JPS62205055A - 新規生理活性物質ｓｋ−１８９４およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アシルコエンザイムＡ合成酵素阻害として有
用な新規生理活性物ｙｓＫ−ｔｓｑ４およびその製造法
に関する。

〔従来の技術〕

従来、微生物が生産し、生物活性を有するＮ−ヒドロキ
シトリアゼン系物質としては、ストレプトミセス・オー
レオファシェンスの生産する、式％式％ で表わされるＷＳ−１２２８Ａおよび式へΔ〜〜ν１″
″ゞ＝　Ｎ　−ＯＨ で表わされるＷＳ−１２２８Ｂが挙げられ、これらの物
質は血管拡張活性を有することが知られている（Ｊ、　
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、　Ｖｏｌ、　３５＋　Ｎｏ、
　２＋　１５７−１６３　（１９８２））。

〔発明が解決しようとする問題点〕

近年、食生活の向上に伴い成人の肥満や脂肪肝など中性
脂肪（トリアジルグリセロール）蓄積に起因する症状が
現代病として問題視されている。

中性脂肪はその生合成の観点からみれば、１分子のグリ
セロール中に３分子の脂肪酸がエステル結合したもので
あるが、その酵素反応は、すべて脂肪酸がコエンザイム
Ａ誘導体という活性化された形で初めて反応が可能とな
る。生体内では、この脂肪酸をコエンザイムＡ誘導体に
活性化する反応を触媒する酵素がアシルコエンザイムＡ
合成酵素であり、中性脂肪生合成に深く係わっており、
中性脂肪生合成活性が高い場合、このアシルコエンザイ
ムＡ合成酵素の活性も高くなっているものと考えられる
。

かかる実情において、アシルコエンザイムＡ合成酵素阻
害活性を有する物質を提供することは、ヒトの治療上必
要なことである。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、上記の問題点を解決すべく、新
規な生理活性物質の探索を目的として種々の土壌から菌
株を分離し、その生産する代謝産物について研究を続づ
けた結果、横浜市鶴見区で採取した土壌から分離したＳ
Ｋ−１８９４菌株の培養物中にアシルコエンザイムＡ合
成酵素阻害活性を有する吻πが産生されることを見出し
た。次いで、該培養物から該アシルコエンザイムＡ合成
酵素阻害活性を分離、精製した結果、２種の物質が単離
され、該物質の理化学的性質を調べた結果。

従来の如く化学構造を有することが判った。このような
化学構造を有する物質は他に見当たらないことから、こ
れらの物質を生理活生物質ＳＫ−１８９４と総称し、後
記式（Ｉｔ）で示される物質をＳＫ−１８９４Ｃと称し
、後記式（ＩＩＩ　）で示される物質を物質ＳＫ−１８
９４Ｄと称することにした。本発明はかかる知見に基い
て完成されたものである。

すなわち、本発明は、式 ％式％ （式中、＝は同時に一重結合ま′たは二重結合を示す）
で表わされる物質ＳＫ−１８９４またはその塩、ならび
にストレプトミセス属に属し、生理活性物質ＳＫ−１８
９４Ｃおよび（または）Ｄを生産する能力を有する微生
物を培地に培養し、培養物に生理活生物質ＳＫ−１８９
４Ｇおよび（または）Ｄを蓄積せしめ、該培養物から生
理活生物質ＳＫ−１８，９４Ｃおよび（または）Ｄを採
取することを特徴とする新規生理活生物質ＳＫ−１８９
４Ｃおよび（または）Ｄあるいはそれらの塩の製造法を
提供するものである。

生理活生物質ＳＫ−１８９４Ｃおよび（または）Ｄ（以
下総称する場合には、単に物質ＳＫ−１８９４と称し、
個々に称する場合には、単に物質ＳＫ−１８９４Ｃ，物
質ＳＫ−１８９４Ｄと称する〕を生産する能力を存する
微生物、〔以下単に物［ＳＫ−１８９４生産菌と称する
〕は、ストレプトミセス属に属するが、例えば本発明者
らが分離したストレプトミセス属に属するＳＫ−１８９
４菌株は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例で
あって、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。

（１’）形態的性質 栄養藺糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察さ
れない。気菌糸はイースト・麦芽寒天、スターチ無機塩
寒天等で豊富に着生し、灰色あるいは淡褐色を星する。

