JPS62294088A - 抗生物質ラサロシドａの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原虫および抗コクシジウム作用を有するポリ
エーテル抗生物質ラサロシ、ドＡの製造法に関する。

〔従来の技術〕

ポリエーテル抗生物質ラサロシドＡはジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー　（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
５ｏｃｉｅｔｙ）　５１巻５２９５ページ、（１９５１
年）および特公昭４６−２１４６７に記載された公知の
抗生物質で、放線醒ストレプトミセスＸ−５３７株（５
ｔｒｅｐ−１ｏｒｎｙｃｅｓ　Ｘ　−５３７）の発酵生
産物として報告されている。さらに特開昭５０−１３５
２８６には前記載１７）Ｘ−５３７株の発酵生産物とし
てラサロシドＡの同族体、ラサロシドＢ、Ｃ，Ｄおよび
Ｅが報告されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ポリエーテル抗生物質ラサロシドＡは抗原虫および抗コ
クシジウム作用が見い出され、ニワトリ、牛などのコク
シジウム症治療薬として使用されており、よりすぐれた
製造法開発のため本物質の新規製造法の開発が望１れる
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ストレプトミセス属に属し、ポリエーテル系
抗生物質ラサロシドのうちＡ成分選うサロシドＡを生成
蓄積せしめ、得られた培養液からラサロシドＡを収出よ
く採取することを特徴とするラサロシドＡの製造法に関
する。

この発明で使用するポリエーテル抗生物質ラサロシドＡ
の生産菌のうち、発明者らが、島根県鹿足郡日原町の土
壌から新たに分離した菌株（ＮＫ−８３−０２６８株と
番号を付す）は次のような菌学的性質を有する。

１、形態学的性質 ＮＫ−８３−０２６８株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸
より、らせん状の気菌糸を形成し、輪生枝はみとめられ
ない。成熟した胞子鎖は１０個以上の胞子の連鎖をみと
め、胞子の大きさは０．６〜０．８Ｘ１．２〜１．６　
　ミクロン位で胞子の表面は平滑である。

２、各種培地上の性状および生理学的性質臼の記載につ
いては（財）日本色沢研究所の色の標準を用いた。

（１）　　シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養
） 無色〜うす黄あるいはうす黄茶の発育上に白〜茶白の気
菌糸を着生し可溶性色素はわずかに紫味をおびる程度で
ある。

（２）　　グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃
培養） うす黄〜赤味茶の発育上に茶白〜明るい茶入あるいはピ
ンク灰の気菌糸を着生し。

可溶性色素は赤味をおびる程度である。

（３）スターチ・無機塩寒天培地（ｌ５Ｐ−培地４．２
７℃培養） うす黄茶〜うす茶の発育上に白〜明るい茶入の気菌糸を
着生し、可溶性色素はわずかに紫味赤をおびる程度であ
る。

（４）チロシン寒天培地（ｌ５Ｐ−培地７．２７℃培養
ン 灰味茶の発育上に白〜明るい茶入の気菌糸を着生し可溶
性色素は茶黒なおびる。

（５）栄養寒天培地（２７℃培養） 黄茶の発育上に気菌糸の着生はみとめられない。可溶性
色素は茶をおびる。

（６）　　イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−２培地、
２７℃培養） うす黄茶の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生し、可溶性
色素は茶をおびる。

（７）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−３培地、２７℃
培養） 無色〜うす黄茶の発育上に茶白〜明るい茶入の気菌糸を
着生し、可溶性色素はわずかに茶色味をおびる程度であ
る。

（８）　　スターチ寒天培地（２７℃培養）無色〜うす
黄茶あるいはうす茶の発育上に茶白〜明るい茶入の気菌
糸を着生し、可溶性色素はわずかにピンク味をおびる程
度である。

（９）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）無色〜うす
黄の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生し可溶性色素はわ
ずかに茶色味をおびる程度である。

（１０）セルロース（２７℃培養） 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素もみとめら
れない。

（１１）ゼラチン穿刺培養 単紳ゼラチン培地（２０℃培養）では無色〜うす黄茶の
発育上Ｋ、気菌糸の着生はみとめられない。また、溶解
性色素は茶色をおびる。

グルコース・ペプトン・ゼラチン培地 （２４℃培養）では、無色〜うす黄茶の発育上に気菌糸
は１着生せず、溶解性色素は茶色味をおびる。

（１２）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育はうす黄茶〜黄茶で、試験管壁の周りに浴って気菌
糸の着生は観察されず溶解性色素は、茶色味をおびる。

