WO2004050890A1

WO2004050890A1 - マクロライド系化合物の製造方法

Info

Publication number: WO2004050890A1
Application number: PCT/JP2003/015170
Authority: WO
Inventors: Akifumi Okuda; Satoshi Yamamoto; Takashi Sakai; Susumu Takeda; Takashi Nakashima; Katsura Kaneko; Tomohiro Sameshima; Taira Kato; Naoto Kawamura
Original assignee: Mercian Corporation; Eisai Co., Ltd.
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2004-06-17
Also published as: RU2005120390A; AU2003284469B2; US20060141589A1; NZ540103A; EP1580278A1; AU2003284469A1; CA2507641A1; JPWO2004050890A1; RU2330069C2; BR0316746A; EP1580278A4; NO20052568L; MXPA05005672A; NO20052568D0; KR20050086873A; US7745198B2; CN1717493A; JP4439401B2

Description

明細書，マクロライド系化合物の製造方法発明の属する技術分野

本発明は、抗腫瘍活性を有する 12員環マクロライド系化合物 11107D物質の生物学的変換による製造方法およびそれに用いられる新規菌株に関する。従来の技術

12員環マクロライド系化合物 11107D物質は、優れた抗腫瘍活性を有する 12員環マクロライド系化合物であり、 11107B物質とともにストレプトミセスエスピー (Streptomyces sp. ) Mer_11107株の培養物より見出されたものである（WO— A 0 2 / 0 6 0 8 9 0参照）。 11107D物質は、 11107B物質の 16位水酸化体に相当するが、その生産性は 11107B物質の生産性よりも少なく、効率的な製造方法の確立が望まれていた。発明の開示

本発明の課題は、マクロライド系化合物 11107B物質を出発原料とした、生物学的変換方法によるマクロライド系化合物 11107D物質の新規な製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために広範な微生物群からマクロライド系化合物 11107B物質の 16位水素原子を水酸基に変換しうる微生物のスクリーニングを試みたところ、糸状菌に分類されるモルティエレラ（Mortierella) 属に属する菌株、放線菌に分類されるストレプトミセス（Streptomyces)属に属する菌株および同じく放線菌に分類されるミクロモノスポラセァェ（Micromonosporaceae) 科に属する菌株が前記変換能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下の（1 ) 〜（3 ) に関する。

( 1 ) 式（I )

( I )

で示されるマクロライド系化合物 11107B物質の、式（II)

(II) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への生物学的変換方法による、式 (II) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質の製造方法であって、下記工程（A) 及び（B) を含むことを特徴とする製造方法。

(A) 前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、モルティエレラ (Mortierella) 属、ストレプトミセス（Streptomyces)属またはミクロモノスポラセァェ (Mi cromonosporaceae) 科に属する菌株またはその培養菌体の調製物の存在下で、式 (I) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質をインキュベーション処理する工程。

(B) 工程 (A) で得られるインキュベーション処理液から式 (II)で示されるマク口ライド系化合物 11107D物質を採取する工程。 ( 2 ) 前記モルティエレラ属に属する菌株がモルティエレラエスピー

(Mortierella sp. ) F - 1529株 (FERM BP - 8547)または F- 1530株 (FERM BP- 8548)である前記（1 ) 記載の製造方法。

( 3 ) 前記ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセスエスピー (Streptomyces sp. ) AB- 1704株（FERM BP- 8551)、 A- 1544株（FERM BP- 8446)または A- 1545株 (FERM BP- 8447)である前記（1 ) 記載の製造方法。

( 4 ) 前記ミクロモノスポラセァ工科に属する菌株カ B- 1896株 (FERM BP- 8550)である前記（1 ) 記載の製造方法。

( 5 ) 前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式 (Π) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、ストレプトミセスエスピー（Streptomyces sp. ) AB-1704株（FERM BP- 8551)。

( 6 ) 前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、モルティエレラエスピー (Mortierella sp. ) F- 1529株 (FERM BP- 8547)または F- 1530株 (FERM

BP- 8548)。

( 7 ) 前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 AB-1896株（FERM BP- 8550)。発明の詳細な説明

本発明の生物学的変換方法では、モルティエレラ（Mortierella) 属、ストレプト ^セス (Streptomyces)属またはミクロモノスホラセァェ (Micromonosporaceae) 科に属する微生物であって、前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B 物質から前記式 (I I)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質へ変換する能力を有する微生物であれば、種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物として、いずれも土壌から分離されたモルティエレラ属に属するモルティエレラエスピ一（Mortierella sp. ) F- 1529株および F- 1530株、ストレプトミセス属に属するストレプトミセスエスピー（Streptomyces sp. ) AB-1704株、 A- 1544株および A- 1545株、ミクロモノスポラセァ工科に属する AB- 1896株等を挙げることができる。 '

Mer- 11107株は、FERM P - 18144として平成 12年 12月 19日付で日本国 305 - 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成 13年 11月 27日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D) において、これを国際寄託 FERM BP- 7812に移管された。

モルティエレラエスピー（Mortierella sp. ) F- 1529株は、日本国 305- 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 5年 1 1月 1 2日付けで FERM BP - 8547として国際寄託されている。また、モルティエレラエスピー（Mortierella sp. ) F-1530株は、同じく日本国 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 5年 1 1月 1 2日付けで FERM BP-8548として国際寄託されている。

ストレプトミセスエスピー（Streptomyces sp. ) AB-1704株は、日本国 305- 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 4年 9月 5日付で、 FERM P-18999として寄託され、さらに平成 1 5年 1 1月 1 2日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D)におレヽて、これを国際寄託 FERM BP - 8551に移管された。また、 A - 1544株、 A - 1545株は、同じく日本国 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 4年 7月 2 3日付でそれぞれ FERM P- 18943および FERM P- 18944として寄託され、さらに平成 1 5年 7月 3 0日付で日本国 305- 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D)において、それぞれ国際寄託 FERM BP- 8446および FERM BP - 8447に移管された。

ミクロモノスポラセァ工科に属する AB- 1896株は、日本国 305- 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 5年 1 1月 1 2日付けで FERM BP - 8550として国際寄託されている。なお、上記菌株の菌学的性状は次のとおりである。