顕微鏡下の観察では、気菌糸は直線状あるいは波状を呈
し、２０ケ以上の胞子の連鎖が認められる。胞子の大き
さは０．９×０．５μｍで円柱状である。胞子の表面は
平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は見出されな
い。

（ＩＩ）各種培地上での性状 イー・ビー・シャーリング（Ｅ、　Ｂ、　Ｓｈｉｒｌｉ
ｎｇ）とデー・ゴツトリーブ（Ｄ、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）
の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・シス
ティマチイック、バクテリオロジー、１６巻、３１３頁
、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を第
１表に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー
・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・
オブ・アメリカ・シカゴ。

１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内に
そのコードを併せて記した。以下は特記しない限り。２
７’Ｃ１２週間目の各培地における観察の結果である。

第１表 （ＩＩＩ　）生理学的諸性質 （１）メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天　　　　　　　　陰性（ロ）ペプト
ン・イースト鉄寒天　　陰性（ハ）グルコース・ペプト
ン・ゼ ラチン培地（２１−２３”Ｃ）　　　陰性（ニ）トリプ
トン・イースト液　　　陰性（２）チロシナーゼ反応 （３）硫化水素の生産　　　　　　　　陰性（４）硝酸
塩の還元　　　　　　　　　陽性（５）ゼラチンの液化
（２１−２３＠Ｃ）（グルコース・ペプトン・ ゼラチン培地）　　　　　　　陽性 （６）スターチの加水分解　　　　　　陰性（７）脱脂
乳の凝固（３７”Ｃ）　　　　陰性（８）脱脂乳のペプ
トン化（３７”Ｃ）陽性（９）生育温度範囲　　　　１
５−４２　°Ｃ（１０）炭素源の利用性 （ブリーダム・ゴトリーブ寒天 培地） 利用する　　：Ｄ−グルコース、キシロース、イノシト
ール、 やや利用するニスクロース、フルクトース、セルロース 利用しない　：Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ
−マンニトー ル、ラフィノース、メリビ オース （ｍ細胞壁組成 細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。

以上、本望の菌学的性状を要約すると次の通りである。

細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。気菌糸の
形態は直線状あるいは波状で、長い胞子鎖を形成する。

胞子の表面は平滑である。

培養上の諸性質としては、栄養菌糸は黄褐色あるいは淡
褐色め色調を呈し、気菌糸は淡褐色、灰色あるいは白色
系の色調を呈する。淡黄褐色の可溶性色素を生産する。

これらの結果から、本菌株はストレプトミセス属に属す
る放線菌であり、プリドハムとトレスナーの分類（バー
ジズ・マニュアル・オブ・デターミネーテイブ・バクテ
リオロジー、第８版、７４Ｂ−８２９員、１９７４年）
によるグレイあるいはレッドシリーズに属する菌種であ
ると考えられる。

なお、本菌株はストレプトミセス・エスピーＳＫ　−１
８９４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、ＳＫ−１８
９４として、工業技術院微生物研究所に寄託されている
（微工研菌寄第８６５５号）。

以上、物［ＳＫ−１８９４生産菌について説明したが、
放線菌の一般的性状として蘭学上の性状は極めて変異し
易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行
われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル
−Ｎ−二トローＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタン
スルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異す
ることは周知の事実であり、このような人工的変異株は
勿論、自然変異株も含め、ストレプトミセス属に属し、
物質ＳＫ−１８９４を生産する能力を有する菌株はすべ
て本発明に使用することができる。

また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異さ
せた菌株も物質ＳＫ−１８９４生産菌として包含される
。

本発明においては、先ずストレプトミセス属に属する物
質ＳＫ−１８９４生産菌が適当な培地に培養される。本
望の培養においては、通常放線菌の培養法が一般に用い
られる。培地としては、微生物が同化し得る炭素源、資
化し得る窒素源、さらには必要に応じて無機塩などを含
存させた栄養培地が使用される。同化し得る炭素源とし
ては、ブドウ糖、シーＪＩ！、糖蜜、澱粉、デキストリ
ン、セルロース、コーン・ステープ・リカーなどが単独
または組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源とし
ては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大
豆粉、コーン・ステーブ・リカー、綿実粕、カゼイン、
大豆蛋白加水分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源
、硝酸塩、アンモニラ塩などの無機窒素化合物が単独ま
たは組み合わせて用いられる。その他、必要に応じてナ
トリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム
塩、リン酸塩などの無機塩、重金属塩類が添加される。

