KR20050086873A - 매크로라이드계 화합물의 제조 방법 - Google Patents

매크로라이드계 화합물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 항종양 활성을 가지는 12원환 매크로라이드계 화합물 11107D의 생물학적 변환에 의한 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 출발원료인 화학식 1로 표시되는 12원환 매크로라이드계 화합물 11107B을, 화학식 2로 표시되는 11107D로 변환시키는 모르티에렐라 속, 스트렙토마이세스 속 또는 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 균주(예컨대 스트렙토마이세스 sp.AB-1704(FERM BP-8551)), 또는 그것의 배양된 균체 제조물을 산소 존재하에 출발원료과 배양하고, 배양물로부터 목적물질인 11107D을 수득한다.
(화학식 1)
(화학식 2)

Description

매크로라이드계 화합물의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING MACROLIDE COMPOUND}

본 발명은 항종양 활성을 갖는 12원환(員環) 매크로라이드계 화합물 11107D의 생물학적 변환에 의한 생산방법 및 그것에 이용되는 신규 균주에 관한 것이다.

12원환 매크로라이드계 화합물 11107D은, 우수한 항종양 활성을 가지는 12원환 매크로라이드계 화합물로, 11107B와 함께 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) Mer-11107 균주의 배양물로부터 발견된 것이다(국제특허 공개공보 2002/060890 참조). 11107D는 11107B의 16번 위치에 히드록시기가 위치한 것으로, 생산성은 11107B에 비하여 낮아 효율적인 제조 방법의 확립이 요구되고 있다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 생물학적 변환법을 통하여 출발원료 매크로라이드계 화합물 11107B로부터 매크로라이드계 화합물 11107D를 제조하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 매크로라이드계 화합물 11107B의 16번에 위치한 수소 원자를 수산기로 변환시킬 수 있는 미생물을 광범한 미생물군으로부터 검색하여, 사상균으로 분류되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 균주, 방선균으로 분류되는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 균주 및 방선균으로 분류되는 마이크로모노스포라세아(Micromonosporaceae) 과에 속하는 균주가 상기 변환능을 가지는 것을 발견하였으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기 (1) 내지 (3)에 관한 것이다.

(1) 생물학적 변환에 의하여 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B로부터 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D을 생산하는 것을 포함하는, 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D의 제조방법이며, 상기 제조방법은 아래 단계 (A) 및 (B)를 포함한다.

(화학식 1)

(화학식 2)

(A) 상기 생물학적 변환을 수행할 수 있는, 모르티에렐라 속, 스트렙토마이세스 속 또는 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 균주, 또는 그것의 배양된 균체의 제조물 존재 하에, 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B를 배양하는 단계.

(B) 단계(A)로부터 수득한 배양물로부터 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D을 수득하는 단계.

(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 모르티에렐라 속에 속하는 균주는 모르티에렐라 sp. F1529(FERM BP-8547) 균주 또는 모르티에렐라 sp. F-1530(FERM BP-8548) 균주인 제조 방법.

(3) 상기 (1)에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주는 스트렙토마이세스 sp. AB-1704(FERM BP-8551) 균주, 스트렙토마이세스 sp. A-1544(FERM BP-8446) 균주 또는 스트렙토마이세스 sp. A-1545(FERM BP-8447) 균주인, 제조 방법.

(4) 상기 (1)에 있어서, 상기 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 균주는 마이크로모노스포라세아 sp. AB-1896(FERM BP-8550) 균주인, 제조 방법.

(5) 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B를 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D로 변환시키는 능력을 갖는 스트렙토마이세스 sp. AB-1704(FERM BP-8551) 균주.

(6) 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B를 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D로 변환시키는 능력을 갖는 마이크로모노스포라세아 sp. F-1529(FERM BP-8547) 균주 또는 마이크로모노스포라세아 sp. F-1830(FERM BP-8548) 균주.

(7) 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B를 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D로 변환시키는 능력을 갖는 AB-1896(FERM BP-8550) 균주.

발명의 상세한 설명

본 발명의 생물학적 변환법에서, 모르티에렐라 속, 스트렙토마이세스 속 또는 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 미생물은, 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B로부터 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물11107D를 변환시킬 수 있다면 속 및 균주의 종류에 상관없이 사용할 수 있으며, 바람직한 미생물로는 모두 토양에서 분리된 모르티에렐라 속에 속하는 모르티에렐라 sp. F-1529 균주와 F-1530 균주, 스트렙토마이세스속에 속하는 스트렙토마이세스 sp. AB-1704 균주와, A-1544 균주와 A-1545 균주 그리고, 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 AB-1896 균주가 있다.

Mer-11107 균주는, 2000년 12월 19일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고 305-8566에 소재한 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM P-18144로 기탁되었고, 이는 2001년 11월 27일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(IPOD)에 국제기탁 FERM BP-7812로 이관되었다.

모르티에렐라 sp. F-1529 균주는, 2003년 11월 12일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM BP-8547로 국제기탁되었다. 또한 모르티에렐라 sp. F-1530 균주는, 이와 동일하게 2003년 11월 12일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM BP-8548로 국제기탁되었다.

스트렙토마이세스 sp. AB-1704 균주는, 2002년 9월 5일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM P-18999로 기탁되었으며, 2003년 11월 12일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 국제기탁 FERM BP-8551로 이관되었다. 또한, 이와 동일하게 A-1544 균주와 A-1545 균주는, 2002년 7월 23일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 각각 FERM P-18943 및 FERM P-18944로 기탁되었고, 2003년 7월 30일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 각각 국제기탁 FERM BP-8446 및 FERM BP-8447로 이관되었다.

마이크로모노스포라세아 과에 속하는 AB-1896 균주는, 2003년 11월 12일자로 일본 이바라키겐 쯔쿠바시 1쵸메 1반 1고 305-8566에 소재한 중앙 제6재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM BP-8550으로 국제기탁되었다.

전술한 균주들의 균학적 성상은 아래와 같다.

[F-1529 균주의 균학적 성상]

(1) 형태

오트밀 한천배지(Oatmeal Agar: 이하 OA로 기재되는 경우가 있음), 맥아 한천배지(Malt Agar: 2% 맥아 추출물 + 1.5% 아가: 이하 MEA로 기재되는 경우가 있음) 및 포테이토 덱스트로즈 한천배지(Potato Dextrose Agar: 이하 PDA로 기재되는 경우가 있음) 플레이트에서, 콜로니는 양모형(floccose)이며, 균사 색상은 백색으로 화이트(1A-1)의 색조를 나타낸다. 25℃에서의 일 주일 배양시, 생육은 OA 플레이트에서 75mm, MEA 플레이트에서 75-80mm, PDA 플레이트에서 직경 75-80mm에 이른다. 콜로니는 꽃갓형(zonate)이다. 이면 착색 및 가용성 색소의 생산은 관찰되지 않는다. 색조 판별은 [Methuen Handbook of Colour(Kornerup & Wanscher, 1978)]를 참조하였다.

광학 현미경 관찰 결과, 영양 균사는 무색이고, 표면은 평활하고, 격벽이 없으며, 균사 폭은 4 - 5㎛이다. 균사의 일부에서는 구형으로 두꺼운 세포벽 포자와 같은 26.5-33㎛ 정도의 부풀어 오른 구조가 관찰되었다. 시험에 제공한 배지에서는 최장 3주간의 배양이라도 생식기관이라고 생각되는 구조는 형성하지 않았다.

(2)18S rRNA 유전자 해석

F-1529 균주의 한천평판 배양 균체에서, FastPrep FP120(Q-BIOgene) 및 Fast DNA 키트t(Q-BIOgene)를 이용하여 DNA 추출하였다. PCR는 puReTaq 레디-투-고 PCR 비드(Amersham Biosciences)와 표1 및 표2의 PCR 프라이머 NS1 및 NS8을 이용하여 실시하였다. PCR 산물은 QIA 신속 PCR 정제 키트(QIAGEN)로 정제하고, ABI Prism BigDye Terminator 키트(Applied Biosystems)에 사용하였다. 서열분석 프라이머는 표1 및 표2의 NS1, NS2, NS3, NS4, NS5, NS6, NS7 및 NS8을 이용하였다. 반응산물은 Dye Ex2.0 스핀 키트(QIAGEN)로 정량하고, ABI PRISM 3100 유전자 분석기(Applied Biosystems)로 서열을 판독한 후 자동 조합기(Applied Biosystems)로 각 서열 단편을 조합함으로써 목적 염기서열을 수득하였다.