[F-1529株の菌学的性状]

(1) 形態

オートミールァガー（Oatmeal Agar：以下 OAと略称する場合がある），モノレトァガ一 (Malt Agar： 2% Malt extract + 1. 5% Agar：以下 MEAと略称する場合がある），ポテトデキストロースァガー（Potato Dextrose Agar：以下 PDAと略称する場合がある）のプレートにおいて、コロニーは羊毛状（floccose)を示し、菌糸色は白色で white Α-l)の色調を呈する。 25°C、 1週間培養における生育は OAプレートで 75隱、 MEAプレートで 75〜80匪、 PDAプレートで直径 75〜80匪に達する。コ口ニーは花笠状の形状を示す。裏面着色及び可溶性色素の産生は認められない。色調に関する記述は「メチューン 'ハンドブック ·ォプ，カラー [ ethuen Handbook of Colour (Kornerup & Wanscher, 1978) ]に従った。

光学顕微鏡による観察の結果、栄養菌糸は無色、表面は平滑で、隔壁は無く、菌糸の幅は 4〜5 μ πιとなる。菌糸の一部に球状で 26. 5〜33 /z m位の厚壁胞子の様な膨らんだ構造が観察された。供試した培地においては最長 3週間の培養でも生殖器官と思われる構造は形成しなかった。

(2) 18S rRNA遺伝子解析

F - 1529株の寒天平板培養菌体を FastPrep FP120 (Q- BlOgene社製）及び Fast DNA Kit (Q- BlOgene社製）を用いて DNA抽出を行った。 PCRは puReTaq Ready- To- Go PCR beads (Amersham Biosciences社製）と表 1及ぴ表 2に示す PCRプライマー NS1及び NS8を用いて実施した。 PCR産物は QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 ABI Prism BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems社製）に用いた。シークェンシンダプライマ一は表 1及び表 2に示す

1, ^2, ^3，^4, 5, ^6, ^7及ぴ^8を用ぃた。反応生成物は DyeEx2. 0 Spin Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製）で配列解読を行い、 AutoAssembler (Applied Biosystems社製）を用いて各シークェンス断片を結合し、目的塩基配列を得た。表 1 18S rRNA遺伝子の塩基配列決定に使用したプライマー（順方向）

得られた本菌株の 18S rRNA遺伝子は、配列番号 9に記載の塩基配列を有する。 ' 日本 DMAデータバンク（http：〃 ww. ddbj. nig. ac. jp/)より公知菌株の DNA塩基配列を入手し、 18S rRNA遺伝子の相同性を調べた。その結果、 Mortierella hyalina (GenBank, accession no. AY157493)の 18S rRNA遺伝子と 99% (上流 803塩基）、 Mortierella chlaraydospora (GenBank, accession no. AF157143)の 18S rRNA遺 1s 子と 98% (全長) _N Mortierella multidivaricata (GenBank, accession no. AF157144) の 18S rRNA遺伝子と 98% (全長）の相同性を示した。

以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がモルティエレラ（Mortierella)属に属すると判断した。 ·

[F- 1530株の菌学的性状]

(1) 形態

オートミーノレァガー（Oatmeal Agar) ，モノレトァガー（Malt Agar) , ポテトデキストロースァガー (Potato Dextrose Agar) のプレートにおいて、コロニーは綿毛状（cottony)を示し、菌糸色は白色で white lA- 1)の色調を呈する。 25°C、 1週間培養における生育は 0Aプレートで 80〜85腿、 MEAプレートで 85mm、 PDAプレートで直径 85mmに達する。コロニーは花笠状の形状を示す。裏面着色及び可溶性色素の産生は認められない。色調に関する記述は「メチューン 'ハンドブック 'ォブ 'カラー LMethuen Handbook of Colour (Kornerup k Wanscher, 1978) ]に従った。

光学顕微鏡による観察の結果、栄養菌糸は無色、表面は平滑で、隔壁は無く、菌糸の幅は 2. 5〜5 // 111となる。菌糸の一部に球状で 10 _μ πι位の厚壁胞子の様な膨らんだ構造が観察された。供試した培地にお！/、ては最長 3週間の培養でも生殖器官と思われる構造は形成しなかった。

(2) 18S rRNA遺伝子解析

F - 1529株と同様の手法で F- 1530株の 18S rRNA遺伝子を解析した。

得られた F-1530株の 18S rRNA遺伝子は、配列番号 1 0に記載の塩基配列を有する。日本 DNAデータバンク（http :〃雨. ddbj. nig. ac. jp/)より公知菌株の DNA塩基配列を入手し、 18S rRNA遺伝子の相同性を調べた。その結果、 Mortierella hyalina (GenBank, accession no. AY157493)の 18S rRNA遺伝子と 100% (上流 803塩基）、 Mortierella chlamydospora (GenBank, accession no. AF157143)の 18S rRNA遺伝子と 98% (全長) 、 Mortierella multidivaricata (GenBank, accession no. AF157144) の 18S rRNA遺伝子と 98% (全長）の相同性を示した。

以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がモルティエレラ（Mortierella)属に属すると判断した。

[AB-1704株の菌学的性状]

(1) 形態

基生菌糸より直状 (Rectiflexibiles type)の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に 20〜50個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは0. 6〜0. 8ズ1. 0〜1. 1 111位で、胞子の表面は平滑状（smooth)を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。

(2) 各種培地における生育状態

各種培地上で 28°C、約 2週間培養後の培養性状を表 3に示す。色調の記載はトレズナ一のカラー 'ホイールズ（Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す符号で表示する。

表 3

(3) 各種炭素源の同化性

プリドハム · ゴトリープ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、培養 2週間後の生育状況を表 4に示す。

表 4

+：同化する、士：多少同化する、 ―：殆ど同化しない

(4) 生理学的諸性質

本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。

(a)生育温度範囲（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）： 5°C 33°C

(b)生育至適温度（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）： 15°C 33°C

(c)ゼラチンの液化（グルコース ·ペプトン ·ゼラチン培地）：陽性 (d)ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陽性

