JPS6144472B2

JPS6144472B2 -

Info

Publication number: JPS6144472B2
Application number: JP54084408A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yonehara; Nozomi Ootake; Kazukyo Onodera; Tomoyoshi Segawa; Keien Kyo; Masanori Sugita
Original assignee: Tobishi Pharmaceutical Co Ltd; Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Tobishi Pharmaceutical Co Ltd; Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1979-07-05
Publication date: 1986-10-02
Also published as: JPS568688A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な抗腫瘍性物質1166A物質及びそ
の製造法に関する。本発明者らは微生物の生産する抗腫瘍性物質の
検索を行い、放線菌Ｄ―1166の番号が付された菌
株が好気的液体培養によりその培養液中に抗腫瘍
性物質を産生することを見出した。本発明者らは
この抗腫瘍性物質を単離、精製することに成功
し、更に詳細に検討した結果、優れた抗腫瘍性を
有する新規な物質であることを発見し、これを
1166A物質と命名した。即ち、第１の本発明の要旨とするところは、分
子量1107（浸透圧法による測定）をもつ中性の物
質であつて、メタノールから無色針晶として結晶
化でき、元素分析値C62.51％，H8.93％，Ｏ
27.96％；融点156〜159℃；比旋光度〔α〕^２０ _Ｄ＝―
33.4゜（ｃ＝1.0％メタノール中）；紫外部吸収
スペクトル（メタノール中）には254nmに特異吸
収極大を示し、添付図面の第１図に示した赤外部
吸収スペクトル（臭化カリウム錠）を示し3400，
2950，1695及び1640cm^-1に特異吸収帯を有し、し
かも添付図面の第２図及び第３図に示した¹H―
核磁気共鳴吸収スペクトル及び¹³C―核磁気共鳴
吸収スペクトルを示し、メタノール，エタノー
ル，アセトン，クロロホルムに可溶，ブタノー
ル，酢酸エチルには一部可溶，水，エチルエーテ
ル，ベンゼン，ヘキサンに離溶性でありエールリ
ツヒ，ドラゲンドルフ，アニスアルデヒド反応で
は陽性，ニンヒドリン，エメリ―エンゲル，塩化
第二鉄反応では陰性である抗腫瘍性物質1166A物
質にある。また、第２の本発明の要旨とするところは、ス
トレプトミセス属に属する1166A物質生産菌を培
養し、その培養物から1166A物質を採取すること
を特徴とする、抗腫瘍性物質1166A物質の製造法
にある。第２の本発明の方法で用いられる1166A物質生
産菌の一例としては、日本の土壌から分離された
放線菌であつてストレプトミセスＤ―1166株があ
り、これは昭和54年１月21日に工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託された（微工研菌寄第4771
号）。この放線菌株であるストレプトミセスＤ―1166
株の菌学的性質について以下に記載する。 (A) 形態ストレプトミセスＤ―1166株の栄養菌糸は分枝
しながら長く伸長し、桿菌状・球菌状に分断せ
ず、隔壁も形成しない。空中菌糸は栄養菌糸より
培地表面に伸長し、巾0.4〜0.5μｍで単軸分枝
し、分枝上に短い胞子柄を密生し、その先端に密
で小さならせん状（１〜８回転、直径２〜2.5μ
ｍ）の胞子鎖を着生する。胞子鎖は10〜40個の胞
子からなり、表面は著しい「しわ状」（rugose）
で、巾0.6〜0.8μｍの鞘に包まれ（輪郭は「こぶ
状」）、個々の胞子形が不明瞭である。また、粘質
物に包まれたらせん状胞子鎖、仁井田の球状体
（ストレプトミセス属、ストレプトベルチシリウ
ム属で時々みられる）などが観察されるが、その
他の特殊形態は観察されなかつた。 (B) 各種培地における生育状況観祭法はISPの方法便覧にしたがい、集落表面
の菌叢色はH.D.トレスナーとE.J.バツカス
（1963）の色系列で示し、集落の裏面色と培地へ
の拡散性色素は分類色名（色の標準：日本色採研
究所）に翻訳して示す。なお詳細な色は（）内
にカラー・ハーモニイ・マニユアル（４版）の色
コードで示した。結果は要約して表１に示す。本菌株の菌叢色は最初白色系列であるが、胞子
の成熟度に伴ない赤色系列（ピンク灰〜明るい茶
灰）を経て灰色系列（明るい茶灰〜茶灰、赤味灰
〜明るい紫味灰、紫味灰〜暗い紫味灰）になる。
培地によつて、最終的には黒色湿潤班を形成す
る。集落の裏面色はうす黄から明るい黄またはう
す黄茶から明るい茶で、いわゆる不鮮明色を示
し、PHを変えても変色しない。培地への拡散性色
素として、メラニン様色素は生成せず、その他の
色素はチロシン寒天培地で33日目にうすピンク、
後にうす茶になり、PH指示薬性（酸性で茶白、塩
基性でうす赤）の色素を生成する。また、有機培
地で裏面色と同様なうす黄茶の色素をわずかに生
成するが、合成培地では生成しない。 (C) 生理的性状本菌株の生理的諸性状を表２に示す。生育最適
温度は20〜30℃にあり、いわゆる中温性放線菌で
ある。メラニン様色素は表１と表２に示した諸培
地及びゼラチン、脱脂牛乳などの有機培地でもほ
とんど生成されない。しかしチロシン寒天培地で
紅色系の色素（多分、ドーパークロム）を生成す
ることから、チロシナーゼ活性はあると考えられ
る。炭素源の利用能を表３に示す。本菌株はＤ―フ
ラクトースを利用しないが、他の８種の糖全部を
生育のために利用し得る。