３、生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・スターチ寒天培地（可溶性デンプン１．０％
、イースト・エキス（大Ｋ）０．２％、粉末寒天（栄研
）２．０％、ｐＨ７，０）を用い、５℃、１０℃、２４
℃、２７℃、３７℃、５０℃の各温度で試験の結果５℃
、１０℃と５０℃を除いてそのいずれの温度でも発育し
たが、最適温度は２４〜２７℃付近と思われる。

（２）　　ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン、２０
℃培養ニゲルコース・ペプトン・ゼラチン、２４℃培養
） いずれの培地においても液化はみとめられない。（２１
日間） （３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
及びスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養 スターチ・無機塩寒天培地では培養後、１４４日目頃ら
、またスターチ寒天培地では、７日目頃からともに氷解
性がみとめられその作用は中等度である。

（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 凝固はみとめられず培養後９日目頃からペプトン化が始
まり、その作用は中等度である。

（５）　　メラニン様色素の生成（トリプトン・イース
ト・プロス、ｌ５Ｐ−培地ｘ；ペプトン・イースト・鉄
寒天、ｌ５Ｐ−培地６；チロシン寒天、ｌ５Ｐ−培地７
；いずれも２７℃培養） いずれの培地でもみとめられる。

（６）炭素源の利用性（プリド・・ム・ゴトリープ寒天
培地、　　ｌ５Ｐ−培地９，２７℃培養〕グルコース、
Ｌ〜アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース
、ラムノース、ラフィノース、イノシトール、Ｄ−マン
ニトール、シュクロースを利用する。

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、２７℃
培養） リンゴ酸石灰の溶解性はみとめられない。

（８）硝酸塩の還元反応（０，１％硝酸カリ含有ペプト
ン水ｌ５Ｐ−培地８．２７℃培養）陰性である。

以上の一性状を要約するとＮＫ−８３−０２６８株は、
ストレプトミセス（８ｔｒｐｔｏｍｙｃｅｓ　）属に属
し細胞壁に含まれる２、６−ジアミツビメリン酸はＬＬ
型である。又胞子のうをみとめられず、気菌糸は、らせ
ん状を有し、輪生枝はみとめられない。胞子の表面は平
滑で、種々の培地で無色〜うす黄あるいはうす黄茶の発
育上に茶白〜明るい茶入の気菌糸を着生し、溶解性色素
は紫味赤〜茶色をおびる。メラニン様色素は陽性、蛋白
分解力は陰性、スターチの氷解性、ミルクのべ。

プトン化はともに中等度である。

特公昭４６−２１４６７および特開昭５０−シ １３５２８６の記載によると、ラサロ秦ドＡおよびＢ、
Ｃ，Ｄ、Ｂ　を生産する菌株としてストレプトミセスＸ
　　５３７（ＮＲＲＬ３３８２　）が挙げられる。Ｘ−
５３７株は電子顕微鏡の所見で、胞子の表面が粗く、ま
た糖の利用性に関し、シュクロースおよびラフィノース
を利用しないと記載されている。一方、ジャーナル・オ
プ・アンティビオティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　）　２７巻、７４４ページ、１
９７４年にはラサロシド生産−菌株で、その菌学的性状
は、Ｊｏｈｎ　Ｗ、　Ｗｅｓｔｅｙ著ＭａｒｃｅＪ　Ｄ
ｅｋｋｅｒ社より出版されたＰｏ１ｙｅｔｈｅｒ　Ａｎ
ｔｉｂｊｏ−１ｉｃｓ　ｖｏｌ、１　（１９８３年）２
９ページに胞子の表面はとげ状を呈し、且つ糖の利用性
に関し、シュクロースおよび゛ラフィノースを利用しな
いと記載されている。しかし、本発明のラサロシドＡ生
産菌、ＮＫ８３−０２６８は前記々載の如く、上記の告
知菌株と異なり、胞子の表面は平滑で、その上シュクロ
ースおよびラフィノース乞利用する点か大きな相異点で
ある。

以上の相異点からＮＫ８３−０２６８株はストレプトミ
セス属に属する一菌株、ストレプトミセスＳｐ、ＮＫ８
３−０２６８と命名し、工業技術院微生物工業技術研究
所に受託番号、機工研菌与第８７６８号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−８７６８）と寄託されている。

