MXPA05005672A - Metodo para producir un compuesto a macrolido. - Google Patents
Metodo para producir un compuesto a macrolido.Info
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Abstract
La presente invencion proporciona un nuevo metodo para producir el compuesto macrolido 11107D con un anillo de 12 miembros que tiene una actividad antitumoral por transformacion biologica. El material de partida que es el compuesto macrolido 11107B con un anillo de 12 miembros representado por la formula (I) se incuba en presencia de una cepa que pertenece al genero Mortierella, el genero Streptomyces o la familia Micromonosporaceae (por ejemplo, cepa AB-1704 de Streptomyces sp. (FERM BP-8551)), cada una de las cuales tiene la capacidad de transformar el compuesto macrolido 11107B con un anillo de 12 miembros en una sustancia 11107D representada por la formula (II), o una preparacion de sus micelios cultivados y oxigeno, y despues se recoge la sustancia 11107D que es un material diana de la solucion de tratamiento. (ver formula (I,II)).
Description
(74) {¾3?: "?^ , *1-(FURUYA,Satoshi etal.); Tl03- (84) ÍB¾11 ARPO Vf (BW, GH, GM, KE, LS, 0007 ¾S¾ F^? B*?f^ffll2-n 7-8 SBlTtfi MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), 3.— 5 V 7 tf JU 6 m Tokyo (JP). If (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), 3 - ? tV&^t (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, ??, IT, LU, MC, NL, PT, RO, SE, SI, SK,
(81) (? f¾ ): AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, TR), OAPI féfF (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ,
BG, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). DK, DM, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, MR, HU, ID, IL, IN, 1S, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, K, M , M , X, MZ, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, KO, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SY, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UO, US, UZ, VC, VN, YU, ZA, ZM, ZW.
(57) SiSS:
^^?^d?-?^-?^?--^ (Mortierella) S, ^ M^7° ¾ "fe^. (Streptomyces) (Micrononosporaceae) (fSIxJÍ t°— (Streptomyces sp. ) AB-1704¾(FERM BP-8551)), * ^:©¾Ei¾á:'¾Sé¾fe-r'¾>5in07D#)¾¾r» -¾l,
(?) MÉTODO PARA PRODUCIR UN COMPUESTO MACRÓLIDO
Campo Técnico La presente invención se refiera a un método para producir un compuesto macrólido 11107D con un anillo de 12 miembros que tiene una actividad antitumoral mediante transformación biológica y a una nueva cepa usada para la producción. Técnica Antecedente El compuesto macrólido 11107D con un anillo de 12 miembros es un compuesto macrólido con un anillo de 12 miembros que tiene una actividad antitumoral excelente y se descubrió junto con una sustancia 11107B a partir de un producto de cultivo de la cepa Mer-11107 de Streptomyces sp . (véase el documento WO-A02/060890) . La sustancia 11107D corresponde a un cuerpo hidróxido en posición 16 del 11107B. La productividad de la sustancia 11107D es inferior a la de la sustancia 11107B y por lo tanto se desea establecer un método de producción eficaz . Descripción de la Invención El propósito de la presente invención es proporcionar un nuevo método para producir el compuesto macrólido 11107D usando el compuesto macrólido 11107B como material de partida mediante un método de transformación biológica. Se ha preparado un ensayo para seleccionar microorganismos capaces de transformar el átomo de hidrógeno de la posición 16 en el grupo hidroxilo del compuesto macrólido 11107B seleccionando entre una gran variedad de grupos de microorganismos para resolver el problema anterior, y como resultado, han descubierto que la cepa que pertenece al género Mortierella clasificada en los hongos filamentosos, una cepa que pertenece al género Streptomyces clasificada en actinomicetes y una cepa que pertenece a la familia Micromonosporaceae que se clasifica igualmente en actinomicetes tiene la función de transformación mencionada anteriormente, para completar la invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere a lo siguiente (1) a (3) . (1) Un método para producir el compuesto macrólido 11107D representado por la fórmula (II) :
(II) donde el compuesto macrólido 11107D se produce a partir del compuesto macrólido 11107D representado por la fórmula (I) :