【表】

【表】 (D) 記載の要約ストレプミセスＤ―1166は次のような形態的性
状をもつ。１栄養菌糸には分断および隔壁形成が
みられない。２胞子鎖はらせん状で、10個以上の
胞子により形成されている。３胞子のうを形成し
ない。以上の性状から、本菌株はストレプトミセ
ス（Streptomyces）属に包含される。本菌株の
胞子鎖が密な小らせん状であり、成熟菌叢色が灰
色系列で湿潤黒色班を形成し、メラニン様色素を
生成しないことから、本菌株はハイグロスコピカ
ス群（hygroscopicus―group）に属する。A.ダ
イエツの最近の研究（A.Dietz in T.Arai ed.
Actinomycetes，the boundary
microorganisms，Toppan co.Ltd，Tokyo，
pp183―191，1976）によれば、湿潤黒色班を形
成するハイグロスコピカス群は胞子の形態により
二群に分けられる。彼は胞子表面が「しわ状」
（rugose）の群と胞子の形が楕円形（帽子形また
は三日月形）の群とに分け、前者をストレプトミ
セス・ハイグロスコピカス（Streptomyces
hygroscopicus）、後者をS.ネオハイグロスコピカ
ス（S.neohygroscopicus）（新種名）とした。そ
して、ハイグロスコピカス群の既知の種と変種を
この２種に再編成した。この研究にしたがえば、
本菌株は胞子鎖が「しわ状」の鞘に包まれ、個々
の胞子形が明瞭に区別できない点で、前者に包含
される。次に本菌種Ｄ―1166の特性を基準にして「バー
ジー氏細菌同定便覧８版（1974）」とE.B.シヤー
リング氏とD.ゴツトリーブ氏のISP記載〔Int.J.
Syst.Bacteriol18，69（1968）；18，279
（1969）；19，391（1969）；22，265（1972）〕及
びその他の文献に記載されたストレプトミセス属
の種を検索し、本菌株はストレプトミセス（以後
Ｓと略記）ハイグロスコピカス（S.
hygroscopicus）種に近縁であることがわかつ
た。そこで本菌Ｄ―1166株とストレプトミセス・ハ
イグロスコピカスNRRL 2387の炭素源の利用能
を比較すると次に示すような結果となる。