この発明で使用するストレプトミセスＳｐ、ＮＫ８３−
０２６８株は、例えば紫外線、６０Ｃｏ等の照射処理、
ナイトロジエンマスタード、アザセリン、亜硝酸、Ｎ−
メチル−Ｎ′−ニトロソ−Ｎ−ニトロングアニジン（Ｎ
ＴＧ）、２−アミノプリン等の変異誘起剤による変異処
理、形質導入、形質転換、細胞融合等の通常用いられる
変異処理手段によってラサロシドＡの生産能力を高める
ことができる。

この発明によるラサロシドＡの生産は菌株ＮＫ８３−０
２６８を培地にて培養することにより行われる。培養方
法は原則的に放線菌の培養方法に準するが、通常は液体
培養による深部培養法が有利である。培養に用いられる
培地としては、菌株ＮＫ８３−０２６８が利用する栄養
源を含有する培地であればよい。

本発明により、ラサロシドＡを製造するにはまず前記菌
株を放線菌が利用し得る栄養物を含有する培地で好気的
に培養する。栄養源としては従来から放線菌の培養に利
用されている公知のものが使用でき、例えば炭素源とし
てグルコース、ガラクトース、マンニトール、テキスト
リン、澱粉、水飴（澱粉麦芽糖化物）、動植物性脂肪及
び油類例えばラード、大豆油などビ単独または組み合わ
せて用いることができろ。無機及び有機窒素源として、
塩化アンモニウム。

硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コー
ン・スチープ・リカー、大豆油カス、オートミール、カ
ザミノ酸、バクトソイトン、ソリプル・ベジタブル・プ
ロティンなど単独または組み合せて用いることができる
。その他必要に応じて食塩、硫酸マグネシウム、燐酸塩
などの無機塩を加えることができる。

培養中発泡が著しい時には例えば大豆油、亜麻仁油等の
植物油や東邦嵐１（東邦化学社製）、シリコンＫＭ−７
０（信越化学工業社製）等の石油系消泡剤を適宜添加す
ればよい。

培養温度は２０〜３０℃、ｐＨは中性ないし微アルカリ
性で培養を行うことが望ましく・。液体培養では通常３
〜７日間培養を行うと抗生物質ラサロシドＡが培養物中
に生成蓄積される。

培養物中の生成量が最大に達したとき培養を停止し、培
養物のまま、水に混和しない酢酸エステル類、高級アル
コール類、芳香族炭化水素、ハロゲン飽和炭化水素類等
で活性物を抽出する。

また培養物を濾過、シ濾過液と菌体とに分け、濾過液中
の活性物を上述した水と混和しない有機溶媒で抽出し、
菌体中に含有される活性物はアルコ−に類、エステル類
、ケトン類で抽出するこ左ができる。このようにして得
たラサロシドＡ粗抽出物から本物質の精製、単離には一
般に微生物代謝生産物をその培養液から単離するために
用いられる方法が利用される。ラサロシドＡはアルコー
ル類、エーテル、エステル類、酢酸、ジメチルスルフオ
キシド、ケトン類等の一般有機溶媒に溶けるが、水およ
び酸、アルカリに不溶の物質で、その精製にはいわゆる
脂溶性抗生物質の精製に用いられる方法により行われる
。すなわちシリカゲル、アルミナ、フロリジル、カラム
ライト等無機担体な用いる分配クロマト法、活性炭末あ
るいはダイアイオンＨＰ−２０、ＸＡＤ−４などの多孔
性吸着樹脂による吸脱着法、セファデックスＬＨ−２０
．ＬＨ−６０等を用いるゲル濾過法、数種の溶媒を組み
合せた向流分配法、各種溶媒での結晶化法等を組み合せ
て用いることができる。

実施例１゜ ロータリー型振盪用５００　ｍｌ容三角フラスコに溶性
澱粉２．０％（国産化学工業社り、グルコース０．５％
プロリッチ（味の素社ｆｆ）０．５％、ペプトン（極東
製薬社製〕０．５％、酵母エキス（犬五栄養化学社製）
０．５％、燐酸第２カＩＪ　０．０５％、硫酸マグネシ
ウム・７水塩０，０５％の培地（ｐＨ７，２）に炭酸カ
ルシウム０．２％を別途添加したもの１０１ｎｌを分注
し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。上記
シード培地にＮＫ８３−０２６８株（ＦＥＢＭ　Ｐ−８
７６８）の１白金耳を接種し２７℃、１８０回／分、２
日間培養した。これとは別にロータリー型振盪機用５０
０　ｍｌ容三角フラスコにガラクトース２．０％（犬山
薬品工業社製）デキストリン２．０％（６澱化学工業社
’ＪＪ）バクトソイトン１．０％（ティフコ社’１３）
コーン・スチープ・リカー０．５％（日本食品化工社製
）硫酸アンモニウム０．２％の培地（ｐＨ７，４）に炭
酸カルシウム０．２％を別途添加したもの１００ｍ１を
分注し。

