SI8912415A - Mikrobni postopek za proizvodnjo imunosupresivnih antibiotikov - Google Patents

Abstract

Postopek se nanaša na mikrobni postopek za proizvodnjo imunosupresivnega ciklosporinskega antibiotičnega kompleksa ali njegovih komponent, ciklosporina A, ciklosporina B in ciklosporina C, s pomočjo aerobne fermentacije vlaknastega glivičnega seva, pri čemer se biosintetizira gornji antibiotik(e) na hranljivi podlagi, ki vsebuje uporabne vire ogljika in dušika, kot tudi mineralne soli, in izolirajo nastali produkti, ki obsega kultiviranje seva nove glivične vrste Tolypocladium varium, da dobimo ciklosporinski antibiotični kompleks, prednostno Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, ki je deponiran v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budimpešta, Madžarska, pod številko NCAIM(P)F 001005, na hranljivi podlagi, ki vsebuje vire ogljika, organske in anorganske vire dušika, kot tudi mineralne soli, pod aerobnimi pogoji, pri 25 do 30 stopinj Celzija, in če je želeno, izolacijo in čiščenje ciklosporinskega antibiotičnega kompleksa ali njegovih nastalih komponent.ŕ

Description

MIKROBSKI POSTUPAK ZA PROIZVODNJU IMUNOSUPRESIVNIH ANTIBIOTIKA

Oblast tehnike

Pronalazak spada u područje proizvodnje antibiotika.

Tehnički problem

Ovaj pronalazak se odnosi na mikrobski postupak za proizvodnju ciklosporinskog kompleksa ili njegovih komponenti ciklosporina A, ciklosporina B i ciklosporina C pomoču aerobne fermentacije.

Stanje tehnike

Ciklosporini su ciklični, neutralni, apolarni jedanaestočlani oligopeptidi, u kojima je jedna polovina aminokiselina različita. Oiklosporin A i ciklosporin B najpre su izolovali A. Ruegger i saradn. (HELV.Chim.Acta 59, 1075 /Τ97θ/)» a ciklosporine B, D, E i G Traber i saradn. (Helv. Chim.Acta 60, 1568 /1977/) iz kulture gljivice (NRRL 8044), koja je ranije identifikova kaoTrichoderma poly'3porum (Ling ex Pers.) Rifai. Kasnije je taksonomija pomenutog soja promenjena, te je posle toga u literaturi opisan kao Tolypocladium inflatum Gams.

Sada je poznato 25 različitih ciklosporinskih antibiotika registrovani kao ciklosporini A do Z (Helv.Chim.

Acta 20, 13 /1987/). Izmedju ovih komponenti ciklosporin A je najvrednija supstanca, koja ima selektivni imunosupresiv— ni efekt.

Ciklosporin A postao je najpre poznat kao blagi antigljivični antibiotik, njegov značajni itnunosupresivni efekt otkriven je tek kasnije (J.F.Borel i sar.: Imrnunology 21, 101? /1977/).

U seriji eksperimenata in vitro i in vivo potvrdjeno je da je^vciklosporin A, C i G vrlo specifično imunosupresivno sredstvo.

Ciklosporin A inhibira i humoralnu i čelijsku indirektnu imunoreakciju. Proučavajuči njegov način dejstva nadjeno je da inhibira T čelijsku proliferaciju kao i interleukin-2 sintezu. ·. ^x

Terapeutska primena ciklosporina A u transplantacijama ljudskih organa objavljeno je u 1978. godini. Najpre je primenjen u transplantacijama bubrega (R.J.Calne i sar., Lancet 1978/2, 1323) i koštane srži (R.L.Powles i sar., Lancet 1978/2, 1327).

U toku transplantacija organa (bubreg, pankreas, j etre, srca, pluca) i koštane' srži, odbacivanje organa ili koštane srži zaustavljeno primenom ciklosporina A.

Štaviše, ciklosporin A je uspešno primenjen za lečenje nekih autoimunih bolesti (uveitis, reumatoidni artritis, psoriasis i miastenije gravis).

U patentno literaturi koriščeni su sledeči mikroorganizmi za proizvodnju ciklosporinskog kompleksa: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (Švajcarska patentna specifikacija br. 589,718); Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 804-4 (prema rani jo j taksonomiji: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai (Švaj carska patentna specifikacija br. 6Ο3,79θ) i Fusarium šolani, MCI-154-9, MCI-1550 (publikovana japanska patentna specifikacija br. 82 63093).