(e)ミルクのぺプトン化 (スキムミルク培地) ：陽性

(f)スターチの加水分解 (スターチ ·無機塩寒天培地）：陽性

(_g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン 'イースト .鉄寒天培地）：陰性

(チロシン培地）：陰性

(h)硫化水素の産生 (ペプトン 'イースト '鉄寒天培地）：陰性

(i)硝酸塩の還元 (0. 1%硝酸カリ含有プロス）：陽性

(j)食塩の耐性 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）：食塩含有量 7 %以下で生育

(5) 菌体成分

本菌の細胞壁から LL型のジァミノピメリン酸が検出された。

以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がストレブトミセス（Streptomyces) 属に属すると判断した。

[A-1544株の菌学的性状]

(1) 形態

基生菌糸より螺旋状 (Spira type)の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に 10〜20個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは 1. 0 X 1. 2〜1. 4 μ πι位で、胞子の表面はトゲ状（spiny)を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。

(2) 各種培地における生育状態

各種培地上で 28°C、約 2週間培養後の培養性状を表 5に示す。色調の記載はトレズナ一のカラー ·ホイールズ（Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す符号で表示する。

表 5

(3) 各種炭素源の同化性

プリードハム · ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、培養 2週間後の生育状況を表 6に示す。

表 6

+：同化する、一：殆ど同化しない

(4) 生理学的諸性質

本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。

(a)生育温度範囲（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）： 15°C〜41°C (b)生育至適温度（ィースト .麦芽寒天培地、 2週間培養）： 20°C〜37°C

(c)ゼラチンの液化（グルコース 'ペプトン 'ゼラチン培地）：陽性

(d)ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陽性

(e)ミルクのぺプトン化（スキムミルク培地）：陽性

(f)スターチの加水分解（スターチ ·無機塩寒天培地）：陽性

(g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン 'イースト ·鉄寒天培地）：陽性

(チロシン培地）：陰性

(h)硫化水素の産生 (ぺプトン 'イースト .鉄寒天培地）：陽性

(i)硝酸塩の還元（0. 1%硝酸カリ含有ブロス）：陰性

G)食塩の耐性 (イースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）：食塩含有量 7 %以下で生育

(5) 菌体成分

以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がストレプトミセス（Streptomyces) 属に属すると判断した。

[A- 1545株の菌学的性状]

(1) 形態

基生菌糸より直状（Rectiflexibiles type)の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に 50個以上の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは 0. 8 Χ 1. 0 μ m位で、胞子の表面は平滑状（smooth)を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。

(2) 各種培地における生育状態

各種培地上で 28°C、約 2週間培養後の培養性状を表 7に示す。色調の記载はトレズナ一のカラー ·ホイールズ（Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す符号で表示する。

表 7

(3) 各種炭素源の同化性

プリ一ドハム · ゴトリープ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、培養 2週間後の生育状況を表 8に示す。

表 8

+：同化する、土：多少同化する、一：殆ど同ィ匕しない

(4) 生理学的諸性質本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。

(a)生育温度範囲（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）： 10°C〜37°C

(b)生育^適温度 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）： 20°C〜33°C

(c)ゼラチンの液化（グルコース 'ペプトン 'ゼラチン培地）：陰性

(d)ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陽性

(e)ミルクのぺプトン化（スキムミルク培地）：陽性

(g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地）：陰性

(チロシン培地）：陰性

(h)硫化水素の産生 (ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地）：陽性

(i)硝酸塩の還元（0. 1%硝酸力リ含有ブロス）：陰性

(5) 菌体成分

[AB - 1896株の菌学的性状]

(1)形態

AB- 1896株は菌株同定に使用した培地上 28°C、 7〜14日間培養において良好もしくは中程度の生育を見せる。 ±咅養中気菌糸は観察されず、基生菌糸上に 1個ずつ胞子が観察される。胞子は球形で、大きさは約 0. 8〜0. 9 μ ηι、胞子の表面はイボ状 (warty) である。胞子嚢、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。

(2)各種培地における生育状態 '

各種培地上で 28°C、約 2週間培養後の培養性状を表 9に示す。色調の記載はトレズナ一のカラー ·ホイールズ（Tresner の Color wheels)の色標名と括弧内に示す符号で表示する。 .

表 9

(3)各種炭素源の同化性

プリードハム ' ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、培養 2週間後の生育状況を表 1 0に示す。

表 1 0

+は同化する、一は殆ど同化しない。

(4)生理学的諸性質

本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。

(a)生育温度範囲（イースト '麦芽寒天培地、 2週間培養）： 20°C 41°C

(b)生育至適温度（イースト '麦芽寒天培地、 2週間培養）： 25。C 37。C

(c)ゼラチンの液化（グルコース .ペプトン 'ゼラチン培地）：陰性

(d)ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陽性

(e)ミルクのペプトン化（スキムミルク培地）：陽性

(f)スターチの加水分解スターチ '無機塩寒天培地）：陽性

(g)メラニン様色素の産生（ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地）：陰性

(チロシン培地) ：陰性 (h)硫化水素の産生（ぺプトン .イースト .鉄寒天培地）：陰性

(i)硝酸塩の還元（0. 1%硝酸力リ含有ブロス）：陽性

(j)食塩の耐性（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養）：食塩含有量 4%でも生育しない

(5)菌体成分

AB - 1896株の細胞壁から meso型のジァミノピメリン酸が検出された。全菌体の主要構成糖としてキシロースとマンノースが検出された。細胞壁ぺプチドグリカン中のァシル型はグリコリル型であった。ミコール酸は検出されなかった。主要メナキノン成分として MK- 9 (H₄)、 MK- 9 (H₆)、 MK- 10 (H₄)、 MK- 10 (H₆)が検出された。

(6) 16S rRNA遺伝子解析

AB - 1896株の培養液を集菌後、 Fast DNA Kit (Q_BI0gene社製）を用いて DNA抽出を行つた。 PCRは 96°C20秒、 50°C20秒、 72°C1分を 30サイクルの反応条件で行った。プライマ一は 9F (5' -GTGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ) (配列番号 1 1 ) 及び 536R