さらに、培地には、必要に応じて、本菌の生育や物’ｊ
７ｓＫ−１８９４の生産を促進する微量栄養素、発育促
進物質、前駆物質などを適当に添加してもよい。

培養は通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条件
下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ま
しい。培養のｐＨは中性付近で培養を行うのが好ましい
。培養温度は２０−３７　’Ｃで行い得るが、通常は２
４−３０’Ｃに保つのがよい。培養時間は、液体の場合
、通常３−６日培養を行うと、本物質ＳＫ−１８９４が
生成語積される。好ましくは、培養中の蓄積量が最大に
達した時に、培養を終了すればよい。これらの培地組成
、培地の液性、培養温度、培養速度、通気量などの培養
条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好
ましい結果が得られるように適宜調節、選択されること
番よいうまでもない。液体培養において、発泡があると
きは、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を
適宜使用できる。

このようにして得られた培養物に蓄積される物質ＳＫ−
１８９４は菌体内および培養濾液中に含有されるので、
培養物を遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、各々
から本物質ＳＫ−１８９４を採取するのが有利である。

培養濾液から物質ＳＫ−１８９４を採取するには、先ず
培養濾液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼンなどの非
親水性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して粗製の
物￥ｔｓＫ−１８９４が得られる。該粗吻實はさらに脂
溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシ
リカゲル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマト
グラフィーにより物［ＳＫ−１８９４Ｃ１−？よびＤを
各々分離精製することができる。

菌体から物１ｉｓＫ−１８９４を採取するには、菌体を
含水アセトン、含水メタノールなどの含水親水性有機溶
媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物
を酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼンなどの非親水性有
機溶媒で抽出し、得られた抽出液は、前記の培養濾液か
ら得た抽出液と合わせて分離精製するか、あるいは前記
と同じ方法により物質ＳＫ−，１８９４ＧおよびＤを各
々分離精製することができる。

次に、本発明の生理活性物質ＳＫ−１８９４ＣおよびＤ
の理化学的性状についてのべる。

（Ｉ）生理活性物質ＳＫ−１８９４Ｇ （１）分子式：　Ｃ＋＋ＩＩ＋ＪｉＯ（高分解能マスス
ペクトルでｍ／２２０９．２９４が観 察された）、 （２）分子１；２０９（マススペクトルよりｍ／２２９
（Ｍ　　）が観察された 〕 （３）比旋光度；　〔α〕１８０°（Ｃ＝１、メタノ−
ル） （４）紫外線吸収スペクトル（７０％アセトニトリル水
中）；第１図の通り、 （５）赤外線吸収スペクトル（クロロホルム中）；第２
図の通り、 （６）溶媒に対する溶解性 ；メタノール、エタノール、アセト ニトリル、酢酸エチル、ベンゼン に可溶、水に不溶 （７）塩基性、酸性、中性の区別 ；中性 （８）物質の色、形状、 ；淡黄色針状結晶 （９）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中
）；第３図の通り、 （１０）化学構造 Ｎ　　−Ｎ　　：　　Ｎ　−ＯＨ ハＡＡ／’ツノ　（Ｉ　Ｉ） 〔２〕生理活性物質ＳＫ−１８９４Ｄ （１）分子式：　Ｃ＋＋Ｈ＋ｓＮ＊Ｏ（高分解能マスス
ペクトルでｍ／ｚ２０５．２６２が観 察された）、 （２）分子１；２０５　（マススペクトルよりｍ／”　
　　２２０５（Ｍ　　）が観察された〕 （３）比旋光度；　〔α〕１８０°（Ｃ−１、メタノ−
ル） （４）紫外線吸収スペクトル（７０％アセトニド　　　
　　′リル水中）　；第４図の通り、。

（５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）；第５図の通
り、 （６）溶媒に対する溶解性 ；メタノール、エタノール、アセト ニトリル、酢酸エチル、ベンゼン に可溶、水に不溶 （７）塩基性、酸性、中性の区別 ；中性 （８）物質の色、形状、 ；黄色針状結晶 （９）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中
）；第６図の通り、 〔発明の効果〕 次に、本発明の物質ＳＫ−１８９４ＣおよびＤの生物学
的性質および毒性について述べる。

