JPH06256281A - 新規物質デフォスタチン - Google Patents
新規物質デフォスタチンInfo
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- JPH06256281A JPH06256281A JP5067346A JP6734693A JPH06256281A JP H06256281 A JPH06256281 A JP H06256281A JP 5067346 A JP5067346 A JP 5067346A JP 6734693 A JP6734693 A JP 6734693A JP H06256281 A JPH06256281 A JP H06256281A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- defostatin
- culture
- dephostatin
- medium
- streptomyces
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｔ細胞やＢ細胞が有するチロシンホスファタ
ーゼを阻害する活性をもち、抗腫瘍剤または免疫調整剤
として利用できる新規な物質を提供する。 【構成】 ストレプトミセス属に属するデフォスタチン
生産菌であるストレプトミセス・エスピー ＭＪ７４２
−ＮＦ５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２３）の培養によ
り、次式（Ｉ） で示されるデフォスタチンを製造する。デフォスタチン
はチロシンホスファターゼの阻害物質であり、免疫調節
剤や抗腫瘍剤として期待され、さらに細胞増殖の機構解
明の道具あるいは試薬としても有用である。
ーゼを阻害する活性をもち、抗腫瘍剤または免疫調整剤
として利用できる新規な物質を提供する。 【構成】 ストレプトミセス属に属するデフォスタチン
生産菌であるストレプトミセス・エスピー ＭＪ７４２
−ＮＦ５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２３）の培養によ
り、次式（Ｉ） で示されるデフォスタチンを製造する。デフォスタチン
はチロシンホスファターゼの阻害物質であり、免疫調節
剤や抗腫瘍剤として期待され、さらに細胞増殖の機構解
明の道具あるいは試薬としても有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はチロシンホスファターゼ
阻害活性、抗腫瘍活性及び免疫調節活性を有する新規な
生理活性物質デフォスタチン、その用途および製造法に
関する。
阻害活性、抗腫瘍活性及び免疫調節活性を有する新規な
生理活性物質デフォスタチン、その用途および製造法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】抗腫瘍性物質は既に多数のものが知ら
れ、また免疫調節物質に関してもいくつかのものが医薬
品として実用化されている。しかし、これらは薬効及び
副作用の点で必ずしも満足できるものではなく、よりす
ぐれた新規な物質に関しては不断の希求があるのが現状
である。またＴ細胞やＢ細胞のＣＤ４５はチロシンホス
ファターゼ活性を有しており、これが抗原刺激により活
性化され、免疫担当細胞の活性化に密接に関与している
と考えられる［セル(Cell)５８，１０５５−１０６６
（１９８９）］。一方、細胞周期的にはｃｄｃ２５が有
するチロシンホスファターゼがＧ２／Ｍ期進行に関与し
ていると考えられている［セル(Cell)６７，１８９−１
９６（１９９１）］。それゆえチロシンホスファターゼ
を阻害する物質は、免疫調節活性や抗腫瘍活性をもつこ
とが期待され、さらに細胞増殖の機構解明の道具あるい
は試薬としても有用である。
れ、また免疫調節物質に関してもいくつかのものが医薬
品として実用化されている。しかし、これらは薬効及び
副作用の点で必ずしも満足できるものではなく、よりす
ぐれた新規な物質に関しては不断の希求があるのが現状
である。またＴ細胞やＢ細胞のＣＤ４５はチロシンホス
ファターゼ活性を有しており、これが抗原刺激により活
性化され、免疫担当細胞の活性化に密接に関与している
と考えられる［セル(Cell)５８，１０５５−１０６６
（１９８９）］。一方、細胞周期的にはｃｄｃ２５が有
するチロシンホスファターゼがＧ２／Ｍ期進行に関与し
ていると考えられている［セル(Cell)６７，１８９−１
９６（１９９１）］。それゆえチロシンホスファターゼ
を阻害する物質は、免疫調節活性や抗腫瘍活性をもつこ
とが期待され、さらに細胞増殖の機構解明の道具あるい
は試薬としても有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】チロシンホスファター
ゼに対して強力な阻害活性を有し、かつ毒性の少ない新
規な生理活性物質の提供が待たれる。
ゼに対して強力な阻害活性を有し、かつ毒性の少ない新
規な生理活性物質の提供が待たれる。
【０００４】本発明は上記の希求に応えることを目的と
し、新規なチロシンホスファターゼ阻害物質を提供する
ことにより目的を達成しようとするものである。
し、新規なチロシンホスファターゼ阻害物質を提供する
ことにより目的を達成しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来より
有用な抗生物質の開発、実用化研究を促進してきたが、
本発明もかかる研究の一端として従来の文献未載の新規
な生理活性物質がある種の微生物の培養液中に産生され
ることを見出した。この物質を単離することに成功し
て、これがチロシンホスファターゼの酵素活性を強く阻
害することを見い出してデフォスタチンと命名した。更
に、本発明者らは、デフォスタチンなる化合物の化学構
造を解明し、また該化合物が抗腫瘍活性と免疫調節活性
を有することを知見した。
有用な抗生物質の開発、実用化研究を促進してきたが、
本発明もかかる研究の一端として従来の文献未載の新規
な生理活性物質がある種の微生物の培養液中に産生され
ることを見出した。この物質を単離することに成功し
て、これがチロシンホスファターゼの酵素活性を強く阻
害することを見い出してデフォスタチンと命名した。更
に、本発明者らは、デフォスタチンなる化合物の化学構
造を解明し、また該化合物が抗腫瘍活性と免疫調節活性
を有することを知見した。
【０００６】従って、第１の本発明によると、次式 で示される化合物であるデフォスタチンが提供される。
【０００７】本発明による新規物質デフォスタチンは、
前記の式（Ｉ）で示される化学構造を有するが、この化
学構造は、プロトン核磁気共鳴スペクトル、炭素１３核
磁気共鳴スペクトル、赤外部吸収スペクトル、質量分析
スペクトルを詳細に検討することによって前記の通り決
定された。
前記の式（Ｉ）で示される化学構造を有するが、この化
学構造は、プロトン核磁気共鳴スペクトル、炭素１３核
磁気共鳴スペクトル、赤外部吸収スペクトル、質量分析
スペクトルを詳細に検討することによって前記の通り決
定された。
【０００８】以下に、デフォスタチンの物理化学的性状
を示す。 （１）外観：淡黄色粉末 （２）溶解性：メタノール、エタノール、アセトンに可
溶、水、ヘキサンに難溶。 （３）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ２５４」
使用）：0.56 （展開溶媒：クロロホルム−メタノール，５：１） （４）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ １６９(positive) １６７(negative) （５）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図１に示す （６）プロトン核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２
に示す （７）炭素１３核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す （８）分子式：Ｃ7 Ｈ8 Ｎ2 Ｏ3 （９）融 点：１０４〜１０７℃ 本発明による新規物質、デフォスタチンがチロシンホス