표 1. 18S rRNA 유전자의 염기서열 결정에 사용한 프라이머(순방향)

서열번호 명칭 서열 1 NS1 5'-gtagtcatatgcttgtct-3' 2 NS3 5'-gcaagtctggtgccagcagcc-3' 3 NS5 5'-aacttaaaggaattgacggaag-3' 4 NS7 5'-gaggcaataacaggtctgtgatg-3'

표 2. 18S rRNA 유전자의 염기서열 결정에 사용한 프라이머(역방향)

서열번호 명칭 서열 5 NS2 5'-cgttcagaccacggtcgtcgg-3' 6 NS4 5'-ttgaatttccttaactgccttc-3' 7 NS6 5'-ctccgttattgtccagacactac-3' 8 NS8 5'-aggcatccacttggacgcct-3'

수득한 균주의 18S rRNA 유전자는, 서열번호 9로 기재된 염기서열을 갖는다.

일본 DNA 유전자은행(http: //www.ddbj.nig.ac.jp/)으로부터 공지 균주의 DNA 염기서열을 입수하여, 18S rRNA 유전자의 상동성을 조사하였다. 그 결과, 모르티에렐라 하이알리나(Mortierella hyalina)(GenBank, accession no. AY157493)의 18S rRNA 유전자와는 99 %(상위 803개 염기), 모르티에렐라 클라미도소포라(Mortierella chlamydospora)(GenBank, accession no. AF157143)의 18S rRNA 유전자와는 98 %(전장), 모르티에렐라 멀티디배리카타(Mortierella multidivaricata)GenBank, accession no. AF157144)의 18S rRNA 유전자와는 98 %(전장)의 상동성을 나타내었다.

본 발명자들은, 이상의 균학적 성질을 토대로, 본 균주가 모르티에렐라 속에 속한다고 판단하였다.

[F-1530 균주의 균학적 성상]

(1) 형태

오트밀 한천배지(Oatmeal Agar), 맥아 한천배지(Malt Agar) 및 포테이토 덱스트로즈 한천배지(Potato Dextrose Agar) 플레이트에서, 콜로니는 솜털형(cottony)이며, 균사 색상은 백색으로 화이트(1A-1)의 색조를 나타낸다. 25℃에서의 일 주일 배양시, 생육은 OA 플레이트에서 80-85mm, MEA 플레이트에서 85mm, PDA 플레이트에서 직경 85mm에 이른다. 콜로니는 꽃갓형(zonate)이다. 이면 착색 및 가용성 색소의 생산은 관찰되지 않는다. 색조 판별은 [Methuen Handbook of Colour(Kornerup & Wanscher, 1978)]를 참조하였다.

광학 현미경 관찰 결과, 영양 균사는 무색이고, 표면은 평활하고, 격벽이 없으며, 균사 폭은 2.5-5㎛이다. 균사의 일부에서는 구형으로 두꺼운 세포벽 포자와 같은 10㎛ 정도의 부풀어 오른 구조가 관찰되었다. 시험에 제공한 배지에서는 최장 3주간의 배양이라도 생식기관이라고 생각되는 구조는 형성하지 않았다.

(2)18S rRNA 유전자 해석

F-1529 균주에서와 동일의 방법으로, F-1530 균주의 18S rRNA 유전자를 판별하였다.

수득한 F-1530 균주의 18S rRNA 유전자는, 서열번호 10으로 기재된 염기서열을 갖는다.

일본 DNA 유전자은행(http: //www.ddbj.nig.ac.jp/)으로부터 공지 균주의 DNA 염기서열을 입수하여, 18S rRNA 유전자의 상동성을 조사하였다. 그 결과, 모르티에렐라 하이알리나(GenBank, accession no. AY157493)의 18S rRNA 유전자와는 100 %(상위 803개 염기), 모르티에렐라 클라미도소포라(GenBank, accession no. AF157143)의 18S rRNA 유전자와는 98 %(전장), 모르티에렐라 멀티디배리카타(GenBank, accession no. AF157144)의 18S rRNA 유전자와는 98 %(전장)의 상동성을 나타내었다.

이상의 균학적 성질을 토대로, 본 발명자들은 본 균주가 모르티에렐라 속에 속하는 것으로 판단하였다.

[AB-1704 균주의 균학적 성상]

(1) 형태

영양균사로부터 곧은 형상(Rectiflexibiles type)의 기균사(aerial hyphae)가 자란다. 성숙한 기균사의 말단에 20-50개 정도의 원통형 포자로 이루어진 포자쇄가 형성된다. 포자의 크기는 0.6 - 0.8 x 1.0 - 1.1 ㎛ 정도로, 포자의 표면은 평활형이며, 포자낭, 균핵, 편모 등의 특수 기관은 관찰되지 않는다.

(2) 다양한 배지에서의 생육 특성

다양한 배지상에서 28℃로 약 2주간 배양한 다음, 이의 생육 특성을 표 3에 나타낸다. 색조는 트레스너의 색상 회전(Tresner의 Color wheels)의 색 명칭과 괄호안에 기재한 부호로 표시한다.

표 3

배지 생육 기균사 영양균사의 색상 가용성 색소 효모ㆍ맥아 한천배지(ISP-2) 양호 진한 아이보리(2db) 누드 황갈색(4gc) 없음 오트밀 한천배지(ISP-3) 양호 풍부 아이보리(2db) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 전분ㆍ무기염 한천배지(ISP-5) 양호 진한 퍼티-아이보리(11/2ec -2db) 코르크 황갈색(4ie) 없음 글리세롤ㆍ아스파라진 한천배지(ISP-5) 양호 진한 담녹황색(11/2db) 누드 황갈색(4gc) 없음 펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지(ISP-6) 양호 풍부 흰색(a) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 티로신 한천배지(ISP-7) 양호 진한 아이보리(2db) 누드 황갈색(4gc) 없음

(3) 다양한 탄소원의 동화성

Pridham-Gottlieb 한천배지에 각종 탄소원을 첨가하여, 28℃에서 2주간 배양하였을때의 생육 상황을 표 4에 나타낸다.

표 4

D-글루코스 + 이노시톨 - L-아라비노스 + L-람노스 + D-자일로스 + D-만니톨 + D-프럭토스 + 라피노스 - 슈크로스 +

(+: 동화한다, ±: 다소 동화한다, -: 거의 동화하지 않는다)

(4) 다양한 생리학적 특성

본 균주의 생리학적 특성은 아래와 같다.

(a) 생육 온도 범위(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 5℃-33℃

(b) 생육 적정 온도(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 15℃-33℃

(c) 젤라틴의 액화(글루코스ㆍ펩톤ㆍ젤라틴 배지): 양성

(d) 밀크의 응고(스킴 밀크배지): 양성

(e) 밀크의 펩톤화(스킴 밀크배지): 양성

(f) 전분의 가수분해(전분ㆍ무기염 한천배지): 양성

(g) 멜라노이드 색소 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 음성, (티로신 배지): 음성

(h) 황화수소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 음성

(i) 질산염의 환원(0.1% 질산칼륨 함유 액체배지): 양성

(j) 식염 내성(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 식염 함유량 7 %이하에서 생육

(5) 균체 성분

본 균주의 세포벽에서 LL 형의 디아미노피멜린산이 검출되었다.

이상의 균학적 특성을 토대로, 본 발명자들은 본 균주가 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속한다고 판단하였다.

[A-1544 균주의 균학적 성상]

(1) 형태

영양균사로부터 나선형(Spira type)의 기균사가 자란다. 성숙한 기균사의 말단에 10-20개 정도의 원통형의 포자로 이루어지는 포자쇄가 형성된다. 포자의 크기는 1.0 x 1.2-1.4㎛ 정도이며, 포자의 표면은 자상(spiny)이고, 포자낭, 균핵, 편모 등의 특수한 기관은 관찰되지 않는다.

