KR100386197B1

KR100386197B1 - 올레아미드를 생산하는 스트렙토미세스 속 신균주 및 그균주로부터 올레아미드를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100386197B1
Application number: KR10-2000-0030484A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 김창진; 신종헌; 황성은; 한재택; 노정래
Original assignee: 서울기능식품 주식회사; 주식회사 비피도; 권호정
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2003-06-02
Also published as: KR20010109831A

Abstract

본 발명은 올레아미드를 생산하는 토양에서 분리된 신균주 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P)와 이 균주에 의해 올레아미드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신균주는 올레아미드의 생산능이 높기 때문에, 이 균주를 배양하여 수면을 유도하는 생리활성 물질인 올레아미드를 생산하거나 균체를 담체에 고정하여 배양함으로써 수면을 유도하는 생리활성 물질인 올레아미드를 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

올레아미드를 생산하는 스트렙토미세스 속 신균주 및 그 균주로부터 올레아미드를 생산하는 방법{Novel Streptomyces sp. Strain and Method for Producing Oleamide Therefrom}

본 발명은 수면을 유도하는 생리활성이 있는 올레아미드를 생산하는 신균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 균주를 배양하여 올레아미드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

올레아미드는 긴 알칸 사슬의 중간에 cis 이중결합이 있고, 사슬구조 끝에 수소 결합으로 단단하게 결합된 아미드가 있다. 올레아미드의 cis 이중결합은 포화된 알칸 화합물의 패킹(packing)을 교란시키며 일차 아미드(primary amide)는 지방질로 구성되어 있는 세포막 구조를 파괴하게 되는 원인이 된다. 올레아미드는 수면이 부족한 고양이의 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에서 발견되었으며 동물의 뇌에서만 소량 생성되는 것으로 알려져 있다. 올레아미드의 생리적 효과는 수면을 유도하고 체온을 낮추는 효과가 있는 것으로 보고되어 지고 있다[Lerner, R. A.Proc. Natl. Acad. Sci., 94, 13375∼13377, 1997].

한편 세포막 단백질에서 올레아미드는 세로토닌 수용체(serotonin recepter)의 작용을 도와주고 갭 정션 채널(gap junction channel)의 폐쇄효과가 있다. 세로토닌 수용체의 작용에서 올레아미드는 단독 작용으로는 아무 효과가 없지만 세로토닌과 함께 작용할 경우 세로토닌 수용체에 대한 세로토닌의 활성을 높이는 효과를 나타낸다[Boger, D. L.,Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 4102∼4107, 1998].

통상의 마취제가 체내에서 세포막의 수용체-채널 복합체(receptor-channel complex)의 안정된 구조를 변화(채널구조의 폐쇄작용)시켜 활성을 나타내듯이 올레아미드도 세포막 구조의 변형을 유발시킴으로써 유사한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

올레아미드는 체내에서 펩티딜글리신-아미드화 모노옥시게나제 (peptidylglycine-amideating monooxygenase(PAM))의 효소반응에 의해 아실-글리실 전구체(acyl-glycine precursor)로부터 생합성 되는 것으로 알려져 있으며[Lerner, R. A.Proc. Natl. Acad. Sci., 94, 13375∼13377, 1997] 올레아미드의 분해는 세포막 결합 효소인 지방산 아미드 가수분해효소(FAAH)가 작용하여 올레아미드를 1가 불포화 지방산인 올레산으로 변환시킴으로써 분해되는 것으로 알려져 있다.

현재까지의 수면을 유도하는 마취제나 수면제의 경우 그 물질이 세포 밖에서 생성되는 물질이거나 인위적으로 화학합성한 것이 대부분이었다. 따라서 이 같은 비세포성 물질이 체내에서 작용하는 기전은 체내에서 생성되는 물질과 차이가 있으며 적지 않은 부작용(두통, 소화불량 등)을 유발한다.