mediante un método de transformación biológica, que comprende los siguientes procesos (A) y (B) : (A) un proceso de incubación del compuesto macrólido 11107B representado por la fórmula (I) en presencia de una cepa que tiene capacidad de realizar el método de transformación biológica mencionado anteriormente y que pertenece al género Mortierella, el género Streptomyces o a la familia Micromonosporaceae o una preparación de sus micelios cultivados; y (B) un proceso de recogida del compuesto macrólido 11107D representado por la fórmula (II) a partir de la solución incubada obtenida en la etapa (A) . (2) El método de producción de acuerdo con la etapa anterior (1) , donde la cepa que pertenece al género Mortierella es la cepa F-1529 (FERM BP-8547) o la cepa F-1530 (FERM BP-8548) de Mortierella sp. (3) El método de producción de acuerdo con la etapa anterior (1) , donde la cepa que pertenece al género Streptomyces es la cepa AB-1704 (FERM BP-8551) , la cepa A-1544 (FERM BP-8446) o la cepa A-1545 (FERM BP-8447) .de Streptomyces s . (4) El método de producción de acuerdo con la etapa (1) anterior, donde la cepa que pertenece a la familia Micromonosporaceae es la cepa AB-1896 (FERM BP-8550) . (5) La cepa AB-1704 (FERM BP-8551) de Streptomyces sp. que tiene la capacidad de transformar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) en el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) . (6) La cepa F-1529 (FERM BP-8547) o la cepa F-1530 (FERM BP-8548) de Mortierella sp . que tiene la capacidad de transformar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) en el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) . (7) La cepa AB-1896 (FERM BP-8550) que tiene la capacidad de transformar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) anterior en el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) anterior. Descripción Detallada de la Invención En el método de transformación biológica de la presente invención, puede usarse cualquier microorganismo que pertenece al género Mortierella, el género Streptomyces o la familia Micromonosporaceae independientemente del tipo de especie de cepa, siempre y cuando tenga la capacidad para transformar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) anterior en el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) anterior. Sin embargo, los ejemplos preferibles de los microorganismos pueden incluir la cepa F-1529 y la cepa F-1530 de Mortierella sp . que pertenecen al género Mortierella, la cepa AB-1704, la cepa A-1544 y la cepa A-1545 de Streptomyces sp . que pertenecen al género Streptomyces y la cepa AB-1896 que pertenece la familia Micromonosporaceae , cada una habiéndose asilado del suelo . La cepa er-11107 se depositó como FERM P-18144 en el
National Institute of Bioscience and Human- echnology Agency of Industrial Science and Technology (1-3 Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) , que ahora se ha reorganizado a Depósito Internacional FEMR BP-7812 en el International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón), el 19 de diciembre de 2000, y se transfirió después al Depósito Internacional FERM BP-7812 en el International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advance Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 27 noviembre de 2001. La cepa F-1529 de Mortierella sp . se depositó internacionalmente en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 12 de noviembre de 2004 como FERM BP-8547. Además, la cepa F-1530 de Mortierella sp . se depositó internacionalmente en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 12 de noviembre de 2003 como FERM BP-8548.
La cepa AB-1704 de Streptomyces sp. se depositó en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higas i 1-Chome, Tsukuba- shi , Ibaraki-ken 305-8566 Japón) como FERM P-18999 el 5 de septiembre de 2002, y después se transfirió al Depósito Internacional FERM BP-8551 el 12 de noviembre de 2003 en el International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) . Además, la cepa A-1544 y la cepa A-1545 se depositaron en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 30-8566 Japón) como FERM P-18943 y FERM P-18944 el 23 de Julio de 2002, y después se trasfirieron al Depósito Internacional FERM BP-8446 y FERM BP-8447 el 30 de Julio de 2003, respectivamente, en el International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) . La cepa AB-1896 que pertenece a la familia Micromonosporaceae se deposito internacionalmente en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) como FERM-BP 8550 el 12 de noviembre de 2003.
Las propiedades taxonómicas de las cepas anteriores son las siguientes .
(Las propiedades taxonómicas de la cepa F-1529) (1) Características morfológicas En cada placa de agar de harina de avena (que en lo sucesivo se abreviará como OA según el caso) , agar de malta (extracto de malta al 2% + agar al 1,5%: que en lo sucesivo se abreviará como MEA según el caso) y agar de dextrosa de patata (que se abreviará en lo sucesivo como PDA según el caso) , la colonia tubo una forma floculosa y el color de las hifas fue blanco, mostrando un tono blanco (1A-1) . En cuanto al crecimiento cuando la cepa se cultivó a 25 °C durante una semana, las colonias alcanzaron los 75 mm de diámetro en la placa OA, 75 a 80 mm de diámetro en la placa MEA y 75 a 80 mm de diámetro en la placa PDA. La colonia tuvo una forma en bandas . No se observó coloración de fondo ni producción de pigmento soluble. El tono de color se describió de acuerdo con "Methuen Handbook of Colour (Komerup & Wanscher, 1978)".