ファターゼを阻害する活性を有することは、下記の試験
法により明らかになった。
を示す。 （１）外観：淡黄色粉末 （２）溶解性：メタノール、エタノール、アセトンに可
溶、水、ヘキサンに難溶。 （３）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ２５４」
使用）：0.56 （展開溶媒：クロロホルム−メタノール，５：１） （４）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ １６９(positive) １６７(negative) （５）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図１に示す （６）プロトン核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２
に示す （７）炭素１３核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す （８）分子式：Ｃ7 Ｈ8 Ｎ2 Ｏ3 （９）融 点：１０４〜１０７℃ 本発明による新規物質、デフォスタチンがチロシンホス
ファターゼを阻害する活性を有することは、下記の試験
法により明らかになった。
【０００９】試験例１ ヒトＴ細胞白血病Jurkat細胞より調製した細胞膜画分
（２μg ）をチロシンホスファターゼとして用いて、こ
れを、基質としての１mMホスホチロシンと共に１００mM
酢酸緩衝液（pH 6.0）に添加後、種々の濃度のデフォス
タチンを更に加え、３７℃で１０分間反応させた。反応
後、生成した無機リンをマラカイトグリーン試薬で発色
させ、６２０nmで吸光度を測定することによりチロシン
ホスファターゼ阻害活性を測定した。その結果、ヒトＴ
細胞白血病Jurkat細胞から前記の如く調製したＣＤ４５
のもつチロシンホスファターゼを本発明のデフォスタチ
ンは濃度依存的に阻害し、そのＩＣ50は 1.5μg/mlであ
ることが認められた。
（２μg ）をチロシンホスファターゼとして用いて、こ
れを、基質としての１mMホスホチロシンと共に１００mM
酢酸緩衝液（pH 6.0）に添加後、種々の濃度のデフォス
タチンを更に加え、３７℃で１０分間反応させた。反応
後、生成した無機リンをマラカイトグリーン試薬で発色
させ、６２０nmで吸光度を測定することによりチロシン
ホスファターゼ阻害活性を測定した。その結果、ヒトＴ
細胞白血病Jurkat細胞から前記の如く調製したＣＤ４５
のもつチロシンホスファターゼを本発明のデフォスタチ
ンは濃度依存的に阻害し、そのＩＣ50は 1.5μg/mlであ
ることが認められた。
【００１０】従って、第２の本発明によると、次式 で示される化合物であるデフォスタチンを有効成分とし
て含有するチロシンホスファターゼ阻害剤が提供され
る。
て含有するチロシンホスファターゼ阻害剤が提供され
る。
【００１１】本発明のデフォスタチン、またはこれを有
効成分として含有するチロシンホスファターゼ阻害剤
は、癌化あるいは免疫担当細胞の活性化の機構解明のた
めの試薬として用いられる。該試薬にデフォスタチンを
用いる場合には、たとえば癌細胞、免疫担当細胞などの
細胞の培養液中に、必要に応じて種々の増殖因子（例え
ば、ＥＧＦ，Ｃｏｎ Ａなど）と組み合わせて、そのま
ま、あるいは安定剤を加えて調製される水溶液あるいは
粉末などの形態で任意の濃度で加えるなどして用いるこ
とができる。
効成分として含有するチロシンホスファターゼ阻害剤
は、癌化あるいは免疫担当細胞の活性化の機構解明のた
めの試薬として用いられる。該試薬にデフォスタチンを
用いる場合には、たとえば癌細胞、免疫担当細胞などの
細胞の培養液中に、必要に応じて種々の増殖因子（例え
ば、ＥＧＦ，Ｃｏｎ Ａなど）と組み合わせて、そのま
ま、あるいは安定剤を加えて調製される水溶液あるいは
粉末などの形態で任意の濃度で加えるなどして用いるこ
とができる。
【００１２】更に、本発明による化合物デフォスタチン
は、前記のチロシンホスファターゼ阻害活性を有するこ
とに加えて、抗腫瘍活性及び免疫調節活性を有すること
が下記の試験例により明らかになった。
は、前記のチロシンホスファターゼ阻害活性を有するこ
とに加えて、抗腫瘍活性及び免疫調節活性を有すること
が下記の試験例により明らかになった。
【００１３】試験例２ デフォスタチンは、腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制を示
した。すなわち、ヒトＴ細胞白血病Jurkat細胞を３×１
０4 個／mlとなるように１０％牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０に浮遊させ、種々の濃度のデフォスタチンと
共に３７℃で２日間培養したが、Jurkat細胞の生育阻止
に関するデフォスタチンのＩＣ50値は、１．８μg/mlで
あると認められた。
した。すなわち、ヒトＴ細胞白血病Jurkat細胞を３×１
０4 個／mlとなるように１０％牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０に浮遊させ、種々の濃度のデフォスタチンと
共に３７℃で２日間培養したが、Jurkat細胞の生育阻止
に関するデフォスタチンのＩＣ50値は、１．８μg/mlで
あると認められた。
【００１４】試験例３ デフォスタチンはヒトＴ細胞Jurkat細胞によるインター
ロイキン２（ＩＬ２）産生も阻害する。１×１０6 個の
Jurkat細胞にＣｏｎ Ａ（８μg/ml）を作用させるとＩ
Ｌ２を産生する。種々の濃度のデフォスタチンおよびＣ
ｏｎ Ａ（８μg/ml）の存在下にJurkat細胞を試験例２
と同じ条件下に培養する試験を行った。これによると、
デフォスタチンは０．２μg/mlの濃度においてこのＩＬ
２産生を完全に阻害した。
ロイキン２（ＩＬ２）産生も阻害する。１×１０6 個の
Jurkat細胞にＣｏｎ Ａ（８μg/ml）を作用させるとＩ
Ｌ２を産生する。種々の濃度のデフォスタチンおよびＣ
ｏｎ Ａ（８μg/ml）の存在下にJurkat細胞を試験例２
と同じ条件下に培養する試験を行った。これによると、
デフォスタチンは０．２μg/mlの濃度においてこのＩＬ
２産生を完全に阻害した。
【００１５】試験例２および３の結果は、デフォスタチ
ンが細胞周期の進行に関与するチロシンホスファターゼ
や、Ｔ細胞の活性化に関与するチロシンホスファターゼ
を阻害することに由ると考えられる。上記の試験から、
本発明によるデフォスタチンは、抗腫瘍活性及び免疫調
節活性を示すことが明らかにされた。従って、本発明に
よるデフォスタチンは抗腫瘍剤として、また免疫調節剤
として使用することができる。
ンが細胞周期の進行に関与するチロシンホスファターゼ
や、Ｔ細胞の活性化に関与するチロシンホスファターゼ
を阻害することに由ると考えられる。上記の試験から、
本発明によるデフォスタチンは、抗腫瘍活性及び免疫調
節活性を示すことが明らかにされた。従って、本発明に
よるデフォスタチンは抗腫瘍剤として、また免疫調節剤
として使用することができる。
【００１６】それ故、第３の本発明によると、前記の式
（Ｉ）で示されるデフォスタチンを有効成分として含有
する免疫調節剤が提供される。
（Ｉ）で示されるデフォスタチンを有効成分として含有
する免疫調節剤が提供される。
【００１７】また、第４の本発明によると、前記の式
（Ｉ）で示されるデフォスタチンを有効成分として含有
する抗腫瘍剤が提供される。
（Ｉ）で示されるデフォスタチンを有効成分として含有
する抗腫瘍剤が提供される。
【００１８】免疫調節剤または抗腫瘍剤として本発明の
デフォスタチンを用いる場合、本化合物は合目的的な任
意の投与経路で、また採用した投与経路によって決る適
当な剤型で投与できる。デフォスタチンは、製薬上許容
される担体あるいは希釈剤で希釈された形態で有効成分
としてデフォスタチンを含む組成物として製剤するのが
普通である。
デフォスタチンを用いる場合、本化合物は合目的的な任
意の投与経路で、また採用した投与経路によって決る適
当な剤型で投与できる。デフォスタチンは、製薬上許容
される担体あるいは希釈剤で希釈された形態で有効成分
としてデフォスタチンを含む組成物として製剤するのが