【表】この結果から該菌種はストレプトミセス・ハイ
グロスコピカスNRRL 2387とは糖類の資化性に
若干の差異があることは明らかであり、また前者
に1166A物質生産能が見られ後者には見られない
ことであり、以上の結果から本菌種はストレプト
ミセス・ハイグロスコピカスに属する新菌種と同
定しストレプトミセス・ハイグロスコピカスＰ―
1166の名称を与えた。第２の本発明の方法を実施するに当つて、
1166A物質生産菌の培養は、好しくは、20〜30℃
の温度で水溶性栄養源を含む培地中で液中好気条
件下で行なう。この目的に有用な栄養培地は、放
線菌が利用できる栄養源を含む培地であればよ
く、培地の組成分として糖類、殿粉類及びグリセ
リンの如き同化性炭素源、カゼイン，ポリペプト
ン，大豆ミール，綿実ミール，肉ミール，酵母エ
キス，肉エキス，CSLの如き有機窒素源もしくは
生長物質源を含有できる。また塩化ナトリウム，
炭酸カルシウム，硫酸鉄，硫酸マグネシウム，硫
酸亜鉛の如き塩、ビタミンB₁₂，ビオチンの如き
微量要素を含有することもできる。又必要に応じ
てシリコーン，植物油または合成消泡剤を培地に
添加して起泡を制御することもできる。 1166A物質生産菌を保存するにあたつては真空
乾燥保存、凍結乾燥保存等の方法が用いられる
が、寒天斜面培地に継植する方法も用いることが
できる。 1166A物質の生産のためには寒天斜面培地より
―白金耳振盪フラスコに植菌し通常２〜５日前培
養して種菌とする。該種菌の一定量を本培養の醗
酵槽に接種し20℃〜30℃の温度で１〜３日通気撹
拌培養すると抗腫瘍性物質1166A物質が培養液１
当り、約21.7mg生産される。 1166A物質はクロロホルム，メタノール，アセ
トンの如き有機溶剤で抽出することができ、また
活性炭，非イオン性多孔性樹脂ハイポーラスポリ
マーHP 20（三菱化成工業(株)製）の如き吸着剤に
吸着し、メタノール，アセトンの如き溶剤で溶出
することができるので、これらの性質を利用して
培養液から採取できる。 1166A物質の好ましい単離，精製法としてはセ
フアデツクスLH―20を用いたカラムクロマトグ
ラフイーがある。次に本発明の1166A物質の物理化学的性質につ
いて詳述する。抗腫瘍性物質1166A物質はメタノール，エタノ
ール，アセトン，クロロホルムに可溶で、ブタノ
ール，酢酸エチルには一部可溶であり、水，エチ
ルエーテル，ベンゼン，ヘキサンには難溶な分子
量1107（浸透圧法により測定）の中性物質であ
る。融点156〜159℃，比旋光度〔α〕^２０ _Ｄ＝―33.4
゜、元素分析値はC62.51％，H8.93％，Ｏ 27.96％
を与え、分子式は元素分析値からC₅₄H₈₄C₁₈と推
定される。メタノールから無色針晶として結晶化
できる。1166A物質の赤外部吸収スペクトル（臭
化カリウム錠）は第１図に示す通りであり、次に
波数（cm^-1）：3400，2950，1695，1640に特異吸
収帯を有する。1166A物質の紫外部吸収スペクト
ルはメタノール中で254nm（ε28000）に極大吸
収を示した。1166A物質のジメチルスルホキシド
溶液の¹H―NMRスペクトルは第２図に示す通り
であり、次の吸収スペクトルを示す；δ3.4（br.
s）1H，3.8（ｍ）5H，4.25（ｂ）1HJ＝５Hz^a，
4.50（ｄ）2H、Ｊ＝６Hz^a，4.92（ｓ）1H，5.10
（ｄ）1H、Ｊ＝11Hz，5.43（ｓ）1H^a，5.62
（ｄ）1H、Ｊ＝15Hz，5.70（ｄ）、1H、Ｊ＝15
Hz，6.12（dd）1H、Ｊ＝15，12Hz，6.84（dd）
1H、Ｊ＝15，12Hz ａこれらのシグナルは重水（D₂O）の添加によ
り消失した。 1166A物質の¹³C―NMRスペクトル（CD₃OD―
CDC_３溶液中）は第３図に示す通りであり、
次の吸収スペクトルを示す； CH₃X₆ CH₂X₃C CHX16 ３（アセタールX1，オキシ―メチンX7，オ
レフイン系メチンX4）一重項X2（ケタール，エステルカルボニル）本発明の1166A物質は次に示すような部分的な
化学構造を有するものと考えられる。また1166A物質はエールリツヒ，ドラゲンドル
フ，アニスアルデヒド反応では陽性、ニンヒドリ
ン，エメリ―エンゲル，塩化第二鉄反応では陰性
であつた。本発明の方法で得られた1166A物質のシリカゲ
ルプレート（Merk，No.5721）を用いた薄層クロ
マトグラフイーにおけるＲ_f値を要約して示すと
次表の通りである。

【表】次に、本発明の方法で得られた1166A物質の生
理活性について記載する。1166A物質は細菌の一
部に対して抗菌力を示し、各種の菌に対する
1166A物質の最低生長阻止濃度（MIC）（mcｇ／
ml）を次に示す。