Como resultado de la observación usando un microscopio óptico, las hifas vegetativas fueron incoloras, tuvieron una superficie lisa, se suministraron sin septo y tuvieron una anchura de 4 a 5 µt?. Se observó una estructura hinchada como la de una espora de pared gruesa que tiene una forma esférica y un tamaño de aproximadamente 26,5 a 33 µtt? en parte de la hifa. En los medios del cultivo a someter a ensayo, no se formó ninguna estructura que parezca ser un órgano genital, incluso cultivando durante un tiempo que no excedió de tres semanas . (2) Análisis del gen del ARNr 18S Se sometieron a extracción de ADN unos micelios de la cepa F-1529 cultivados en una placa de agar usando Fast Prep FP120 (fabricado por Q-BIO gene) y el kit Fast DNA (fabricado por Q-BIO gene) . Se practicó la PCR usando perlas de PCR puRetaq Ready-To-Go (fabricado por Amersham Biosciences) y los cebadores de PCR NSl y NS8 mostrados en las Tablas 1 y 2. Los productos de PCR se purificaron usando el Kit de Purificación de PRC QIAquxck (fabricado por QIAGEN) y después se trataron con el Kit ABI Prism BigDye Terminator (fabricado por Applied Biosystems) . Como cebadores de secuenciación se usaron NSl, NS2, NS3 , NS4, NS5, NS6, NS7 y NS8 mostrados en las Tablas 1 y 2. Los productos de reacción se purificaron usando un Kit Dye EX 2.0 Spin (fabricado por QIAGEN) y se sometieron a análisis de secuencia usando un Analizador Genético ABI PRISM 3100 (fabricado por Applied Biosystems) . Después, los fragmentos secuenciados se combinaron entre si usando un Auto Assembler (fabricado por Applied Biosystems) para obtener la secuencia de nucleótidos de longitud completa . Tabla 1 Cebadores usados para determinar la secuencia de nucleótidos del gen del ARNr 18S (dirección directa)
Tabla 2 Cebadores usados para determinar la secuencia de nucleótidos del gen del ARNr 18S (dirección inversa) N° de Nombre Secuencia secuencia 5 NS2 5' -cgttcagaccacggtcgtcgg-3 ' 6 NS4 5' -ttgaatttccttaactgccttc-3 ' 7 NS6 5 ' -ctccgttattgtccagacactac-3 ' 8 NS8 5' -aggcatccacttggacgcct-3 ' gen del ARNr 18S obtenido de este modo de la cepa secuencia de nucleótidos descrita en la secuencia N° La secuencia de ADN de una cepa conocida se obtuvo del Japan DNA Data Bank (http://www.ddbj .nig.ac.jp/) para examinar la homología de los genes del ARNr 18S. Como resultado, este gen del ARNr 18S tubo una homología del 99% (803 bases cadena arriba) con el gen del ARNr 18S de Mortierella hyalina (N° de acceso a GenBank ??157493), una homología del 98% (longitud completa) con el gen del ARNr 18S de Mortierella chlamydospora (N° de acceso a GenBank AF157143) y una homología del 98% (longitud completa) con el gen del ARNr 18S de Mortierella multidivaricata (N° de acceso a GenBank AF157144) . De las propiedades micológicas anteriores, se determinó que esta cepa pertenece al género Mortierella. Propiedades taxonómicas de la cepa F-1530 (1) Características morfológicas En cada placa de agar de harina de avena, agar de malta y agar de dextrosa de patata, la colonia tuvo una forma algodonosa y el color de las hifas fue blanco, mostrando un tono blanco (1A-1) . En cuando al crecimiento cuando la cepa se cultivó a 25 °C durante una semana, la cepa alcanzó de 80 a 85 mm de diámetro en la paca OA, 85 mm de diámetro en la placa MEA y 85 mm de diámetro en la placa PDA. La colonia tuvo una forma en bandas . No se observó coloración de fondo ni producción de pigmento soluble. El tono de color se describió de acuerdo con "Methuen Handbook of Colour (Kornerup & Wanscher, 1978)". Como resultado de la observación usando un microscopio óptico, las hifas vegetativas fueron incoloras, tenían una superficie lisa, se suministraron sin septo y tuvieron un ancho de 2,5 a 5 µt?. Se observa una estructura hinchada como la de una espora de pared gruesa, que tiene una forma esférica y un tamaño de aproximadamente 10 µ?t?, en una parte de la hifa. En los medios de cultivo a someter a ensayo, no se formó ninguna estructura que parezca ser un órgano genital incluso cultivando durante un tiempo que no excedió de tres semanas . (2) Análisis del gen del ARNr 18S El gen del ARNr 18S de la cepa F-1530 se analizó del mismo modo que en el caso de la cepa F-1529. El gen del ARNr 18S obtenido de este modo de la cepa F-1530 tubo una secuencia de nucleótidos descrita en la secuencia N° 10. La secuencia de ADN de una cepa conocida se obtuvo del Japan DNA Data Bank (http://www.ddbj .nig.ac.jp/) para examinar la homología de los genes del ARNr 18S. Como resultado, este gen del ARNr 18S tubo una homología del 100% (803 bases cadena arriba) con el gen del ARNr 18S de Mortierella hyalina (N° de acceso de GenBank AY157493) , una homología del 98% (longitud completa) con el gen del ARNr 18S de Mortierella chlamydospora (N° de acceso a GenBank AF157143) y una homología del 98% (longitud completa) con el gen del ARNr 18S de Mortierella multidivaricata (N° de acceso a GenBank AF157144) . De las características microbianas mencionadas anteriormente, se determinó que la presente cepa pertenece al género Mortierella. (Las propiedades taxonómicas de la cepa AB-1704) (1) Características morfológicas Las hifas aéreas de tipo rectiflexibles se prolongaron desde las hifas vegetativas en esta cepa. Las cadenas de esporas que constan de aproximadamente 20 a 50 esporas cilindricas se formaron en el extremo de las hifas aéreas maduras. El tamaño de las esporas fue aproximadamente de 0,6 a 0,8 x 1,0 a 1,1 µt?, la superficie de las esporas fue lisa, y no se observaron órganos específicos tales como esporangio, esclerotio y flagelo. (2) Características en cultivo en diversos medios. Las características en cultivo de la cepa después de incubación a 28 °C durante dos semanas en diversos medios se muestran en la Tabla 3. El tono del color se describe por los nombres de color y códigos que se muestran en paréntesis de ruedas de Color de Tresner.