普通である。
【００１９】免疫調節剤または抗腫瘍剤として本発明化
合物デフォスタチンを実際に投与する場合には、これら
を注射用蒸溜水または生理食塩水に溶解して注射する方
法が代表的な投与法である。具体的には、動物の場合に
は、腹腔内注射、皮下注射、静脈または動脈への血管内
注射および注射による局所投与などの方法があり、また
ヒトの場合は静脈または動脈への血管内注射または注射
による局所投与などの方法がある。
合物デフォスタチンを実際に投与する場合には、これら
を注射用蒸溜水または生理食塩水に溶解して注射する方
法が代表的な投与法である。具体的には、動物の場合に
は、腹腔内注射、皮下注射、静脈または動脈への血管内
注射および注射による局所投与などの方法があり、また
ヒトの場合は静脈または動脈への血管内注射または注射
による局所投与などの方法がある。
【００２０】本発明化合物デフォスタチンの投与量は、
動物試験の結果および種々の状況を勘案して、連続的ま
たは間欠的に投与したときに総投与量が一定量を越えな
いように定められる。具体的な投与量は、投与方法、患
者または被処理動物の状況、たとえば年齢、体重、性
別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患者また
はその病気の程度に応じて調整されることは言うまでも
ない。また一定の条件下における投与の適量と投与回数
は、上記指針を基として専門医の適量決定試験によって
決定されなければならない。具体的には、一つの指針と
してデフォスタチンの投与量は成人一日あたり、 0.001
〜 0.1ｇ程度である。
動物試験の結果および種々の状況を勘案して、連続的ま
たは間欠的に投与したときに総投与量が一定量を越えな
いように定められる。具体的な投与量は、投与方法、患
者または被処理動物の状況、たとえば年齢、体重、性
別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患者また
はその病気の程度に応じて調整されることは言うまでも
ない。また一定の条件下における投与の適量と投与回数
は、上記指針を基として専門医の適量決定試験によって
決定されなければならない。具体的には、一つの指針と
してデフォスタチンの投与量は成人一日あたり、 0.001
〜 0.1ｇ程度である。
【００２１】更に、デフォスタチンを産生する前記の微
生物はストレプトミセス属に属する菌株であると認めら
れた。従って、第５の本発明によると、次式（Ｉ） で示される化合物であるデフォスタチンの製造法とし
て、ストレプトミセス属に属するデフォスタチン生産菌
を培地で好気的に培養し、その培養物よりデフォスタチ
ンを採取することを特徴とするデフォスタチンの製造法
が提供される。
生物はストレプトミセス属に属する菌株であると認めら
れた。従って、第５の本発明によると、次式（Ｉ） で示される化合物であるデフォスタチンの製造法とし
て、ストレプトミセス属に属するデフォスタチン生産菌
を培地で好気的に培養し、その培養物よりデフォスタチ
ンを採取することを特徴とするデフォスタチンの製造法
が提供される。
【００２２】このデフォスタチン生産菌の一例には、平
成４年２月、微生物化学研究所において、沼津市の土壌
より分離された放線菌で、ＭＪ７４２−ＮＦ５の菌株番
号が付された菌がある。このＭＪ７４２−ＮＦ５株は下
記の菌学的性状を有するものである。
成４年２月、微生物化学研究所において、沼津市の土壌
より分離された放線菌で、ＭＪ７４２−ＮＦ５の菌株番
号が付された菌がある。このＭＪ７４２−ＮＦ５株は下
記の菌学的性状を有するものである。
【００２３】１．形態 ＭＪ７４２−ＮＦ５株は顕微鏡下で分枝した基生菌糸よ
りらせん形成を有する気菌糸を伸長し、輪生枝及び胞子
のうは認めない。成熟した胞子鎖は、５０個以上の胞子
の連鎖を認め、胞子の大きさは0.86〜0.95×1.36〜1.45
ミクロン位である。なお、胞子の表面は平滑である。
りらせん形成を有する気菌糸を伸長し、輪生枝及び胞子
のうは認めない。成熟した胞子鎖は、５０個以上の胞子
の連鎖を認め、胞子の大きさは0.86〜0.95×1.36〜1.45
ミクロン位である。なお、胞子の表面は平滑である。
【００２４】２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラーハーモニ
ー・マニュアル（Container Corporation ofAmerica の
color harmony manual）を用いた。 （１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 無色の発育上に、うすピンク［５ba，Shell Pink］の気
菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、白の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育の上に、うすピンク
［５ca，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２
７℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うす茶［４e
c，Rose Beige］の気菌糸を着生し、溶解性色素はかす
かに茶色味を帯びる。 （５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ca〜５cb，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素
はかすかに茶色味を帯びる。
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラーハーモニ
ー・マニュアル（Container Corporation ofAmerica の
color harmony manual）を用いた。 （１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 無色の発育上に、うすピンク［５ba，Shell Pink］の気
菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、白の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育の上に、うすピンク
［５ca，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２
７℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うす茶［４e
c，Rose Beige］の気菌糸を着生し、溶解性色素はかす
かに茶色味を帯びる。 （５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ca〜５cb，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素
はかすかに茶色味を帯びる。
【００２５】（６）栄養寒天培地（２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、白色の気菌糸を
着生し、溶解性色素は認められない。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７
℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うす茶［４e
c，Lt Rose Beige ］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃
培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ca，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ba，Shell Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 （１０）スターチ寒天培地（２７℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うすピンク