포유 동물의 뇌조직에만 생산되는 것으로 알려진 올레아미드 (9-octadecenamide)를 생물공학적 기법으로 생산하기 위하여 이를 생산하는 미생물을 검색하던 중 토양 미생물 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P)이 올레아미드를 생산함을 발견하고 생물공학적인 방법으로 본 기능성 지방질을 생산할 수 있는 방법을 완성하였다.

도 1은 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P)의 전자현미경 사진이고;

도 2는 화학식 1로 표시되는 올레아미드 생산균주 검색에 사용하였던 박층 크로마토그래피의 결과를 나타낸 그래프이고;

도 3은 화학식 1로 표시되는 올레아미드의 생산균주인 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P)의 배양일수별 건조세포량, pH, 올레아미드생산량을 측정한 그래프이고;

도 4는 배양액을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 얻은 분획의 TLC결과이고;

도 5는 HP5890GC/JEOL에서 화학식 1로 표시되는 올레아미드의 EISMS 의 질량 분석 스펙트럼이고;

도 6은 JEOL JNM-LA400용액에서 화학식 1로 표시되는 올레아미드의 500MHz 수소핵자기공명 스펙트럼이고;

도 7은 JEOL JNM-LA400용액에서 화학식 1로 표시되는 올레아미드의 125MHz 탄소핵자기공명 스펙트럼이다.

본 발명은 기능성 지방질인 올레아미드를 생산하는 신규 미생물 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P)과 본 지방질을 미생물 배양액으로부터 정제, 제조하는 방법을 그 특징으로 한다.

본 발명에서는 동물의 뇌 조직에서만 소량 생산되는 기능성 지방질인 올레아미드를 생산하는 신규 미생물 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378)을 이용하여 생물공학적으로 본 물질을 대량 생산할 수 있는 방법을 확보할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 올레아마이드 및 그 유도체가 포함되어 있는 수면유도제를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 균주의 동정

1) 형태적특성

아이·에스·피 (ISP, International Streptomyces Project)규정에 따라 28℃에서 14일간 배양한 후 광학현미경 및 전자현미경 하에서 형태적 특성을 조사한 결과, 포자의 연쇄상은 나사선(spiral) 형태를 나타내었으며 포자의 표면은 매끈하고 기균사는 비교적 잘 성장분기하며 통상의 조건에서는 분단하지 않는 특성이 있었다. 글리세롤-아스파라긴 한천배지와 타이로신-한천배지를 제외한 배지에서 기균사의 생육이 양호하였으며 착생 포자의 형성정도도 풍부하였다. 본 포자는 구형으로 크기는 0.8-1.0 x 0.8-1.0 ㎛로 보통 15-20개 정도의 연쇄상으로 되어있었다.

2) 각종 배지조건에 따른 배양학적 특성

각종 ISP배지조건에서 28℃,21일간 배양한 후 본 균주의 배양학적 특성을 조사하였으며, 그 결과는 표 1과 같았다. 본 균주의 생육정도는 글리세롤-아스파라긴 한천배지와 타이로신-한천배지를 제외한 배지에서 양호하였다. 기균사의 색상은 대부분의 배지에서 회색이었으며 배지 뒷면의 색상은 갈색을 나타내었고 수용성색소는 모든 배지에서 무색을 나타내었다.

각종 배지조건에 따른 배양학적 특성

배지의 종류	기생균사의생육 및 색상	기질균사의생육 및 색상	배지뒷면의 색상	수용성색소
배지의 종류	생육정도	색상	생육정도	색상	흙갈색	무색
효모-맥아한천배지(ISP2)	양호	회색	양호	갈색	회갈색	무색
오트밀 한천배지(ISP3)	양호	회색	양호	갈색	갈색	무색
무기염류-전분 한천배지(ISP4)	양호	회색	양호	연한갈색	갈색	무색
글리세롤-아스파라진 한천배지(ISP5)	불량	황백색	불량	불량	불량	무색
펩톤-효모한천배지(ISP6)	보통	황백색	불량	연한황색	연한 갈색	무색
타이로신한천 배지(ISP7)	불량	불량	불량	불량	불량	무색
벤넷 한천배지	양호	회색	양호	갈색	갈색	무색
영양 한천배지	보통	회색	불량	연한황색	연한 황색	무색

3) 생리적 특성

본 균주의 생리적 특성은 쉴링-거트리브 한천배지를 사용하여 28℃에서 21일간 배양한 후 전분가수분해능, 수용성 색소생성능, 밀크 펩톤화, 나이트레이트 환원력, 멜라닌 색소의 형성능, 스킴밀크 가수분해능 등을 조사하였으며, 그 결과 표 2와 같다.

