SU1308200A3

SU1308200A3 - Способ получени биологически активного комплекса @ 6049 и штамм @ @ @ . @ . 6049-продуцент биологически активного комплекса @ 6049

Info

Publication number: SU1308200A3
Application number: SU833598051A
Authority: SU
Inventors: Киюото Сумио; Нисикава Мотоаки; Ивами Морита; Терано Хироси; Кохсака Масаноби; Иманака Хироси
Original assignee: Фудзисава Фармасьютикал Ко.,Лтд (Фирма)
Priority date: 1982-05-24
Filing date: 1983-05-23
Publication date: 1987-04-30
Also published as: DE3369158D1; AU1488683A; JPH0216756B2; JPS58212787A; JPH0415236B2; KR900004066B1; EP0095154B1; ES8501440A1; EP0095154A1; DK232483D0; DK232483A; US4578271A; ES522637A0; ATE24933T1; KR840004783A; AU565322B2; JPH02257886A; CA1209935A

Description

(21)3598051/28-14

(22)23.05.83

(31)8215123

(32)24.05.82

(33)JP

(46) 30.04.87. Бюл. № 16

(71)Фудзисава Фармасьютикал Ко., Лтд

(JP)

(72)Сумио Киюото, Мотоаки Нисикава, Морита Ивами, Хироси Терано, Масаноби Кохсака и Хироси Иманака (JP) (53) 615-779.9(088.8)

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА WS 6049 И ШТАММ ACTINOMADURA PULVERACENS SP. NOV 6049ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА WS 6049