［４ea〜４ca，LightApricot 〜Flesh Pink］の気菌糸
を着生し、かすかに茶色味の溶解性色素を帯びる。
着生し、溶解性色素は認められない。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７
℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うす茶［４e
c，Lt Rose Beige ］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃
培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ca，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ba，Shell Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 （１０）スターチ寒天培地（２７℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うすピンク
［４ea〜４ca，LightApricot 〜Flesh Pink］の気菌糸
を着生し、かすかに茶色味の溶解性色素を帯びる。
【００２６】（１１）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上にうすピンク［５b
a，Shell Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 （１２）セルロース（ろ紙片添加合成液、２７℃培養） 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められ
ない。 （１３）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）及びグルコース
・ペプトン・ゼラチン培地（２７℃培養）のいずれの場
合も、発育は無色〜うす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解
性色素は茶色味を帯びる。 （１４）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育は無色〜うす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素
は培養後１０日目頃より茶色味を呈する。
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上にうすピンク［５b
a，Shell Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 （１２）セルロース（ろ紙片添加合成液、２７℃培養） 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められ
ない。 （１３）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）及びグルコース
・ペプトン・ゼラチン培地（２７℃培養）のいずれの場
合も、発育は無色〜うす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解
性色素は茶色味を帯びる。 （１４）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育は無色〜うす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素
は培養後１０日目頃より茶色味を呈する。
【００２７】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（りん酸水素二カリ
ウム 0.05％、Ｌ−アスパラギン 0.05％、グルコース
1.0％、ひも寒天 3.3％、pH 7.0）を用い、１４℃、２
０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温
度で試験した結果、１４、５０℃を除き、そのいずれの
温度でも生育する。最適生育温度は２７℃〜３０℃付近
と思われる。 （２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃
培養） 双方の培地で、培養後１２日目頃より液化が始まり、２
１日間の観察で完了はしなかったが液化作用は中等度で
ある。 （３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
およびスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養） いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性が認
められ、その作用は強い。 （４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 凝固は認められず、培養後１０日目頃よりペプトン化が
始り、１８日目頃に完了する。 （５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培
地７；いずれも２７℃培養） いずれの培地でも陰性である。
ウム 0.05％、Ｌ−アスパラギン 0.05％、グルコース
1.0％、ひも寒天 3.3％、pH 7.0）を用い、１４℃、２
０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温
度で試験した結果、１４、５０℃を除き、そのいずれの
温度でも生育する。最適生育温度は２７℃〜３０℃付近
と思われる。 （２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃
培養） 双方の培地で、培養後１２日目頃より液化が始まり、２
１日間の観察で完了はしなかったが液化作用は中等度で
ある。 （３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
およびスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養） いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性が認
められ、その作用は強い。 （４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 凝固は認められず、培養後１０日目頃よりペプトン化が
始り、１８日目頃に完了する。 （５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培
地７；いずれも２７℃培養） いずれの培地でも陰性である。
【００２８】（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
ラムノースを利用し、シュクロース、イノシトール、ラ
フィノース、Ｄ−マンニトールは利用しない。Ｄ−フラ
クトース及びラクトースは恐らく利用しないと思われ
る。 （７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地、２
７℃培養） 培養後１０日目頃より発育の周辺のリンゴ酸石灰を溶解
する。その作用は中等度である。 （８）硝酸塩の還元反応（ 0.1％硝酸カリウム含有ペプ
トン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養） 陽性である。 （９）セルロースの分解（ろ紙片添加合成液、２７℃培
養） 約６カ月間培養後分解が認められた。
リーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
ラムノースを利用し、シュクロース、イノシトール、ラ
フィノース、Ｄ−マンニトールは利用しない。Ｄ−フラ
クトース及びラクトースは恐らく利用しないと思われ
る。 （７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地、２