(5' -GTATTACCGCGGCTGCTG-3' ) (配列番号 1 2 ) を用いた。 PCR産物は MinElute PCR

Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、シークェンシング用サンプルとした。

シークェンシングは ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製）装置、及ぴ BigDye Terminatorキットを用い、標準のプロトコールに従った。プライマ一は 9F, 536Rを用いた。

得られた本菌株の 16s rRNA遺伝子の 5'末端側の約 500塩基は、配列番号 1 3の通り •でめる。

日本 DNAデータバンク（http：〃 www. ddbj. nig. ac. jp/)より公知菌株の DNA塩基配列を入手し、 16s rRNA遺伝子の 5'末端側 400〜500塩基間の相同性を調べた。その結果、 Micro画 ospora sp. DSM44396 (GenBank, accession no. AJ560637)の 16s rRNA 城伝ナとは 98%、 Micromonospora purpureochromogenes (GenBank, accession no. X92611)遺伝子と 98%、1^ 011)0003 01-3属の基準株でぁる¾!. chalcea IF012135 (GenBank, accession no. D85489)遺伝子と 95%、Verrucosispora属の基準株である Verrucosispora gifhornensis (GenBank, accession no. Y15523)遺伝子と 95%の相同性を示した。

AB- 1896株は大方 Micromonospora属の特徴を持つ力 S、全菌体の主要構成糖としてァラビノースが検出されずマンノースが検出された点で Micromonospora属とは完全には一致しない。また Verrucosispora gifhornensisで見られる特徴的な胞子が菌株同定に使用した培地上では観察されない点で Verrucosispora属とも完全には一致しない。本発明者らは、これらの菌学的性質を総合的に考慮して、 AB 1896株をミクロモノスポーラセァ工科 (Family Micromonosporaceae) に属する放線菌と判断した。

本発明によれば、まず工程（A)において、前記菌株またはその培養菌体調製物、さらに酸素の存在下で、出発原料 (基質)であるマクロライド系化合物 11107B物質がインキュベーション処理される。この処理は前記菌株を好気的条件下で培養する際に、その培養液中に基質を添カ卩して行う力あるいは場合により前記菌株の培養菌体を、例えばそのまま、もしくはホモジナイズした調製物の懸濁液中に基質を添カロし、酸素を含む気体、例えば空気を通気しながらインキュベーションして行うこともできる。

培養液への基質の添加は、培養前または培養開始後一定期間経過したときのいずれの時期に行ってもよい。上記菌体は上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造できる。かかる培養菌体の調製物を用意するための菌株の培養または基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができるが、通常は液体培養による振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。

培養に用いられる培地としては、モルティエレラ（Mortierella) 属、ストレプ卜ミセス (Streptomyces 属 §たはミク口モノスホラセァェ (Micromonosporaceae) 科に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としての、グノレコース、ガラクトース、シユークロース、マノレト-ース、フノレク卜一ス、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、大豆油等を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としては、フアルマメディア、ペプトン、肉エキス、大豆粉、魚粉、グルテンミール、カゼイン、乾燥酵母、アミノ酸、酵母エキス、 NZ- case、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモ-ゥム等の無機窒素源を単独または組み合わせて用いうる。その他、例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシゥム、硫酸マグネシウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、 ±玺ィ匕マンガン、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミン Bおよびピオチン等のビタミン類、シク口デキストリン類のような包接剤も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、各種消泡剤を適宜培地中に添加することができる。消泡剤の添カ卩にあたっては目的物質の生産に悪影響を与えない濃度とする必要がある。

咅養条件は該菌株が良好に生育して上記物質を生産し得る範囲内で適宜選択し得る。例えば培地の pHは 5〜 9程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常 20〜40°C、好ましくは 24~30°Cに保つのが良い。培養日数は 1〜 8日程度で、通常 2〜5日程度である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類ゃ特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。また、培養菌体調製物は、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体またはホモジナイズした菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。菌体の懸濁に使用できる溶液は、前記した培地であるか、あるいはトリスー酢酸、トリスー塩酸、コハク酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの緩衝液を単独または混合したものである。緩衝液の pHは、 5. 0〜9. 0、好ましくは 6. 0〜7. 5である。

基質となる 11107B物質は、粉末のままか、あるいは水溶性有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドなどに溶解して培養液または菌体の懸濁液に添加することができ、その添加量は、例えば、培養液の場合、培養液 1 L当り 50〜5000mgが好ましい。基質添加後は、 20〜31°Cで約 1〜 5日間、振とうあるいは通気攪拌などの操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより基質である 11107B物質を目的の 11107D物質に変換することができる。

次に、工程（B ) において、前記工程（A) で得られたインキュベーション処理液から目的の 11107D物質を採取する。 11107D物質を工程（A) の反応混合物から単離するには、一般に微生物代謝産物を単離するために用いられる種々の既知精製手段を選択、組合せて行うことができる。例えば、メタノール、エタノール、プタノール、アセトン、酢酸ェチル、酢酸プチル、クロ口ホルム、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セフアデックス LH- 20等を用いたゲル濾過ク口マトグラフィー、ダイャイオン HP-20等の疎水性吸着樹脂、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィ一による吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組合せ、場合により反復使用することにより、分離精製することができる。実施例

以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント（％)は、特に断りのない限り、重量パーセント（％(w/v) ) を示す。

参考例 1 (原料である 11107B物質の製造）

ストレプトミセスエスピー（Streptomyces sp. ) !^1-11107株 81¾1 BP- 7812)の斜面培養（ISP- 2培地）から 1白金耳を 50mlの種母培地 [グルコース 2. 0%、大豆粉（ェスサンミート、味の素（株）製） 1. 0%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 5%、塩化ナトリウム 0. 25%、炭酸カルシウム 0. 32%、殺菌前 pH6. 8]を入れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 2日間培養して第一段種母培養液を得た。この培養液 0· 1mlを同じ種母培地 100mlを入れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 1日間培養して第二段種母培養液を得た。このようにして得た第二段種母培養液 800mlを生産培地 [可溶性澱粉 5. 0%、フアルマメディァ 0. 8%、グルテンミール 0. 8%、酵母エキス 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 1%、殺菌前 pH6. 8] 100 Lを入れた 200 Lタンクに接種し、培養温度 28°Cで攪拌数 90rpm、通気量 1. 0vvm、内圧 20kPaの条件で 5日間通気攪拌培養を行って培養液を得た。