- 5 U toku fermentacionih postupaka koji se vrše sa gornjim mikroorganizmoma dobljeni su niški proizvodni nivoi za ciklosporine, posle dugih fermentacionih perioda i prinosi izolovanja su takodje bili niški

Rešenje tehničkog problema sa primerima izvod j en,ja

Naša istraživanja bila su usredsredjena na otkriče sojeva mikroorganizama, koji bi proizvodili ciklosporinski antibiotički kompleks ili njegove komponente u visim koncentracijama i na pogodnijim uslovima nego prethodni sojevi. Trijazom velikog broja vlaknastih gljivičnih sojeva izolovanih iz zemlje, nadjen je soj mikroorganizma Tolypocladium -roda, koji je bio sposoban da biosintetiše ciklosporinski antibiotički kompleks. Ovaj mikroorganizem koji smo označili ΟΥ/93» u taksonomskim proučavanjima nije mogao’biti identifikovan si sa jednim od gljivičnih sojeva koji proizvode ciklosporinski kompleks. Tolypocladium varium species nova CY/93 je novi takson roda Tolypocladium koji može biti diferenciran na nivou vrsti.

I t

i

Na osnovu gornjih otkrica pronalazak se odnosi na mikrobski postupak,koji proizvodi bujon koji sadrži visoke koncentracije ciklosporina, primenom jednog novog mikroor_x ganizma, Tolypocladium varium species nova CY/95, koji je deponovan u National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Madjarska pod brojem NCAIM(P)P OOIOO5. Permentacioni bujom sadrži pored ciklosporina A, glavnog proizvoda, i male količine ciklosporina B i ciklosporina C.

z

Taksonomske karakteristike nove gljivične vrste su uporedjene sa glavnim dijagnostičkim osobinama vrste Tolypocladium kao što sledi:

Rod Tolypocladium prvi je opisao Gams u 1971. godini kao novi rod Moniliales iz tla. Njegove karakteristične

- 4 osobine su: sporo rastenje, bele kolonije slične jastuku, terminalnimi lateralni fialidi razvijeni delimično na kratkom bočnom ogranku, sa jako nadutom osnovom i vlaknasti, često povijenog vrata koji se završava u jednočelijsku konidiju. Unutar ovoga roda razlikuju se po Gansu sledeče tri nove vrste: T. geodes, T. cylindrosporum i T. inflatum.

T. geodes ima jako izražen zemljani miriš Actinorayces-tipa, dok je novi T. varium sp. nov. CY/93 kompletno lišen toga. Štaviše, čelijski nosači T. geodes su znatno uži od onih T. varium sp.nov. ΟΥ/93· Konidija T. cylindrosporum je karakteristično duga i izdužena, dok one t. varium sp. nov. ΟΥ/93 sferne i samo malo izdužene. Konidije T. inflatum su jajaste i duže od onih vidjenih u kulturi T. varium sp. nov. ΟΥ/93- Fialidi T. inflatum su nastali kao pršijeni, bilo direktno na hifama ili na 2 do 3 um dugačkim čelijskim nosačima. T. varium sp. nov. CY/93 ne pokazuje takvu sliku pršljenastog rasporeda, i samo se s vremena na vreme sporadično može. otkriti. Usled primarno belog, pamuku sličnog vazdušastog micelijuma, kolonije svib poznatib vrsta Tolypocladium su bele, dok je naličje kolonija žučkasto-sivo, bezbojno ili žuto. Nikakvi tipični rastvorljivi pigmenti se ne stvaraju. T. varium sp. nov. ΟΥ/93 može se takodje razlikovati u tom pogledu : u podloži koja sadrži glukozu i pepton, kao i ekstrakt slada i ekstrakt kvasca nastaje jedan tamni, jako siv, odnosno crn pigment vremenski promenljiv.

Taksonomsko vrednovanje novih vrsta uporedjeno sa drugim poznatim vrstama Tolypocladium uradjeno je na osnovu sledečih publikacija: W. Gams, Persoonia, 6, 185-191 (1971) i G.L. Barron, Can. J. Bot., 439-442 (1980).

Dijagnostički modeli Tolypocledium varium sp. nov. 0Υ/93 sažeti su u onom što sledi.

Kolonije stare- deset dana imaju prečnik od 10 do 25 inm, njihova površina je pokrivena belim, pamuku sličnim,

