JPS60100575A - リンゴ腐乱病病原菌に対して抗菌作用を有する１１６６ｅ抗生物質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗生物質たる１１６６Ｆ！物質およびそ
の製法に関する。

本発明者らは放１線菌の産生ずる抗生物質の検索を行う
過程で、放線菌Ｄ−１１６６株が好気的液体培養により
その培養液中にリンゴ腐乱病病原菌に対して抗菌活性を
有する抗生物質を産生ずることを見出した。本発明者ら
はこの抗生物質を単１”ＩＩ、ｆＩｙ製することに成功
しそしてそれを詳細に検討した結果、リンゴ腐乱病病原
菌Ｖａ１８ａｃｅｒａｔｏｓｐθｒｍａに対して優れた
抗菌作用を有する新規な物質であることを発見したので
これを１１６６に物質と命名した。

本発明の第１の要旨である１１６６Ｅ！物質は次のよう
な物理化学的性質を有している。

（２）分子式　〇５４Ｈ５６０８ （３）分子１ｋ　５９２．７８８ ５ （４）〔α）　＋　４９．５°（ｃ＝０．０５５．メタ
／−ル中）（５）融点　９５〜９６．５℃ （６）元署六分析 旧算値　実ｉ’ｌｌｌ盾 ｃ　：　６８．８９％　６８７５係 Ｈ：９．５２郊　９５０φ ０　：　２１．５９条　２１．４　ｆ３係（７）紫外吸
収ズはクトル（メタノール中）（第１図り創（ｄ）λｍ
ａｘ　２４６ｎｍ（ε＝１８０００　）λＩＩ］ａｘ　
２７８ｎｍ　（ε＝７５０ｎ　）（８）赤外吸収スはク
トル（臭化カリウム板）（第２図参照）３４００．１６
７０，１６５５，１６４５，１６１５，１２５０゜１１
０５（ｚ−’） （９）プロトンＮＭＲ（重クロロホｌレム中で測定）（
第５１図参照）−ＯＨ３（３３）　０．８１ −ｃＨ３（ろ１）ｏ、８３ 一０Ｈ２−ＯＨ３（２５）　０．８９ ＞−Ｉ！、　（２９）　０．９４ ＞０Ｈ５（３２）　１．０３ ′″）−ｃＨ５（２８）　１．０８ とｃＨｓ（３０）　１．９４ ン（Ｙｄ５　（２７）　１．９８ ＞ｃＨｓ　（２６）　２．０４ −ｏａＨ３（ろ４）　ろ、２６ 〉皿−ＯＨ（２１）　３．８５ ＣＨ３０−２匹＜　（１４）　３．９２〉亜−〇−（２
３）　４．００ ）Ｏ）Ｉ−ＯＨ（１７）　４．１０ 〉聾−０−（１５）　４．９７ ＝Ｏ１ｆ−（１３）　５．２　Ｕ ！乱〉−皿一（５，１１） ５．８５ ＝ＯＨ−坦＝ＯＨ（１２）　＆５１ （１０）　＋　５０−ＮＭＲ（市クロロホルム中）（第
４図−”＝＝＋１＜１　＞６３　（ｑ）　４．８ ６２　（ｑ）　６．９ ５１　（ｑ）　９．６ ２５　（（１）　１０．７ ２７　（ｑ）　１５．１ ２８　（ｑ＞　１７．４ １　（ｑ）　２ｏ、。

２９　（ｑ）　２１．５ ２４　（ｔ）２１．！５ ろ４　（ｑ）　５５．５ ２１　＠））　６Ｂ、２ １７　（ａ）　７０．５ ２３　（ｄ、）　７１．３ １９　（ｓ）　ｑｃｙｚ。