(57) Изобретение вы вл ет штамм-продуцент , который позвол ет получить вещества, обладающие противомикробными и противоопухолевыми свойствами . Штамм (Ш) Actinomadura pulveracens Sp. nov 6049 выделен из образца почвы,собранной в г. Вака ма, Япони .Ш депонирован в американской коллекции типовых культур под номером АТСС 39100 и характеризуетс соответствующими физиолого-биохимическими признаками. Дл получени биологически активного комплекса WS 6049 Ш Actinomadura pulveracens Sp. nov 6049 культивируют в аэробных услови х в водной питательной среде, содержащей 4% сахарозы, 0,5% сухих дрожжей; 0,1% KjHPO ; 0,1 гептагидрата сульфата магни , 0,1% хлористого натри -, О ,2% сульфата аммони ; 0,2% карбоната кальци -, 0,0001% гептагидрата сульфата железа; 0,0001% тетрагидрата хлористого марганца; 0,0001% гептагидрата сульфата цинка и 0,00005% йодистого натри , при в течение 4 сут при перемешивании. Мицелий экстрагируют этилацетатом, экстракты промывают 1%-ным бикарбонатом натри и 10%-ным хлористым натрием. Экстракты концентрируют в вакууме, дегидратированный концентрат хроматографируют, колонку промывают хлороформом и элюи-- руют смесью хлороформа и метанола 40:1. Фракции вакуумируют, полученный порошок раствор ют в хлороформе и хроматографируют, промывают смесью хлороформ:ацетон (8:1), вещество WS 6049А элюируют смесью хлороформ: ацетон (4:1), вещество WS 6049 В злюируют смесью хлороформ:ацетон (2:1). Изобретение относитс к микробиологии и касаетс получени биологически активных веществ, обладающих антимикробной и противоопухолевой ак тивностью. Целью изобретени вл етс вы вление штамма-продуцента, способного образовывать биологически активное вещество, и разработка способа его получени , что позволит расширить ар сенал противомикробных и противоопухолевых лекарственных средств. Штамм Actinoraadura pulveracens sp nov. 6049 выделен из образца почвы, собранной в г. Вака ма, Япони . Штамм депонирован в Американской Коллекции типовых культур под номером АТСС 39100 и характеризуетс сле дующими признаками. Культурально-морфологические признаки . Агар с овс ной мукой - воздушный мицелий зеленовато-белый, цветова характеристика дана на основе Color Standart (Нихон Сикисаи Ко., Лтд), субстратный мицелий бесцветный, раст Еоримьш пигмент отсутствует. Агар с дрожжевым и солодовым зкстрактами - воздушный мицелий бледноголубой , субстратньй мицелий бледножелтый , растворимый пигмент отсутствует . Агар с минераль 1ыми сол ми и крах малом - воздушный мицелий белый, суб сгратный мицелий светло-красньш, рас вэримый пигмент отсутствует. Глюкозо-аспарагиновый агар - воздушный мицелий отсутствует, субстрат ный мицелий розовый, растворимый пигмент отсутствует. Глицерино-аспарагиновый агар - в душный мицелий следы, субстратный ми бледно-розовый, растворимый пигмент отсутствует. Сахарозо-нитратный агар - воздушный мицелий отсутствует, субстратный М1 целий бледно-розовый, растворимый пкгмент отсутствует. Питательньм агар - воздушный мицелий отсутствует, субстратный мице лий светло-красный, растворимый пиг мент отсутствует. Картофельно-декстрозный агар воздушный мицелий отсутствует, субстратный мицелий бледно-розовый, растворимый пигмент отсутствует. бледно-розовый, растворимый пигмент отсутствует. Физиолого-биохимические признаки. Температурный интервал роста 2041°С , оптимальна температура 30-35°С. Интервал рН дл роста 6-10, оптимальна величина рН 7-8. Нитраты в нитриты не восстанавливает . Крахмал гидролизует. Слабо коагулирует молоко, не пептонизирует. Желатин разжижает. Меланин не образует . Сероводород не образует. Проба на уреазу отрицательна . Из источников углерода хорошо усваивает D-ксилозу, рамнозу, П-глюкозу , сахарозу; слабо усваивает глицерин , мальтозу, D-инозит, D-галактозу, не усваивает-цитрат натри , лактозу, D-фруктозу, сукцинат натри , инулин, раффинозу, о -арабинозу, маннит, Dманнозу , целлюлозу, D-трегалозу, салицин , хитин, ацетат натри . Из источников азота усваивает дрожжевой экстракт, пептон, клейковинную муку, муку из сем н хлопка, осевую муку, кукурузную выт жку, сушеные дрожжи, пшеничные зародыши, аммониевые соли, мочевину, аминокислоты и другие. Способ с использованием предлагаемого штамма иллюстрируетс следующими примерами. Пример 1. Водную среду (160 мл), содержащую, %: крахмал 2, i глюкозу 0,5, мука сем н хлопка t, высушенные дрожжи 1., кукурузна выт жка 0,5 и карбонат кальци (рН 7,0) 0,2, наливают в каждую из трех колб Эрленмейера емкостью 500 мл и стерилизуют при в течение 30 мин. Петлю скошенной культуры микроорганизма Actinomadura pulveracens sp. nov. № 6049 (АТСС 39100) инкулируют в каждую из сред и культивируют при 30°С на вращающемс встр хивателе с размахом в 3 дюйма (7 ,62 см) при 220 об/мин в течение 4 сут. Полученную в результате культуру инокулируют в водную среду (20 л), содержащую, %: сахароза 0,2, сухие дрожжи 0,5, KjHPO Ь,1 , гептагидрат сульфата магни 0,1, хлористый натрий 0,1, сульфата аммони 0,2, карбонат кальци 0,2, гептагидрат сульфата железа 0,0001, тетрагидрат хлористого марганца 0,0001, гептагидрат сульфата цинка 0,0001 и йодистый натрий 0,00005, в 30-литровой емкости дл ферментации , которую предварительно стерилизуют при 120С в течение 30 мин,и культивируют при 30°С в течение 4 с при аэрировании с использованием 20 л в минуту и при перемешивании при 300 об/мин. Полученную культуральную жидкост фильтруют с помощью диатомовой земли (1 кг). К полученному мицелию добавл ют 10 л этилацетата, перемешивают в течение 10 мин. Экстрагиро вание осуществл ют два раза и экстракты объедин ют. Экстракты промывают 10 л 1%-ного бикарбоната натри и 10 л 10%-ного хлористого натри . Затем экстракты концентрируют в вакууме до объема в 1 л. После дегидратации безводным сульфатом натри этилацетатный раствор далее концент рируют в вакууме и полученные масл нистые вещества нанос т на хроматографическую колонну с использованием силикагел (70 мл). Колонку пр мывают 200 мл хлороформа и элюируют смесью хлороформа и метанола (40:1) Фракции, содержащие активные вещест ва (500 мл), концентрируют в вакууме , получа неочищенный порошок ( 140 мг). Порошок раствор ют в 2 мл хлороформа и подвергают колоночной хроматографии на силикагеле (20 мл). Колонку промывают смесью хлороформ: ацетон (8:1) и вещество WS 6049-А элюируют смесью хлороформ:ацетон (4:1). Вещество WS 6049-В элюируют смесью хлороформ:ацетон (2:1). Каждую из фракций, содержащих WS 6049-А и WS 6049-В, концентрирую

в вакууме, получа неочищенный порошок вещества WS 6049-А (17 мг) и WS 6049-В (15 мг), соответственно. Их отдельно подвергают жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности (НР1 С). Хроматографию контролируют с помощью УФ-детектора . Используют стальную колонку (внутренний диаметр - 7,9 мм, длина 300 мм) , наполненна LL порасилом со скоростью потока 3 мл/мин. Используема подвижна фаза представл ет собой смесь гексана, хлороформа и метанола (25:10:2). HPL С при упом нутьгх вьпие услови х дает фракцию А (врем удерживани 18 мин) и фракцию В (врем удерживани 26 мин). Получают 12 мг бесцветного порошка вещества WS 6049-А из фракции А и 8 мг бесСтационарна фаза:

Rf 0,59 (силикагель/хлороформ: метанол силикагелева пластина: 10:1 (об/об));

Rf 0,33 (хлороформ:ацетон 1:1 об/об).