- 5 vazdušastim micelijumom bogat obrazujučim sporama. Naličje kolonija je žučkastosivo ili prljavo-sivo. U ponekoj kompleksnoj podloži stvara se je:dan tamnosiv, rastvori jiv pigment. I terminalna i lateralna sporulacija se vidja na hifama vazdušastog micelijuma. Fialidi su smešteni bilo usamljeno ili spodadično, kadkad u pršljenima, direktno na hifama ili na kratkim (2 do 3/um) celijskim nosačima. Fialidi se graded nadute osnove (2-4 x 2-3/im) i dugog vlaknastog vrata (2-4 x 0.5-0·6/im)· Konidija gornjih delova su uzane (2-3 ^x 1· 3-2.2/im), obično sferne i ravne. Specifični epitet varium’¹ pripisuje se promenljivosti fialida. Soj označen CY/93 ne može da koristi rafinozu, ali raste dobro na sledečim izvorima ugljenika: manitolu, inozitolu, sabarozi, fruktozi, ramnozi, galaktozi, dekstrozi, arabinozi i ksilozi na površini kulture. Njegove kulture se lose razvijaju na hranijivoj podloži i na sladni ekstraktagaru, a dobro se razvija na agaru sa sojinim brasnom, Czapek-agaru i agaru sa krompir-dekstrozom. Agar sa ovsenim brasnom i agar sa dekstrozom i ekstraktom kvasca nije podesan za čuvanje. Osim toga, holotipski soj (ΟΥ/93) Tolypocladium varium sp^ n. se razlikuje od autentičnog tipskog soja Topypocladium inflatum (CBS ?14.?0) s obzirom da potonji sloj razvija bogate, bele, vazdušaste micelije kada se kultiviraj u na mal:.oznoj agarnoj hrani jivo j podloži, dok Tolypocladium .variuin sp. nov. CY/93 ne stvara takve vazdušaste micelije. Tipski soj Tolypocladium inflatum stvara crvenkastomrk endopigment u svojim supstratnim micelijama na hranijivoj podloži agara i gvoždje-peptona, dok supstratne micelije Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 ostaju svetložute. Soj Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 ne može koristiti arabinozu, dok Tolypocladium inflatum može. Koristeči natrijum-nitrit potonji soj razvija bogate micelije, dok Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 teško raste.

Poredjenje Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 sa autentičnim sojevima drugih Tolypocladium vrsta, sa Trichoderma polysporum ATCC 16,641 i sa Cylindrocarpon lucium· NRRL 5760 je sažeto u tabeli I.

- 6 Tabela 1

-	e	c e r	E 3	e	e o		c
	O ra	O u	□ Ui	□	□ c-	(0	a
|·Ο\	*”* «J P 4°	O CLO	q P	n cm CO CM	e e r-i Ui o	u (D
	ω	O ·	<—< 6 ·	rH	z-M Γ* • O	(D U M3 η n	U O O Ό
1	O o e r, <-t u · O (0 ►· > .	U Ul P** n -m f« 1 H K (/)	o o -< • ' r- '-I (Z5 ο t- O O	O «—i O ΙΠΝ O. S) r>.o h οω o tu m t— 0)0	O (Π O. Π1 >s*O <~l o CLJD	O CLf~ trt O >(J . ·«-< «—i O l n μ-	ug r» Ό3 ΙΛ <_U —•(J Q£
L---—......—.............—..... -- : Razlaganje celuloza	U UJ 1— o o	H- O)	h d<	>□ OZ Li-i 7»
i	-	-	-	-	+++	++ +
Vazduš. micelija:zelena ili • plavičastozelena	4	-	-	-		+++	+++
Stvaranje crvenog rastvorijivog pigmenta na King-agaru f'		-	-	-	-	-	+++
Stvaranje mrkog pigmenta na gvoždje-pepton agaru	-	-	··	-	-	-	+++
Stvaranje tamnomrkog pigmenta na sintetskom glicerol agaru	—	-	-	-	-	++·►	-
Iskorišcenje saharoze	+++	-r>+	+++	+++	+++	-	+++
Iskoriščenje inulina	-	-	-	-	-	-	+++
! Rastenje na 5°C	+++	+++	+++	+++	+++
Rastenje na 5?°C	-	-	-	-	-	+	+++
! Otpornost prema toplotnoj ’ obradi na 5o°C tokom 60 min. t	+++	-	-	-	-	+++	+++
! Stvaranje kiseline | iz glukoze	+++	+++	+	+	+++	+++	+++
• Iskorišcenje natrijum! salicilata l	-	-	-	-	-	+++	+++
! Iskorišcenje natrijummalonata	+♦	++	++	-	-	++	++
i Iskorišcenje natrijumί tartarita |	+	++	++	-	-	++	++
Stvaranje rastvorijivog ljubicastog pigmenta na ti rozin i leucin agaru	-	-	-	+++	+++	-	-

- 7 Na osnovu gornjih otkriča pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa i/ili njegovih komponenti, ciklosporina A, ciklosporina B i ciklosporina C, pomoču aerobne fermentacije vlaknastog gljivičnog soja, biosintezom gornjeg antibiotika(a) u hranijivoj podloži, koja sadrži upotrebljive izvore ugljenika i azota, kao i mineralne soli, i izolovanjem nastalih proizvoda, što obuhvata kultiviranje soja nove gljivične vrste Topypocladium varium koji stvara ciklosporinski antibiotički kompleks, prioritetno Tolypocladium varium sp. nov. ΟΥ/95, deponovan u National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Madjarska pod imenom NCAIM(P)F 001005, na hranljivoj podloži koja sadrži izvore ugljenika, izvore organskog, neorganskog azota, kao i mineralne soli, pod aerobnim uslovima, u temperaturnom području od. 25-3O°C i· ako se želi^ izolovanje i prečiščevanje ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa ili njegovih stvorenih komponenti.