２　（ｇ）　１２２．１ １１　（ｄ）　１２５．３ １３　（ｄ）　１２Ｚ４ １２　（ａ）　１３２．５ ４　（θ）　１３４．３ １０　（ｓ）　１４２．７ ５　（ａ、）　１４４．６ ３　（ｄ）　１４６．、ｌＳ １　（ｓ）　１７２．０ （注）　ｑ　ニーＯＨｓ、ｔ　：　−０Ｈ２−、ａ　ニ
ーＯＨ＜、ｓ　：　−０−（１１）溶解性 メタノール、エタノール、了セトン、ｎ−ブタノール、
ピリジン、酢酸エチルおよびクロロホルムに可溶、ｎ−
ヘギサンおよび水に不溶。

（１２）外観　無色結晶状 （１ろ）　ａｆイ直　０．７４ 〔シリカゲルプレートとしでのメルク１Ｊｌ１５７２１
を用いた薄層クロマトグラフィーによる測定、ｎ−ヘキ
サン／酢酸エチル（１：２）使用〕 また、第２の本発明の要旨とするところは、ストレプト
ミセス属に４する１１６６Ｅ物質生産菌を培養し、その
培養物から１１６６に物質を採取することを特徴とする
、抗腫瘍性物質１１６６Ｅ物質の製造法にある。

第２の本発明の方法で用いられる１１６６Ｆｌｉ物質生
産閉の一例としては、埼玉県大宮市の土壌から分離され
た放ｎＰＡであってストレプトミセス・バイグロスコピ
カスＤ−１１６６株があり、これは昭和５４年１月１２
日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された（微
工研菌寄第４７７１号）。

この放線菌株であるストレプトミセス・バイグロスコピ
カスＤ−１１６６株の菌学的性質について以下に記載す
る。

（Ａ）形態 ストレフトミセス−バイグロスコピカスＤ−１１６６株
の栄養菌糸は分枝しながら長く伸長し、桿菌状・球偵状
に分断せず、隔壁も形成しない。

空中菌糸は栄養菌糸より培地表面に伸長し、巾０．４〜
０．５μｍで単軸分校し、分枝上に短い胞子柄を密生し
、その先端に密で小さならせん状（１〜８回転、直径２
〜２．５μｍ）の胞子鎖を着生する。胞子鎖は１０〜４
０個の胞子からなり、表面は著しい「しわ状Ｊ　（ｒｕ
ｇｏｓｅ　）で、巾０．６〜０．８μｍの鞘に包まれ（
輪郭は「こぶ状」）、個々の胞子形が不明瞭である。ま
た、粘質物に包まれたらせん状胞子鎖、仁井田の球状体
（ストレプトミセス絹、ストレプトベルチシリウム属で
時々みられる）などが観察されるが、その他の特殊形態
は観察されなかった。

（Ｂ）　各種培地における生育状況 観察法はＩＳＦの方法便覧にしたがい、集落表面の菌叢
色はＨ，Ｄ、　）レスナーとに、Ｊ、バッカス（１９６
ろ）の色系列で示し、集落の奥面色と培地への拡散性色
素は分類色名（色の４票準：日本色彩研究所）に翻訳し
て示す。なお詳細な色は０内ニカラー・ハーモニイ・マ
ニュアル（４版）の色コードで示した。結果は要約して
表１に示す。

本菌株の菌叢色は最初白色系列であるが、胞子の成熟度
に伴ない赤色系列（ピンク灰〜明るい茶入）を経て灰色
系列（明るい茶入〜茶灰、赤味灰〜明るい紫味灰、紫味
灰〜暗い紫味灰）になる。培地によって、最終的には黒
色湿潤斑を形成する。集落の裏面色はうす黄から明るい
黄またはうす黄茶から明るい茶で、いわゆる不鮮明色を
示し、　ｐＨを変えても変色しない。培地への拡散性色
素として、メラニン様色素は生成せず、その他の色素は
チロシン寒天培地で６日目にうすピンク、後にうす茶に
なり、ｐＨ指示薬性（酸性で蒼白、＠基柱でうす赤）の
色素を生成する。また、有機培地で裏面色と同様なうす
黄茶の色素をわずかに生成するが、合成培地では生成し
ない。