１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したフラスコに
前記培養液２１１１１を無菌的に接種し、２７℃、１８
０回／分の条件下で６日間振盪培養を行なった。培養液
はｐＨ８，３で濾過操作により、ろ液９．３２と湿菌体
５３０ｇを得た。

なお培養力価はバチルス・スバチルスＰＣＩ　２１９を
被検菌とするペプトン寒天平板によるカップ法にて行な
い培養ろ液をＩＵ／ｍｌとした。

まず培養ろ液９．３！を１規定の苛性ソーダ溶液でｐＨ
９に調整後、等量の醋酸エチルと混合撹拌後静置し、醋
エチ層を分取した。得られた醋エチ層を４００ｍ１の蒸
留水で洗滌した後、５００ｇの無水硫酸す）　ＩＪウウ
にて脱水し、減圧下濃縮乾固することにより褐合ペレッ
ト１．０５　ｇ　（８，４０／■）を得た。一方、湿菌
体５３０ｇを７００　ｍｌのアセトン中で室温１時間攪
拌後、濾過操作によりアセトン抽出液を採取し、減圧下
１００ｍ１にｍ縮した。

この濃縮液を１規定苛性ソーダ溶液でｐＨＣｉ、　Ｏに
調整し１等量の酢酸エチルで活性成分を抽出し、得られ
た酢エチ抽出液をｓｏｍｔの蒸留水で洗滌後、無水硫酸
す）　ＩＪウム３０ｇで脱水し、減圧下で濃縮乾固する
ことにより褐色ペレッ）　１．５５　ｇ　（９，ＩＬＪ
／ｍｌ）を得た。

先の抽出物を合せクロロホルム５　ｍｌに溶解し、あ■ らかじめクロロホルムで充填したシリカゲルカラム２６
０　ｍｌ　（メルク社製、キーゼルゲル６０）にチャー
ジしクロロホルム５００　ｍｌを流し、サラニクｏｏホ
ルム：メタノ−＃（９７：　３　）１３００ｍｌにて溶
出した。バニリン硫酸および塩化第二鉄溶液の呈色反応
陽性画分を集め減圧下で濃縮乾固することにより薄黄色
の粉末５５５■（３３Ｕ／■）ヲ得り。次にこの粉末を
５　ｍｌのメタノールに溶解■ し、あらかじめメタノールで充填したセファデックスＬ
Ｈ−２０，１ツカラムに負荷させメタノールにより溶出
した。バニリン硫酸および塩化第二鉄溶液の呈色反応陽
性画分を集め減圧下で濃縮乾固することにより白色粉末
４４０ｍｇ（４０Ｕ／ｒｎｇ）を得た。

この粉末を臭化カリウム錠にて測定した赤外吸収曲線の
吸収啄犬値（波数ｃｍ−’　）は３４００゜２９８０、
　２９５０．　２８９０．　１７２０．　１６００．　
１５８０゜１４６０、　１４３０．　１３８５．　１３
７５．　１３２５．　１３００゜１２８０、　１２５５
．　１２１０．　１１５０．　１１３５．　１１０５゜
１０８０、　１０５０．　１０２５．　１０００．　９
７０．　９５０゜９４０、　９１０．　８９０．　８６
０．　８４０．　８０５．　７８５゜７６０．７４０．
７００　を示し、同一条件で測定したラサロシドＡ・ナ
トリウム塩・標準品（日本ロッシュ社製・ロフト番号０
９５７１２２）の赤外吸収曲線と一致した。

ナオ、紫外線吸収曲線、ＦＡＢ−マススペクトルの質量
数ｍ／ｚ５９１　（Ｍ＋１］　　及び”Ｃ−ＮＭＲのケ
ミカルシフトは文献値（ジャナル・オブ・アンティビオ
テックス１９７８年、３１巻、２８９頁）と一致した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ストレプトミセス・ｓｐ．ＮＫ８３−０２６８株を培地
   に培養し、ラサロシドＡを生成・蓄積せしめ、得られる
   培養物からラサロシドＡを分離、採取することを特徴と
   するラサロシドＡの製造法