Prema preferiranoj realizaciji ovog pronalaska ciklosporinski antibiotički kompleks se stvara sa novim sojem Tolypocladium varium sp. nov. CY/93· Selekcionisani soj je jako podesan zbog njegovog brzog rastenja. Podesna odlika je, što soj može da iskoristi sahatozu, glukozu, sorbozu, maltozu, fruktozu, škrob, glicerol, kao i razne masti i ulja kao izvore ugljenika i razne vrste organskog i neorganskog azota, kao što je tečnost od močenja kukuruža, pepton, kvaščev ekstrakt, mesni ekstrakt, natrijum-nitrat, amonijum-nitrat, amonijum-sulfat, kao i razne aminokiseline. Pored gornjih izvora ugljenika i azota, hranljiva podloga , koja se koristi za proizvodnju ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa, može da sadrži i mineralne soli (kalijum-hlorid, magnezijum-sulfat ili kalijum-dihidrofosfat), tragove elemenata (bakar, mangan, soli gvoždja), stuviše vitamina i sredstva protiv pcnušanja.

- 8 Prema prefcriranom postupku ovog pronalaska tečna podloga se inokuliše sa suspenzijom konidija i miceliia koje su pripravljene od agar kose kulture Tolypocladium varium sp. nov. CY/93· Posle kultivisanja od 3 dana, predkultura tako dobljena, koristi se radi inokulisanja podloge koja se primenjuje za stvaranje antibiotika, koja se potom inkubira na 25 do 30°C, bolje na 25°G, tokom 5 do 7 dana Za vreme fermentacije održava se pH u području 6.0 do 2.5 bolje na 5·2. Fermentacija se izvodi pod aerobnim uslovima uz smažno mešanje (75θ do 1000 r.p.m.J i provetravanje od 3θθ litara/sat.

Za vreme fermentacije ciklosporinski sadržaj bujona se kontroliše mikrobskim ogledom i HPLC. čim je proizvedena maksimalna količina antibiotika, ovi se dobijaju iz tečnosti kulture na poznat način ekstrakcionim i/ili adsorptivnim metodama. Ciklosporinska- koncentracija bujona je merena na osnovu antigljivične aktivnosti ciklosporina pomoču difuzionog testa na ploči; Aspergillus niger, Aspergillus japonicus i Curvularia lunata mogu korisno da se upotrebe kao test-organizmi (M. Dreyfuss i sar., European J. Appl. Microbiol., *>, 125-133 /1976/). HPLC analiza ciklosporinske koncentracije bujona vržena je iz bujonskih uzoraka razblaženih deset puta sa metanolom prema F. Kreuzig (J. Chromat. 290« 181 /1984/). Prema našim eksperimentima ciklosporinski antibiotički kompleks, koji sadrži ciklosporin A, kao glavni proizvod, i ciklosporin B i ciklosporin C kao manje komponente su nastali u visokom prinosu (95θ mcg/ml) pomoču novog soja Tolypocladium varium sp. nov. CY/95· , Ekstrakcioni postupci mogu korisno da se primene za izolovanje ciklosporinskog kompleksa iz fermentacionog bujona. Pre ekstrakcije se micelijum odvoji bilo filtrovanjem ili centrifugiranjem. Antibiotici proizvedeni tokom fermentacije mogu se pogodno. isprati od čelija mikroorganizma sa nižini alkoholima, prioritetno sa metanolom ili sa ketonima prioritetno sa -acetonom, dok ciklosporini u bujonskom filtra tu mogu biti ekstrahovuni sa organskim rastvaračima koji se ne mešaju sa vodom, kao što je etil-acetat, n-butil-acetat, dihlormetan, 1,2-dihloretan ili hloroform, prioritetno sa n-butil-acetatom. Sirov proizvod dobljen ekstrakcijom je kontaminiran sa crvenim ili ljubičastim pigmentima, koje proizvode gljivice, što može da se ukloni adsorpcijom sa aktivnim ugljem ili silika^elom. Moguče masne nečistoče (tj. sredstva protiv penušanja) mogu se odvojiti razdvajanjem u jednom sistemu petrol-etar i metanola koji sadrži 10% vode gde se nečistoče prenose u petrol-etarski sloj.

Vodeno-metanolna faza se koncentriše na sniženom pritisku, potom se vodeni ostatak ekstrahuje sa diblormetanom, koji se upari radi dobijanja prečiščenog ciklosporina. Ciklosporin A se može odvojiti od manjih ciklosporinskih komponenti pomoču hromatografije na koloni i prekristalizacijom.