Tabla 3
Utilización de diversas fuentes de carbono Se añadieron diversas fuentes de carbono a agar Pridham- Gottlieb y se cultivaron a 28 °C durante 2 semanas. El crecimiento de la cepa se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4
(+: positivo, ±: ligeramente positivo, -: negativo) (4) Diversas propiedades fisiológicas Las diversas propiedades fisiológicas de la presente cepa son las siguientes . (a) Intervalo de temperatura de crecimiento (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) 5°C a 33 °C. (b) Intervalo de temperatura de crecimiento óptimo (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante
2 semanas) 15 °C a 33 °C. (c) Licuefacción de gelatina (medio de glucosa-peptona- gelatina) positivo. (d) Coagulación de leche (medio de leche desnatada) positivo. (e) Peptonización de leche (medio de leche desnatada) positivo . (f) Hidrólisis de almidón (agar de sales inorgánicas- almidón) positivo . (g) Formación de pigmento melanoide (agar de peptona- extracto de levadura-hierro) negativo, (agar de tirosina) negativo . (h) Producción de sulfuro de hidrógeno (agar de peptona- extracto de levadura-hierro) negativo.
(i) Reducción de nitrato (caldo que contiene nitrato potásico al 0,1%) positivo. ( ) Tolerancia al cloruro sódico (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) crecido a un contenido salino del 7% o menos. (5) Quimiotaxonomía Se detectó ácido LL-diaminopimélico de la pared celular de la presente cepa. De las características microbianas mencionadas anteriormente, se determinó que la presente cepa pertenece al género Streptomyces . (Las propiedades taxonómicas de la cepa A-1544) (1) Características morfológicas Las hifas aéreas de tipo rectiflexibles se prolongaron desde las hifas vegetativas en esta cepa. Las cadenas de esporas que constan de aproximadamente 10 a 20 esporas cilindricas se formaron en el extremo de las hifas aéreas maduras. El tamaño de las esporas fue aproximadamente 1,0 x
1,2 a 1,4 µ?t?, la superficie de las esporas fue espinosa, y no se observaron órganos específicos tales como esporangio, esclerotio y flagelo. (2) Características en cultivo en diversos medios Las características en cultivo de la cepa después de incubación a 28 °C durante dos semanas en diversos medios se muestran en la Tabla 5. El tono de color se describe por los nombres de color y códigos que se muestran en paréntesis de las ruedas de Color de Tresner. Tabla 5 Medio Crecimiento Hifas aéreas Color de las hifas Pigmento vegetativas soluble
Agar de extracto Bueno Gruesas Amarillo melón Ninguno de levadura- Gris plata claro extracto de malta (3fe) (3ea) (ISP-2) Agar de harina de Bueno Abundantes Amarillo melón Ninguno avena Gris claro- claro (ISP-3) Gris plata (d- (3ea) 3fe)
Agar de sales Bueno Abundantes Amarillo melón Ninguno inorgánicas- Gris plata claro almidón (3fe) (3ea) (ISP-4) Agar de glicerol- Bueno Abundantes Amarillo melón Ninguno asparagina Ceniciento claro (ISP-5 (5fe) (3ea) Agar de peptona- Bueno Ninguno Amarillo melón Marrón extracto de claro negruzco levadura-hierro (3ea) pálido (ISP-6) Agar de tirosina Bueno Abundantes Amarillo melón Ninguno (ISP-7) Gris claro disimulado (3ea) (2fe) Utilización de diversas fuentes de carbono Se añadieron diversas fuentes de carbono a agar Prxdham-Gottlieb y se cultivaron a 28°C durante 2 semanas. El crecimiento de la cepa se muestra en la Tabla 6. Tabla 6
positivo, -: negativo) (4) Diversas propiedades fisiológicas Las diversas propiedades fisiológicas de la presente cepa son las siguientes . (a) Intervalo de temperatura de crecimiento (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) 15 °C a 41 °C (b) Intervalo de temperatura de crecimiento óptimo (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) 20 °C a 37 °C (c) Licuefacción de gelatina (medio de glucosa-peptona- gelatina) positivo (d) Coagulación de leche (medio de leche desnatada) positivo (e) Peptonización de leche (medio de leche desnatada) positivo (f) Hidrólisis de almidón (agar de sales inorgánicas- almidón) positivo (g) Formación de pigmento melanoide (agar de peptona- extracto de levadura-hierro) positivo, (agar de tirosina) negativo (g) Producción de sulfuro de hidrógeno (agar de peptona-extracto de levadura-hierro) positivo (i) Reducción de nitrato (caldo que contiene nitrato potásico al 0,1%) negativo (j ) Tolerancia al cloruro sódico (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante dos semanas) crecido a un contenido salino del 7% o menos (5) Quimiotaxonomía Se detectó ácido LL-diaminopimélico de la pared celular de la presente cepa. De las características microbianas mencionadas anteriormente, se determinó que la presente cepa pertenece al género Streptomyces . (Las propiedades taxonómicas de la cepa ?