JPH0378391B2

JPH0378391B2 -

Info

Publication number: JPH0378391B2
Application number: JP20749483A
Authority: JP
Inventors: Nozomi Ootake; Haruo Seto; Tomoyoshi Segawa; Tetsuo Sasaki; Masanori Sugita
Original assignee: Tobishi Pharmaceutical Co Ltd; Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Tobishi Pharmaceutical Co Ltd; Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1983-11-07
Filing date: 1983-11-07
Publication date: 1991-12-13
Also published as: JPS60100574A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な抗生物質たる1166D物質および
その製法に関する。本発明者らは放線菌の産生する抗生物質の検索
を行う過程で、放線菌Ｄ−1166の番号を付された
菌株が好気的液体培養によりその培養液中にリン
ゴ腐乱病病原菌に対して抗菌活性を有する抗生物
質が産生されることを見出した。本発明者らは、
この抗生物質を単離、精製することに成功しそし
てそれを詳細に検討した結果、リンゴ腐乱病病原
菌Valsa ceratospermaに対して優れた抗菌作用
を有する新規物質であることを発見し、これを
1166D物質と命名した。本発明の対象たる1166D物質は次の物理化学的
性質を有する。 (1) 構造 (2) 分子式 C₃₈H₅₉O₁₀N (3) 分子量 679.86 (4)〔α〕²⁵ _D ＋43.4゜（ｃ＝0.1、メタノール中） (5) 融点 138〜139℃ (6) 元分析（C₃₈H₅₉O₁₀Nとして）計算値実測値Ｃ　：67.13％ 66.80％Ｃ　： 8.75％ 8.71％Ｏ　：23.53％ 22.98％Ｎ　： 2.06％ 2.01％ (7) 紫外線吸収スペクトル（メタノール中）（第
１図参照） λmax246nm（ε＝13800） λmax276nm（ε5700） (8) 赤外吸収スペクトル（臭化カリウム板）（第
２図参照） 3400，1720，1675，1650，1615，1250，1105
（cm^-1）

【表】

【表】ｔ：−CH〓、ｓ：−C−
｜
(11) 溶解性メタノール、エタノール、アセトン、ｎ−ブタ
ノール、ピリジン、酢酸エチルおよびクロロホル
ムに可溶、ｎ−ヘキサンおよび水に不溶。 (12) 外観無色結晶丈 (13) R_f 値 0.32 〔シリカゲルプレートとしてのメルクNo.5721を
用いた薄層クロマトグラフイーによる測定、ｎ−
ヘキサン／酢酸エチル（１：２）使用〕また、第２の本発明の要旨とするところは、ス
トレプトミセス属に属する1166D物質生菌菌を培
養し、その培養物から1166D物質を採取すること
を特徴とする、1166D物質の製造法にある。第２の本発明の方法で用いられる1166D物質生
産菌の一例としては、埼玉県大宮市の土壌から分
離された放線菌であつてストレプトミセス・ハイ
グロスコピカスＤ−1166株があり、これは昭和54
年１月12日に工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託された（微工研菌寄第4771号）。この放線菌株であるストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスＤ−1166株の菌学的性質について以
下に記載する。 (A) 形態ストレプトミセス・ハイグロスコピカスＤ−
1166株の栄養菌糸は分岐しながら長く伸長し、
桿菌状・球菌状に分断せず、隔壁も形成しな
い。空中菌糸は栄養菌糸より培地表面に伸長
し、巾0.4〜0.5μmで単軸分枝し、分枝上に短い
胞子柄を密生し、その先端に密だ小さなららせ
ん状（１〜８回転、直径２〜2.5μm）の胞子鎖
を着生する。胞子鎖は10〜40個の胞子からな
り、表面は著しい「しわ状」（rusose）で、幅
0.6〜0.8μmの鞘に包まれ（輪郭は「こぶ状」）、
個々の胞子形が不明瞭である。また、粘質物に
包まれたらせん胞子鎖、仁井田の球状体（スト
レプトミセス属、ストレプトベルチシリウム属
で時々みられる）などが観察されるが、その他
の特殊形態は観察されなかつた。 (B) 各種培地における生育状況観察法はISPの方法便覧にしたがい、集落表
面の菌叢色はH.D.トレスナーおよびE.J.バツカ
ス両氏（1963）の色系列で示し、集落の裏面色
と培地への拡散性色素は分類色名（色の標準：
日本色彩研究所）に翻訳して示す。なお詳細な
色は（）内にカラー・ハーモニイ・マニユア
ル（４版）の色コードで示した。結果は要約し
て表１に示す。本菌株の菌叢色は最初白色系列であるが、胞
子の成熟度に伴ない赤色系列（ピンク灰〜明る
い茶灰）を経て灰色系列（明るい茶灰〜茶灰、
赤味灰〜明るい紫味灰、紫味灰〜暗い紫味灰）
になる。培地によつて、最終的には黒色湿潤斑
を形成する。集落の裏面色はうす黄から明るい
黄またはうす黄茶から明るい茶で、いわゆる不
鮮明色を示し、PHを変えても変色しない。培地
へ拡散性色素として、メラニン様色素は生成せ
ず、その他の色素はチロシン寒天培地で３日目
にうすピンク、後にうす茶になり、PH指示薬性
（酸性で茶白、塩基性でうす赤）の色素を生成
する。また、有機培地で裏面色と同様なうす黄
茶の色素をわずかに生成するが、合成培地では
生成しない。 (C) 生理的性状本菌株の生理的緒性状を表２に示す。生育最
適温度は20〜30℃にあり、いわゆる中温性放線
菌である。メラニン様色素は表１と表２に示し
た諸培地およびゼラチン、脱脂牛乳などの有機
培地でもほとんど生成されない。しかしチロシ
ン寒天培地で紅色系の色素（多分、ドーパーク
ロム）を生成することから、チロシナーゼ活性
はあると考えられる。炭素源の利用能を表３に示す。本菌株はＤ−
フラクトースを利用しないが、他の８種の糖全
部を生育のために利用し得る。