Struktura izolovanih proizvoda razjasnjene su pomoču UV, IR, NMR, ·£ _masenora spektroskopi jom, a aminokiseline analizom.

Sledeči primeri su ilustracije, ali ne ograničavaju domet pronalaska.

Primer 1

Suspenzija konidije i micelijuma koji su dobljeni iz ekstrakt slada-ekstrakt kvasca-agar kose kulture Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, priprema se sa 5 ml jednog 0.9% rastvora natrijum-hlorida. 1 ml ove suspenzije se se koristi da bi se inakulisalo 100 ml sterilnog IC inoculum medi um u erlenmajeru od ml.

Sastav IC medij uma:

Glukoza . go g

Kazein-pepton ' 5 g

Natrijum-nitrat 5 g

Kalijum-dihidrofosfat 2 g

- 10 Kalijum-hlorid θ·5 S

Magnezi j um-sulf at »7^0 θ·5 C

Fero(II)-sulfat·7Η₂Ο 0.01 g u 1000 ml česmenske vode.

pH hranljive podloge se dotera do 5-2 pre sterilizacij θ i smeša sterilise na 121 C tokom 25 min. Kultura se in— kubira na 25°C u rotacionoj mučkalici (54-0 r.p.m.), zatim se uzimaju obroči od 5 ovog inoculum roedium radi inokulisa— nja petnaest erlenmajera od 500 ml, koji sadrže po 100 ml FC^ sterilne podloge.

Sastav FC^ podloge:

Glukoza 6 Tripton 4-0 g Urea 2 g Amonijum-sulfat - 12 g Natrijum-nitrat 3 g Kalijura-dihidrofosfat 2 g Kalijum-hlorid 0.5 g Magnezij um-sulf at ·7Η₂0 0.5 g Fero(II)-sulfat’7H₂0 0.01 g u 1000 ml vode iz česme.

pH hranljive podloge se dotera do 5·2 pre sterilizacije i smeša se sterilizuje na 121°U tokom 25 minuta.

Baloni se inkubiraju na rotacionoj mučkalici (54-0 r.p.m.) na 25°C. Tokom fermentacije, antibiotička koncentracija bujena se kontroliše pomoču difuzionog testa na ploči.

Kao test-organizam upotrebljava se Aspergillus niger. Konz centracija ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa u bujonu se ispituje koristeči ciklosporin A kao standard.

Fermentacija.se nastavlja tokom 168 sati, kad bujon sadrži 400 ^g/ml ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa. Ciklosporinski kompleks se izoluje prema'sledečem postupku: Čelije iz jedne litre bujona se filtruje i antibiotici se isperu dvaput sa 200 ml metanola. Vodeni rastvor metanola se koncentruje pod sniženim pcitiskom, potom se antibiotički se ekstrahuje sa 200 inl n-butil—acetata. n—Butil-acetatni ekstrakti se spoje, suše iznad anhidrovanog natrijum-sulfata zatim upare na sniženom pritisku na 40°C. Dobljenih 5.7 g sirovog proizvoda se rastvore u lu ml metanola i prenesu na vrh gel-kolone odSephadex-LH-20 (kolona dužine 4-0 cm, prečnika 2,5 cm) pripravljene sa metanolom. Potom se lipidne nečistoče odvoje eluiranjem sa metanolom. Frakcije koje sadrže ciklosporinski kompleks upare se pod sniženim pritiskom na 4O°C. Razdvajanje komponenti dobijenog ciklosporinskog kompleksa (1.05 g) se izvodi pomoču hromatognafije na silikagel koloni, koja je napravljena od 20 g Kieselgel 40 (Reanal, Budapest), eluiranjem sa hloroform-metanolnom smešom, koja sadrži metanol čija se zapremina postepeno povečava. Eluiranje se otpočne sa 100 ml hloroforma, potom nastavlja sa smešom hloroform-metanol u kojoj se sadržaj metanola povečava za 0.5% na svakih 100 ml smeše. Sadržaj ciklosporina iz frakcije se kontroliše pomoču tanko-slojne hromatografije (ploča: Kieselgel 60 ^254» Alufoil /Merck/, razvijaš: smeša etil-acetat-izopropanol 95:5» detekcija:jodne pare). Ciklosporini A, B i C se eluiraju iz kolone pomoču smeše metanol-hloroform, koja sadrži 2.0%, 2.5% i 3.0% metanola. Frakcije koje sadrže čiste komponente su uparene pod sniženim pritiskom; prinos: 225 mg ciklosporina A (t.t : 137-14O°C,./Z/pj -189° /metanol/), 25 mg ciklosporina B (t.t.: 149-151°0) i 52 mg ciklosporina C (t.t.: 15O-152°C).

Primer 2

Pet litara IC inokulum medijuma, sterilisanog na

121°C tokom 45 minuta u laboratorijskom fermentoru od 10 li✓ tara, inokuliše se sa 200 ml muckane inokulum-kulture, napravljene kao što je opisano u primeru 1, potom inkubira na 25°C, meša na 750 r.p.m i provetrava sa 500 1/h vazduha.