Молекул рный вес: FD. Масс: m/z 1333 (), F ABQMe:m/z 1311 ().

Хроматографи гельпроникновени : 1100-1200.

13С Спектр дерно-магнитноrd резонанса (CDClj) (млн.дол.): 13,9; 14.6; 16,7; 17,6; 19,9; 22,8; 29,1; 34,0; 35,2; 39,6; 42,3; 52,7; 55,8; 56,1; 56,2; 56,-2; 60,3; 61,7; 64,7; 66,7; 68,4; 69,0; 69,3; 69,8; 70,5; 72,0; 75,9; 76,1; 77,2; 77,3; 83,2; 86,3; 88,5; 90,7; 97,3; 98,6; ; 98,9; 99,6; 99,7; 103,9; 107,8; 112,7; цветного порошка вещества WS 6049-В из фракции В. Физические и химические свойства вещества WS 6049. Вещество WS 6049 состоит из вещества WS 6049-А и WS 6049-В, которые имеют следующие характеристики. WS 6049-А - бесцветный порошок. Дает положительную реакцию Драгендорфа, Эрлиха и с сульфатом цери и отрицательную реакцию с нингидрином. Раствор етс в метаноле, ацетоне, хлороформе, слабо раствор етс в диэтиловом эфире, не раствор етс в гексане , воде.Т.пл. (разложение). Удельное вращение: (o)jj -208(С 1,0, сне). Спектр ультрафиолетового поглощени : Л;Г 252НМ(Е,560); 280 им (E:|;/ 370); 320 им (Е 220). СНзОН+НСе 252,280,320 нм. ,.CH,OH+NaOH . „„.. -,,п / мокс 280,310 (плечо) нм. Спектр инфракрасного поглощени : мй 3450, 3350, 3250, 2960, 920, 1725, 1675, 1610, 1595, 1520, 1465, 1450, 1405, 1370, 1350, 1310, 1250, 1180, 1155, 1115 1075, 1020, 985, 955, 905, 850 см- С 52,03%, Н 5,71%, N 4,15%, S , 86%. 130 123,2; 125,0; 130,0; 130,0; 131,1; 136,8; 144,2; 146,6; 154,0; 154,6; 160,9; 166,6; 192,4. 1Н спектр дерномагнитного резонан са (CDClj):(млн.дол ): 8,57 (1Н, с), 7,48 (1Н, с), 6,6 (Тн, .), 6,2 (( Н, д. , : 1,6 Гц), 6,18 (1Н, широкий с.), 5,93 (1Н, д., : 9,6 Гц) 5,83 (1Н, д.д.), 3 9,6, 1,6 Гц), 5,7 (1Н, д. , Гц), 5,6 (1Н, м.) 5,48 (1Н, д., J 2,3 Гц), 5,43 (1Н, широкий синглет), 4,97 (1Н, дублет), 4,7 (2Н, мультиплет), 4,56 (1Н, дублет , J 2,3 Гц), 4,23 (1Н, синглет) 4,2-3,6 (10-14 Н), 3,97 (ЗН, синглет 3,88 (ЗН, синглет), 3,79 (ЗН), синглет ), 3,5 (2Н, мультиплет), 3,43 (ЗН, синглет), 2,77 (1Н, синглет), 2,7 (2Н, мультиплет),2,52 (ЗН, синглет ), 2,5 (Ш), синглет), 2,7 (2Н, мультиплет), 2,52 (ЗН, синглет), 2,5 (1Н, мультиплет), 2,4-2,25 (ЗН, муль типлет), 2,17 (1Н, синглет), 2,12 (ЗН, синглет), 2,07 (1Н, мультиплет) 1,77 (2Н, синглет), 1,5 (2Н, мультиплет ), Т,41 (ЗН, дублет, D 6 Гц), 1,35 (ЗН, дублет, Л 6 Гц), 1,32 (ЗН, дублет, J 6 Гц), 1,2 (4Н,муль типпет). WS 6049-В. Бесцветный порошок. По ложительна реакци Драгёндорфа, реакци Эрлихта и реакци сульфата цери . Отрицательна : реакци ингидрина . Растворимо в метаноле, ацетоне, хлороформе, плохо растворимо в диэти ловом эфире. Не растворимо в гексане Т.пл.:145С (разложение). Удельное вращение: (d) -201 ( с 1,0, CHCKj). Спектр ультрафиолетового поглощени : 253 нм (EV 620). 280 нм (.11° 450) 320 нм (Е 250) нее 253, 280, 320 нм; max .СНзОН. 250, 282, 310 (плечо) нм. Спектр инфракрасного поглощени : 3450, 3350, 3250, 2990, 2920, 1725, 1675, 1610, 1595, 1520, 1465, 1450, 1405, 1370, 1350, 1310, 1250, 1180, 1155, 1115, 1075, 1020, 985, 955, 905, 880, 850 см . 