（Ｃ）　生理的性状 本菌株の生理的諸性状を表２に示す。生育最適温度は２
０〜６０℃にあり、いわゆる中温性放線菌である。メラ
ニン様色素は表１と表２に示した諸培地およびゼラチン
、脱脂牛乳などの有機培地でもほとんど生成されない。

しかしチロシン寒天培地で紅色系の色素（多分、ドー・
ξ−クロム）を生成することから、チロシナーゼ活性は
あると考えられる。

炭ズ（源の利用能を表６に示す。本菌株はＤ−プラクド
ースを利用しないが、他の８種の糖全部を生育のために
利用し得る。

表　１　各 陪地における生育状況 を色（２ｃａ　）　な　し 表２　生理的性質 １．　生＝＃　温度１ｔｂ１　１０〜４ＯＮ：生育最適
温度　２０〜′５０℃ ２、ゼラチンの液化　１う性 ３、脱脂牛乳の凝固　陰　性 脱脂牛乳のペプトン化　強く陽性 ４、スターチの加水分解　強く陽性 ５、メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地　Ｉ’ｍ　性 ペプトン・イースト・μオこ天ｊ母也　陰　性トリプト
ン・イースト液体培地　＋４．’、性＆硝酸塩の還元　
強く陽性 表６　炭素源の利用能 Ｌ−アラビノース（４→　ｂ−イノシトール０ＤＤ−キ
シロース　（＋）　Ｌ−ラムノース　（］］ＯＤ−グル
コース（１］）　ラフィノース０うＤ−フラクトース←
）　Ｄ−マンニット　（ハ）シュクロース　（→ θ４）よく利帛する　０→利用する （ハ）利用せず （Ｄ）　記載の要約 ストレプトミセスバイグロスコピカスＤ−１１６６は次
のような形態的性状をもつ。　１）栄養菌糸には分断お
よび隔壁形成がみられない。　２）胞子鎖はらせん状で
、１０個以上の胞子により形成されている。　３）胞子
のうを形成しない。以上の性状から、本菌株はストレプ
トミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅθ）属に包含される
。本菌株の胞子鎖が密な小らせん状であり、成熟菌叢色
が灰色系列で湿潤黒色斑を形成し、メラニン様色素を生
成しないことから、本菌株はハイグロスコピーカス群（
ｎｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ−ｇｒｏｕｐ　）に属する
。

Ａ。ダイ二ツの最近の研究（Ａ、　Ｄｉｅｔｚｉｎ　Ｔ
、Ａｒａｉｅｄ、、　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、　
ｔｈｅ　ｂｏｕｎｄａｒｙ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ。

Ｔｏｐｐａｎ　ｃｏ、　Ｌｔａ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｉ）
ｐｌ　８３〜１９１　、１９７６）によれば、湿潤黒色
斑を形成するノ・イグロスコピカス群は胞子の形態によ
り二群に分けられる。

彼は胞子表面が［しわ状Ｊ（ｒｕｇｏθθ）の群と胞子
の形が楕円形（帽子形または三日月形）の群とに分け、
前者をストレプトミセス・バイグロスコピカス（ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｅ　）
、後者を８．ネオバイグロスコピカス（Ｓ、　ｎｅ７）
ｈｙＩ７ｒｏｏｃｏｐｉｃｕｓ　）（新種名）とした。

そして、バイグロスコピカス群の既知の種と変種をこの
２種にＦｒ　ｈａｓ成した。

この研究にしたがえば１本菌株は胞子４．′ｉが「しわ
状」の鞘に包まれ、　ｎ、ｓｘ々の１１；シ子形が明（
瞭に区別できない点で、前者に包含される。

次に本菌挿Ｄ−１１６６の・特性を基１′入へにして［
パージ−氏細菌同定便覧８版（１９７４）Ｊとに、Ｂ。

シャーリング氏とり、ゴツトリーブ氏のＩＳＰ記載〔工
ｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１Ｂ
、６９（１９６Ｂ）：す、２７９（１９６９）；■、３
９１（１９６９）：ム。