Fermentacija se nastavlja tokom 72 sata, potom se uzme 500 ml ovog inokulum medijuma radi inokuliranja 5 1 FG₂ medijuma, steriliše na 121°C tokom 45 minuta u laboratorijskom fermentoru od 10 litara.

- 12 Sastav FC^ medijuma:

Glukoza

Tripton

Urea

Amonij um-sulf at

Natrij um-nitrat

Kalij um-dihidrofosfat

Magnezi j um-sulf at -7^0

K upri (. 11)-s ulf at · 5^0

Mangan (II)-s ulf at· 7^0

Fero (II) -s ulf at · 7^0 u 1000 ml vode iz česme.

g 40 g 2 6 12 g ε o.5 ε o.5 ε 0.Olg O.Olg O.Olg pH podloge se dotera do 5-2 pre sterilizacije. Inokulisana kultura se inkubira na 25°C, meša sa 750 r.p.m. i provetrava sa 300 l/h.‘

Fermentacija se nastavlja pod gornjim uslovima tokom 144 sata, dok se ne dostigne pik ciklosporinskih titara, potom se žanje bujon.

Ciklosporin A je izolovan iz 4.8 litara fermentiranog bujona, koji sadrži 500 ug/ml ciklosporinskog kompleksa sledečim postupkom.

čelije mikroorganizma centrifuguju se i ciklosporinski kompleks ispira od celija sa 2 x 1 litar metanola. Vodeno-metanolni rastvor se koncentruje pod sniženim pritisku, zatim se antibiotički kompleks ekstrahuje iz vodenog koncentrata sa 2 x 250 ml n-butil-acetata. '

Ciklosporinski kompleks se ekstrahuje iz filtrata fermentiranog bujona sa 2 x 250 ml n-butil-acetata. Svi nbutil—acetttni ekstrakti se suoje, suae iznad anhidrovanog natri jum-sulfata, z.tim se r·.stvor upari pod sniženim pritiskom na 40°C. Prethodno prečiščevanje dobijenog sirovog proizvoda (19.2 g) se izvodi pomoču hromatogr-ifije na koloni napravijenoj od luO g hieselgel 60 (veličina čestica

- 15 0.065 do 0.2 mm), sa rastvucačima za razvijanje hloroformmetanol-aceton (92:4:4). Frakcije koje sadrže ciklosporinski kompleks (tanko-slojna hromatografska analiza; ploča: Kieselgel 60 F₂^_/p DC Alufoil /Merck/; razvijač: heksanaceton 2:1; detekcija: hlor/tolidin reagens) su uparene do suva. Ostatak uparavanja (5-28 g) se podvrgava hromatografij na koloni da bi dobili ciklosporin A. Kolona je napunjena sa 115 g Kieselgel 60 (veličina cestica 0.065 do 0.2 mra) i eluira se sa smešom heksan-aceton, koja sadrži postepeno povečane zapremine acetona. Ciklosporin A se eluira iz kolone sa smešom, koja sadrži 25% acetona. Uparavanjem frakcija, koje sadrže ciklosporin A dobijeno je 1.46 g ciklosporina A.

Primer 5

Suspenzija konidije ili micelijuma iz kose kulture Tolypocladium varium sp. nov. CY/95 na agaru sa ekstraktom slada i ekstraktom kvasca, napravi se sa 5 ml jednog 0.9% rastvora natrijum-blorida, te uzima da bi se inokulisalo 800 ml IC inoculum medium, koji je opisan u primeru 1, i steriliše u erlenmajeru od 5 litre. Balon se inkubira na rotaciohoj mučkalici (540 r.p.m.) na 25°C tokom 2,5 dana, potom se 5 litara jedne FC^ podloge steriliše u laboratorijskom fermentom od 10 litara na 121°C tokom 45 minuta i inokuliše s njim. ·

Sastav FC^ podloga:

Sorboza	60	g
Tripton	40	g
Urea	2	g
Amoni j um-s ulfat	12	g
Natrijum-nitrat	5	g
Kalij um-dihidrofosfat	2	g
Kalijum-hlorid	0.5	G
Magnezij um-sulfat·7Ho0	o.5	<*· 6
Mangan(II)-sulfat·71^0	0.01	G
Gvoždje(II)-sulfat«7H2O	0.01	G

u 1000 ml vode iz česme.

- 14 i pH podloge se dotera do 5.2 pre sterilizacije. Inokulisana kultura se inkubira na 25°C, meša sa 1000 r.p.m i provetri sa 3θθ 1/h.

Fermentacija se nastavlja tokom 168 sati, kada fermentirani bujon sadrži 600 mcg/ml ciklosporinskog kompleksa prema mikrobskoj analizi.