７℃培養） 培養後１０日目頃より発育の周辺のリンゴ酸石灰を溶解
する。その作用は中等度である。 （８）硝酸塩の還元反応（ 0.1％硝酸カリウム含有ペプ
トン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養） 陽性である。 （９）セルロースの分解（ろ紙片添加合成液、２７℃培
養） 約６カ月間培養後分解が認められた。
【００２９】以上の性状を要約すると、ＭＪ７４２−Ｎ
Ｆ５株は、その形態上、気菌糸はらせんを形成し、輪生
枝及び胞子のうは認められない。気菌糸の先端には５０
個以上の胞子を連鎖し、その表面は平滑である。種々の
培地で、発育はうす黄茶、気菌糸はうすピンクを呈し、
溶解性色素は認められない。最適生育温度は２７〜３０
℃付近である。メラニン様色素の生成は陰性、スターチ
の水解性は強い方、蛋白の分解力は中等度ないし強い方
である。
Ｆ５株は、その形態上、気菌糸はらせんを形成し、輪生
枝及び胞子のうは認められない。気菌糸の先端には５０
個以上の胞子を連鎖し、その表面は平滑である。種々の
培地で、発育はうす黄茶、気菌糸はうすピンクを呈し、
溶解性色素は認められない。最適生育温度は２７〜３０
℃付近である。メラニン様色素の生成は陰性、スターチ
の水解性は強い方、蛋白の分解力は中等度ないし強い方
である。
【００３０】なお、細胞壁に含まれる２，６−ジアミノ
ピメリン酸はＬＬ−型であった。◎これらの性状より、
ＭＪ７４２−ＮＦ５株は、ストレプトミセス（Streptom
yc es）属に属すると考えられる。更に近縁の既知菌種を
検索するとストレプトミセス・ロゼオスポルス（Strept
omyces roseosporus ，文献「International Journal
of Systematic Bacteriology」，１８巻，３７０頁，１
９６８年）及びストレプトミセス・ロゼオルス（Strept
omyces roseolus，文献「International Journal of S
ystematic Bacteriology」，１８巻，１６７頁，１９６
８年）があげられた。そこで、当研究所保存の上記２菌
種とＭＪ７４２−ＮＦ５株を実地に比較検討し、次の表
１に示した。
ピメリン酸はＬＬ−型であった。◎これらの性状より、
ＭＪ７４２−ＮＦ５株は、ストレプトミセス（Streptom
yc es）属に属すると考えられる。更に近縁の既知菌種を
検索するとストレプトミセス・ロゼオスポルス（Strept
omyces roseosporus ，文献「International Journal
of Systematic Bacteriology」，１８巻，３７０頁，１
９６８年）及びストレプトミセス・ロゼオルス（Strept
omyces roseolus，文献「International Journal of S
ystematic Bacteriology」，１８巻，１６７頁，１９６
８年）があげられた。そこで、当研究所保存の上記２菌
種とＭＪ７４２−ＮＦ５株を実地に比較検討し、次の表
１に示した。
【００３１】
【表１】
【００３２】ＭＪ７４２−ＮＦ５株は、気菌糸の形態が
らせん状であるが他の２種は Recti flexibilesでらせん
は形成しない。この点が大きな差異であり、あとは３者
とも極めて近い性状を示している。これらのことよりＭ
Ｊ７４２−ＮＦ５株はストレプトミセス・ロゼオスポル
ス及びストレプトミセス・ロゼオルスに極めて近縁の種
であるが同種とは言えない。従ってＭＪ７４２−ＮＦ５
株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces s.p.)
ＭＪ７４２−ＮＦ５とする。なお、ＭＪ７４２−ＮＦ
５株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請し、
平成４年１０月２７日にＦＥＲＭ Ｐ−１３２２３号と
して受託された。
らせん状であるが他の２種は Recti flexibilesでらせん
は形成しない。この点が大きな差異であり、あとは３者
とも極めて近い性状を示している。これらのことよりＭ
Ｊ７４２−ＮＦ５株はストレプトミセス・ロゼオスポル
ス及びストレプトミセス・ロゼオルスに極めて近縁の種
であるが同種とは言えない。従ってＭＪ７４２−ＮＦ５
株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces s.p.)
ＭＪ７４２−ＮＦ５とする。なお、ＭＪ７４２−ＮＦ
５株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請し、
平成４年１０月２７日にＦＥＲＭ Ｐ−１３２２３号と
して受託された。
【００３３】第５の本発明の方法において、デフォスタ
チンは、ストレプトミセス属に属するデフォスタチン生
産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養物から目
的物を採取することによって製造できる。培地は、デフ
ォスタチン生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有する
ものでありうる。具体的には、例えば、炭素源としてグ
ルコース、ガラクトース、グリセロール、デキストリ
ン、シュークロース、マルトース、スターチ及び油脂類
などが使用でき、窒素源として大豆粉、綿実粕、乾燥酵
母、酵母エキス及びコーンスティープリカーなどの有機
物並びにアンモニウム塩または硝酸塩、例えば硫酸アン
モニウム、硝酸ナトリウム及び塩化アンモニウムなどの
無機塩が利用できる。また必要に応じて、炭酸カルシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、重金属
塩などの無機塩類を添加することができる。発酵中の発
泡を抑制するために、常法に従って適当な消泡剤、例え
ばシリコーン油を添加することもできる。
チンは、ストレプトミセス属に属するデフォスタチン生
産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養物から目
的物を採取することによって製造できる。培地は、デフ
ォスタチン生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有する
ものでありうる。具体的には、例えば、炭素源としてグ
ルコース、ガラクトース、グリセロール、デキストリ
ン、シュークロース、マルトース、スターチ及び油脂類
などが使用でき、窒素源として大豆粉、綿実粕、乾燥酵
母、酵母エキス及びコーンスティープリカーなどの有機
物並びにアンモニウム塩または硝酸塩、例えば硫酸アン
モニウム、硝酸ナトリウム及び塩化アンモニウムなどの
無機塩が利用できる。また必要に応じて、炭酸カルシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、重金属
塩などの無機塩類を添加することができる。発酵中の発
泡を抑制するために、常法に従って適当な消泡剤、例え
ばシリコーン油を添加することもできる。
【００３４】培養方法としては、一般に用いられている
抗生物質の生産方法と同じく、好気的液体培養法が最も
適している。培養温度は２０−３０℃が適当であるが、
２５−３０℃が好ましい。この方法でデフォスタチンの
生産量は、振盪培養、通気攪拌培養共に培養４日間で最
高に達する。
抗生物質の生産方法と同じく、好気的液体培養法が最も
適している。培養温度は２０−３０℃が適当であるが、
２５−３０℃が好ましい。この方法でデフォスタチンの
生産量は、振盪培養、通気攪拌培養共に培養４日間で最
高に達する。
【００３５】このようにして、デフォスタチンの蓄積さ
れた培養物が得られる。この培養物中では、デフォスタ
チンは培養ろ液中にも菌体中にも存在する。
れた培養物が得られる。この培養物中では、デフォスタ
チンは培養ろ液中にも菌体中にも存在する。
【００３６】このような培養物からデフォスタチンを採
取するには、合目的的な任意の方法が利用可能である。
その一つは抽出の原理に基づくものであって、具体的に
は、培養ろ液中のデフォスタチンについてはこれを水不
混和性のデフォスタチン用溶剤、例えば酢酸エチルなど