【表】表２生理的性質１生育温度範囲 10〜40℃ 生育最適温度 20〜30℃ ２ゼラチンの液化陽性３脱脂牛乳の凝固陰性脱脂牛乳のペプトン化強く陽性４スターチの加水分解強く陽性５メラニン様色素の生成チロシン寒天培地陰性ペプトン・イースト・鉄寒天培地陰性トリプトン・イースト液体培地陰性６硝酸塩の還元表３炭素源の利用能Ｌ−アラビノース（＋）Ｌ−イノシトール（）Ｄ−キシロース（＋）Ｌ−ラムノース（）Ｄ−グルコース（）ラフイノース（＋）Ｄ−フラクトース（−）Ｄ−マンニツト（）シユクロス（＋）（）よく利用する（＋）利用する（−）利用せず (D) 記載の要約ストレプトミセス・ハイグロスコピカスＤ−
1166は次のような形態的特性状をもつ。１）栄
養菌糸には分断および隔壁形成がみられない。
２）胞子鎖はらせん状で、10個以上の胞子によ
り形成されている。３）胞子襄を形成しない。
以上の性状から、本菌株はストレプトミセス
（Streptomyces）属に包含される。本菌株の胞
子鎖が密な小らせん状であり、成熟菌叢色が灰
色系列で湿潤黒色斑を形成し、メラニン様色素
を生成しないことから、本菌株はハイグロスコ
ピカス群（hygroscopicus−group）に属する。
A.ダイエツの最近の研究〔A.Dietz in T.
Araied.「Actinomyeetes，the boundary
microorganisms」第183〜191頁（1976）参照〕
によれば、湿潤黒色斑を形成するハイグロスピ
カス群は胞子の形態により二群に分けられる。
彼は胞子表面が「しわ状」（rugoss）の群と胞
子の形が楕円形（帽子形または三日月形）の群
とに分け、前者をストレプトミセス・ハイグロ
スコピカス（Streptomyces hygroscopicus）、
後者をストレプトミセス・ネオハイグロスコピ
カス（S.neohygroscopicus）（新種名）とし
た。そして、ハイグロスコピカス群の既知の種
と変種をこの２種に再編成した。この研究にし
たがえば、本菌株は胞子鎖が「しわ状」の鞘に
包まれ、個々の胞子形が明瞭に区別できない点
で、前者に包含される。次に本菌種Ｄ−1166の特性を基準にして「バ
ージー氏細菌同定便覧８版（1974）」とE.B.シ
ヤーリングおよびD.ゴツトリーブ両氏のISP記
載〔Int.J.Syet.Bacteriol 18，69（1968）：18，
279（1969）；19，391（1969）；22，265（1972）〕
およびその他の文献に記載されたストレプトミ
セス属の種を検索し、本菌株はストレプトミセ
ス（以後Ｓと略記）ハイグロスコピカス（S.
hygrosccpicus）種に近縁であることがわかつ
た。そこで本菌Ｄ−1166株とストレプトミセス・
ハイグロスコピカスNRRL2387の炭素源の利
用能を比較すると次に示すような結果となる。