Izolovanjem kao što je opisano u primeru 2, dobija se 310 mg ciklosporina A iz 1 litre bujona.

Primer 4

Suspenzija konidije ili micelije od 5 do 10 dana stare kose kulture Tolypocladiura varium sp. nov. ΟΥ/93 na agaru uz ekstrakt slada i ekstrakt kvasca, napravljena sa 5 ml jednog 0.9% rastvora natrijum-blorida, uzima se radi inokulisanja 5θθ ml IC inoculum medium opisan u primeru 1, i sterilisan u erlenmajeru od 3 litre. Potom se balon inkubira na rotacionoj muckalici (340 r.p.m.) na 25°C tokom 3 dana, zatim se 5 litara FC^-podloge, koja je sterilisana u laboratorijskom fermentom od 10 litara na 121°C tokom 45 minuta, inokuliše s njim.

Sastav FC^ podloge:

Maltoza	80	g
Tripton	40	g
Urea	2	g
Amonij um-s ulfat	12	g
Natrij um-nitrat	3	g
Kalij um-dibidrofosfat	2	g.
KalijzUm-hlorid	0.5	g
Magnezi j um-s ulf at· 7^0	0.5	G
Mangan(II)-sulfat«7H20	0.01	C
Bak.ir( II )-s ulfat ·5ΗοΟ c.	0.01	rr u>
Gvoždje(II)-sulfat-71L,0	0.01	G
u 1000 ml vode iz česme. •	-
pH podloge se dotera do 5.2	pre s	terilizacij

- 15 Posle inokulisanja fermentisani bujon se inkubira na 25°C, meša sa 1000 r.p.m. i provetrava sa 300 1/h.

Fermentacija se nastavlja tokom 144 sati, kada fermentirani bujon sadrži 620 mcg/ml ciklosporinskog kompleksa prema mikrobskoj analizi.

Izolovanj e se vrši postupkom, koji je opisan u primeru 1. Tako se dobija 3θ5 mg ciklosporina A iz 1 litre bujona.

Primer 5

Suspenzija konidije ili micelije od 5 do 7 dana stare kose kulture Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 (NCAIM(P)F 001005) na agaru uz ekstrakt slada i ekstrakt kvasca, dobijena sa 5 ml jednog 0.9% rastvora natrijumhlorida, uzima se da bise inokulisalo 500 ml IC inoculum medi um opisan u primeru 1, i koji je starilrsan u erlenmajeru od 3 litre. Balon se inkubira na rotacionoj mučkalici (340 r.p.m.)·na 25°C tokom 2 dana, potom se 5 litara FC^ podloge,, sterilisano u laboratorijskora fermentoru od 10 li tara na 121°C tokom 45 minuta, inokuliše s njim. Posle ino kulisanja fermentisani bujon se meša sa 750 r.p.m. na 25°C i provetrava sa 3θθ 1/h. Posle kultivisanja tokom 96 sati dodaje se sterilisani vodeni rastvor od 100 g maltoze i fermentacija nastavi do 144. sata, kada bujon sadrži 950 mcg/ml ciklosporinskog kompleksa prema mikrobskoj analizi. Ukupno se žanje 4.8 litara bujona. Izolovanje se izvodi prema postupku opisan u primeru 2, što daje prinos od 2.75 g ciklosporina A.

- 16 Najbolji način koji je poznat podnosiocu prijave za koriščenje pronalaska u privredi

Ovaj pronalazak se najbolje može koristiti ako se realizuje na sledeči način:

Suspenzija konidije i micelije dobijeni iz kose kulture Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 na agaru uz ekstrakt slada i ekstrakt kvasca, priprema se sa 5 ml jednog 0.9% rastvora natrijum-hlorida. 1 ml ove suspenzije se koristi da bi se inakulisalo 100 ml sterilnog IC inoculum medium u erlenmajeru od 500 ml.

Sastav IC medijuma:

Glukoza	60	g
Kazein-pepton	5	g
Natrijum-nitrat	3	g
Kalij um-dihidrofosfat	2	g
Kalij um-hlorid	0.5	g
Magnezij um-s ulf at · 7^0	0.5	g
Gvožd j e (II) -s ulf at ·	0.01	g

u 1000 ml vode iz česme.

pH hranljive podloge se dotera do 5·2 pre sterilizacije i smeša steriliše na 121°C tokom 25 minuta. Kultura se inkubira na 25°C u rotacionoj mučkalici (5^z,-0 rp.m.), zatim se uzimaju obroči od 5 ml ovog inoculum medi um radi inokulisanja petnaest erlenmajera od 500 ml, koji sadrže po 100 ml P.C^ stecilne podloge.