-1545) (1) Características morfológicas Las hifas aéreas de tipo rectiflexibles se prolongaron desde las hifas vegetativas en esta cepa. Las cadenas de esporas que constan de aproximadamente 50 esporas se formaron en el extremo de las hifas aéreas maduras. El tamaño de las esporas fue aproximadamente 0,8 x 1,0 µ??, la superficie de las esporas fue lisa, y no se observaron órganos específicos tales como esporangio, esclerotio y flagelo. (2) Características en cultivo en diversos medios Las características en cultivo de la cepa después de incubación a 28 °C durante dos semanas en diversos medios se muestran en la Tabla 7. El tono de color se describe por los nombres de color y códigos que se muestran en paréntesis de ruedas de color de Tresner. Tabla 7 Medio Crecimiento Hifas aéreas Color de las hifas Pigmento vegetativas soluble
Agar de extracto Bueno Abundantes Amarillo melón Ninguno de levadura- Rosa claro-marrón extracto de malta amarillento desnudo (ISP-2) grisáceo (5cb) (3ea-4gc) Agar de harina Moderado Finas Rosa perlado Ninguno de avena (ISP-3) Rosa (3ca) amarillento grisáceo (5cb) Agar de sales Bueno Finas Marfil claro Ninguno inorgánicas- Rosa (2ca) almidón (ISP-4) amarillento grisáceo (5cb) Agar de glicerol- Bueno Abundantes Rosa perlado Ninguno asparagina Rosa (3ca) (ISP-5) amarillento grisáceo (5cb) Agar de peptona- Moderado Ninguno Amarillo melón Ninguno extracto de claro levadura-hierro (3ea) (ISP-6) Agar de tirosina Bueno Abundantes Amarillo melón Ninguno (ISP-7) Rosa claro amarillento (3ea) grisáceo (5cb) Utilización de diversas fuentes de carbono Se añadieron diversas fuentes de carbono a agar Pridham-Gottlieb y se cultivaron a 28 °C durante 2 semanas. El crecimiento de la cepa se muestra en la Tabla 8. Tabla 8
positivo, +: ligeramente positivo, -: negativo) (4) Diversas propiedades fisiológicas Las diversas propiedades fisiológicas de la presente cepa son las siguientes . (a) Intervalo de temperatura de crecimiento (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) 10°C a 37 °C (b) Intervalo de temperatura de crecimiento óptimo (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) 20°C a 33°C (c) Licuefacción de gelatina (medio de glucosa-peptona- gelatina) negativo (d) Coagulación de leche (medio de leche desnatada) positivo (e) Peptonización de leche (medio de leche desnatada) positivo (f) Hidrólisis de almidón (agar de sales inorgánicas- almidón) positivo (g) Formación de pigmento melanoide (agar de peptona- extracto de levadura-hierro) negativo, (agar de tirosina) negativo (h) Producción de sulfuro de hidrógeno (agar de peptona-extracto de levadura-hierro) positivo (i) Reducción de nitrato (caldo que contiene nitrato potásico al 0,1%) negativo ( ) Tolerancia al cloruro sódico (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) crecido a un contenido salino del 7% o menos (5) Quimiotaxonomía Se detectó ácido LL-diaminopimélico de la pared celular de la presente cepa. De las características microbianas mencionadas anteriormente, se determinó que la presente cepa pertenece al género Streptomyces . (Propiedades taxonómicas de la cepa AB-1896) (1) Características morfológicas La cepa AB-1896 mostró crecimiento bueno o moderado en los medios de cultivo usados para identificar la cepa a 28 °C durante 7 a 14 días . No se observaron hifas durante los cultivos y se observó una espora en cada hifa vegetativa. La espora tenía una forma esférica y el tamaño de la misma fue aproximadamente 0,8 a 0,9 µ??, y la superficie de las esporas fue rugosa . No se observaron órganos específicos tales como esporangio, esclerotio y flagelo. (2) Características en cultivo en diversos medios Las características en cultivo de la cepa después de incubación a 28 °C durante dos semanas en diversos medios se muestran en la Tabla 9. El tono de color se describe por los nombres de color y códigos que se muestran en paréntesis de las ruedas de Color de Tresner. Tabla 9 Medio Crecimiento Color de las hifas Pigmento soluble vegetativas Agar de extracto Bueno Bizcocho Ninguno de levadura- Berver (3li) (3ec) extracto de malta (ISP-2) Agar de harina de Moderado Amarillo melón Ninguno avena Marrón corcho claro (ISP-3) (4ie) (3ea) Agar de sales Bueno Amarillo melón Ninguno inorgánicas- Berver (3li) claro almidón (ISP-4) (3ea) Agar de glicerol- Moderado Rosa perlado Ninguno asparagina Gris apagado (3ca) (ISP-5) oliva claro (1li) Agar de peptona- Bueno Amarillo melón Ninguno extracto de Berver (3li) claro levadura-hierro (3ea) (IPS-6) Agar de tirosina Moderado Rosa perlado Ninguno (ISP-7) Gris oliva claro (3ca) (1 1/2ge) (3) Utilización de diversas fuentes de carbono Se añadieron diversas fuentes de carbono a agar Pridham-Gottlieb y se cultivaron a 28°C durante 2 semanas. El crecimiento de la cepa se muestra en la Tabla 10.