２６５（１９７２））およびその他の文献に記載された
ストレプトミセス属の種を検索し、本菌株はストレプト
ミセス（以後日と略記）バイグロスコピカス（Ｓ、　ｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　）種に近緑であることがわ
かった。

そこで本菌Ｄ−１１６６株とストレプトミセスバイグロ
スコピカスＮＲＲＬ　２３８７の炭素源の利用能を比較
すると次に示すような結果となる。

本菌株Ｄ−１１６６と近縁（重 の炭素源利用能の比較 Ｌ−アラビノース　＋　±　＋ Ｄ−キシロース　÷　±　＋ Ｄ−グルコース　什　＋　＋ Ｄ−７ラクトース　−　＋　＋ シュクロース　十　− Ｌ−イノシトール　廿　士　− Ｌ−ラムノース　廿　＋　＋ ラフィノース　＋　−− Ｄ−マンニット　妊　＋ この結果から該Ｆ、４＋　４ｆｆｉはストレプトミセス
・バイグロスコピカスＮＲＲＬ２６８７と（は糖づ７Ｌ
１の一゛Ｌ化性に若干の差異があることは明らかであ（
〕、また前者には１１（５６Ｅ物貢生産能が見ら′ｆ′
Ｌ罷老に１１見られないことであり、以、上の１１°１
１↑Ｓから本薗、（すはストレプトミセス・バイグロス
コピカスに、ｉ′：する新菌種と同定しストレプトミセ
ス・バイグロスコピカスＤ−１１６６の名亦を与えた。

第２の本発明の方法を実ｔｊｉ＋ｊするに当って、１１
６６ｙ、物質の生ｔｉｆｚ凶の培携は２０〜６７℃好γ
しくけ２５〜３０℃のｕＮ度範ＩＪ１」で：Ｒｊ　、信
の１１プ！゛謎１：４の培養に適切な水ｆ、１７性栄首
源を含む培Ｊ’Ｊ’ｉ中にて好気条件下で実１１ｐｑさ
れる。

本培養の目的に供さね２る」、ｌ地として１・ま放’Ｆ
？ｊ！　ｔ“１が利用テきる栄’Ｎ　”Ｉｔｆ：’ａ　
メげ、１．＜、培地＜、４１　我とシテクルコース、フ
ラクトース、シュークロースなどの机ｌ＝ｉ　、ｊｌ没
オ分、およびグリセリンなどの炭素源およびカゼイン、
ポリペプトン、大豆ミール、綿実ミール、肉エキス、乾
燥酵母、コーンステイーシリカ−などの有機態窒素もし
くはイ’Ａｆｆｉ　’１９アンモニウム、塩化アンモニ
ウムなどの無様態窒素などの窒素ン原が単独でないしく
ｄ併合して用いる・にができる。

さらに、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、４１Ｊｉ［
ビ２鉄、硫ｒ浚マグネシウム、硫酸亜鉛、各種ビタミン
などを生育促進および調節の目的で利用することも可能
である。

必〆に応じて、シリコーン１、（直物油あるいは合成消
泡剤を培地に添加し発泡を防ぐことも可能である。

Ｄ−１１６６株の保存は凍結乾燥、培養液の凍結保存、
寒天斜面培地などに継代するなど種々の方法が可能であ
る。

１１６６ｗ物質を生産する場合、寒天斜面培地より一白
金耳胞子を掻き取り振轍フラスコに移殖し２〜５日、２
７〜３０℃で培；ネしトコ［′１１とする。

本培養のスケールに応じて１重培養全ＩＸりり返し種菌
を大−陸に得ることもできる。

本培？１・にｇ９してはこのようにして１′：Ｉらｈた
Ａ（１１：Ｍ　’！ｉニ一定ＪＸｉ醗酵（ｊ１に接イ；
ｉし２ｏ〜６５℃好ましくは２７〜３０℃で２〜５日間
・１ｒＪ、気Ｉｌ′ζ拌ノーる。得られた培芥′ｅ、を
遠心分１前址たは〃コノハなどの手段により菌体を菓め
水とアセ）・ン、メタノールなどとの混合溶〃ＩＬに−
Ｃ菌体より目的物ｆ′ｆを（１（ｊ出する。

