JPH0353312B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な抗生物質たる1166E物質および
その製法に関する。 本発明者らは放線菌の産生する抗成物質の検索
を行う過程で、放線菌Ｄ−1166株が好気的液体培
養によりその培養液中にリンゴ腐乱病病原菌に対
して抗菌活性を有する抗生物質を産生することを
見出した。本発明者らはこの抗生物質を単離、精
製することに成功しそしてそれを詳細に検討した
結果、リンゴ腐乱病病原菌Valsaceratosperma
に対して優れた抗菌作用を有する新規な物質であ
ることを発見したのでこれを1166E物質と命名し
た。 本発明の第１の要旨である1166E物質は次のよ
うな物理化学的性質を有している。 (1) 構造 (2) 分子式 C₃₄H₅₆O₈ (3) 分子量 592.788 (4) 〔α〕²⁵ _D ＋49.5°（ｃ＝0.055、メタノール中
） (5) 融点 95〜96.5℃ (6) 元素分析 計算値 実測値 Ｃ　：68.89％ 68.75％ Ｈ　： 9.52％ 9.50％ Ｏ　：21.59％ 21.48％ (7) 紫外吸収スペクトル（メタノール中）（第１
図参照） λ_nax246nｍ（ε＝18000） λ_nax278nｍ（ε＝7500） (8) 赤外吸収スペクトル（臭化カリウム板）（第
２図参照） 3400、1670、1655、1645、1615、1250、1105
（cm^-1） (9) プロトンNMR（重クロロホルム中で測定）
（第３図参照）

【表】 〓−CH_３ (30) 1.94

(27) 1.98

【表】 (10) ¹³C−NMR（重クロロホルム中）（第４図参
照）

〔シリカゲルプレートとしてのメルクNo.5721を用いた薄層クロマトグラフイーによる測定、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１：２）使用〕

また、第２の本発明の要旨とするところは、ス
トレプトミセス属に属する1166E物質生産菌を培
養し、その培養物から1166E物質を採取すること
を特徴とする、抗腫瘍性物質1166E物質の製造法
にある。 第２の本発明の方法で用いられる1166E物質生
産菌の一例としては、埼玉県大宮市の土壌から分
離された放線菌であつてストレプトミセス・ハイ
グロスコピカスＤ−1166株があり、これは昭和54
年１月12日に工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託された（微工研菌寄第4771号）。 この放線菌株であるストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスＤ−1166株の菌学的性質について以
下に記載する。 (A) 形態 ストレプトミセス・ハイグロスコピカスＤ−
1166株の栄養菌糸は分枝しながら長く伸長し、
桿菌状・球菌状に分断せず、隔壁も形成しな
い。空中菌糸は栄養菌糸より培地表面に伸長
し、巾0.4〜0.5μｍで単軸分枝し、分枝上に短
い胞子柄を密生し、その先端に密で小さならせ
ん状（１〜８回転、直径２〜2.5μｍ）の胞子鎖
を着生する。胞子鎖は10〜40個の胞子からな
り、表面は著しい「しわ状」（rugose）で、巾
0.6〜0.8μｍの鞘に包まれ（輪郭は「こぶ状」）、
個々の胞子形が不明瞭である。また、粘質物に
包まれたらせん状胞子鎖、仁井田の球状体（ス
トレプトミセス属、ストレプトベルチシリウム
属で時々みられる）などが観察されるが、その
他の特殊形態は観察されなかつた。 (B) 各種培地における成育状況 観察法はISPの方法便覧にしたがい、集落表
面の菌叢色はH.D.トレスナーとE.J.バツカス
（1963）の色系列で示し、集落の裏面色と培地
への拡散性色素は分類色名（色の標準：日本色
彩研究所）に翻訳して示す。なお詳細な色は
（ ）内にカラー・ハーモニイ・マニユアル
（４版）の色コードで示した。結果は要約して
表１に示す。 本菌株の菌叢色は最初白色系列であるが、胞
子の成熟度に伴ない赤色系列（ピンク灰〜明る
い茶灰）を経て灰色系列（明るい茶灰〜茶灰、
赤味灰〜明るい紫味灰、紫味灰〜暗い紫味灰）
になる。培地によつて、最終的には黒色湿潤斑
を形成する。集落の裏面色はうす黄から明るい
黄またはうす黄茶から明るい茶で、いわゆる不
鮮明色を示し、PHを変えても変色しない。培地
への拡散性色素として、メラニン様色素は生成
せず、その他の色素はチロシン寒天培地で３日
目にうすピンク、後にうす茶になり、PH指示薬
性（酸性で茶白、塩基性でうす赤）の色素を生
成する。また、有機培地で裏面色と同様なうす
黄茶の色素をわずかに生成するが、合成培地で
は生成しない。 (C) 生理的性状 本菌株の生理的諸性状を表２に示す。成育最
適温度は20〜30℃にあり、いわゆる中温性放線
菌である。メラニン様色素は表１と表２に示し
た諸培地およびゼラチン、脱脂牛乳などの有機
培地でもほとんど生成されない。しかしチロシ
ン寒天培地で紅色系の色素（多分、ドーパーク
ロム）を生成することから、チロシナーゼ活性
はあると考えられる。 炭素源の利用能を表３に示す。本菌株はＤ−
プラクトースを利用しないが、他の８種の糖全
部を生育のために利用し得る。