(2) 다양한 배지에서의 생육 상태

다양한 배지에서 28℃로 약 2주간 배양하였을때의 생육 성상을 표 5에 나타낸다. 색조는 트레즈너의 색상 회전(Tresner의 Color wheels)의 색상 명칭과 괄호안에 기재한 부호로 표시한다.

표 5

배지 생육 기균사 영양균사의 색상 가용성 색소 효모ㆍ맥아 한천배지(ISP-2) 양호 진한 은회색(3fe) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 오트밀 한천배지(ISP-3) 양호 풍부 연한 회색-은회색(d-3fe) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 전분ㆍ무기염 한천배지(ISP-5) 양호 풍부 은회색(3fe) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 글리세롤ㆍ아스파라진 한천배지(ISP-5) 양호 풍부 재색(5fe) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지(ISP-6) 양호 없음 연한 멜론 노랑(3ea) 흐린 검갈색 티로신 한천배지(ISP-7) 양호 코베르트 회색(2fe) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음

(3) 다양한 탄소원의 동화성

Pridham-Gottlieb 한천배지에 각종 탄소원을 첨가하여, 28℃에서 2주간 배양하였을때의 생육 상황을 표 6에 나타낸다.

표 6

D-글루코스 + 이노시톨 - L-아라비노스 + L-람노스 + D-자일로스 + D-만니톨 + D-프럭토스 + 라피노스 - 슈크로스 -

(+: 동화한다, ±: 다소 동화한다, -: 거의 동화하지 않는다)

(4) 다양한 생리학적 특성

본 균주의 생리학적 특성은 아래와 같다.

(a) 생육 온도 범위(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 15℃-41℃

(b) 생육 적정 온도(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 20℃-37℃

(c) 젤라틴의 액화(글루코스ㆍ펩톤ㆍ젤라틴배지): 양성

(d) 밀크의 응고(스킴 밀크배지): 양성

(e) 밀크의 펩톤화(스킴 밀크배지): 양성

(f) 전분의 가수분해(전분ㆍ무기염 한천배지): 양성

(g) 멜라노이드 색소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 양성, (티로신 배지): 음성

(h) 황화수소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 양성

(i) 질산염의 환원(0.1% 질산칼륨 함유 배지): 음성

(j) 식염 내성(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 식염 함유량 7% 이하에서 생육

(5) 균체 성분

본 균주의 세포벽에서 LL 형의 디아미노피멜린산이 검출되었다.

이상의 균학적 성질을 토대로, 본 발명자들은 본 균주가 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속한다고 판단하였다.

[A-1545 균주의 균학적 성상]

(1) 형태

영양균사로부터 곧은 형상(Rectiflexibiles type)의 기균사가 자란다. 성숙한 기균사의 말단에 50개 이상의 포자로 이루어지는 포자쇄가 형성된다. 포자의 크기는 0.8 x 1.0㎛ 정도로, 포자의 표면은 평활형이고, 포자낭, 균핵, 편모 등의 특수 기관은 관찰되지 않는다.

(2) 다양한 배지에서의 생육 특성

다양한 배지상에서 28℃로 약 2주간 배양한 다음, 이의 생육 특성을 표 7에 나타낸다. 색조는 트레스너의 색상 회전(Tresner의 Color wheels)의 색 명칭과 괄호안에 기재한 부호로 표시한다.

표 7

배지 생육 기균사 영양균사의 색상 가용성 색소 효모ㆍ맥아 한천배지(ISP-2) 양호 풍부 회색과 노란색이 도는 분홍(5cb) 연한 멜론노란내지 누드 황갈색(3ea-4gc) 없음 오트밀 한천배지(ISP-3) 중간 엷은 회색과 노란색이 도는 분홍(5cb) 펄 분홍(3ca) 없음 전분ㆍ무기염 한천배지(ISP-5) 양호 엷은 회색과 노란색이 도는 분홍(5cb) 연한 아이보리(2ca) 없음 글리세롤ㆍ아스파라진 한천배지(ISP-5) 양호 풍부 회색과 노란색이 도는 분홍(5cb) 펄 분홍(3ca) 없음 펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지(ISP-6) 중간 없음 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 티로신 한천배지(ISP-7) 양호 풍부 회색과 노란색이 도는 분홍(5cb) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음

(3) 다양한 탄소원의 동화성

Pridham-Gottlieb 한천배지에 각종 탄소원을 첨가하여, 28℃에서 2주간 배양하였을때의 생육 상황을 표 8에 나타낸다.

표 8

D-글루코스 + 이노시톨 + L-아라비노스 + L-람노스 + D-자일로스 + D-만니톨 + D-프럭토스 + 라피노스 + 슈크로스 -

(+: 동화한다, ±: 다소 동화한다, -: 거의 동화하지 않는다)

(4) 다양한 생리학적 특성

본 균주의 생리학적 여러 가지 성질은 아래와 같다.

(a) 생육 온도 범위(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 10℃-37℃

(b) 생육 적정 온도(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 20℃-33℃

(c) 젤라틴의 액화(글루코스ㆍ펩톤ㆍ젤라틴배지): 음성

(d) 밀크의 응고(스킴 밀크배지): 양성

(e) 밀크의 펩톤화(스킴 밀크배지): 양성

(f) 전분의 가수분해(전분ㆍ무기염 한천배지): 양성

(g) 멜라노이드 색소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 음성, (티로신배지): 음성

(h) 황화수소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 양성

(i) 질산염의 환원(0.1% 질산칼륨 함유 배지): 음성

(j) 식염 내성(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 식염 함유량 7% 이하에 생육

(5) 균체 성분

본 균주의 세포벽에서 LL 형의 디아미노피멜린산이 검출되었다.

이상의 균학적 성질을 토대로, 본 발명자들은 본 균주가 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속한다고 판단하였다.

[AB-1896 균주의 균학적 성상]

(1) 형태

AB-1896 균주는 균주 동정에 사용한 배지에서 28℃로 7-14일간 배양하였을때 양호 또는 중간 정도의 생육을 보인다. 배양중 균사는 관찰되지 않고, 각 영양균사에서 포자가 1 개씩 관찰된다. 포자는 구형이며, 크기는 약 0.8-0.9㎛이고, 포자의 표면은 사마귀형(warty)이다. 포자낭, 균핵, 편모 등의 특수한 기관은 관찰되지 않는다.

(2) 다양한 배지에서의 생육 특성

다양한 배지상에서 28℃로 약 2주간 배양한 다음, 이의 생육 특성을 표 9에 나타낸다. 색조는 트레스너의 색상 회전(Tresner의 Color wheels)의 색 명칭과 괄호안에 기재한 부호로 표시한다.

표 9

배지 생육 영양균사의 색상 가용성 색소 효모ㆍ맥아 한천배지(ISP-2) 양호비버(Berver)(3li) 붉은빛의 황색(3ec) 없음 오트밀 한천배지(ISP-3) 중간코르크 황갈색(4ie) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 전분ㆍ무기염 한천배지(ISP-5) 양호비버(3li) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 글리세롤ㆍ아스파라진 한천배지(ISP-5) 중간연한 올리브빛 칙칙한 황갈색(1li) 펄 분홍(3ca) 없음 펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지(ISP-6) 양호비버(3li) 연한 멜론 노랑(3ea) 없음 티로신 한천배지(ISP-7) 중간연한 올리브빛 g회색(11/2ge) 펄 분홍(3ca) 없음

(3) 다양한 탄소원의 동화성

Pridham-Gottlieb 한천배지에 각종 탄소원을 첨가하여, 28℃에서 2주간 배양하였을때의 생육 상황을 표 10에 나타낸다.

표 10

D-글루코스 + 이노시톨 - L-아라비노스 + L-람노스 - D-자일로스 + D-만니톨 - D-프럭토스 + 라피노스 + 슈크로스 +

(+: 동화한다, -: 거의 동화하지 않는다)

(4) 다양한 생리학적 특성

본 균주의 생리학적 특성은 아래와 같다.