Tabla 10
positivo, -: negativo) (4) Diversas propiedades fisiológicas Las diversas propiedades fisiológicas de la presente cepa son las siguientes . (a) Intervalo de temperatura de crecimiento (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) 20°C a 41 °C (b) Intervalo de temperatura de crecimiento óptimo (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante
2 semanas) 25°C a 37°C (c) Licuefacción de gelatina (medio de glucosa-peptona- gelatina) negativo (d) Coagulación de leche (medio de leche desnatada) positivo (e) Peptonización de leche (medio de leche desnatada) positivo (f) Hidrólisis de almidón (agar de sales inorgánicas- almidón) positivo (g) Formación de pigmento melanoide (agar de peptona- extracto de levadura-hierro) negativo, (agar de tirosina) negativo (h) Producción de sulfuro de hidrógeno (agar de peptona- extracto de levadura-hierro) negativo (i) Reducción de nitrato (caldo que contiene nitrato potásico al 0,1%) positivo (j ) Tolerancia al cloruro sódico (agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubación durante 2 semanas) no crecido a un contenido salino del 4% (5) Quimiotaxonomía Se detectó ácido diaminopimélico tipo meso de la pared celular de la cepa AB-1896. Se detectaron como azúcares estructurales principales de todos los micelios, xilosa y mañosa. El tipo de acilo en el glicano peptídico de la pared celular fue un tipo glicólico. No se detectó ácido micólico. Como componentes de menaquinona principales, se detectaron MK-9 (H4) , MK-9 (H6) , MK-10 (H4) y MK-10 (H6) . (6) Análisis del gen del ARNr 16S Se recogió un caldo de cultivo de la cepa AB-1896 y se sometió a extracción de ADN usando el kit Fast DNA (fabricado por Q-BIO gene) . La PCR se realizó en unas condiciones de reacción de 96°C/20 segundos, 50°C/20 segundos y 72°C/un minuto en 30 ciclos en total. Como cebadores, se usaron 9F (5 ' -GTGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' ) (secuencia N° 11) y 536R (5'-GTATTACCGCGGCTGCTG-3 ' ) (secuencia N° 12). El producto de PCR se purificó usando un Kit de Purificación de PCR MinElute (fabricado por QIAGEN) para proporcionar una muestra de secuenciación . La secuenciación se realizó usando un Analizador
Genético ABI PRISM 310 (fabricado por Applied Biosystems) y un kit BigDye Terminator de acuerdo con sus protocolos convencionales. Como cebadores, se usaron 9F y 536R. Se describe en la secuencia N° 13 la secuencia de aproximadamente 500 nucleótidos obtenidos de este modo en el extremo terminal 5 'del gen del ARNr 16S de la presente cepa.
Las secuencias de ADN de cepas conocidas se obtuvieron del Japan DNA Data Bank (http://www.ddbj .nig.ac.jp/) para examinar la homología de 400 a 500 bases en el extremo terminal 5' de los genes del ARNr 16S. Como resultado, este gen del ARNr 16S tuvo una homología del 98% con el gen del ARNr 16S de DSM44396 de Mxcromonospora sp. (N° de acceso a GenBank AJ5S0637) , una homología del 98% con un gen de Mxcromonospora purpureochromogenes (N° de acceso a GenBank X92611) , una homología del 95% con un gen de IF012135 de M. Chalcea (N° de acceso a GenBank D85489) que es un tipo de cepa del género Mxcromonospora y una homología del 95% con un gen de Verrucosispora gifhornensis (N° de acceso a GenBank ?15523) que es un tipo de cepa del género "Verrucosispora. Aunque la cepa AB-1896 tiene casi las mismas características que el género Micromonospora, se corresponde de manera imperfecta con el género Micromonospora en la cualidad de que no se detecta arabinosa pero se detecta mañosa como azúcar estructural principal de todos los micelios. Además, la cepa AB-1896 no se corresponde perfectamente con el género Verrucosispora en la cualidad de que no se observaron las esporas peculiares de Verrucosispora gifhornensis en el medio usado para identificar la cepa. Se decidió que la cepa AB-1896 es actinomicetes que pertenece a la familia Micromonosporaceae con respecto a las propiedades taxonómicas anteriores . De acuerdo con la presente invención, primero en el proceso (A) , se incuba el compuesto macrólido 11107B que es el material de partida (sustrato) en presencia de las cepas o productos anteriores preparados por sus micelios cultivados y también en presencia de oxígeno . Este tratamiento puede realizarse añadiendo el sustrato en el caldo de cultivo cuando se cultivan las cepas anteriores en condiciones aeróbicas o, como puede ser el caso, añadiendo el sustrato en una solución en suspensión de los micelios cultivados de las cepas anteriores o de un producto preparado por homogenización de estas células con flujo de gas que contiene oxigeno, por ejemplo, aire. El sustrato puede añadirse al caldo de cultivo antes de cultivar o cuando pasa un tiempo fijo después del comienzo del cultivo. Los