【表】

【表】 培地
表２ 生理的性質 １ 生育温度範囲 10〜40℃ 生育最適温度 20〜30℃ ２ ゼラチンの液化 陽性 ３ 脱脂牛乳の凝固 陰性 脱脂牛乳のペプトン化 強く陽性 ４ スターチの加水分解 強く陽性 ５ メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地 陰性 ペプトン・イースト・鉄寒天培地 陰性 トリプトン・イースト液体培地 陰性 ６ 硝酸塩の還元 強く陽性 表３ 炭素源の利用能 Ｌ−アラビノース（＋）
Ｌ−イノシトール（） Ｄ−キシロース（＋） Ｌ−ラムノース（） Ｄ−グリコース（） ラフイノース（＋） Ｄ−フラクトース（−）
Ｄ−マンニツト（） シユクロース（＋） （）よく利用する （＋）利用する （−）利用せず (D) 記載の要約 ストレプトミセスハイグロスコピカスＤ−
1166は次のような形態的性状をもつ。(1)栄養菌
糸には分断および隔壁形成がみられない。(2)胞
子鎖はらせん状で、10個以上の胞子により形成
されている。(3)胞子のうを形成しない。以上の
性状から、本菌株はストレプトミセス
（Streptomyces）属に包含される。本菌株の胞
子鎖が密な小らせん状であり、成熟菌叢色が灰
色系列で湿潤黒色斑を形成し、メラニン様色素
を生成しないことから、本菌株はハイグロスコ
ピカス群（hygroscopicus−group）に属する。
A.ダイエツの最近の研究（A.Dietz in T.
Araied.Actinomycetes，the boundary
microorganisms，Toppan Co.Ltd，Tokyo，
pp183〜191、1976）によれば、湿潤黒色斑を
形成するハイグロスコピカス群は胞子の形態に
より二群に分けられる。彼は胞子表面が「しわ
状」（rugose）の群と胞子の形が楕円形（帽子
形または三日月形）の群とに分け、前者をスト
レプトミセス・ハイグロスコピカス
（Streptomyces hygroscopicus）、後者をS.ネ
オハイグロスコピカス（S.neohygroscopicus）
（新種名）とした。そして、ハイグロスコピカ
ス群の既知の種と変種をこの２種に再編成し
た。この研究にしたがえば、本菌株は胞子鎖が
「しわ状」の鞘に包まれ、個々の胞子形が明瞭
に区別できない点で、前者に包含される。 次に本菌種Ｄ−1166の特性を基準にして「バ
ージー氏細菌同定便覧８版（1974）とE.B.シヤ
ーリング氏とD.ゴツトリーブ氏のISP記載
〔Int.J.Syst.Bacteriol 18、69（1968）；18、279
（1969）；19、391（1969）；22、265（1972）〕およ
びその他の文献に記載されたストレプトミセス
属の種を検索し、本菌株はストレプトミセス
（以後Ｓと略記）ハイグロスコピカス（S.
hygroscopicus）種に近縁であることがわかつ
た。 そこで本菌Ｄ−1166株とストレプトミセスハ
イグロスコピカスNRRL2387の炭素源の利用
能を比較すると次に示すような結果となる。