(a) 생육 온도 범위(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 20℃-41℃

(b) 생육 적정 온도(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 25℃-37℃

(c) 젤라틴의 액화(글루코스ㆍ펩톤ㆍ젤라틴배지): 음성

(d) 밀크의 응고(스킴 밀크배지): 양성

(e) 밀크의 펩톤화(스킴 밀크배지): 양성

(f) 전분의 가수분해(전분ㆍ무기염 한천배지): 양성

(g) 멜라노이드 색소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 음성, (티로신 배지): 음성

(h) 황화수소의 생산(펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천배지): 음성

(i) 질산염의 환원(0.1% 질산칼륨 함유 배지): 양성

(j) 식염 내성(효모ㆍ맥아 한천배지, 2주간 배양): 식염 함유량 4%에서 생육하지 않는다.

(5) 균체 성분

AB-1896 균주의 세포벽에서 메조(meso)형의 디아미노피멜린산이 검출되었다. 전체 균체의 주된 구조 당으로는 자일로스와 만노스가 검출되었다. 세포벽의 펩티드 글리칸에서의 아실 형태는 글리콜릴 형태이었다. 마이콜릭 산은 검출되지 않았다. 주된 메나퀴논 성분으로서 MK-9(H4), MK-9(H6), MK-10(H4), MK-10(H6)가 검출되었다.

(6) 16S rRNA 유전자 판별

AB-1896 균주의 배양액을 모아, Fast DNA 키트(Q-BIOgene)를 이용하여 DNA 추출을 실시하였다. PCR는 96℃ 20초, 50℃ 20초, 72℃ 1분으로 이루어진 30 회의 반응조건으로 수행하였다. 프라이머는 9F(5'-GTGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(서열번호11) 및 536R(5'-GTATTACCGCGGCTGCTG-3')(서열번호12)를 이용하였다. PCR 산물은 MinElute PCR 정제 키트(QIAGEN)를 이용하여 정제한 후 서열분석용 샘플로 사용하였다.

서열분석은 ABI PRISM 310 유전자 분석기(Applied Biosystems)와 BigDye Terminator 키트를 이용하고, 표준 프로토콜에 따라 실시하였다. 프라이머는 9F와 536R를 사용하였다.

본 균주의 16s rRNA 유전자의 5' 말단에 위치한 약 500개의 염기는, 서열번호 13으로 기재한다.

일본 DNA 유전자은행(http: //www.ddbj.nig.ac.jp/)으로부터 공지 균주의 DNA 염기서열을 입수하여, 18S rRNA 유전자의 5' 말단의 400-500개 염기간의 상동성을 조사하였다. 그 결과, 마이크로모노스포라 sp. DSM44396(GenBank, accession no. AJ560637)의 16s rRNA 유전자와는 98 %, 마이크로모노스포라 퍼르퍼레오크로모젠(Micromonospora purpureochromogenes)(GenBank, accession no. X92611) 유전자와는 98 %, 마이크로모노스포라 속 균주인 M. 칼세아(M. chalcea) IFO12135(GenBank, accession no. D 85489) 유전자와는 95 %, 베루코시스포라(Verrucosispora) 속 균주인 베루코시스포라 지포르넨시스(Verrucosispora gifhornensis)(GenBank, accession no. Y 15523) 유전자와는 95 %의 상동성을 나타내었다.

AB-1896 균주는 대부분 마이크로모노스포라 속의 특징을 가지지만, 균체 전체를 이루는 주된 구조 당이 아라비노스가 아니고 만노스로 검출되는 점에서, 마이크로모노스포라 속과는 완전히는 일치되지 않는다. 또한 베루코시스포라 지포르넨시스에서 보이는 특징적인 포자가 균주 동정에 사용한 배지상에서는 관찰되지 않는 점에서, 베루코시스포라 속과도 완전히는 일치되진 않는다. 본 발명자들은, 이들 균학적 성질을 종합적으로 고려하여, AB-1896 균주를 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 방선균으로 판단하였다.

본 발명에 있어서, 첫번째 단계 (A)는, 상기 균주 또는 그것의 배양 균체물을, 산소의 존재 하에서, 출발원료(기질)인 매크로라이드계 화합물 11107B과 배양하는 것이다. 이는 상기 균주를 호기적 조건 하에서 배양할 때 배양액 중에 기질을 첨가하여 배양하거나, 또는 경우에 따라 상기 균주의 배양 균체의 현탁액에, 예컨대, 그대로 또는 균질화한 제조물의 현탁액 중에 기질을 첨가하여 배양하며, 산소를 포함하는 기체, 예를 들면 공기를 통기하면서 배양을 수행할 수도 있다.

배양액에 기질 첨가는, 배양 전 또는 배양 개시 후 일정기간 경과한 어느 시기에 실시할 수 있다. 상기 균체는 전술한 어느 하나의 균주를 영양원 함유 배지에 접종하고, 호기적으로 배양함으로써 제조할 수 있다. 이러한 배양 균체의 제조물을 준비하기 위하여 균주의 배양물 또는 기질이 첨가된 상태에서 수행하는 균주 배양은, 원칙적으로는 일반 미생물의 배양방법에 준하여 행할 수 있지만, 통상 액체배양에 의한 진탕 배양, 통기 교반배양 등의 호기적 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다.

배양에 이용되는 배지로는, 모르티에렐라 속, 스트렙토마이세스 속 또는 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 미생물이 이용할 수 있는 영양원을 함유한 배지일 수 있으며, 각종 합성배지, 반합성배지, 천연배지 등 모두 이용가능하다. 배지조성은 탄소원으로서 글루코스, 갈락토오스, 슈크로스, 말토오스, 프럭토스, 글리세린, 덱스트린, 전분, 당밀, 대두유 등을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다.

질소원으로는, 파마 배지(Pharma media), 펩톤, 고기 추출물, 대두가루, 어분, 글루텐 밀, 카세인, 건조 효모, 아미노산, 효모 추출물, NZ-카세(case), 유레아 등의 유기 질소원, 소듐 나이트레이트 및 암모늄 설페이트 등의 무기 질소원을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 기타, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산칼슘, 황산마그네슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 황산구리, 황산철, 염화망간, 염화코발트 등의 염류, 중금속 염, 비타민 B 및 비오틴 등의 비타민류, 사이클로덱스트린과 같은 포접제도 필요에 따라 부가적으로 사용할 수 있다. 또한, 배양중 현저한 발포가 발생되는 경우에는, 각종 소포제를 적절하게 배지에 첨가할 수 있다. 목적 물질의 생산에 약영향을 미치지 않는 농도로 소포제를 첨가할 필요가 있다.

배양조건은, 상기 균주가 양호하게 생육하여 상기 물질을 생산할 수 있는 범위 내에서 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면 배지의 pH는 약 5-9, 통상 중성부근으로 하는 것이 바람직하다. 배양온도는, 통상 약 20-40℃, 바람직하게는 약 24-30℃로 유지하는 것이 좋다. 배양일수는 약 1-8일로, 통상 약 2-5일이다. 상술한 각종 배양조건은, 사용 미생물의 종류나 특성, 외부조건 등에 따라서 적절하게 변경할 수 있으며, 최적조건을 선택할 수 있다.

또한, 배양 균체의 제조물은, 배양 종료 후 원심분리 또는 여과에 의해 분리한 균체 또는 균질화한 균체를 적당한 용액에 현탁하여 제조한다. 균체의 현탁에 사용될 수 있는 용액은, 전술한 배지이거나 또는 트리스-아세트산, 트리스-염산, 숙신산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨 등의 완충액이 단독으로 또는 혼합된 것이다. 완충액의 pH는 5.0-9.0이며, 바람직하게는 6.0-7.5이다.

기질인 11107B은, 가루로, 또는 수용성 유기용매, 예를 들면 에탄올, 메탄올, 아세톤, 디메틸설폭사이드 등에 용해되어 배양액 또는 균체의 현탁액에 첨가될 수 있으며, 첨가량은, 예를 들면, 배양액의 경우에는 배양액 1L 대해 50-5000mg가 바람직하다. 기질 첨가 후, 20-31℃에서 약 1-5일간, 진탕 또는 통기교반 등을 실시하고 호기 조건 하에서 반응을 진행시킴으로써 기질인 11107B을 목적물질인 11107D로 변환시킬 수 있다.