このようにして得た培養液の一部（10 L)を 10 Lの 1ーブタノールにて抽出後、ブタノール層を減圧乾固し、 100 gの粗活性画分を得た。この粗活性画分をセフアデックス LH - 20 (フアルマシア社製、 1500 ml)上に添加し、テトラヒドロフラン一メタノール（1 : 1)の溶媒で溶出した。 540 mlから 660 mlまでに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固し、残渣 (660 mg)を得た。さらにこの残渣を酢酸ェチルおよびメタノール (9 : 1 ; v/v)の混液に溶解し、シリカゲル力ラムクロマトグラフィー（ヮコ一ゲル 0200、 50 g)に付した。このカラムを n—へキサンおよび酢酸ェチル（l : 9 ;v/v)の混液（2 L)で溶出し、 468 mlから 1260 mlまでに溶出した画分を集め、減圧下で濃縮し、粗活性画分を 25mg得た。

得られた粗活性画分を下記の HPLC分取条件 (A)で分取高速液体ク口マトグラフィ — (HPLC)に付し、保持時間 34分に溶出される画分を集め、ァセトニトリルを留去後、下記 HPLC分取条件 (B)にてその画分を HPLCによる脱塩を行うことにより 11107B物質 (保持時間： 37分）を 6 mg得た。

HPLC分取条件 (A)

カラム： YMC-PACK ODS-AM SH - 343 - 5AM, φ 20mmX 250mm (ヮイエムシ—社製) 温度：室温

流速： 10ml/分

検出： 240nm

溶出液：ァセトニトリル /0. 15%リン酸一カリウム（pH3. 5) (2: 8〜8 : 2, v/v, 0〜50 分，リニアグラジェント）

HPLC分取条件 (B)

カラム： YMC-PACK ODS-AM SH-343 - 5AM, φ 20議 X 250mm (ヮイエムシ—社製）温度：室温

流速： 10ml/分

検出： 240nm

溶出液：メタノール/水（2: 8〜10: 0， v/v, 0〜40分, リニアグラジェント）

実施例 1 (AB-1704株の取得）

土壌から分離された菌株の斜面培地 [可溶性澱粉 0. 5%、グルコース 0. 5%、魚肉ヱキス（和光純薬工業（株）製) 0. 1%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 1%·、 NZ-case (フムコ 'シェフィールド 'ケミカル社製） 0. 2%、塩化ナトリウム 0. 2%、炭酸カルシウム 0. 1%、寒天 (和光純薬工業（株）製) 1. 6%]から 1白金耳を Ί mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、ポリペプトン（日本製薬 (株）製) 0. 5%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製) 0. 5%、炭酸カルシゥム 0. 1%]を入れた 65ml容の試験管に接種し、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。

さらに種母培養液 0. 5mlを 7 mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0 %、ポリペプトン（日本製薬（株）製) 0. 5%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 1%]の入った 65ml容の試験管に植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。次に基質である 11107B物質を 25mg/mlエタノール溶液として調製し、 0. 2ml添加した。添加後、 28°Cで 48時間振とうし、変換反応を行つた。反応後、下記の HPLC分析条件 (a)で HPLC分析を行い、反応混合物中に 11107D 物質が生成している株、 AB-1704株（FERM BP-8551)を取得した。

HPLC分析条件 (a)

カラム： CAPCELL PAK C18 SG120, φ 4. 6mmX 250匪（資生堂（株）製）

温度： 40°C

流速： 1 ml/分

検出： 240nm

溶出液：ァセトニトリノレ /0. 15%リン酸一カリウム（pH3. 5) (3 : 7〜5 : 5, v/v, 0〜18 分，リニアグラジェント），ァセトニトリル /0. 15%リン酸一力リウム（pH3. 5) (5： 5 —85： 15, v/v, 18〜22分，リニアグラジェント）

保持時間： 11107D物質 9. 9分、 11107B物質 19. 4分

実施例 2 (A- 1544株および A- 1545株の取得）

土壌から分離された菌株の斜面培地 (ィースト ·麦芽寒天培地）から 1白金耳を 20mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 4%、グルコース 0. 1%、大豆粉（エスサンミート、味の素（株）製） 0. 5%、牛肉エキス（Difco社製) 0. 3%、酵母エキス（Difco社製） 0. 5%、トリプトン.ペプトン (Difco社製） 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 4%]を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。

さらに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 2. 0°/₀、大豆粉 (エスサンミート、味の素（株）製) 2. 0%、酵母ヱキス（オリエンタル酵母ェ業 (株)製) 0. 5%、塩化ナトリウム 0. 25%、炭酸カルシゥム 0. 32%、硫酸銅 0. 0005%、塩化マンガン 0. 0005%、硫酸亜鉛 0. 0005%、殺菌前 ρΗ7· 4]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 28°Cで 4日間振とう培養機上で培養した。得られた培養液 2 mlを 15ml試験管に分注した。次に基質である 11107B物質を 20mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、 0. 05ml'添加した。添加後 28°Cで 23時間振とうし、変換反応を行った。反応後、下記の HPLC分析条件 (b)で HPLC分析を行い、反応混合物中に 11107D物質が生成している株、 A- 1544株 (FERM BP- 8446)および A- 1545株 (FERM BP- 8447)を取得した。

HPLC分析条件 (b)

カラム： CAPCELL PAK C18 SG120, φ 4. 6mm X 250讓（資生堂（株）製）

温度： 40°C

流速： 1 ml/分

検出： 240mn .