（１）微生物由来アシルコエンザイムＡ合成酵素に対す
る阻害作用 アシルコエンザイムへ合成酵素活性に対する影響は遊離
脂肪酸定量用キット（和光純薬社製、ＮＥＦＡＣ−Ｔｅ
ｓｔ）を用い、その使用方法に従って測定した。アシル
コエンザイムＡ合成酵素を予め薬剤で１０分間室温で保
温後、上記キットに添付されているオレイン酸標準液（
１ｒｎ　Ｅ　ｑ　／　Ｉｌ）を５０ａｌｌ添加して反応
させ、アシルコエンザイムへ合成酵素活性を測定した。

本酵素に対する５０％阻害する濃度を算定した結果は、
次の通りである。

物質ＳＫ−１８９４ｃ　　　　６．４ｐｇ１ｍｅ物′Ｒ
８Ｋ−１８９４Ｄ　〉３０ 物質ＷＳ−１２２８Ａ　　　　３．２ 物質ＷＳ−１２２８Ｂ　　＞３０ 以上の通り、本発明の生理活性物ｆｌｔＳＫ−１８９４
はアシルコエンザイムＡ合成酵素活性をするだけでなく
、公知の物質ＷＳ−１２２８ＡおよびＢも該阻害活性を
示した。

（２）動物細胞由来アシルコエンザイムＡ合成酵素に対
する影響。

バーキットリンパ腫由来Ｒａｊｉ細胞は外部より与えら
れた脂肪酸をアシルコエンザイムＡ合成酵素によりコエ
ンザイムＡ誘導体に活性化後、直ちに、中性脂肪、ホス
ファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールに変
換することが知られている。

０．２％ゼラチン含有リン酸緩衝液（Ｇ−ＰＢＳ）０．
６ｍ６中にＲａｊｔ細胞を２Ｘ１０’個となるように調
整し、Ｇ−ＰＢＳで希釈した薬剤を０．２ｍｆｆ１加え
る。薬剤の最終濃度は４．８゜１６μｇ　／　ｍ　１と
なるように調整した。この濃度では薬剤のＲａｊｉ細胞
に対する障害は見られない。この混合物を３７’Ｃで３
０分間保温後、〔′！Ｈ〕−オレイン酸を１μｇ、　　
（５ｘｌＯ’　ａｐｍ）を加え、さらに３７’Ｃで３０
分間反応させた。脂質の抽出は、ブライとダイヤの方法
〔（Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈ
ｙｓ、＋　３７　＋　９９１　（１９５９）〕に従って
行った。脂質抽出物はシリカゲル薄層クロマト用プレー
ト（メルク社製、６０Ｆｚｓ４）にスポットし、クロロ
ホルム−メタノール−濃アンモニア水（６０：３５：５
）で展開し、放射活性をラジオスキャナー（ベルトルト
社製）で測定した。

その結果、物’ｌＳＫ−１８９４Ｃｔ−ｊヨびＤは脂肪
酸の脂質への取り込みを阻害し、その５０％阻害濃度は
、各々、８ｔｔｇ／ｍｌおよび１６．ｃｒｇ／ｍｌと測
定された。また物質ＷＳ−１２２８ＡおよびＢも同程度
の阻害活性が測定された。物質ＳＫ−１８９４Ｃおよび
ＤのＲａｊｉ細胞での脂肪酸の脂質への取り込み阻害活
性は、アシルコエンザイムＡ合成酵素を阻害することに
由来すると考えられる。

（３）毒性 物ＷＳＫ−１８９４ＣおよびＤを各々１００ｍｇ／ｋｇ
をマウス腹腔内に投与したが、何ら毒性は認められなか
った。

以上のように、本発明の生理活性物質ＳＫ−１８９４Ｃ
およびＤは毒性が低く、アシルコエンザイムＡ合成酵素
に対して著しい阻害活性を示すことから、ヒトの中性脂
肪蓄積に起因する疾病の予防および治療に有用である。

〔実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明の物’ｌＳＫ−１８９４Ｃ
およびＤの製造例を具体的に説明する。