다음으로, 단계 (B)에서는 상기 단계 (A)로부터 수득된 배양물로부터 목적물질인 11107D를 수득한다. 11107D는 단계 (A)의 반응 혼합물로부터 분리하며, 일반적으로 미생물 대사산물을 분리하기 위해 이용되는 공지의 여러가지 정제수단을 선택, 조합하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸 아세트이트, 클로로포름, 톨루엔 등을 이용한 유기용매 추출, 각종 이온 교환크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 등을 이용한 겔 여과 크로마토그래피, 다이아이온(Diaion) HP-20 등의 소수성 흡착수지, 활성탄, 실리카겔 등에 의한 흡착 크로마토그래피, 또는 박층 크로마토그래피에 의한 흡탈착 처리, 또는 역상컬럼 등을 이용한 고속 액체 크로마토그래피 등을, 단독 또는 적절하게 조합하고, 경우에 따라 반복 사용함으로써, 분리 정제할 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적인 예를 들어 보다 상세하게 설명하나, 본 발명이 이들 예에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 또한 하기의 실시예에서, 퍼센트(%)는 특별한 언급이 없는 한 중량 퍼센트(%(w/v))를 나타낸다.

참고예 1(원료인 11107B의 제조)

스트렙토마이세스 sp.Mer-11107 균주(FERM BP-7812)의 편향(slant)배양물(ISP-2 배지)에 적신 하나의 백금이로, 50ml의 종균배지(글루코스 2.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 1.0%, 효모추출물(오리엔탈 효모공업주식회사) 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 탄산칼슘 0.32%, 멸균전 pH6.8)가 있는 500 ml의 삼각플라스크에 접종하고, 28℃에서 2일간 배양하여 일차 종균 배양액을 수득하였다. 이 배양액 0.1ml을 동일 종균배지 100ml가 있는 500ml의 삼각플라스크에 넣고, 28℃에서 1일간 배양하여 이차 종배양액을 수득하였다. 상기 이차 종배양액 800ml을 생산배지(가용성 전분 5.0%, 파마배지 0.8%, 글루텐 밀 0.8%, 효모 추출물 0.5%, 탄산칼슘 0.1%, 멸균전 pH6.8) 100L가 있는 200L 탱크에 넣고, 배양온도 28℃에서 교반수 90rpm으로 통기량 1.0vvm, 내압 20kPa의 조건으로 5일간 통기 교반 배양을 실시하여 배양액을 수득하였다.

수득한 배양액 일부(10L)를 10L의 1-부탄올로 추출하고, 부탄올 층은 감압건조하여 100 g의 조 활성분획을 수득하였다. 상기 조 활성분획은 세파덱스 LH-20(Pharmacia, 1500ml)에 주입하고, 테트라하이드로퓨란-메탄올(1:1)의 용매로 용출시켰다. 540ml 내지 660ml의 용출 분획을 감압하에서 농축 건조하여, 잔사(660mg)를 수득하였다. 또한 상기 잔사를 에틸 아세테이트 및 메탄올(9:1, v/v)의 혼합액에 용해시킨 다음, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(WACO GEL C-200, 50g)에 흡착시켰다. 컬럼으로부터 n-헥산 및 에틸 아세테이트(1:9, v/v) 혼합액(2L)을 사용하여 용출시키고, 468ml 내지 1260ml의 용출 분획을 모은 후 감압하에서 농축하여 조 활성분획 25mg을 수득하였다.

수득한 조 활성분획을 아래 HPLC 분취조건(A)으로 분취용 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 흡착시키고 머무름시간 34분에 용출되는 분획을 모은 다음 아세토니트릴을 제거하고, 상기 분획을 아래 HPLC 분취조건(B)으로 HPLC에 의한 탈염을 실시함으로써 11107B(머무름시간: 37분) 6mg을 수득하였다.

HPLC 분취조건(A):

컬럼: YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM, φ 20mm x 250mm(YMC)

온도: 상온

유속: 10ml/분

검출: 240nm

용출액: 아세토니트릴/0.15% 인산제일칼륨(pH3.5)(2:8 내지 8:2, v/v, 0-50분, 직선 농도구배)

HPLC 분취조건(B):

컬럼: YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM, φ 20mm x 250mm(YMC)

온도: 상온

유속: 10ml/분

검출: 240nm

용출액: 메탄올/물(2:8 내지 10:0, v/v, 0-40분, 직선 농도구배)

실시예 1(AB-1704 균주 분리)

토양으로부터 분리한 균주의 편향배지(가용성 전분 0.5%, 글루코스 0.5%, 어육추출물(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 0.1%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.1%, NZ-카세(Humko Sheffield Chemical Co.) 0.2%, 염화나트륨 0.2%, 탄산칼슘 0.1%, 한천(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 1.6%)에 적신 하나의 백금이로, 7ml의 종균배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%)이 있는 65ml의 시험관에 접종하고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다.

종균배양액 0.5ml을 7ml의 생산배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%))가 있는 65ml의 시험관에 넣고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하였다. 이후 기질인 11107B을 25mg/ml 에탄올 용액으로 제조하여 이를 0.2ml로 첨가하였다. 첨가 후, 28℃에서 48시간 흔들어, 변환반응을 수행하였다. 반응 후, 하기 HPLC 분석조건(a)으로 HPLC를 실시함으로써, 반응혼합물내에서 11107D을 생성하는 균주, AB-1704 균주(FERM BP-8551)를 분리하였다.

HPLC 분석조건(a)

컬럼: CAPCELL PAK C 18SG120, φ 4.6mm x 250mm(SHISEIDO CO.,)

온도: 40℃

유속: 1ml/분

검출: 240nm

용출액: 아세토니트릴/0.15% 인산제일칼륨(pH3.5)(3:7 내지 5:5, v/v, 0-18분, 직선 농도구배), 아세토니트릴/0.15% 인산제일칼륨(pH3.5)(5:5 내지 85:15, v/v, 18-22분, 직선 농도구배)

머무름시간: 11107D 9.9분, 11107B 19.4분

실시예 2(A-1544 균주와 A-1545 균주의 분리)

토양으로부터 분리한 균주의 편향배지(효모ㆍ맥아 한천배지)에 적신 하나의 백금이로, 20ml의 종균배지(가용성 전분 2.4%, 글루코스 0.1%, 대두가루((ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 0.5%, 쇠고기 추출물(Difco) 0.3%, 효모 추출물 (Difco) 0.5%, 트립톤ㆍ펩톤(Difco) 0.5%, 탄산칼슘 0.4%)가 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다.

종균배양액 0.6ml을 60ml의 생산배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 2.0%, 대두가루((ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 효모 추출물(오리엔탈 효모공업(주)) 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 탄산칼슘 0.32%, 황산구리 0.0005%, 염화망간 0.0005%, 황산아연 0.0005%, 멸균전 pH7.4)가 있는 500ml의 삼각플라스크에 넣고, 28℃에서 4일간 진탕 배양로 배양하였다. 얻어진 배양액 2ml을 15ml 시험관에 나누어 주입하였다. 다음으로 기질인 11107B을 20mg/ml 디메틸설폭사이드 용액으로 제조하고, 이를 0.05ml로 첨가하였다. 첨가 후 28℃에서 23시간 흔들어, 변환 반응을 수행하였다. 반응 후, 하기 HPLC 분석조건(b)으로 HPLC분석을 실시함으로써, 반응혼합물내 11107D을 생성하는 균주로, A-1544 균주(FERM BP-8446) 및 A-1545 균주(FERM BP-8447)를 수득하였다.

HPLC 분석조건(b)

컬럼: CAPCELL PAK C 18SG120, φ 4.6mm x 250mm(SHISEIDO CO.,)

온도: 40℃

유속: 1ml/분

검출: 240nm

용출액: 아세토니트릴/물(50: 50, v/v) 등용매

머무름시간: 11107B 7.2분, 11107D 3.6분

실시예 3(플라스크 규모에서의 AB-1704 균주에 의한 변환)

토양으로부터 분리한 스트렙토마이세스 sp. AB-1704 균주(FERM BP-8551)의 편향배지(가용성 전분 0.5%, 글루코스 0.5%, 어육 추출물(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 0.1%, 효모 추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.1%, NZ-카세(Humko Sheffield Chemical Co.) 0.2%, 염화나트륨 0.2%, 탄산칼 슘0.1%, 한천(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 1.6%))에 적신 하나의 백금이로, 100ml의 종균배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%)가 있는 500ml의 삼각플라스크에 접종하고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또한 100ml의 생산배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%)가 있는 500ml의 삼각플라스크 150개에 종균배양액을 2ml씩 넣고, 28℃에서 2일간 진탕 배양기로 배양하였다.