通常、溶媒と水の混合比が５０φ〜７０ヴの混液を用い
るが混合比ｅよこれに限らない。抽出操作１ｄ必要に１
忘じ繰り返し行える。このようにして１１６６に物質を
含む抽出液を得た後、残圧下混合溶媒を除去する。

得られた１１６６ｇ１′／Ｊ質を含む水溶ｉ’ｌ’ｔ　
ｆ：硫１．ツまたは塩ｌ循にてｐＨを調節して当該Ｉ吻
’ｔｌ　４：抽出しやすい状態にする。必要があれば、
工業用食塩などを加え抽出効率を高めたりエマルジョン
防止などの手段を講じることもできる。

続いて水と混合しない酢酸エチル、クロロホルム、ブタ
ノールなどの溶剤を用いて１１６６Ｅ物質を有１・幾溶
媒層に転溶させる。抽出液を飽和食塩水などの溶液にて
洗浄すれば水溶性の不純吻などの除去に効果がある。か
くして得られた路！；堵層に芒硝を加え脱水した後溶媒
を減圧下に留去すれば１１６６に物質を含む粗抽出物を
得ることができる。

υｙに、１１６６ｇ物′ｎを、１青製するためには通常
の脂溶性低分子物質の４重１製手段ｆ：適用できる。

すなわち種々の吸着クロマトグラフィーが有効であり、
吸着剤としては一般に使用される担体たとえばシリカゲ
ル、アルミナ、マクロポーラス非イオン系吸着樹脂等が
１吏用できるが、シリカゲルが最も有効に利用される。

溶出溶成としてはへキサン／酢酸エチル（１：１）の混
合Ｍ　媒系が為している。Ｒｊ、層クロマトグラフィー
でしらべて１１６６Ｅ’吻質を含有する溶出症フラクシ
ョンを集め、次いで減圧鎖線して溶〃！、１を留去する
と１１６６に’物質を含む負１１犬゛、勿がイ；Ｉらｈ
る。１けられた油状物はシリカケ゛ルを用いろ調゛：゛
±γ！、：　Ｊｉうクロマトグラフィーにおいてｎ−ヘ
キサン／　ＥＣｉｊ’４エチル（１：２）の混合溶媒系
で１１いｊ１ｑ後、　Ｒｆ＝０．７４附近の１１６６Ｅ
物・直に７）１１当する区分をかき１反怜そして酢ｉ浚
エチルで？＋’；出する。溶出ｃ夜はイ戊１五下に濃縮
してイリら−ｈ−る粗製の１１６６Ｆ、’物質はＬＩ（
−２０のカラムクロマトグラフィーに付される。

溶出はメタノールで行ない、１１６６に物＋（′【を含
む区分を集−めて減圧下に痙縮すると１１６６ｇ物質の
粗粉末が得られる。？ｉ１られた粗粉末を少量′の酢酸
エチルに溶解し次いでｎ−ヘキサンを加えると１’１６
６に物質が無色不定形結晶として単離される。このよう
にして得られた１　１６６　ｖ　物質は前記したような
物理化学的性状を有する。

本発明による１１６６に物質の生物活性について述べる
と、１１６６Ｅ物質はリンゴ腐乱病病原菌Ｖａｌｅａ　
ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａに対して抗菌活性を示す。

かかる抗菌活性は、ペニシリンＧおよびストレプトマイ
シンを各０．５％含むＰＳＡ培地（培地１℃に馬鈴ｇ２
Ｏｏｒ分の熱水抽出物、サッカロース２０２、寒天１０
２を含有、ｐＨ５，８に調整）を用いてペーパーディス
ク法で調べた。結果は次のとおりである。

１１６６ｍ物質濃度　生育阻止円径 ２５μ？　／ｍｅ　４５　ｔｒａｎ １２．５　４゜ ６．２　３７ ３．１　３１．５ １、５６　３７．５ ０．７８　２２ 次に本発明を更に説明するために実施例を掲げる。

