第一活性剂的治疗有效量独立地为10、20、30、50或100mg/天。

10.权利要求9所述的用途，其中所述第一活性剂每天给予两次。

11.权利要求1所述的用途，其中所述第一活性剂与环孢素A序贯给予。

12.权利要求1所述的用途，其中所述第一活性剂与环孢素A同时给予。