생리적특성

조사 항목
전분 가수분해	양 성
젤라틴 액화	음 성
수용성 색소 생성	음 성
밀크 펩톤화	양 성
나이트레이트 환원력	양 성
멜라닌 색소 생성	음 성
스킴 밀크 가수분해	양 성
세포벽 DAP 분석	L.L 형

4) 탄소이용성

본 균주의 탄소 이용성은 쉴링-거트리브 한천배지를 사용하여 28℃ 에서 14일간 배양한 후 조사하였다. 그 결과는 표3.과 같다.

본 균주는 표3에 공시한 11종류의 탄소원중 D-글루코스, D-후락토스, 이노시톨, 라피노스, D-자이로스, 를 이용하였다.

당이용성

D-글루코스	양 성
L-아라비노스	음 성
D-후룩토스	양 성
갈락토스	음 성
이노시톨	양 성
만니톨	음 성
라피노스	양 성
람노스	음 성
수크로스	음 성
D-자이로스	양 성
셀루로스	음 성

5) 균체성분

본 균주의 균체 세포벽 성분을 벡커의 방법(B.Beckeret al.,Applied Microbiology12, 421-423 (1964))에 의해 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 L.L형 이었다.

이상의 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성 및 당이용성, 균체성분 들을 조사한 결과, 본 균주를 스트렙토미세스속 균주로 동정하여, 본 균주를 스트렙토미세스속 KK90378로 명명하였다. 본 발명자들은 본 균주를 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터의 균주기탁기관에 2000년 4 월 28 일자로 기탁하여 KCTC-18014P의 균주번호를 부여받았다.

방선균의 균체 성질은 일정한 것이 아니라 자연적으로 혹은 인공적으로 용이하게 변화되는 것이 일반적인 성질이며, 본 스트렙토미세스속 KK90378 (KCTC18014P) 균주는 일반 방선균주의 경우와 마찬가지로 그 성상이 변화하기 쉽다. 따라서, 본 발명 스트렙토미세스속 KK90378 (KCTC18014P)은 물론, 이 균주에 유래하는 돌연변이주 (자연돌연변이 또는 인공돌연변이주), 형질접합체 또는 유전공학적인 방법에 의해 새롭게 만들어진 균주라 하여도 올레아미드 물질을 생산하는 것은 모두 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다.

2. 균주의 배양

본 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다 탄소원으로는 글로코스와 가용성 전분(soluble starch)을 사용하고, 질소원으로는 소이빈밀(soybean meal), 효모 추출물(yeast extract), 육즙(beef extract)를 사용하였다. 그리고 디포타슘 히드로겐포스페이트(dipotalssiumhydrogenphosphate)를 사용하였고, pH조절을 위하여 칼슘 카보네이트(calcium calbonate)를 사용하여 배양하였다. 배양방법으로는 호기적조건에서 진탕배양하였으며, 배양온도는 28℃로 하였다. 또한 배양기간이나 진탕배양의 경우 통상 7 일 배양함으로써 활성물질의 생산이 최고에 달하였다.

3. 신규 화합물의 분리 및 정제

상기한 바와 같은 배양조건하에서 균주를 배양하여 활성물질을 얻는다. 활성물질은 배양액에서만 존재하므로 배양액을 원심분리하여 배양 상등액과 균체를 분리한 후 다음에서 기술하는 방법에 의하여 효율적으로 추출정제를 실시한다. 즉, 표시되는 화합물은 지용성물질이므로 배양액을 에틸아세테이트 등의 유기용매를 가하여 추출한다.