実施例 ５００ｍ６容三角フラスコにグルコース０．　１％、ス
ターチ２．４％、ペプトン０．３％、牛肉０．３％、酵
母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．４％を含む培地
（ｐＨ７，０に調整）　１００ｍ１を仕込み、綿栓後、
蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたストレプトミセス
・エスピーＳＫ−１８９４（ＦＥＲＭ−Ｐ　　Ｎｏ、８
６５５）を白金耳にて無菌的に接種し、２７６Ｃで４８
時間振とう培養して種培養液を得た。

一方、３０１ジャーファーメンタ−１基にグルコース１
．０％、可溶性スターチ１．０％、コーン・ステイープ
・リカー０．３％、オートミール１．０％、ファーマメ
ディア１．０％、塩基性炭酸マグネシウム０．５％を含
む培地（ｐＨ６，５に調整）を仕込み、蒸気滅菌冷却後
、種培養した種培養液２００ｍｊ！を無菌的に移植し、
攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量１０１２１分の培養条件
下で２７°Ｃで６８時間通気攪拌培養した。

培養後、培養液を遠心分離して上清１２１と菌体に分離
し、菌体は８０％アセトン水１．５１で抽出し、抽出液
を約１１迄減圧濃縮後、そのｔｌａ　Ｋｇ液を上澄に加
えた。これを酢酸エチル１３１で抽出し、抽出液を減圧
ｔｌ縮して粗製物５．５ｇを得た。この粗製物を酢酸エ
チル３０ｍｆに懸濁し、シリカゲル（２５０ｇ、　、メ
ルク社製、Ａｒ　ｔ。

９３８５）のカラムにチャージし、クロロホルム−メタ
ノール（７５：　１）で溶出するカラムクロマトグラフ
ィーを行った。各フラクションは２０、ｍｌづつ分画し
、活性成分を含むフラクションを集め、減圧乾固して粗
油性物質６０　Ｑｍｇを得た。これを４０回に分けて高
速液体クロマトグラフィーにより分離精製した。装置は
トリロータ■（日本分光社製）を用い、カラムはＹＭＣ
−ＰａｃＫ　　Ａ−３４３（ＯＤＳ系樹脂、山村化学研
究所部）を用い、溶媒系は、６０％より８０％のアセト
ニトリル水の直線グラジェント（３０分）を用い、検出
はＵＶ３００ｎｍ、流速は８ｍＩｔ／分で行った。その
結果ＳＫ−１８９４ｃとＤを各々７ｍｇおよびＳｍｇＪ
ｔｃ単離した。

【図面の簡単な説明】

第１図は生理活性物質ＳＫ−１８９４Ｃの紫外線吸収ス
ペクトル、第２図は該物質の赤外線吸収スペクトル、第
３図は該物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示し、
第４図は生理活性物質ＳＫ−１８９４Ｄの紫外線吸収ス
ペクトル、第５図は該物質の赤外線吸収スペクトル、第
６図は該物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、▲数式、化学式、表等があります▼は同時に一
   重結合または二重結合を示す）で表わされる物質ＳＫ−
   １８９４またはその塩。 ２）、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるれる物質ＳＫ−１８９４Ｃである特許請求
   の範囲第１項記載の物質ＳＫ−１８９４またはその塩。 ３）、ストレプトミセス属に属しかつ式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる物質ＳＫ−１８９４Ｄである特許請求の範
   囲第１項記載の物質ＳＫ−１８９４またはその塩。 ４）、ストレプトミセス属に属し、生理活性物質ＳＫ−
   １８９４Ｃおよび（または）Ｄを生産する能力を有する
   微生物を培地に培養し、培養中に生理活性物質ＳＫ−１
   ８９４Ｃおよび（または）Ｄを蓄積せしめ、該培養物か
   ら生理活性物質ＳＫ−１８９４Ｃおよび（または）Ｄを
   採取することを特徴とする新規生理活性物質ＳＫ−１８
   ９４Ｃおよび（または）Ｄあるいはそれらの塩の製造法
   。 ５）、ストレプトミセス属に属し、生理活性物質ＳＫ−
   １８９４Ｃおよび（または）Ｄを生産する能力を有する
   微生物がストレプトミセス・エスピーＳＫ−１８９４（
   ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ．８６５５）である特許請求の範囲
   第４項記載の製造法。