溶出液：ァセトニトリノレ/水 (50 ： 50, v/v)ァイソクラティック

保持時間： 11107B物質 7. 2分、 11107D物質 3. 6分

実施例 3 (フラスコスケールにおける AB-1704株による変換)

土壌から分離されたストレプトミセスエスピー（Streptomyces sp. ) AB - 1704株 (FERM BP-8551)の斜面培地 [可溶性澱粉 0. 5%、グルコース 5%、魚肉エキス（和光純薬工業（株）製) 0. 1%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製) 0. 1%、 ΝΖ - case (フムコ ·シェフィールド .ケミカル社製） 0. 2%、塩化ナトリウム 0· 2%、炭酸カルシウム 0. 1%、寒天 (和光純薬工業（株）製） 1. 6%]から 1白金耳を 100mlの種母培地 [可溶性澱粉 2· 0%、グルコース 1. 0%、ポリペプトン（日本製薬（株）製) 0. 5%,酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製) 0· 5%、炭酸カルシウム 0. 1%] を入れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに 100mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0°んグルコース 1. 0%、ポリペプトン（日本製薬（株）製) 0. 5%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 1%]の入った 500ml容の三角フラスコ 150本に種母培養液を 2 mlずつ植え継ぎ、 28°Cで 2日間振とう培養機上で培養した。

得られた培養液 a00ml/500ml容三角フラスコ、 150本）に、 20mg/mlエタノール溶液として調製した、基質である 11107B物質をそれぞれ 0. 44ml添加した。添加後、 28°C で 9時間振とうし、変換反応を行った。反応終了後、培養液を集め、 2700rpm、 10 分間の遠心分離によって培養上清と菌体に分離した。菌体は 5 Lのメタノールで抽出後、ろ過してメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液から減圧下でメタノールを留去した後、培養上清と合わせて、 10 Lの酢酸ェチルにて抽出した。得られた酢酸ェチル溶液を減圧下で濃縮し、 2090mgの粗活性画分を得た。この粗活性画分をテトラヒドロフラン一メタノール（1： 1， v/v)の混液 4 mlおよび 50%ァセトニトリル水溶液 6 mlに溶解し、 0DSカラムクロマトグラフィー（ヮイエムシ一社製、 0DS-A 120-S50 3. 6cm X 43cm)に付し、 40%ァセトニトリル水溶液で溶出した。 336mlから 408mlまでに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固することにより 560mgの残渣を得た。さらにこの残渣を 50%メタノール水溶液 10mlに溶解し、 0DS力ラムクロマトグラフィー（ヮイエムシ一社製 ODS-AM 120-S50 φ 3. 6cm X 40cm)に付し、 50%メタノール水溶液で溶出した。 1344mlから 182½1までに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固することにより、 11107D物質 252mgを得た。

実施例 4 (フラスコスケールにおける A- 1545株による変換）

A - 1545株 (FERM BP- 8447)の斜面培地（ィースト .麦芽寒天培地）から 1白金耳を 25mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 2. 0%、大豆粉（エスサンミート、味の素（株）製) 2. 0%、酵母エキス（D co社製 ) 0. 5%、塩化ナトリウム 0. 25%、炭酸カルシウム 0. 32%、殺菌前 ρΗ7· 4]を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 28°C で 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。この培養液 0. 75mlを 2 ml容のセラムチューブ (住友ベークライト（株）製）に分注し、同量の 40%グリセロール水溶液を添カ卩し、攪拌後— 70°Cで凍結し、凍結種母を作製した。この凍結種母を融解し、そのうち 0. 25mlを 25mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 2. 0%、大豆粉 (エスサンミート、味の素（株）製) 2. 0%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業 (株）製) 0. 5%、塩化ナトリウム 0· 25%、炭酸カルシウム 0. 32%、殺菌前 ρΗ7. 4]を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに種母培養液 0. 5mlを 100mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 2. 0%、大豆粉 (エスサンミート、味の素（株）製) 2. 0%、酵母エキス（ォリェンタル酵母工業（株）製) 0. 5%、塩化ナトリウム 0. 25%、炭酸カルシウム 0. 32%、殺菌前 pH7. 4]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。

得られた培養液（100ml/500ml容三角フラスコ、 10本）、それぞれについて 3000rpm、 10分間の遠心分離を行い集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH6. 0) 100mlに懸濁した。次に基質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、それぞれ ΙηιΓ添加した。添加後、 28°Cで 24時間振とうし、変換反応を行った。反応終了後、反応液を集め、 5000rpm、 20分間の遠心分離によって、上清と菌体に分離した。上清は 1 Lの酢酸ェチルにて抽出した。菌体は 500mlのメタノールで抽出後、ろ過してメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液から減圧下でメタノ一ルを留去した後、 1 Lの酢酸ェチルで抽出した。それぞれの酢酸ェチル層を水洗し、無水硫酸ナトリウムにて脱水乾燥後、合わせて減圧下で濃縮し、 937mgの粗画分を得た。この粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60，50g)に付し、酢酸ェチルおよび n—へキサン（90： 10； v/v)の混液 1200mlで溶出し、 11107D物質を含む画分 234mgを得た。得られた活性画分を下記分取条件 (C)で分取高速液体クロマトグラフィー (HPLC)に付し、得られる溶出液を下記の分析条件 (c)で HPLC分析した。こうして得られた 11107D物質を含む画分から、溶媒を留去することにより、 11107D 物質 80mgを得た。 '

HPLC分取条件 (C)

カラム： CAPCELL PAK C18 UG120, ψ ³0mmX 250mm (資生堂（株）製）

流速： 20ml/分

検出： 240nm

溶出液：ァセトニトリル/水（30： 70, v/v)アイソクラティック

HPLC分析条件 (c) カラム： CAPCELL PAK C18 SG120, φ 4. 6瞧 X 250議（資生堂（株）製）温度： 40°C

流速： 1 ml/分

検出： 240nm

溶出液：ァセトニトリノレ/水（35： 65, v/v)アイソクラティック

保持時間： 11107D物質 7. 8分

実施例 5 (フラスコスケールにおける A - 1544株による変換)