얻어진 유효성분이 포함된 혼합액으로부터 용매를 증발시킨후 클로로포름:메탄올=100:1-1:1(V/V)의 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시한다. 그리고 얻어진 활성부위를 다시 클로로포름:메탄올=95:5(V/V)를 사용하여 재차 컬럼 크로마토그래프를 실시한다. 그런 다음 얻어진 활성부위를 클로로포름 : 메탄올=98:5(V/V) 용매를 사용하여 예비 박층 크로마토그래피(prep. TLC)를 행한다. 위와 같은 방법을 반복하여 단일물을 얻는다. 단일 물질의 확인은 TLC 및 가스 크로마토그래피로 확인하였다.

구조분석을 위해¹H-NMR(500MHz),¹³C-NMR(125MHz) 및 DEPT 스펙트라는 JEOL JNM-LA400으로 측정하였고 GC-MS는 HP5890GC/JEOL로, ESIMS (electrosprayionization mass spectroscopy)는 JEOL JMS-AX505WA로 측정하였으며 UV 스펙트럼 (Shimazu UV-260)은 메탄올을 용매로 측정하였다.

스트렙토미세스속 (Streptomycessp.) KK90378 (KCTC18014P)균주가 생산하는 올레아미드는 무색의 오일로서 UV λ max (MeOH) 208 ㎚에서 최대흡수 피크를 보였으며, ESIMS 분석결과 분자량이 280으로 확인되었으며 분자식은 C₁₈H₃₅ON로 결정되었으며,¹H,¹³C, HMBC(heteronuclear multiple bond coherence)등에 의해 구조를 확인하였다.

그 밖의 활성물질 올레아미드에 대한 이화학적 특징은 다음과 같다.

1) 물질의 성상: 무색 오일

2) 분자량: 280

3) 분자식: C₁₈H₃₅ON

4) 질량분석 (M+H): 280 [도 5 참조]

5) 자외선 흡수 스펙트럼 (UV λ max (MeOH)): 208 ㎚

6) 핵자기공명 (NMR) 흡수스펙트럼: CD₃OD를 용매로 하고 TMS(Si(CH₃)₄)를 표준물질로 하여 수소핵자기공명 (¹H-NMR) 스펙트럼과 탄소핵자기공명 (¹³C-NMR) 스펙트럼을 조사하여 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다.

7) 용해성

용해: 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 메탄올

불용: 물

8) 박층 크로마토 그라피: Rf 값

흡착제: 머크사 실리카겔 60F 254

전개용매: CHCl₃:MeOH = 10:1 (V/V)

9) 화학구조식- 화학식 1과 같다.

본 발명에 있어서, 고정화 균체 및 효소는 균체나 그 균체가 생산하는 효소 본래의 특성을 살려서 이용목적에 적합하도록 인공적으로 개량하려는 시도 중의 하나로서, 유용물질 생산능력이 있는 균체나 촉매활성이 있는 효소 그대로 고정화시켜 물에 불용성이 되도록 하는 것이다. 균체나 효소를 고정화하면 열·pH·유기용매·변성제 등에 대한 안정성이 증대되고, 장기간 반복하여 연속사용이 가능하여 유용물질 생산에 대한 비용이 절감된다. 또한 촉매밀도가 높아져 반응속도가 증대하여 반응시간이 단축되며 반응생산물로부터 균체나 효소를 제거할 필요가 없어져 순도 및 수율이 향상되는 장점이 있다.

따라서, 본 발명의 균체를 해조 다당류인 알긴산을 담체로 사용하여 고분자를 녹인 상태로부터 겔을 형성시키는 포괄법을 통해 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P) 균체를 고정화할 수 있다.