【表】 この結果から該菌種はストレプトミセス・ハ
イグロスコピカスNRRL2387とは糖類の資化
性に若干の差異があることは明らかであり、ま
た前者には1166E物質生産能が見られ後者には
見られないことであり、以上の結果から本菌種
はストレプトミセス・ハイグロスコピカスに属
する新菌種と同定しストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスＤ−1166の名称を与えた。 第２の本発明の方法を実施するに当つて、
1166E物質の生産菌の培養は20〜37℃好ましく
は25〜30℃の温度範囲で通常の放線菌の培養に
適切な水溶性栄養源を含む培地中にて好気条件
下で実施される。 本培養の目的に供される培地としては放線菌
が利用できる栄養源を含めばよく、培地組成と
してグルコース、フラクトース、シユークロー
スなどの糖類、殿粉、およびグリセリンなどの
炭素源およびカゼイン、ポリペプトン、大豆ミ
ール、綿実ミール、肉エキス、乾燥酵母、コー
ンステイープリカーなどの有機態窒素もしくは
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無
機態窒素などの窒素源が単独でないしは併合し
て用いる事ができる。 さらに、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、
硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、各種ビ
タミンなどを生育促進および調節の目的で利用
することも可能である。 必要に応じて、シリコーン、植物油あるいは
合成消泡剤を培地に添加し発泡を防ぐことも可
能である。 Ｄ−1166株の保存は凍結乾燥、培養液の凍結
保存、寒天斜面培地などに継代するなど種々の
方法が可能である。 1166E物質を生産する場合、寒天斜面培地よ
り一白全耳胞子を掻き取り振盪フラスコに移殖
し２〜５日、27〜30℃で培養し種菌とする。本
培養のスケールに応じて種培養を繰り返し種菌
を大量に得ることもできる。 本培養に際してはこのようにして得られた種
菌を一定量醗酵槽に接種し20〜35℃好ましくは
27〜30℃で２〜５日間通気撹拌する。得られた
培養液を遠心分離または過などの手段により
菌体を集め水とアセトン、メタノールなどとの
混合溶媒にて菌体より目的物質を抽出する。通
常、溶媒と水の混合比が50％〜70％の混液を用
いるが混合比はこれに限らない。抽出操作は必
要に応じ繰り返し行える。このようにして
1166E物質を含む抽出液を得た後、減圧下混合
溶媒を除去する。 得られた1166E物質を含む水溶液を硫酸また
は塩酸にてPHを調節して当該物質を抽出しやす
い状態にする。必要があれば、工業用食塩など
を加え抽出効率を高めたりエマルジヨン防止な
どの手段を講じることもできる。 続いて水と混合しない酢酸エチル、クロロホ
ルム、ブタノールなどの溶剤を用いて1166E物
質を有機溶媒槽に転溶させる。抽出液を飽和食
塩水などの溶液にて洗浄すれば水溶性の不純物
などの除去に効果がある。かくして得られた溶
媒層に芒硝を加え脱水した後溶媒を減圧下に留
去すれば1166E物質を含む粗抽出物を得ること
ができる。 更に、1166E物質を精製するためには通常の
脂溶性低分子物質の精製手段を適用できる。す
なわち種々の吸着クロマトグラフイーが有効で
あり、吸着剤としては一般に使用される担体た
とえばシリカゲル、アルミナ、マクロポーラス
非イオン系吸着樹脂等が使用できるが、シリカ
ゲルが最も有効に利用される。溶出溶媒として
はヘキサン／酢酸エチル（１：１）の混合溶媒
系が適している。薄層クロマトグラフイーでし
らべて1166E物質を含有する溶出液フラクシヨ
ンを集め、次いで減圧濃縮して溶媒を留去する
と1166E物質を含む油状物が得られる。得られ
た油状物はシリカゲルを用いる調製薄層クロマ
トグラフイーにおいてｎ−ヘキサン／酢酸エチ
ル（１：２）の混合溶媒系で展開後、Rf＝0.74
附近の1166E物質に相当する区分をかき取りそ
して酢酸エチルで溶出する。溶出液は減圧下に
濃縮して得られる粗製の1166E物質はLH−20
のカラムクロマトグラフイーに付される。溶出
はメタノールで行ない、1166E物質を含む区分
を集めて減圧下に濃縮すると1166E物質の粗粉
末が得られる。得られた粗粉末を少量の酢酸エ