얻어진 배양액(100ml/500ml의 삼각플라스크, 150개)에, 20mg/ml 에탄올 용액으로 제조한 11107B을 각각 0.44ml씩 첨가하였다. 첨가 후, 28℃에서 9시간 흔들어, 변환반응을 수행하였다. 반응종료 후, 배양액을 모아, 2700rpm에서 10분간의 원심분리하여 배양상청액과 균체를 분리하였다. 균체는 5L의 메탄올로 추출 및 여과하여 메탄올 추출액을 수득하였다. 메탄올 추출액은 감압하에서 메탄올을 제거한 후, 배양상청액과 합하고 10L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 에틸 아세테이트용액은 감압하에서 농축하여, 2090mg의 조 활성분획을 수득하였다. 이 조 활성분획을 테트라하이드로퓨란-메탄올(1:1, v/v) 혼합액 4ml과 50% 아세토니트릴수용액 6ml에 용해하여, ODS 칼럼 크로마토그래피(YMC CO., ODS-AM 120-S50 φ 3.6cm x 43cm)에 흡착시키고, 40% 아세토니트릴수용액으로 용출시켰다. 336ml 내지 408ml의 용출 분획을 감압하에서 농축 건조함으로써, 560mg의 잔사를 수득하였다. 또한 이 잔사를 50% 메탄올 수용액 10ml에 용해한 후 ODS 칼럼 크로마토그래피(YMC CO., ODS-AM 120-S50 φ 3.6cm x 40cm)에 흡착시킨 다음 50% 메탄올 수용액으로 용출시켰다. 1344ml 내지 1824ml의 용출 분획은 감압하에서 농축 건조하여, 11107D 252mg을 수득하였다.

실시예 4(플라스크 규모에서 A-1545 균주에 의한 변환)

A-1545 균주(FERM BP-8447)의 편향배지(효모ㆍ맥아 한천배지)에 적신 하나의 백금이로, 25ml의 종균배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 2.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 효모추출물(Difco) 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 탄산칼슘 0.32%, 멸균전 pH7.4)가 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하고, 28℃에서 2일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 이 배양액 0.75ml을 2ml의 혈청 튜브(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)에 나누어 주입하고, 동량의 40% 글리세롤 수용액을 첨가한 다음 교반후 -70℃에서 동결하여, 동결 종균을 제작하였다. 이 동결종균를 융해하고, 그 중 0.25ml을 25ml의 종균배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 2.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 탄산칼슘 0.32%, 멸균전 pH7.4)가 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하고, 28℃에서 2일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또 종균배양액 0.5ml을 100ml의 생산배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 2.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 탄산칼슘 0.32%, 멸균전 pH7.4)가 있는 500ml의 삼각플라스크에 넣고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하였다.

얻어진 배양액(100ml/500ml 용량의 삼각플라스크, 10개) 각각을 3000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 수집한 후 이를 50mM 인산완충액(pH6.0) 100ml에 현탁하였다. 다음으로, 기질인 11107B을 100mg/ml 디메틸설폭사이드 용액으로 제조한 다음 이를 각각에 1ml씩 첨가하였다. 첨가 후, 28℃에서 24시간 흔들어, 변환반응을 수행하였다. 반응종료 후, 반응액을 모아 5000rpm으로 20분간의 원심분리하여, 상청액과 균체를 분리하였다. 상청액은 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 균체는 500ml의 메탄올로 추출 및 여과하여 메탄올 추출액로 수득하였다. 메탄올 추출액으로부터 감압하에서 메탄올을 제거한 후, 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 각각의 에틸 아세테이트층을 수세하고, 무수황산나트륨으로 탈수건조시킨 후, 모두 모아 감압하에서 농축함으로써 937mg의 조분획을 수득하였다. 조분획을 실리카겔칼럼 크로마토그래피(Kiesel gel 60, 50g)에 흡착시키고, 에틸 아세테이트 및 n-헥산(90:10, v/v) 혼합액 1200ml으로 용출시켜, 11107D을 포함하는 분획 234mg을 수득하였다. 얻어진 활성분획은 하기 분취조건(C)으로 분취용 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 흡착시키고, 얻어지는 용출액을 하기의 분석조건(c)로 HPLC하였다. 수득된 11107D을 포함하는 분획은 용매를 제거하여, 11107D 80mg을 수득하였다.

HPLC 분취조건(C)

컬럼: CAPCELL PAK C 18UG120, φ 30mm x 250mm(SHISEIDO CO.,)

유속: 20ml/분

검출: 240nm

용출액: 아세토니트릴/물(30: 70, v/v) 등용매

HPLC 분석조건(c)

컬럼: CAPCELL PAK C 18SG120, φ 4.6mmx 250mm(SHISEIDO CO.,)

온도: 40℃

유속: 1ml/분

검출: 240nm

용출액: 아세토니트릴/물(35:65, v/v) 등용매

머무름시간: 11107D 7.8분

실시예 5(플라스크 규모에서의 A-1544 균주에 의한 변환)

실시예 4과 동일의 방법으로 수득한 A-1544 균주(FERM BP-8446)의 배양액(100ml/500ml 용량의 삼각플라스크, 10개) 각각은 3000rpm에서 10분간의 원심분리하여 균체를 수득하고, 이를 50mM 인산완충액(pH6.0) 100ml에 현탁하였다. 이후 100mg/ml 디메틸설폭사이드 용액으로 제조한 기질 11107B을, 각각에 1ml씩 첨가하였다. 첨가 후, 28℃에서 24시간 흔들어, 변환반응을 수행하였다. 반응종료 후, 반응액을 모아, 5000rpm으로, 20분간 원심분리하여 상청액과 균체를 분리하였다. 상청액은 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 균체는 500ml의 아세톤으로 추출 및 여과하여 아세톤 추출액으로 수득하였다. 아세톤 추출액은 감압하에서 아세톤을 제거한 후, 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 각각의 에틸 아세테이트층을 수세하고, 무수황산나트륨으로 탈수건조한 다음 모두 모아 감압하에서 농축하여, 945mg의 조분획을 수득하였다. 조분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Kiesel gel 60, 50g)에 흡착시키고, 에틸 아세테이트 및 n-헥산(50:50, v/v) 혼합액 100ml과, 에틸 아세테이트 및 n-헥산(75:25, v/v) 혼합액 200ml과, 에틸 아세테이트 및 n-헥산(90:10, v/v) 혼합액(600ml)으로 용출시켜, 11107D을 포함하는 분획 463mg을 수득하였다. 상기 분획을 실시예 4의 분취조건(C)으로 분취용 고속액체크로마토그래피(HPLC)하고, 수득한 용출액은 실시예 4의 분석조건(c)으로 HPLC을 수행하였다. 이렇게 해서 얻어진 11107D을 포함하는 분획에서 용매를 제거하여, 11107D 304mg을 수득하였다.

실시예 6(F-1529 균주와 F-1530 균주의 분리)

토양으로부터 분리한 균주의 편향배지(포테이토 덱스트로스 한천배지)에 적신 하나의 백금이로, 20ml의 종균배지(감자전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 인산제일칼륨 0.1%, 황산마그네슘 제7수화물 0.05%)이 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하고, 25℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또 종균배양액 0.6ml을 60ml의 생산배지(감자전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 인산제일칼륨 0.1%, 황산마그네슘 제7 수화물 0.05%)가 있는 500ml의 삼각플라스크에 넣고, 28℃에서 4일간 진탕 배양기로 배양하였다. 얻어진 배양액 2ml을 15ml 시험관에 나누어 주입하였다. 각각은 3000rpm으로 5분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 50mM 인산완충액(pH7.0) 2ml에 현탁하였다. 다음으로 기질인 11107B을 20mg/ml 디메틸설폭사이드 용액으로 제조하고, 각각에 0.05ml씩 첨가하였다. 첨가 후 28℃에서 23시간 흔들어, 수산화반응을 수행하였다. 반응 후, 실시예 4의 분석조건(c)으로 HPLC하여, 11107D의 피크가 나타나는 균주, F-1529 균주(FERM BP8547)과 F-1530 균주(FERM BP-8548)를 분리하였다.