micelios anteriores pueden producirse inoculando una cualquiera de las cepas anteriores en un medio que contiene un nutriente y cultivando en condiciones aeróbicas . El cultivo de la cepa para producir preparaciones de micelios o el cultivo de la cepa que se realiza en el momento en que el sustrato se añade, puede realizarse de acuerdo con un método de cultivo general de microorganismos fundamentalmente. Sin embargo, en general, el cultivo preferiblemente se realiza en condiciones aeróbicas, por ejemplo, cultivo de matraces en agitación y cultivo en tanque de acuerdo con cultivo liquido. Como medio usado para cultivar, puede usarse cualquier medio en la medida que contenga un nutriente que puedan utilizar los microorganismos que pertenecen al género Mortierell-a, el género Streptomyces o la familia Micromonosporaceae, y pueden utilizarse diversos medios sintéticos, medios semisintéticos y medios naturales. Como composición de medio, pueden usarse diversas fuentes de carbono tales como glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, fructosa, glicerina, dextrina, almidón, melazas y aceite de soj a de manera independiente o en combinaciones . Como fuente de nitrógeno, puede usarse una fuente de nitrógeno orgánica simple o una combinación tal como medios p arma, peptona, extracto de carne, harina de soja, harina de pescado, harina de gluten, caseína, levadura seca, aminoácido, extracto de levadura, NZ-case y urea, y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como nitrato sódico y sulfato amónico. Adicionalmente, por ejemplo, pueden añadirse y usarse sales tales como cloruro sódico, cloruro potásico, carbonato cálcico, sulfato de magnesio, fosfato sódico, fosfato potásico, sulfato de cobre, sulfato de hierro, cloruro de manganeso o cloruro de cobalto; sales de metales pesados; vitaminas tales como vitamina B o biotina; y agentes de inclusión tales como ciclodextrinas, si es necesario. Además, cuando la formación de espuma es extraordinaria durante el cultivo, pueden añadirse de manera apropiada diversos agentes desespumantes en el medio si es necesario. Cuando se añaden agentes desespumantes, es necesario ajusfarlo a una concentración para que no afecte de manera adversa a la producción de una sustancia objetivo. Las condiciones de cultivo pueden seleccionarse de manera apropiada en el intervalo al que la cepa microbiana crece bien y puede producir la sustancia mencionada anteriormente. Por ejemplo, el pH de un medio es aproximadamente de 5 a 9, y preferiblemente casi neutro en general . La temperatura de fermentación se mantiene habitualmente de 20°C a 40DC y preferiblemente de 24°C a 30 °C. El periodo de fermentación es aproximadamente de 1 a 8 días, y habitualmente aproximadamente de 2 a 5 días. Las condiciones de fermentación mencionadas anteriormente pueden cambiarse apropiadamente de acuerdo con el tipo y propiedades del microorganismo usado, condiciones externas y similares, y es innecesario decir que pueden seleccionarse unas condiciones óptimas . Además, la preparación de micelios en cultivo se prepara suspendiendo los micelios separados por centrifugación o filtración u homogenizados en una solución apropiada después de que termine el cultivo. Los ejemplos de soluciones usadas para la suspensión de los micelios incluyen el medio mencionado anteriormente o soluciones tampón tales como tris-ácido acético, tris-ácido clorhídrico, succinato sódico, citrato sódico, fosfato sódico y fosfato potásico de manera simple o en combinaciones . El pH de la solución tampón es de 5,0 a 9,0 y preferiblemente de 6,0 a 7,5. La sustancia 11107B como sustrato puede añadirse en un caldo de cultivo o en una solución en suspensión de micelios en forma de polvo o en forma de solución disuelta en un disolvente soluble en agua, por ejemplo, etanol, metanol, acetona o dimetilsulfóxido . La cantidad de la sustancia 11107B añadida es preferiblemente de 50 a 5000 mg por 1 litro de caldo de cultivo en el caso de caldo de cultivo. Después de la adición del sustrato, se realizan procedimientos tales como agitación de matraz o cultivo en tanque de 20 a 40 °C durante aproximadamente 1 a 5 días para realizar una reacción en condiciones aeróbicas, por las que la sustancia 11107B como sustrato puede convertirse en al sustancia 11107D. A continuación, en el proceso (B) , la sustancia 11107D diana se recoge de la solución incubada obtenida en el proceso (A) anterior. Los métodos apropiados se seleccionan entre diversos métodos de purificación conocidos que se usan habitualmente para asilar metabolitos de microorganismos y se usan en combinación para aislar la sustancia 11107D de la mezcla de reacción en el proceso (A) . Por ejemplo, puede usarse extracción por un disolvente