チルに溶解し次いでｎ−ヘキサンを加えると
1166E物質が無色不定形結晶として単離され
る。このようにして得られた1166E物質は前記
したような物理化学的性状を有する。 本発明による1166E物質の生物活性について
述べると、1166E物質はリンゴ腐乱病病原菌
Valsa ceratospermaに対して抗菌活性を示
す。かかる抗菌活性は、ペニシリンＧおよびス
トレプトマイシンを各0.5％含むPSA培地（培
地１に馬鈴署200ｇ分の熱水抽出物、サツカ
ロース20ｇ、寒天10ｇを含有、PH5.8に調整）
を用いてペーパーデイスク法で調べた。結果は
次のとおりである。 1166E物質濃度 生育阻止円径 25μｇ／ml 45mm 12.5 40 6.2 37 3.1 31.5 1.56 37.5 0.78 22 次に本発明を更に説明するために実施例を掲げ
る。 実施例 可溶性殿粉1.0％、ポリペプトン1.0％、廃糖密
1.0％、肉エキス1.0％よりなる培地100mlを500ml
の坂口フラスコに分注し滅菌後ストレプトミセ
ス・ハイグロスコピカスＤ−1166株（微工研菌寄
第4771号）を一白金耳量接種し30℃で48時間振盪
培養した。次に同じ培地に500mlのエーレンマイ
ヤーフラスコに100mlずつ分注し滅菌後上記の種
菌を３％の割合で加え30℃で72時間回転式振盪培
養機で培養しジヤー醗酵槽による本培養の種菌と
した。乾燥酵母0.2％、CaCO₃0.4％、NaCl0.5％
よりなる培地を15ずつ30ステンレス製醗酵槽４
基に仕込み滅菌後種菌を3.0％の割合で加え30℃
で通気撹拌培養を行なつた（通気量15／分、回
転数300r.p.m）。 次いで、72時間培養した後に培養液を採取し培
養液より菌体を別した。 得られた菌体に65％アセトン−水混液を８加
え撹拌後一夜放置し過して抽出液を得た。減圧
下にアセトンを留去し得られた水溶液をPH7.0に
調節した後酢酸エチル10を加えて撹拌し抽出し
た。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、酢酸エチ
ルを減圧下に留去し橙黄色の油状物質を得た。得
られた油状物質は、シリカゲルクロマトグラフイ
ーに付し、ヘキサンで溶出を行なつて不純物を除
去した後、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）の混
合溶媒系で溶出を行ない1166E物質を含む画分を
得た。得られた画分を減圧下に溶媒を留去して
1166E物質を含む油状物質105mgを得た。得られ
た油状物質をメタノールに溶解してシリカゲル
（西独メルク社HF254）の薄層クロマトグラフイ
ー〔ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１：２）溶媒系
使用〕に付し、Rf0.74〜0.72の1166E物質に相当
する区分をかき取り、そして酢酸エチルで溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しそして得られた粗物
質をメタノールに溶解した後、セフアデツクス
LH−20のカラムクロマトグラフイーに付してメ
タノールで溶出した。次いで1166E物質を含む区
分を集め、減圧下に濃縮して1166E物質の粗粉末
23mgを得た。得られた粗粉末を酢酸エチルに溶解
した後、ｎ−ヘキサンを添加して1166E物質の無
色不定形結晶11mgを得た。 得られたものの融点は95〜96.5℃であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による1166E物質の紫外吸収ス
ペクトルを示す図であり、第２図は同じく赤外吸
収スペクトルを示す図であり、第３図は同じくプ
ロトンNMRを示す図でありそして第４図は同じ
く ¹³C−NMRを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式 で表わされる1166E物質。 ２ ストレプトミセス属に属する1166E物質生産
   菌を培養し、その培養物から1166E物質を採取す
   ることを特徴とする、1166E物質の製造法。 ３ 1166E物質生産菌がストレプトミセス・ハイ
   グロスコピカスＤ−1166株（微工研菌寄第4771
   号）である特許請求の範囲第２項に記載の方法。