Sestav PC₁ podloge:

Glukoza	80
Tripton	40
Urea	2
Amonij um-s ulfat	12
Natrijum-nitrat	'J
Kalij um-dihidrofosfat	2
Kalijum-hlorid	0
M··«gn e z i j um-s u 1 f a t · 7H	0

u 1000 ml vode iz česme.

pH hranljive podloge se dotera na 5-2 pre sterilizacije i smeša se sterilizuje na 121 C tokom 25 minuta.

Baloni se inkubiraju na rotaciono j mešalici (3^/!·θ r.p.m.) na 25°C. Tokom fermentacije antibiotička koncentracija bujona se kontroliše pomoču difuzionog testa na ploči.

Kao test-organizam upotrebljava se Aspergillus niger.Koncentraci j a ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa u bujonu se ispituje koristeci ciklosporin A kao standard.

Fermentacija se nastavlja tokom 168 sati, kad bujon sadrži 400yug/ml ciklosporinskog antibiotičkog kompleksa. Ciklosporinski kompleks se izoluje prema sledečem postupku: Čelije iz jedne litre bujona se filtruju i antibiotici se isperu dvaput sa 200 ml metanola. Vodeni rastvor metanola se koncentruje pod sniženim pritiskom, potom se antibiotički kompleks ekstrahuje iz vodenog koncentrata sa 2 x 50 ml n-butil-acetata. Sadržaj ciklosporina iz bujonskog filtrata se ekstrahuje sa 200 ml n-butil-acetata. n-Butil-acetatni ekstrakti se spoje, suše iznad anhidrovanog natrijum-sulfata zatim upare na sniženom pritisku na 40°C. Dobljenih $.7 g sirovog proizvoda se rastvori u 10 ml metanola i prenese na vrh gel kolone Sephadex-LH-20 (kolona dužine 40 cm, prečnika 2,5 cm) pripremljene sa metanolom. Tada se lipidne nečistoče odvoje eluiranjem sa metanolom. Frakcije koje sadrže ciklosporinski kompleks se upare pod sniženim pritiskom na 40°C. Razdvajanje komponenti dobijenog ciklosporinskog kompleksa L 1.05 g) se izvodi pomoču hromatografije na silikagel koloni, koja se pravi od 20 g Kieselgel 40 (Seanal, Budapest) eluiranjem sa hloroform-metanolnom smešom, koja sadrži metanol čija se zapreraina postppeno povečava. Eluiranje se počne sa 100 ml hloroforma, potom nastavlja sa smešom hloroformmetanol u kojoj se s držaj metanola povečava za 0.5?) n··» svakih 100 ml smeše. Oadržaj ciklosporina iz fr kcije kontroliše se pomoču tanko-slojne hromatografije (ploča:Kieselgel 60 1*254» DC Alufoil /Merck/, razvijač: smeša etil-acetatizopropanol 95:5, detekcija: jodne pare.) Ciklosporini A,

B i C se eluiraju iz kolone pomoču smeše metanol-hloroform koja sadrži 2.O#, 2.5$ i 3·θ$ metanola. Frakcije koje sadr že čiste komponente su uparene pod sniženim pritiskom, prinos: 225 mg ciklosporina A (t.t. 15?-14O°C, / /^: -189° /metanol/, 25 mg ciklosporina B (t.t. 14-9-151°C) i 52 mg ciklosporina C (t.t. 15O-152°C).

Claims (5)

1. Mikrobni postopek za proizvodnjo ciklosporinskega kompleksa ali njegovih komponent, ciklosporina A, ciklosporina B in ciklosporina C, z aerobno fermentacijo vlaknastega glivičnega seva, pri čemer se biosintetizira gornji antibiotik(e) v hranljivi podlagi, ki vsebuje uporabne vire ogljika in dušika, kot tudi mineralne soli, in izolirajo nastali produkti, označen s tem, da obsega kultiviranje seva nove glivične vrste Tolypocladium varium, ki tvori ciklosporinski antibiotični kompleks, na hranljivi podlagi, ki vsebuje vire ogljika, organske in anorganske vire dušika, kot tudi mineralne soli, pod aerobnimi pogoji, pri 25 - 35 °C in, če je želeno, izolacijo in čiščenje ciklosporinskega antibiotičnega kompleksa ali njegovih nastalih komopnent.

2. Postopek, kot je zahtevan v zahtevku 1, v katerem kot glivični sev uporabimo Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, ki je deponiran v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budimpešta, Madžarska, pod številko NCAIM(P)F 001005.

3. Postopek, kot je zahtevan v zahtevku 1, znotraj katerega izvedemo fermentacijo na podlagi za kultiviranje, katera vsebuje pepton, amonijev sulfat in tripton, kot vir dušika, in glukozo, maltozo in sorbitol, kot vir ogljika.

4. Tolypocladium varium fimgus sp.

5. Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, kije deponiran v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budimpešta, Madžarska, pod številko NCAIM(P)F 001005.