で抽出する方法、あるいは菌体内のデフォスタチンにつ
いては遠心分離などで得た菌体集体をメタノール、アセ
トンなどで処理して回収する方法などがある。菌体を分
離せずに培養物そのままを上記の抽出操作に付すことも
できる。適当な溶媒を用いた向流分配法も抽出の範疇に
いれることができる。
取するには、合目的的な任意の方法が利用可能である。
その一つは抽出の原理に基づくものであって、具体的に
は、培養ろ液中のデフォスタチンについてはこれを水不
混和性のデフォスタチン用溶剤、例えば酢酸エチルなど
で抽出する方法、あるいは菌体内のデフォスタチンにつ
いては遠心分離などで得た菌体集体をメタノール、アセ
トンなどで処理して回収する方法などがある。菌体を分
離せずに培養物そのままを上記の抽出操作に付すことも
できる。適当な溶媒を用いた向流分配法も抽出の範疇に
いれることができる。
【００３７】培養物からデフォスタチンを採取する他の
一つの方法は吸着の原理に基づくものであって、既に液
状となっているデフォスタチン含有物、例えば培養ろ液
あるいは上記のようにして抽出操作を行うことによって
得られる抽出液、を対象として、適当な吸着剤、例えば
シリカゲル、活性炭などを用いて目的のデフォスタチン
を吸着させ、その後、適当な溶媒にて溶離させることに
よってデフォスタチンを得ることができる。このように
して得られたデフォスタチン溶液を減圧下に濃縮乾固す
れば、デフォスタチン粗製品が得られる。
一つの方法は吸着の原理に基づくものであって、既に液
状となっているデフォスタチン含有物、例えば培養ろ液
あるいは上記のようにして抽出操作を行うことによって
得られる抽出液、を対象として、適当な吸着剤、例えば
シリカゲル、活性炭などを用いて目的のデフォスタチン
を吸着させ、その後、適当な溶媒にて溶離させることに
よってデフォスタチンを得ることができる。このように
して得られたデフォスタチン溶液を減圧下に濃縮乾固す
れば、デフォスタチン粗製品が得られる。
【００３８】このようにして得られるデフォスタチンの
粗製品をさらに精製するためには、上記の抽出法及び吸
着法にゲル濾過法、高速液体クロマトグラフィー、向流
分配法などを必要に応じて組み合わせて必要回数行えば
よい。具体的には、例えば、デフォスタチン粗製品を２
５％メタノール系で高速液体クロマトグラフィーを行う
ことによりデフォスタチンの純品が得られる。
粗製品をさらに精製するためには、上記の抽出法及び吸
着法にゲル濾過法、高速液体クロマトグラフィー、向流
分配法などを必要に応じて組み合わせて必要回数行えば
よい。具体的には、例えば、デフォスタチン粗製品を２
５％メタノール系で高速液体クロマトグラフィーを行う
ことによりデフォスタチンの純品が得られる。
【００３９】前記のように、デフォスタチンは現在のと
ころ微生物の培養によってのみ得られているが、類縁化
合物の合成化学的修飾によって製造することも、あるい
は全合成的に製造することもできよう。また、遺伝子工
学的手法によることもできよう。すなわち、デフォスタ
チン産生遺伝子を適当な微生物に組み込み、このような
形質転換微生物を培養し、この培養物から得ることも可
能である。
ころ微生物の培養によってのみ得られているが、類縁化
合物の合成化学的修飾によって製造することも、あるい
は全合成的に製造することもできよう。また、遺伝子工
学的手法によることもできよう。すなわち、デフォスタ
チン産生遺伝子を適当な微生物に組み込み、このような
形質転換微生物を培養し、この培養物から得ることも可
能である。
【００４０】微生物の培養による場合の菌株としては、
例えばストレプトミセス属に属するデフォスタチン生産
能を有するもの、具体的には、本発明者らの分離したス
トレプトミセス・エスピー ＭＪ７４２−ＮＦ５株が使
用できるが、その他の菌株については、抗生物質生産菌
の単離の常法によって適当なものを自然界より分離する
ことが可能である。また、ストレプトミセス・エスピー
ＭＪ７４２−ＮＦ５株を含めて、デフォスタチンの生
産菌を放射線照射その他の変異処理に付して、デフォス
タチンの生産能を高める余地も残されている。さらに遺
伝子工学的手法によるデフォスタチンの生産も可能であ
る。
例えばストレプトミセス属に属するデフォスタチン生産
能を有するもの、具体的には、本発明者らの分離したス
トレプトミセス・エスピー ＭＪ７４２−ＮＦ５株が使
用できるが、その他の菌株については、抗生物質生産菌
の単離の常法によって適当なものを自然界より分離する
ことが可能である。また、ストレプトミセス・エスピー
ＭＪ７４２−ＮＦ５株を含めて、デフォスタチンの生
産菌を放射線照射その他の変異処理に付して、デフォス
タチンの生産能を高める余地も残されている。さらに遺
伝子工学的手法によるデフォスタチンの生産も可能であ
る。
【００４１】以下に、本発明を、デフォスタチンの醗酵
的製造を示す実施例について説明する。
的製造を示す実施例について説明する。
【００４２】実施例１ １）種母の調製 下記の組成の成分を１リットルの水に溶解してpH 7.4に
調整した培地を種母の調製に使用した。
調整した培地を種母の調製に使用した。
【００４３】 グリセロール ２０ｇ デキストリン ２０ｇ バクトソイトン １０ｇ イーストエキス ３ｇ 硫酸アンモニウム ２ｇ 炭酸カルシウム ２ｇ （殺菌前pH 7.4）
【００４４】記培地を１００mlを５００mlのいぼ付き三
角フラスコへ分注し、殺菌後、培地へ、ストレプトミセ
ス・エスピー ＭＪ７４２−ＮＦ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３２２３）をスラントより１白金耳接種し、２７℃にて
２日間振とう培養し、得られた培養物を種母として用い
た。
角フラスコへ分注し、殺菌後、培地へ、ストレプトミセ
ス・エスピー ＭＪ７４２−ＮＦ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３２２３）をスラントより１白金耳接種し、２７℃にて
２日間振とう培養し、得られた培養物を種母として用い
た。
【００４５】２）デフォスタチンの生産 使用した生産培地は、下記の組成の成分を１リットルの
水に溶解して、pH 7.4に調整した培地である。
水に溶解して、pH 7.4に調整した培地である。
【００４６】 グリセロール ２０ｇ デキストリン ２０ｇ バクトソイトン １０ｇ イーストエキス ３ｇ 硫酸アンモニウム ２ｇ 炭酸カルシウム ２ｇ （殺菌前pH 7.4）
【００４７】上記培地１１０mlを５００ml容の三角フラ
スコに分注し殺菌した後、その培地へ、上記種母を３％
の接種量で添加し、２７℃にて４日間好気培養を行なっ
た。
スコに分注し殺菌した後、その培地へ、上記種母を３％
の接種量で添加し、２７℃にて４日間好気培養を行なっ
た。
【００４８】３）デフォスタチンの採取 上記の条件で培養後、得られた培養液（５リットル）を
濾過し、濾液を等量の酢酸エチルで抽出した。菌体はア
セトンで抽出後、アセトンを除き酢酸エチルで抽出し
た。それら酢酸エチル抽出液を集めて濃縮乾固した。得
られた乾固物を少量のクロロホルムに溶解し、溶液から
不溶物を除いた後、シリカゲル（メルク社製「キーゼル
ゲル」）のカラム（４cmφ×１５cm）に吸着させ、クロ
ロホルム−メタノール（１００：１）で溶出した。
濾過し、濾液を等量の酢酸エチルで抽出した。菌体はア
セトンで抽出後、アセトンを除き酢酸エチルで抽出し
た。それら酢酸エチル抽出液を集めて濃縮乾固した。得
られた乾固物を少量のクロロホルムに溶解し、溶液から
不溶物を除いた後、シリカゲル（メルク社製「キーゼル
ゲル」）のカラム（４cmφ×１５cm）に吸着させ、クロ
ロホルム−メタノール（１００：１）で溶出した。
【００４９】デフォスタチンを含む活性フラクションを
濃縮乾固し、少量のメタノールに溶解後、高速液体クロ
マトグラフィーのカラム（センシュー社製「ヌクレオシ
ルＣ１８」、2.0 cmφ×２５cm）に吸着させ、２５％メ
タノールで溶出することによりデフォスタチンの純粋粉
末１００mgを得た。
濃縮乾固し、少量のメタノールに溶解後、高速液体クロ
マトグラフィーのカラム（センシュー社製「ヌクレオシ
ルＣ１８」、2.0 cmφ×２５cm）に吸着させ、２５％メ
タノールで溶出することによりデフォスタチンの純粋粉