実施例 4と同様の方法にて得られた A- 1544株（FERM BP - 8446)の培養液

(100ml/500ml容三角フラスコ、 10本）、それぞれについて、 3000rpm、 10分間の遠心分離を行い集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH6. 0) 100mlに懸濁した。次に基質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、それぞれ 1 ml添カロした。添加後、 28°Cで 24時間振とうし、変換反応を行った。反応終了後、反応液を集め、 5000rpm、 20分間の遠心分離によって、上清と菌体に分離した。上清は 1 L の酢酸ェチルにて抽出した。菌体は 500mlのアセトンで抽出後、ろ過してアセトン抽出液を得た。アセトン抽出液から減圧下でアセトンを留去した後、 1 Lの酢酸ェチルで抽出した。それぞれの酢酸ェチル層を水洗し、無水硫酸ナトリウムにて脱水乾燥後、合わせて減圧下で濃縮し、 945mgの粗画分を得た。この粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60， 50g)に付し、酢酸ェチルおよび η— へキサン（50： 50； v/v)の混液 100ml、酢酸ェチルおよび n—へキサン（75： 25； v/v) の混液 200ml、酢酸ェチルおよび n—へキサン（90 ： 10 ； v/v)の混液（600ml)で溶出し、 11107D物質を含む画分 463mgを得た。得られた画分を実施例 4記載の分取条件 (C)で分取高速液体ク口マトグラフィー (HPLC)に付し、得られる溶出液を実施例 4 記載の分析条件（c)で HPLC分析した。こうして得られた 11107D物質を含む画分から、溶媒を留去することにより、 11107D物質 304mgを得た。

実施例 6 (F- 1529株およぴ F- 1530株の取得）

土壌から分離された菌株の斜面培地（ポテトデキストロース寒天培地）から 1白金耳を 20mlの種母培地（馬鈴薯澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、大豆粉（エスサンミート、味の素 (株)製） 2. 0%、リン酸一カリウム 0. 1%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%) を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 25°Cで 3日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地（馬鈴薯澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、大豆粉（エスサンミート、味の素 (株)製） 2. 0%、リン酸一力リゥム 0. 1%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%) の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 28°Cで 4日間振とう培養機上で培養した。得られた培養液 2mlを 15ml試験管に分注した。それぞれについて 3000rpm、 5分間の遠心分離によつて集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 2mlに懸濁した。次に基質である 11107B物質を 20tng/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、それぞれ 0. 05ml添加した。添加後 28°Cで 2 3時間振とうし、水酸化反応を行った。反応後、実施例 4記載の分析条件（c)で HPLC分析を行い、 11107D物質の'ピークが現れる株、 F- 1529株 (FERM BP8547) およぴ F-1530株（FERM BP-8548)を取得した。

実施例 7 (フラスコスケールにおける F-1529株による変換)

モルティエレラエスピー（Mortierella sp. ) F- 1529株（FERM BP-8547)の斜面培地

(ポテトデキストロース寒天培地）から 1白金耳を 25mlの種母培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、大豆粉 (エスサンミート、味の素 (株) 製） 2. 0%、リン酸一力リゥム 0. 1%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%]を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 25°Cで 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、大豆粉（エスサンミート、味の素（社）製） 2. 0%、リン酸一カリウム 0. 1%、硫酸マグネシゥム 7水和物 0. 05%]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 25°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。

得られた培養液（60ml/500ml容三角フラスコ、 18本）をそれぞれ 3000rpm、 5分間の遠心分離によって集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 60mlに懸濁した。次に基質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、それぞれ 0. 6ml添加した。添加後、 25°Cで 2 2時間振とうし、変換反応を行った。反応終了後、 5000rpm、 2 0分間の遠心分離によって、ろ液と菌体に分離した。上清は 1 L の酢酸ェチルにて抽出した。菌体は 500mlのアセトンで抽出後、ろ過してアセトン抽出液を得た。アセトン抽出液から減圧下でアセトンを留去した後、 1 Lの酢酸ェチルで抽出した。それぞれの酢酸ェチル層を水洗し、無水硫酸ナトリウムにて脱水乾燥後、合わせて減圧下で濃縮し、 11107D物質を含む 1. 21gの粗画分を得た。この · 11107D物質を含む粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Kiesel gel 60， 50g)に付し、酢酸ェチルおよび n-へキサン（90 : 10 ;v/v)の混液 1200mlで溶出し、 11107D物質を含む画分 369mgを得た。

得られた画分を実施例 4に記載した HPLC分取条件 (C)で分取高速液体ク.口マトダラフィー (HPLC)に付し、溶出される 11107D物質を含む画分を得た後、溶媒を留去することにより、 11107D物質 180mgを得た。

実施例 8 (フラスコスケールにおける F - 1530株による変換)

モルティエレラエスピー（Mortierella sp. ) F- 1530株（FERM BP- 8548)の斜面培地

(ポテトデキストロース寒天培地）から 1白金耳を 25mlの種母培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、大豆粉 (エスサンミート、味の素 (株)製) 2. 0%、リン酸一力リゥム 0. 1%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%]を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 25°Cで 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、大豆粉 (エスサンミート、味の素（株）製） 2. 0%、リン酸一カリウム 0. 1%、硫酸マグネシゥム 7水和物 0. 05%]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 25°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。

得られた培養液（60ml/500ml容三角フラスコ、 1 8本）をそれぞれ 3000rpm、 5分間の遠心分離によって集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 60mlに懸濁した。次に基質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、それぞれ 0. 6ml添加した。添加後、 25°Cで 2 2時間振とうし、変換反応を行った。反応終了後、 5000rpm、 2 0分間の遠心分離によって、ろ液と菌体に分離した。上清は 1 L の酢酸ェチルにて抽出した。菌体は 500mlのアセトンで抽出後、ろ過してアセトン抽出液を得た。アセトン抽出液を減圧下でアセトンを留去した後、 1 Lの酢酸ェチルで抽出した。それぞれの酢酸ェチノレ層を水洗し、無水硫酸ナトリウムにて脱水乾燥後、合わせて減圧下で濃縮し、 11107D物質を含む 0. 89gの粗画分を得た。この 11107D物質を含む粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60, 50g)に付し、酢酸ェチルおよび n—へキサン（90:10;v/v)の混液 1200ml、次いで酢酸ェチル 500mlで溶出し、 11107D物質を含む粗画分 163mgを得た。得られた画分を実施例 4に記載した HPLC分取条件 (C)で分取高速液体ク口マトグラフィー (HPLC)に付し、溶出される 11107D物質を含む画分を得た後、溶媒を留去することにより、 11107D物質 30mgを得た。