【表】この結果から該菌種はストレプトミセス・ハ
イグロスコピカスNRRL2387とは糖類の資化
性に若干の差異があることは明らかであり、ま
た前者に1166D物質生産能がみられ後者にはみ
られないことであり、以上の結果から本菌種は
ストレプトミセス・ハイグロスコピカスに属す
る新菌種と同定しストレプトミセス・ハイグロ
スコピカスＤ−1166の名称を与えた。第２の本発明の方法を実施するに当つて、
1166D物質の生産菌の培養は20〜37℃好ましく
は25〜30℃の温度範囲で通常の放線菌の培養に
適切な水溶性栄養源を含む培地中にて好気条件
で実施される。本培養の目的に供される培地としては放線菌
が利用できる栄養源を含めばよく、培地組成と
してグルコース・フラクトース、シユークロー
スなどの糖類、殿粉、およびグリセリンなどの
炭素源およびカゼイン、ポリペプトン、大豆ミ
ール、綿実ミール、肉エキス、乾燥酵母、コー
ンステイープリカーなどの有機態窒素もしくは
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無
機態窒素などの窒素源が単独でないしは併合し
て用いる事ができる。さらに、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、
硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、各種ビ
タミンなどを生育促進および調節の目的で利用
することも可能である。必要に応じて、シリコーン、植物油あるいは
合成消泡剤を培地に添加し発泡を防ぐことも可
能である。Ｄ−1166株の保存は凍結乾燥、培養液の凍結
保存、寒天斜面培地などに継代するなど種々の
方法が可能である。 1166D物質を生産する場合、寒天斜面培地よ
り一白金耳胞子を掻き取り振盪フラスコに移殖
し２〜５日、27〜30℃で培養し種菌とする。本
培養のスケールに応じて種培養を繰り返し種菌
を大量に得ることもできる。本培養は際してはこのようにして得られた種
菌を一定量醗酵槽に接種し20〜35℃好ましくは
27〜30℃で２〜５日間通気撹拌する。得られた
培養液を遠心分離または過などの手段により
菌体を集め水とアセトン、メタノールなどとの
混合溶媒にて菌体より目的物質を抽出する。通
常、溶媒と水の混合比が50％〜70％の混液を用
いるが混合比はこれに限らない。抽出操作は必
要に応じ繰り返し行える。このようにして
1166D物質を含む抽出液を得た後、減圧下混合
溶媒を除去する。得られた1166D物質を含む水溶液を硫酸また
は塩酸にてPHを調節して当該物質を抽出しやす
い状態にする。必要があれば、工業用食塩など
を加え抽出効率を高めたりエマルジヨン防止な
どの手段を講じることもできる。続いて水と混合しない酢酸エチル、クロロホ
ルム、ブタノールなどの溶剤を用いて1166D物
質を有機溶媒層に転溶させる。抽出液を飽和食
塩水などの溶液にて洗浄すれば水溶性の不純物
などの除去に効果がある。かくして得られた溶
媒層に芒硝を加え脱水した後溶媒を減圧下に留
去すれば1166D物質を含む粗抽出物を得ること
ができる。更に、1166D物質を精製するためには通常の
脂溶性低分子物質の精製手段を適用できる。す
なわち通常用いられる精製法として種々の吸着
クロマトグラフイーが有効であり、吸着剤とし
ては一般に使用される担体たとえばシリカゲ
ル、アルミナ、巨孔質（マクロポーラス）非イ
オン系吸着樹脂等が使用できるが、本物質
1166D物質の精製にはシリカゲルが最も有効に
利用される。溶出溶媒としてはヘキサン／酢酸
エチル（１：１）の混合溶媒系が適している。
薄層クロマトグラフイー上で1166D物質を含有
するフラクシヨンを集め、そして減圧濃縮して
溶媒を留去すると1166D物質を含む油状物が得
られる。このようにして得られた油状物はシリ
カゲルを用いる調製的薄層クロマトグラフイー
に付される。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１：
２）の混合溶媒系で展開後、R_f＝0.32附近の
1166D物質に相当する区分をかき取りそして酢
酸エチルで溶出する。溶出液を減圧濃縮して得
られる粗製の1166D物質はLH−20のカラムク