末１００mgを得た。
【００５０】
【発明の効果】本発明による新規物質デフォスタチン
は、免疫調節活性、抗腫瘍活性と共にチロシンホスファ
ターゼ阻害活性を有しており、免疫調節剤や抗腫瘍剤と
して有用である。また、チロシンホスファターゼ阻害剤
として、癌化や細胞増殖の機構解明の手段に試薬として
有効である。
は、免疫調節活性、抗腫瘍活性と共にチロシンホスファ
ターゼ阻害活性を有しており、免疫調節剤や抗腫瘍剤と
して有用である。また、チロシンホスファターゼ阻害剤
として、癌化や細胞増殖の機構解明の手段に試薬として
有効である。
【図１】デフォスタチンのＫＢｒディスク法による赤外
吸収スペクトルを表わす。
吸収スペクトルを表わす。
【図２】デフォスタチンの重アセトン中における２７０
MHz でのプロトン核磁気共鳴スペクトルを表わす。
MHz でのプロトン核磁気共鳴スペクトルを表わす。
【図３】デフォスタチンの重アセトン中における 67.8M
Hzで炭素１３核磁気共鳴スペクトルを表わす。
Hzで炭素１３核磁気共鳴スペクトルを表わす。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】以下に、デフォスタチンの物理化学的性状
を示す。 （１）外観：白色粉末 （２）溶解性：メタノール、エタノール、アセトンに可
溶、水、ヘキサンに難溶。 （３）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ２５４」
使用）：0.56 （展開溶媒：クロロホルム−メタノール，５：１） （４）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ １６９(positive) １６７(negative) （５）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図１に示す （６）プロトン核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２
に示す （７）炭素１３核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す （８）分子式：Ｃ7 Ｈ8 Ｎ2 Ｏ3 （９）融 点：１０４〜１０７℃（１０）紫外部吸収スペクトル（メタノール中、濃度10
μg ／ml）：添付図面の図４に示す 本発明による新規物質、デフォスタチンがチロシンホス
ファターゼを阻害する活性を有することは、下記の試験
法により明らかになった。
を示す。 （１）外観：白色粉末 （２）溶解性：メタノール、エタノール、アセトンに可
溶、水、ヘキサンに難溶。 （３）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ２５４」
使用）：0.56 （展開溶媒：クロロホルム−メタノール，５：１） （４）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ １６９(positive) １６７(negative) （５）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図１に示す （６）プロトン核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２
に示す （７）炭素１３核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す （８）分子式：Ｃ7 Ｈ8 Ｎ2 Ｏ3 （９）融 点：１０４〜１０７℃（１０）紫外部吸収スペクトル（メタノール中、濃度10
μg ／ml）：添付図面の図４に示す 本発明による新規物質、デフォスタチンがチロシンホス
ファターゼを阻害する活性を有することは、下記の試験
法により明らかになった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Container Corporation ofAmerica
のcolor harmony manual）を用いた。 （１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 無色の発育上に、うすピンク［５ba，Shell Pink］の気
菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、白の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育の上に、うすピンク
［５ca，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２
７℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うす茶［４e
c，Lt Rose Beige ］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
かすかに茶色味を帯びる。 （５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ca〜５cb，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素
はかすかに茶色味を帯びる。
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Container Corporation ofAmerica
のcolor harmony manual）を用いた。 （１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 無色の発育上に、うすピンク［５ba，Shell Pink］の気
菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、白の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、２７℃培養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育の上に、うすピンク
［５ca，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２
７℃培養） うす黄茶［３ic，Lt Amber］の発育上に、うす茶［４e
c，Lt Rose Beige ］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
かすかに茶色味を帯びる。 （５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培
養） うす黄茶［２gc，Bamboo］の発育上に、うすピンク［５
ca〜５cb，Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素
はかすかに茶色味を帯びる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】なお、細胞壁に含まれる２，６−ジアミノ
ピメリン酸はＬＬ−型であった。これらの性状より、Ｍ
Ｊ７４２−ＮＦ５株は、ストレプトミセス（Streptomyc
es）属に属すると考えられる。更に近縁の既知菌種を検
索すると、ストレプトミセス・ロゼオスポルス（Strept
omyces roseosporus ，文献「International Journal
of Systematic Bacteriology」，１８巻，３７０頁，１
９６８年）及びストレプトミセス・ロゼオルス（Strept
omyces roseolus，文献「InternationalJournal of Sy
stematic Bacteriology」，１８巻，１６７頁，１９６
８年）があげられた。そこで、当研究所保存の上記２菌
種とＭＪ７４２−ＮＦ５株を実地に比較検討し、次の表
１に示した。
ピメリン酸はＬＬ−型であった。これらの性状より、Ｍ
Ｊ７４２−ＮＦ５株は、ストレプトミセス（Streptomyc
es）属に属すると考えられる。更に近縁の既知菌種を検
索すると、ストレプトミセス・ロゼオスポルス（Strept