実施例 9 (AB- 1896株の収得）

土壌から分離された菌株の斜面培地 [可溶性澱粉 0.5%、グルコース 0.5%、魚肉ェキス（和光純薬工業（株）製） 0.1%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0.1%、 NZ-case (フムコ ' シエフィールド 'ケミカル社製） 0.2%、塩化ナトリウム 0.2%、炭酸カルシウム 0·1%、寒天（和光純薬工業（株）製） 1.6%]から 1 白金耳を 5mlの種母培地（可溶性澱粉 2.0%、グルコース 1.0%、ポリペプトン（日本製薬社製） 0.5%、酵母エキス（オリエンタル酵母（株）製） 0.5%、炭酸カルシゥム 0.1%) を入れた 65ml容の試験管に接種し、 28°Cで 1ひ日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに種母培養液 0. lmlを 5mlの生産培地（可溶性澱粉 2.0。/₀、グルコース 1.0%、ポリペプトン（日本製薬（株）製） 0.5%、酵母エキス

(オリエンタル酵母工業（株）製） 0.5%、炭酸カルシウム 0.1%) の入った 65ml容の試験管に植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。次に基質である 11107B物質を 40mg/mlエタノール溶液として調製し、それぞれ 0.05ml添加した。添加後、 28°Cで 24時間振とうし、水酸化反応を行った。反応後、下記の分析条件 (d) で HPLC分析を行い、 11107D物質が現れる株、 AB- 1896株を取得した。

HPLC分析条件 (d)

カラム： UNISON UK-C18, φ 4· 6讓 X 50mm (Imtakt社製）

温度： 30°C

流速： 2ml/分

検出： 240nm

溶出液：水/ァセトニトリノレ/ギ酸（1000:10:1〜10:1000:1, v/v/v, 0〜4分，リニアグラジェント）

保持時間： 11107D物質 2.5分実施例 1 0 (試験管スケールにおける AB - 1896株による変換）

AB - 1896株の斜面培地（可溶性澱粉 0. 5%、グルコース 0. 5%、魚肉エキス（和光純薬工業（株）製） 0. 1°ん酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 1%、 NZ-case (フムコ 'シェフィ一ルド ·ケミカル社製） 0. 2%、塩化ナトリゥム 0. 2%、炭酸力ルシゥム 0. 1%、寒天（和光純薬工業（株）製） 1. 6%) から 1白金耳を 5mlの種母培地（可溶性澱粉 2· 0%、グルコース 1. 0%、ポリペプトン（日本製薬（株）製） 0. 5%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0· 5%、炭酸カルシウム 0. 1%) を入れた 65ml容の試験管に接種し、 28°Cで 10日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。さらに種母培養液 0. lmlを 5mlの生産培地（可溶性澱粉 2. 0%、グルコース 1. 0%、ポリペプトン（日本製薬（株）製） 0. 5%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 1%)の入った 65ml容の試験管に植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。

得られた培養液（5ml/65ml容試験管、 1本）に基質である 11107B物質を 40mg/mlェタノール溶液として調製し、 0. 05πιΓ添加した。添加後、 28°Cで 24時間振とうし、水酸化反応を行った。得られた培養液を 3ml分取し、 2mlの 1—ブタノールを加えて振とうした後、 3000r_Pmにて 10分間遠心分離した。得られた上清を留去し、 2mlのメタノール溶液として、下記の HPLC分析条件 (e)および HPLC分析条件 (f)にて HPLC分析を行い、反応混合物中に 11107D物質が生成していることを確認した。

HPLC分析条件 (e)

カラム： UNISON UK-C18, φ 4. 6mmX 50mm(Imtakt社製）

温度： 40°C

流速： 2ml/分

検出： 240nm

溶出液：ァセトニトリル /0. 01%トリフルォロ酢酸（2 :8〜5 : 5, v/v， 0〜10分，リニァグラジェント）

保持時間： 11107D物質 6. 1分

HPLC分析条件 (f)

カラム： UNISON UK-C18, φ 4. 6mmX 50隱（Imtakt社製）温度： 40°C

流速： 2ml/分

検出： 240nm

溶出液：メタノール /0.01%トリフルォロ酢酸（4:6〜7:3， v/v，0〜10分，リニアグラジェント）

保持時間： 11画物質 6.1分

Claims

請求の範囲式（I )

( I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質の、式（II)

( II ) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への生物学的変換方法による、式 (II) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質の製造方法であって、下記工程 (A) 及び（B ) を含むことを特徴とする製造方法。

(A) 前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、モルティエレラ (Mortierella) 属、ストレプトミセス（Streptomyces)属またはミクロモノスポラセァェ (Micromonosporaceae) 科に属する菌株またはその培養菌体の調製物の存在下で、式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質をインキュベーション処理.する工程。

(B ) 工程（A) で得られるインキュベーション処理液から式（II)で示されるマク口ライド系化合物 11107D物質を採取する工程。

2 . 前記モルティエレラ属に属する菌株がモルティエレラエスピー .

(Mortierella sp. ) F-1529株 (FERM BP- 8547)または F- 1530株 (FERM BP-8548)である請求項 1記載の製造方法。

3 . 前記ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセスエスピー (Streptomyces sp. ) AB-1704株（FERM BP - 8551)、 A- 1544株（FERM BP- 8446)または A - 1545株（FERM BP- 8447)である請求項 1記載の製造方法。

4 . 前記ミクロモノスポラセァ工科に属する菌株が AB- 1896株 (FERM BP-8550)である請求項 1記載の製造方法。

5 . 前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、ストレプトミセスエスピー（Streptomyces sp. ) AB- 1704株（FERM BP- 8551)。

6 . 前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、モルティエレラエスピー（Mortierella sp. ) F- 1529株（FERM BP- 8547)または F- 1530株（FERM BP-8548)。

7 . 前記式（I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 AB-1896株 (FERM BP-8550)。