【表】

【表】更に1166A物質の抗腫瘍性を次の如く試験し
た。C3Hハムスターの2K細胞（C3H2Kと略称）
をSV―40ウイルスで形質転換させたガン（腫
瘍）細胞（SV―40transformed ce11）に対して
試験管内で1166A物質の抗腫瘍性を検定すると、
該物質は形態変化、発育阻害作用を示す。

【表】上記のように1166A物質は抗腫瘍活性を有する
ので、抗腫瘍剤としての用途が期待され、また一
部の細菌に対しては殺菌剤として利用できる。次に実施例について本発明を説明するが、これ
に限定まれるものではない。実施例可溶性澱粉1.0％、ポリペプトン1.0％、庶糖蜜
1.0％、肉エキス1.0％よりなる培地15mlを大型試
験管に分注し、滅菌後ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスＤ―1166株（微工研菌寄第4771号）
を―白金耳量で接種し、30℃で48時間振盪培養し
た。次に同じ培地を500ml容のエ―レンマイヤ―
フラスコに100mlずつ分注しし、滅菌後上記の種
菌を３％の割合で加え、30℃で72時間回転式振盪
機で培養し、ジヤー醗酵槽による本培養の種菌と
した。可溶性澱粉2.5％、大豆粉1.5％、硫安0.2％、乾
燥酵母0.2％、CaCO₃0.4％、、NaC0.5％より成
る培地を15ずつ30容のステンレス製醗酵槽４
基に仕込み、滅菌後種菌を3.0％の割合で加え、
30℃で通気撹拌培養を行つた（通気量15／分、
回転数300rpm）。次いで72時間培養した後に、培
養液を採取し、培養液から菌体を別した。得ら
れた菌体に10容のアセトン―水の混合溶媒（混
合比７：３）を加え、菌体を充分浸漬し、撹拌後
抽出液を別する。この操体を２回繰返し、抽出
液を合せて減圧下にアセトンを溜去し、濃縮液を
得た。得られた濃縮液を2N―苛性ソーダ溶液を用い
てPHを９〜10に調節し、2.0のＮ―ブタノール
を加えて活性物質をブタノール層に転溶する。こ
の抽出操体を３回繰返し、得られた抽出液を合せ
て減圧下にブタノールを溜去し、活性物質を含む
油状物質を得た。次いで前記油状の物質をメタノール―酢酸―水
（80：１：20）の混合溶媒に溶解させ、予じめ同
じ溶液を用いて充分に飽和させたセフアデツクス
LH―20のカラムに充填し、クロマトグラフイー
を行う。得られた活性な画分を集め、溶媒を減圧
下に溜去して1166A物質の粗結晶1.75ｇを得た。この様にして得られた粗結晶をメタノールに溶
解し、水を加えて低温下に放置して1166A物質を
無色針晶として得た（融点156〜159℃）。収量は
1.30ｇであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の1166A物質の赤外部吸収スペ
クトル図、第２図は¹H―NMRスペクトル図、第
３図は¹³C―NMRスペクトル図である。

Claims

【特許請求の範囲】１分子量1107（浸透圧法による測定）をもつ中
性の物質であつて、メタノールから無色針晶とし
て結晶化でき、元素分析値C62.51％，H8.93％，
Ｏ 27.96％；融点156〜159℃；比旋光度〔α〕^２０ _Ｄ
＝―33.4゜（ｃ＝1.0％メタノール中）；紫外部
吸収スペクトル（メタノール中）には254nmに特
異吸収極大を示し、添付図面の第１図に示した赤
外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠）を示し
3400，2950，1695及び1640cm^-1に特異吸収帯を有
し、しかも添付図面の第２図及び第３図に示した
¹H―核磁気共鳴吸収スペクトル及び¹³c―核磁気
共鳴吸収スペクトルを示し、メタノール，エタノ
ール，アセトン，クロロホルムに可溶、ブタノー
ル、酢酸エチルには一部可溶、水，エチルエーテ
ル，ベンゼン，ヘキサンに難溶性でありエールリ
ツヒ，ドラゲンドルフ，アニスアルデヒド反応で
は陽性，ニンヒドリン，エメリ―エンゲル，塩化
第二鉄反応では陰性である抗腫瘍性物質1166A物
質。２ストレプトミセス属に属する1166A物質生産
菌を培養し、その培養物から1166A物質を採取す
ることを特徴とする、抗腫瘍性物質1166A物質の
製造法。３ 1166A物質生産菌がストレプトミセス・ハイ
グロスコピカスＤ―1166株（微工研菌寄第4771
号）である特許請求の範囲第２項に記載の方法。