6 Тонко-слойиа хроматографи : Стационарна фаза: про вл ющий астворитель Rf величина хлороформ: етанол (10:1) 0,53 (об/об), Силикагельный лист хлороформ: цетон (1:1) 0,18 (об/об). Молекул рый вес. Хроматографи гель проникновени : 100-1200, 13 С Спектр дерно-магнитного реонанса (); (млн.дол .): 13,8, 16,7, 17,6, 19,8, 22,7, 29,1, 33,9, 4,1, 35,2, 39,5, 52,8, 55,8, 56,1, 56,3, 61,0 61,5, 64,6, 66,7, 68,4, 69,0, 69,3, 69,8, 70,4, 71,9, 75,9, 76,2, 76,7, 77,2, 77,3, 77,6, 83,2, 86,6, 88,3, 90,7, 97,3, 9.8,6, 99,0, 99,6, 99,7, 1-03,9, 107,8, 112,7, 123,2, 124,9, 129,8, 131,0, 136,8, 144,2, 146,3, 154,0, 154,6, 160,9, 166,6, 192,4. 1Н Спектр дерно-магнитного резонанса (CDClj): (Г (млн. дол .): 11,75, (1Н, синглет), 8,57 (1Н, синглет ), 7,48 (1Н, синглет), 6,6 (1Н, двойной дублет), 6,24 (1Н, дублет, 3 1,3 Гц), 6,18 (1Н, широкий синглет ), 5,93 (1Н, дублет, 3- 9,2 Гц), 5,83 (1Н, двойной дублет, 3 9 Гц и 1,3 Гц), 5,70 (1Н, широкий дублет), 5,5 (1Н, мультиплет), 5,47 (1Н, дублет , ,3 Гц), 5,42 (1Н, широкий синглет), 4,98 (ТН, дублет, 3 9 Гц), 4,70-4,6 (2Н, мультиплет), 4,56 (1Н, дублет, .3 2,3 Гц), 4,24 (1Н, синглет ), 4,15-3,4 (12-18Н), 3,97 (ЗН, синглет), 3,88 (ЗН, синглет), 3,79 (ЗН, синглет), 3,42 (ЗН, синглет), 2,52 (ЗН, синглет), 2,6-2,4 (2Н, мультиплет ), 2,4-2,2 (7-8 Н), 2,12 (ЗН, синглет), 2,2-2,0 (2Н, мультиплет), 1,5 (2Н, мультиплет), 1,4 (ЗН, дублет , D 6,Гц), 1,35 (ЗН, дублет, D 6 Гц) , 1,33 (ЗН, дублет, J 6 Гц), как показано на фиг. 4. Биологические свойства веществ WS 6049. Противоопухолева активность веществ WS 6049. Противоопухолева активность веществ WS 6049 определ лась в экспериментальной опухолевой системе на мышах . Лимфоцитарна лейкеми Р-388 имп- лантировалась интраперитонеально мышцам BDF 1 при размере инокулюма 1 10 клеток на мышь. Через 24 ч имплантации опухолевых клеток мышам интраперитонеально (внутрибрюшннно) ввод т постепенно увеличивающиес дозы антибиотиков . Обработка производитс на 1-4-й день.

Вещества WS 6049 суспендируют в физиологическом солевом растворе (0,9%). Контрольные животные получают интраперитонеальные дозы физиологического солевого раствора. Объем инъекции составл ет 0,2 мл во всех экспериментах.

Терапевтические ответные реакции измер лись по среднему времени выживани , а результаты выражались как Т/С% (врем вьгаивани обработанной группы, деленное на врем выживани контрольной группы и умноженное на 100). Токсичность измер лась как потер веса между дн ми О и 4 после инокул ции опухоли.

Вещества У5 6049-А и WS 6049-В активны против лейкемии Р-388. Дозы 0,025-12,0 мкг/кг привод т к значительному увеличению продолжительности жизни у мышей.

Противомикробна активность веществ WS 6049-А и WS 6049-В.

Противомикробную активность веществ WS 6049-А и WS 6049-В определ ют методом серийного разведени в бульоне дл бактерий и в среде Сабуро дл грибков и дрожжей. Минимальные ингибирующие концентрации (МТС) выражались в мкг/мл после инкубировани в течение ночи при 37°С дл бактерий , и 48-72 ч инкубировани при 28°С дл грибков и дрожжей. Противомикробные спектры веществ WS 6049-А и WS 6049-В показаны в таблице.