실시예 1 : 미생물 배양

종배지 및 생산배지로서 글루코스 20%, 가용성 전분 10%, 소이빈밀 25%, 육즙 1%, 효모 추출물 4%, NaCl 2%, K₂HPO₄0.25%, CaCO₃2%를 함유한 배지에 pH7.2로 조정한 후 사용하였다. 500㎖의 배플 플라스크(baffle flask) 2개에 각각 50㎖씩 분주한 종배지를 121℃에서 20분간 살균하고, 이것에 균주의 아가 피스(agar piece)를 접종하고 28℃, 150rpm에서 2일간 진탕 배양하여 배양기의 종배양으로 사용하였다. 121℃에서 20분 살균한 400㎖을 함유한 2ℓ배플 플라스크에 종배양액 2.5%를 접종하여 28℃에서 7일간 140rpm의 속도로 진탕 배양하였다. 배양 일수별 균체증가 및 올레아미드 생산량을 나타낸 결과는 도 2에 나타난 바와 같다.

실시예 2 : 배양액으로부터 활성물질의 분리 및 구조결정

실시예 1에서 얻은 배양여액을 5,000×g에서 30분간 원심 분리하여 배양 상등액과 균체를 분리하고 상등액은 동량의 에틸아세테이트를 가하여 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 농축한 후 메탄올에 용해하여 클로로포름:메탄올=100:1-1:1(V/V)의 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이를 표준물질과 같이 TLC분석을 하여 동일 Rf치를 보이고 발색시약 드라겐도르프(dragendorf)시약에서 발색하는 활성분획인 95:5①과 95:5②를 얻었다[도 4].

얻어진 활성부위를 클로로포름:메탄올=98:5(V/V) 용매를 사용하여 예비 박층 크로마토그래피를 용매조건 클로로포름:메탄올=98:2(V/V)에서 행한다. 밴드가 ①-⑩까지 나타나 이중 활성성분이 고농도로 존재하는 밴드 ②와③을 합하여 용매조건 헥산(hexane):에틸아세테이트=4:1(V/V)로 하여 재차 예비 TLC를 실시한다. 8개의 밴드중 밴드②, ④, ⑤가 활성이 있는 것으로 나타나 이들을 표준물질과 함께 용매조건 클로로포름:메탄올=10:1(V/V)에서 TLC를 행한 결과 밴드④의 스폿(spot)이 표준물질과 같은 스폿을 나타냈다. 또한 올레아미드는 양전하를 띠는 아미노기를 함유하므로 이온교환수지를 사용하여 다른 음이온 전하를 띠는 지방질로부터 분리 정제도 가능하다.

실시예 3: 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp.) KK90378 (KCTC18014P) 균체의 고정화

2.5% 알긴산나트륨 용액과 스트렙토미세스속 KK90378(Streptomycessp. KK90378) (KCTC18014P) 균체 배양액을 1:1 비율로 혼합하였다. 이때 알긴산나트륨에 견고성을 부여하기 위해 0.1M CaCl₂를 첨가한 후 반투명한 구형의 겔이 형성되도록 15분간 상온에 방치한 후 이용하였다. 고정화 균체는 4℃ 냉장고에 저장하여 사용하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 연구를 통해 균주를 배양하여 수면을 유도하는 생리활성 물질인 올레아미드를 생산하거나 균체를 담체에 고정하여 올레아미드를 효율적으로 생산할 수 있다.

Claims

올레아미드를 생산하는 스트렙토미세스속 KK90378(KCTC18014).
제 1항의 균주를 배양하여 그 배양물로부터 올레아미드를 생산하는 방법.
삭제
제 2항에 있어서, 제 1항의 균주를 배양하여 생산된 배양액의 상등액을 유기용매인 헥산 또는 에틸아세테이트로 추출하는 것을 특징으로 하는 올레아미드를 생산하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 균주를 해조 다당류를 담체로 고정화하는 것을 특징으로 하는 올레아미드를 생산하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 해조 다당류는 알긴산 나트륨인 것을 특징으로 하는 올레아미드를 생산하는 방법.
제 2항에 있어서, 제 1항의 균주를 배양하여 생산된 배양액의 상등액을 유기용매인 헥산 또는 에틸아세테이트로 추출하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 또는 이온교환수지를 사용하여 정제하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 올레아미드를 생산하는 방법.