ロマトグラフイーに付される。溶出はメタノー
ルで行ない、1166D物質を含む区分を集めて減
圧濃縮すると1166D物質の粗粉末が得られる。
得られた粗粉末を少量の酢酸エチルに溶解しそ
してｎ−ヘキサンを加えると1166D物質が無色
不定形結晶として単独採取される。このように
して得られた1166D物質は前記したような物理
化学的性状を有する。本発明による1166D物質の生物活性について
述べるに、1166D物質はリンゴ腐乱病病原菌
Valsa ceratospermaに対して抗菌活性を示
す。かかる抗菌活性はペニシリンＧおよびスト
レプトマイシンを各0.5％含むPSA培地（培地
１にじやがいも200ｇ分の熱水抽出物、サツ
カロース20ｇ、天10ｇを含有、PH5.8に調整）
を用いてペーパーデイスク法で調べた。結果は
次のとおりである。 1166D物質濃度生育阻止濃度 2μｇ／ml 20mm 12.5 19 6.2 18 3.1 17 1.56 16 0.78 14 次に本発明を更に説明するために実施例を掲げ
る。実施例可溶性殿粉1.0％、ポリペプトン1.0％、廃糖密
1.0％、肉エキス1.0％よりなる培地100mlを500ml
の坂口フラスコに分注し、滅菌後ストレプトミセ
ス・ハイグロスコピカスＤ−1166株（微工研菌寄
第4771号）を１白金耳量接種し30℃で48時間振盪
培養した。次に同じ培地を500mlのエーレシマイ
ヤーフラスコに100mlずつ分注し滅菌後上記の種
菌を３％の割合で加え30℃で72時間回転式振盪培
養機で培養しジヤー醗酵槽による本培の種菌とし
た。乾燥酵母0.2％、CaCO₃0.4％、NaCl0.5％よ
りなる培地を15ずつ30ステンレス製醗酵槽４
基に仕込み滅菌後種菌を3.0％の割合で加え30℃
で通気撹拌培養を行なつた（通気量15／分、回
転数300r.p.m）。次いで、72時間培養した後に培養液を採取し培
養液より菌体を別した。得られた菌体に65％アセトン−水混液を８加
え、撹拌後一夜放置し過して抽出液を得た。減
圧下にアセトンを留去し得られた水溶液をPH7.0
に調節した後酢酸エチル10を加えて撹拌し抽出
した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、酢酸エ
チルを減圧下に留去し橙黄色の油状物質を得た。得られた油状物質は、シリカゲルカラムクロマ
トグラフイーに付し、ヘキサンで溶出を行ない不
純物を除去した後、ヘキサン／酢酸エチル（１：
１）よりなる混合溶媒系で溶出を行ない、1166D
物質を含む画分を得た。得られた画分は減圧下に
溶媒を留去して1166D物質を含む油状物質211mg
を得た。得られた油状物質はメタノールに溶解し
シリカゲル（西独メルク社、HF254）の薄層ク
ロマトグラフイー〔ｎ−ヘキサン／酢酸エチル溶
媒系（１：２）〕に付し、R_f＝0.32〜0.30の1166D
物質に相当する区分をかき取り、酢酸エチルで溶
出した。溶出液は減圧下に濃縮し、得られた粗物
質はメタノールに溶解した後、セフアデツクス
LH−20のカラムクロマトグラフイーに付してメ
タノールで溶出した。次いで1166D物質を含む区
分を集め、減圧濃縮して、1166D物質の粗粉末45
mgを得た。得られた粗粉末を酢酸エチルに溶解し
た後、ｎ−ヘキサンを添加して1166D物質の無色
不定形結晶23mgを晶出させた。得られたものの融
点は138〜139℃であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による1166D物質の紫外吸収ス
ペクトルを示す図であり、第２図は同じく赤外吸
収スペクトルを示す図であり、第３図は同じくプ
ロトンNMRを示す図であり、そして第４図は同
じく ¹³C−NMRを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１構造式で表わされる1166D物質。２ストレプトミセス属に属する1166D物質生産
菌を培養し、その培養物から1166D物質を採取す
ることを特徴とする、1166D物質の製造法。３ 1166D物質生産菌がストレプトミセス・ハイ
グロスコピカスＤ−1166株（微工研菌寄第4771
号）である特許請求の範囲第２項に記載の方法。