omyces roseosporus ，文献「International Journal
of Systematic Bacteriology」，１８巻，３７０頁，１
９６８年）及びストレプトミセス・ロゼオルス（Strept
omyces roseolus，文献「InternationalJournal of Sy
stematic Bacteriology」，１８巻，１６７頁，１９６
８年）があげられた。そこで、当研究所保存の上記２菌
種とＭＪ７４２−ＮＦ５株を実地に比較検討し、次の表
１に示した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】ＭＪ７４２−ＮＦ５株は、気菌糸の形態が
らせん状であるが他の２種は Rectiflexibilesでらせん
は形成しない。この点が大きな差異であり、あとは３者
とも極めて近い性状を示している。これらのことより、
ＭＪ７４２−ＮＦ５株はストレプトミセス・ロゼオスポ
ルス及びストレプトミセス・ロゼオルスに極めて近縁の
種であるが同種とは言えない。従ってＭＪ７４２−ＮＦ
５株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces s
p. ) ＭＪ７４２−ＮＦ５とする。なお、ＭＪ７４２−
ＮＦ５株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請
し、平成４年１０月２７日にＦＥＲＭ Ｐ−１３２２３
号として受託された。
らせん状であるが他の２種は Rectiflexibilesでらせん
は形成しない。この点が大きな差異であり、あとは３者
とも極めて近い性状を示している。これらのことより、
ＭＪ７４２−ＮＦ５株はストレプトミセス・ロゼオスポ
ルス及びストレプトミセス・ロゼオルスに極めて近縁の
種であるが同種とは言えない。従ってＭＪ７４２−ＮＦ
５株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces s
p. ) ＭＪ７４２−ＮＦ５とする。なお、ＭＪ７４２−
ＮＦ５株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請
し、平成４年１０月２７日にＦＥＲＭ Ｐ−１３２２３
号として受託された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】培養物からデフォスタチンを採取する他の
一つの方法は吸着の原理に基づくものであって、既に液
状となっているデフォスタチン含有物、例えば培養ろ液
あるいは上記のようにして抽出操作を行うことによって
得られる抽出液を対象として、適当な吸着剤、例えばシ
リカゲル、活性炭などを用いて目的のデフォスタチンを
吸着させ、その後、適当な溶媒にて溶離させることによ
ってデフォスタチンを得ることができる。このようにし
て得られたデフォスタチン溶液を減圧下に濃縮乾固すれ
ば、デフォスタチン粗製品が得られる。
一つの方法は吸着の原理に基づくものであって、既に液
状となっているデフォスタチン含有物、例えば培養ろ液
あるいは上記のようにして抽出操作を行うことによって
得られる抽出液を対象として、適当な吸着剤、例えばシ
リカゲル、活性炭などを用いて目的のデフォスタチンを
吸着させ、その後、適当な溶媒にて溶離させることによ
ってデフォスタチンを得ることができる。このようにし
て得られたデフォスタチン溶液を減圧下に濃縮乾固すれ
ば、デフォスタチン粗製品が得られる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】上記培地を１００mlを５００mlのいぼ付き
三角フラスコへ分注し、殺菌後、培地へ、ストレプトミ
セス・エスピー ＭＪ７４２−ＮＦ５（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３２２３）をスラントより１白金耳接種し、２７℃に
て２日間振とう培養し、得られた培養物を種母として用
いた。
三角フラスコへ分注し、殺菌後、培地へ、ストレプトミ
セス・エスピー ＭＪ７４２−ＮＦ５（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３２２３）をスラントより１白金耳接種し、２７℃に
て２日間振とう培養し、得られた培養物を種母として用
いた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】デフォスタチンのＫＢｒディスク法による赤外
部吸収スペクトルを表わす。
部吸収スペクトルを表わす。
【図２】デフォスタチンの重アセトン中における２７０
MHz でのプロトン核磁気共鳴スペクトルを表わす。
MHz でのプロトン核磁気共鳴スペクトルを表わす。
【図３】デフォスタチンの重アセトン中における 67.8
MHz での炭素１３核磁気共鳴スペクトルを表わす。
MHz での炭素１３核磁気共鳴スペクトルを表わす。
【図４】デフオスタチンを10μg ／mlの濃度で含むメタ
ノール中におけるデフオスタチの紫外部吸収スペクトル
を表わす。
ノール中におけるデフオスタチの紫外部吸収スペクトル
を表わす。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】追加
【補正内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/00 8931−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 長縄 博 東京都大田区田園調布本町３番17号 (72)発明者 澤 力 神奈川県綾瀬市綾西４丁目６番７号 (72)発明者 濱田 雅 東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデ ンス405号 (72)発明者 梅澤 一夫 東京都渋谷区広尾３丁目１番２−505号
Claims (5)
- 【請求項１】 次式（Ｉ） で示される化合物であるデフォスタチン。
- 【請求項２】 次式（Ｉ） で示される化合物であるデフォスタチンを有効成分とす
るチロシンホスファターゼ阻害剤。 - 【請求項３】 次式（Ｉ） で示される化合物であるデフォスタチンを有効成分とす
る免疫調節剤。 - 【請求項４】 次式（Ｉ）
- 【請求項５】 ストレプトミセス属に属するデフォスタ
チン生産菌を培地で好気的に培養し、その培養物よりデ
フォスタチンを採取することを特徴とする、次式（Ｉ） で示されるデフォスタチンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5067346A JPH06256281A (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 新規物質デフォスタチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5067346A JPH06256281A (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 新規物質デフォスタチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06256281A true JPH06256281A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=13342375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5067346A Pending JPH06256281A (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 新規物質デフォスタチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06256281A (ja) |
-
1993
- 1993-03-04 JP JP5067346A patent/JPH06256281A/ja active Pending
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