実施例 可溶性殿粉１．０裂、ポリはプトン１，０チ、廃糖密１
．０％、肉エキス１．０％よりなる培地１００ｍ１を５
００ｍの坂ロフラスコに分注しｔｋＭ　ｉＷｊ後ストレ
ゾトミセス・バイグロスコピカスＩ）　−１１６６株（
微工研菌寄第４７７１号）を−白金耳叶接口し６０℃で
４８時間振諦培養した。仄に同じ培ＪｔｋＫ５００−の
エーレンマイヤーフラスコＫ　１００−ずつ分注し滅菌
後上記の種菌を６％の割合で加えろ０℃で７２時間回転
式振１１１培養機で培養しジャー醗酵槽による本培養の
棟１ｖ４とした。乾燥酵母０．２％、０ａＯ０３ｏ、　
４　％、Ｎａ０Ｆ、　０．５　％よりなる培地を１５１
ずつ６０９ステンレス製醗酵槽４基に仕込み滅菌後拙菌
を３．０係の割合で加え！ＩＯ℃で通気攪拌培養を行な
った（通気量１５ｆ！、７分、回転数３００　ｒ、ｐ、
ｍ　）。

次いで、７２時間培養した後に培養液を採取し培養液よ
り菌体を戸別した。

得うれた菌体に６５％アセトン−水混液を８Ｌ加え攪拌
後−夜装置し濾過して抽出液を得た。

減圧下にアセトンを留去し得られた水溶液をｐＴ（ＺＯ
に調節した後酢酸エチル１０２を加えて攪拌し抽出した
。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、酢酸エチルを減圧
下に留去し橙黄色の油状物質を得た。得られた油状物質
は、シリカケ゛ルクロマトグラフイーに付し、ヘキサン
で溶出を行なって不純物を除去した後、ヘキサン／酢酸
エチル（１：１）の混合溶媒系で溶出を行ない１１６６
Ｆ！物質を含む両分を得た。得られた両分を減圧下に溶
媒を留去して１１６ｔＳＲ物質を含む油状物質１０５η
を得た。得られた油状物質をメタノールに溶解してシリ
カゲル（西独メルク社ＨＦ２５４　）の薄層クロマドグ
シフイー〔ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１：２）溶媒系
１吏用〕に付し。

Ｒｆｏ、　７４〜０．７２の１１６６ｇ物質に相当する
区分をかき取り、そして酢酸エチルで溶出した。溶出液
を減圧下に（トユ縮しそして得られた組物質をメタノー
ルに溶解した後、セファデックスＬＨ−２００カラムク
ロマトグラフィーに付してメタノールで溶出した。欠い
で１１６６ｗ物はを含む区分を集め、減圧下に濃縮して
１１６６１ｕ物質の粗粉末２３■を得た。イ：Ｉられた
粗粉末を二１°ＩＹ酸エチルに溶解した後、ｎ−ヘキサ
ンをゐ加して１１６６］！！物質の無色不定形結晶１１
　ｍｙをイ１ｔた。

得られたものの融点は９５〜９６．５℃であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による１１６６に物質の紫外吸収スペク
トルを示す図でちり、第２図は同じく赤外吸収スはクト
ルを示す図であり、第６図は同じくプロトンＮＭＲを示
す図でありそして第４図は同じ＜　１５ａ−ＮＭｕを示
す図である。 特許出願人　日清製粉株式会社 同　束菱薬品工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）構造式 で表わされる１１６６Ｆｌｉ物質。 ２）ストレプトミセス属に属する１１６６ｇ物質生産菌
   を培養し、その培養物から１１６６１物質を採取するこ
   とを特徴とする。１１６６ｚ物質の製造法。 ３）１１６６に物質生産菌がストレプトミセス・バイグ
   ロスコピカスＤ−１１６６株（微工研菌寄第４７７１号
   ）である特許請求の範囲第２項に記載の方法。