실시예 7(플라스크 규모에서의 F-1529 균주에 의한 변환)

모르티에렐라 sp. F-1529 균주(FERM BP-8547)의 편향배지(포테이토 덱스트로즈 한천배지)에 적신 하나의 백금이로, 25ml의 종균배지(감자전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 인산제일칼륨 0.1%, 황산마그네슘 제7 수화물 0.05%)이 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하고, 25℃에서 2일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또 종균배양액 0.6ml을 60ml의 생산배지(감자전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 인산제일칼륨 0.1%, 황산마그네슘 제7 수화물 0.05%)가 있는 500ml의 삼각플라스크에 넣고, 25℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하였다.

얻어진 배양액(60ml/500ml 용량의 삼각플라스크, 18개)을 각각 3000rpm으로 5분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 50mM 인산완충액(pH7.0) 60ml에 현탁하였다. 다음으로 기질인 11107B을 100mg/ml 디메틸설폭사이드 용액으로 제조하고, 각각 0.6ml씩 첨가하였다. 첨가 후, 25℃에서 22시간 흔들어, 변환반응을 수행하였다. 반응종료 후, 5000rpm으로 20분간의 원심분리하여 여과액과 균체로 분리하였다. 상청액은 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 균체는 500ml의 아세톤으로 추출 후, 여과하여 아세톤 추출액을 수득하였다. 아세톤 추출액의 아세톤을 감압하에서 제거한 후, 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 각각의 에틸 아세테이트층을 수세하고, 무수황산나트륨으로 탈수건조후, 모두 모아 감압하에서 농축함으로써, 11107D을 포함하는 1.21g의 조분획을 수득하였다. 11107D을 포함하는 조분획을 실리카겔칼럼 크로마토그래피(Kiesel gel 60, 50g)에 흡착시키고, 에틸 아세테이트 및 n-헥산(90: 10; v/v) 혼합액 1200ml으로 용출시켜, 11107D을 포함하는 분획369mg을 수득하였다.

얻어진 분획을 실시예 4에 기재한 HPLC 분취조건(C)으로 분취용 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 흡착시키고, 11107D을 포함하는 용출 분획을 얻은 후, 용매를 제거함으로써, 11107D 180mg을 수득하였다.

실시예 8(플라스크 규모에서의 F-1530 균주에 의한 변환)

모르티에렐라 sp. F-1530 균주(FERM BP-8548)의 편향배지(포테이토 덱스트로즈 한천배지)에 적신 하나의 백금이로, 25ml의 종균배지(감자전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 인산제일칼륨 0.1%, 황산마그네슘 제7수화물 0.05%)이 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하고, 25℃에서 2일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또 종균배양액 0.6ml을 60ml의 생산배지(감자전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 대두가루(ESUSAN MEAT, Ajinomoto Co. Ltd.) 2.0%, 인산제일칼륨 0.1%, 황산마그네슘 제7수화물 0.05%)가 있는 500ml의 삼각플라스크에 넣고, 25℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하였다.

얻어진 배양액(60ml/500ml 용량의 삼각플라스크, 18개)을 각각 3000rpm으로 5분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 50mM 인산완충액(pH7.0) 60ml에 현탁하였다. 다음으로 기질인 11107B을 100mg/ml 디메틸설폭사이드 용액으로 제조하고, 각각 0.6ml씩 첨가하였다. 첨가 후, 25℃에서 22시간 흔들어, 변환반응을 수행하였다. 반응종료 후, 5000rpm으로 20분간의 원심분리하여 여과액과 균체로 분리하였다. 상청액은 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 균체는 500ml의 아세톤으로 추출 후, 여과하여 아세톤 추출액을 수득하였다. 아세톤 추출액을 감압하에서 아세톤을 제거한 다음, 1L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 각각의 에틸 아세테이트층을 수세하고, 무수황산나트륨으로 탈수건조후, 모두 모아 감압하에서 농축함으로써, 11107D을 포함하는 0.89g의 조분획을 수득하였다. 이 11107D을 포함하는 조분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Kiesel gel 60, 50g)에 흡착시키고, 에틸 아세테이트 및 n-헥산(90:10, v/v) 혼합액 1200ml과 이후 에틸 아세테이트 500ml으로 용출시켜, 11107D을 포함하는 조분획 163mg을 수득하였다. 얻어진 분획을 실시예 4에 기재한 HPLC 분취조건(C)으로 분취용 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 흡착시키고, 11107D을 포함하는 용출 분획을 얻은 후, 용매를 제거함으로써, 11107D 30mg을 수득하였다.

실시예 9(AB-1896 균주의 분리)

토양으로부터 분리한 균주의 편향배지(가용성 전분 0.5%, 글루코스 0.5%, 어육추출물(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 0.1%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.1%, NZ-카세(Humko Sheffield Chemical Co.) 0.2%, 염화나트륨 0.2%, 탄산칼슘 0.1%, 한천(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 1.6%에 적신 하나의 백금이로, 5ml의 종균배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%)이 있는 65ml의 시험관에 접종하여, 28℃에서 10일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또 종균배양액 0.1ml을 5ml의 생산배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%)가 있는 65ml의 시험관에 넣고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하였다. 다음으로 기질인 11107B을 40mg/ml 에탄올 용액으로 제조하고, 각각 0.05ml 씩 첨가하였다. 첨가 후, 28℃에서 24시간 흔들어, 수산화반응을 수행하였다. 반응 후, 하기의 분석조건(d)으로 HPLC하여, 11107D이 나타나는 균주, AB-1896 균주를 수득하였다.

HPLC 분석조건(d)

컬럼: UNISON UK-C18, φ 4.6mm x 50mm(Imtakt)

온도: 30℃

유속: 2ml/분

검출: 240nm

용출액: 물/아세토니트릴/포름산(1000:10:1 내지 10:1000:1, v/v/v, 0-4분, 직선 농도구배)

머무름시간: 11107D 2.5분

실시예 10(시험관 규모에서의 AB-1896 균주에 의한 변환)

AB-1896 균주의 편향배지(가용성 전분 0.5%, 글루코스 0.5%, 어육추출물(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 0.1%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.1%, NZ-카세(Humko Sheffield Chemical Co.) 0.2%, 염화나트륨 0.2%, 탄산칼슘 0.1%, 한천(Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) 1.6%)에 적신 하나의 백금이로, 5ml의 종균배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼 슘0.1%)이 있는 65ml의 시험관에 접종하여, 28℃에서 10일간 진탕 배양기로 배양하여 종균배양액을 수득하였다. 또 종균배양액 0.1ml을 5ml의 생산배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤(일본제약(주)) 0.5%, 효모추출물(Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%)가 있는 65ml의 시험관에 넣고, 28℃에서 3일간 진탕 배양기로 배양하였다.

얻어진 배양액(5ml/65ml 용량의 시험관, 하나)에 기질인 11107B을 40mg/ml 에탄올 용액으로 제조하고, 이를 0.05ml로 첨가하였다. 첨가 후, 28℃에서 24시간 흔들어, 수산화반응을 수행하였다. 얻어진 배양액을 3mlㅎ씩 나누고, 각각에 2ml의 1-부탄올을 첨가하여 흔든 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액은 제거하고, 잔류물은 2ml의 메탄올 용액로 제조한 다음 아래 HPLC 분석조건(e) 및 HPLC 분석조건(f)으로 HPLC를 수행하여, 반응혼합물내에 11107D이 생성되어 있음을 확인하였다.

HPLC 분석조건(e)

컬럼: UNISON UK-C18, φ 4.6 mmx 50mm(Imtakt)

온도: 40℃

유속: 2ml/분

검출: 240nm

용출액: 아세토니트릴/0.01% 트리플루오로아세트산(2:8 내지 5:5, v/v, 0-10분, 직선 농도구배)

머무름시간: 11107D 6.1분

HPLC 분석조건(f)

컬럼: UNISON UK-C18, φ 4.6mm x 50mm(Imtakt)

온도: 40℃

유속: 2ml/분

검출: 240nm

용출액: 메탄올/0.01% 트리플루오로아세트산(4:6 내지 7:3, v/v, 0-10분, 직선 농도구배)

머무름시간: 11107D 6.1분

SEQUENCE LISTING <110> MERCIAN CORPORATION Eisai Co., Ltd. <120> Process for producing macrolide compounds <130> 03074PCT <160> 11 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gtagtcatat gcttgtct 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 gcaagtctgg tgccagcagc c 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 aacttaaagg aattgacgga ag 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gaggcaataa caggtctgtg atg 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 cgttcagacc acggtcgtcg g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ttgaatttcc ttaactgcct tc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ctccgttatt gtccagacac tac 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 aggcatccac ttggacgcct 20 <210> 9 <211> 1733 <212> DNA <213> Mortierella sp. F-1529 <400> 9 aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa acaactttgt actgtgaaac tgcgaatggc 60 tcattaaatc agttatagtt tatttgatta taccttacta cttggataac cgtggtaatt 120 ctagagctaa tacatgctaa aaatcccgac ttctggaagg gatgtattta ttagataaaa 180 aaccaatgcg ggcaaccgct tttctggtga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct 240 tgtgctagcg atgtttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg 300 cctaccatgg ttttaacggg taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga 360 gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgatacgg 420 ggaggtagtg acaataaata acaatacagg gctttatagt cttgtaattg gaatgagtac 480 aatttaaatc tcttaacgag gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta 540 attccagctc caatagcgta tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaattt 600 taggtctggt tggacggtct gctctctagg gtttgtactg tcctgaccgg gccttacctt 660 ctggtgagct gtcgtgttgt ttactcagtg cggcagggaa ccaggacttt tactttgaaa 720 aaattagagt gtttaaagca ggcattcgct tgaatacatt agcatggaat aatagaatag 780 gactttggtt ctattttgtt ggtttctagg accgaagtaa tgattaatag ggatagttgg 840 gggcattagt atttaattgt cagaggtgaa attcttggat ttattaaaga ctaacttctg 900 cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac 960 gatcagatac cgtcgtagtc ttaaccataa actatgccga ctagggatca ggcaaggata 1020 ttttgacttg tttggcacct tatgagaaat caaagttttt gggttccggg gggagtatgg 1080 tcgcaaggct gaaacttaaa ggaattgacg gaagggcacc accaggagtg gagcctgcgg 1140 cttaatttga ctcaacacgg ggaaactcac caggtccaga catagtaagg attgacagat 1200 tgagagctct ttcttgattc tatgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg 1260 atttgtctgg ttaattccgt taacgaacga gaccttaacc tgctaaatag ttaggtcaac 1320 gattgttgat cgtcaacttc ttagagggac tattgactat tagtcaatgg aagtttgagg 1380 caataacagg tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgatcaa 1440 gtcaacgagt ttacaacctt ggccggaagg tctgggtaat cttttgaaac ttgatcgtgc 1500 tggggatagt ccattgcaat tattggactt caacgaggaa ttcctagtaa gcgtgagtca 1560 tcagctcgcg ttgattacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt 1620 gaatggctta gtgaggcttt cggattggac tttggcagct ggcaacagca gctagggact 1680 gaaaagtcat ccaaacttgg tcatttagag gaagtaaaag tcgtaacaag gtt 1733 <210> 10 <211> 1731 <212> DNA <213> Mortierella sp. F-1530 <400> 10 aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa acaactttgt actgtgaaac tgcgaatggc 60 tcattaaatc agttatagtt tatttgatta taccttacta cttggataac cgtggtaatt 120 ctagagctaa tacatgctaa aaatcccgac ttctggaagg gatgtattta ttagataaaa 180 aaccaatgcg ggcaaccgct tttctggtga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct 240 tgtgctagcg atgtttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg 300 cctaccatgg ttttaacggg taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga 360 gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgatacgg 420 ggaggtagtg acaataaata acaatacagg gctttatagt cttgtaattg gaatgagtac 480 aatttaaatc tcttaacgag gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta 540 attccagctc caatagcgta tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaattt 600 taggcctggt tggacggtct gctctagggt ttgtactgtc ctgactgggt cttaccttct 660 ggtgagctgt cgtattgttt actcagtgcg gcagggaacc aggactttta ctttgaaaaa 720 attagagtgt ttaaagcagg cattcgcttg aatacattag catggaataa tagaatagga 780 ctttggttct attttgttgg tttctaggac cgaagtaatg attaataggg atagttgggg 840 gcattagtat ttaattgtca gaggtgaaat tcttggattt attaaagact aacttctgcg 900 aaagcatttg ccaaggatgt tttcattaat caagaacgaa agttagggga tcgaagacga 960 tcagataccg tcgtagtctt aaccataaac tatgccgact agggatcagg caaggatatt 1020 ttgacttgtt tggcacctta tgagaaatca aagtttttgg gttccggggg gagtatggtc 1080 gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggagtgga gcctgcggct 1140 taatttgact caacacgggg aaactcacca ggtccagaca tagtaaggat tgacagattg 1200 agagctcttt cttgattcta tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttg gtggagtgat 1260 ttgtctggtt aattccgtta acgaacgaga ccttaacctg ctaaatagtt aggccaacgt 1320 ttgttggtcg tcaacttctt agagggacta ttgactatta gtcaatggaa gtttgaggca 1380 ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgatcaagt 1440 caacgagttt acaaccttgg ccggaaggtc tgggtaatct tttgaaactt gatcgtgctg 1500 gggatagtcc attgcaatta ttggacttca acgaggaatt cctagtaagc gtgagtcatc 1560 agctcgcgtt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga 1620 atggcttagt gaggctttcg gattggactt tggcagctgg caacagcagc tagggactaa 1680 aaagtcatcc aaacttggtc atttagagga agtaaaagtc gtaacaaggt t 1731 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 11 gtgtttgatc ctggctcag 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gtattaccgc ggctgctg 18 <210> 13 <211> 414 <212> DNA <213> AB-1896 <400> 13 gtcgagcgga aggcccttcg gggtactcga gcggcgaacg ggtgagtaac acgtgagcaa 60 cctgccctag gctttgggat aaccccggga aaccggggct aataccgaat atgacttctg 120 gtcgcatgac cggtggtgga aagtttttcg gcctgggatg ggctcgcggc ctatcagctt 180 gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg 240 ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 300 acaatgggcg gaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta 360 aacctctttc agcagggacg aagcgtaagt gacggtacct gcagaagaag cgcc 414

Claims (7)

  1. 생물학적 변환에 의해 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B로부터 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D을 제조하는 방법으로서,
    (A) 상기 생물학적 변환을 수행할 수 있는, 모르티에렐라(Mortierella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 또는 마이크로모노스포라세아(Microomonosporaceae) 과에 속하는 균주, 또는 그것의 배양된 균체의 제조물 존재 하에, 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B를 배양하는 단계; 및
    (B) 단계(A)로부터 수득한 배양물로부터 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D을 수득하는 단계;
    를 포함하는 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D의 제조방법:
    (화학식 1)
    (화학식 2)
  2. 제 1항에 있어서, 상기 모르티에렐라 속에 속하는 균주는 모르티에렐라 sp.F-1529(FERM BP-8547) 균주 또는 모르티에렐라 sp.F-1530(FERM BP-8548)균주인 것을 특징으로 하는 매크로라이드계 화합물 11107D의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주는 스트렙토마이세스 sp.AB-1704(FERM BP-8551) 균주, 스트렙토마이세스 sp.A-1544(FERM BP-8446) 균주 또는 스트렙토마이세스 sp.A-1545(FERM BP-8447) 균주인 것을 특징으로 하는 매크로라이드계 화합물 11107D의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로모노스포라세아 과에 속하는 균주는 AB-1896 균주(FERM BP-8550)균주인 것을 특징으로 하는 매크로라이드계 화합물 11107D의 제조방법.
  5. 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B을 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D로 변환시키는 능력을 가진 스트렙토마이세스 sp. AB-1704 (FERM BP-8551).
  6. 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B을 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D로 변환시키는 능력을 가진 모르티에렐라 sp.F-1529(FERM BP-8547) 또는 모르티에렐라 sp.F-1530(FERM BP-8548).
  7. 화학식 1로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107B을 화학식 2로 표시되는 매크로라이드계 화합물 11107D로 변환시키는 능력을 가진 AB-1896(FERM BP-8550).
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