orgánico tal como metanol, etanol, butanol, acetona, acetato de etilo, acetato de butilo, cloroformo o tolueno; diversos tipos de cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de filtración en gel usando Sephadex LH-20; el tratamiento de adsorción y desorción por cromatografía de absorción usando una resina de adsorción hidrófoba tal como Diaion HP-20, carbono activo o gel de sílice, o cromatografía en capa fina; o cromatografía líquida de alta resolución usando una columna de fase inversa y similares, de manera independiente o en combinaciones o se usan de manera repetida por lo que la sustancia 11107D puede separarse y purificarse. Ej emplos La presente invención se explicará con más detalle por medio de los Ejemplos, que no se pretende que limiten el alcance de la presente invención. En los siguientes Ejemplos, todas las denominaciones de % indican porcentaje en peso (p.%), salvo que se diga lo contrario. Ejemplo 1 Referencial Producción de sustancia 11107B como material de partida. Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (medio ISP-2) de la cepa Mer-11107 de Streptomyces sp. (FERM BP-7812) en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 50 mi de medio de siembra (glucosa al 2,0%, harina de soja al 1,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co . Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), cloruro sódico al 0,25%, carbonato calcico al 0,32%, pH 6,8 antes de esterilización), y se cultivó a 28°C durante dos días para dar el primer caldo de cultivo de siembra. Se inocularon 0,1 mi del caldo de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contendía 100 mi del mismo medio de siembra y se cultivó a 28 °C durante un día para dar el segundo caldo de cultivo de siembra. El segundo caldo de cultivo de siembra (800 mi) obtenido de este modo se inoculó en un tanque de 200 litros que contenía 100 litros de un medio de producción (almidón soluble al 5,0%, Pharmamedia al 0,8%, harina de gluten al 0,8%, extracto de levadura al 0,5% y carbonato calcico al 0,1%, pH 6,8 antes de esterilización) y se cultivó durante cinco días con las siguientes condiciones, para dar un caldo de cultivo. Temperatura del cultivo: 28 °C Agitación: 90 rpm Aireación: 1,0 wm Presión interna 20 kPa Una parte del caldo de cultivo (10 1) obtenido de este modo se extrajo con 10 litros de 1-butanol, y después la fase de butanol resultante se evaporó a sequedad, para dar 100 g de la fracción activa en bruto. La fracción activa en bruto se aplicó en Sephadex LH-20 (1500 mi; fabricado por Pharmacia Co . Ltd.) y se eluyó con tetrahidrofurano-metanol (1:1) como disolvente. Se concentró una fracción eluida de 540 mi a 660 mi a sequedad, para dar un residuo (660 mi) . El residuo resultante se disolvió en una mezcla de acetato de etilo y metanol (9:1; v/v) y se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (WAKO GEL C-200, 50 g) . La columna se eluyó con una mezcla (2 1) que constaba de n-hexano y acetato de etilo (1:9, v/v), se recogieron las fracciones eluidas de 468 mi a 1260 mi, se evaporaron para dar 25 mi de una fracción activa en bruto . La fracción activa en bruto obtenida se sometió a cromatografía líquida de alta resolución preparativa (HPLC) en las siguientes condiciones de HPCL preparativa (A) , y se recogieron las fracciones eluidas al tiempo de retención de 34 minutos. Después de retirar el acetonitrilo, las fracciones respectivas se desalaron por HPLC en las siguientes condiciones de HPLC preparativa (B) para dar 11107B (Tiempo de retención: 37 minutos, 6 mg) . Condiciones de HPLC preparativa ?: Columna: YMC- PAC ODS-A SH-343-5A , (p20 mm x 250 mm (fabricado por YMC Co . ) Temperatura: temperatura ambiente Velocidad de flujo: 10 ml/min Detección: 240 nm Eluyente : acetonitrilo/dihidrogenofosfato potásico acuoso al 0,15% (pH 3,5) (2:8 a 8:2, v/v, 0 a 50 min, gradiente lineal) Condiciones de HPLC preparativa B: Columna: YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM, f20 mm x 250 mm (fabricado por YMC Co . ) Temperatura: temperatura ambiente Velocidad de flujo: 10 ml/min Detección: 240 nm Eluyente : metanol/agua (2:8 a 10:0, v/v, 0 a 40 min, gradiente lineal) Ejemplo 1 Aislamiento de la cepa AB-1704 Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (almidón soluble al 0,5%, glucosa al 0,5%, extracto de carne de pescado al 0,1% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)/ extracto de levadura al 0,1% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), NZ-case al 0,2% (fabricado por Humko Sheffield Chemical Co.), cloruro sódico al 0,2%, carbonato calcico al 0,1% y agar al 1,6% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)) de la cepa asilada de la tierra en un tubo de ensayo de 65 mi que contenía 7 mi de un medio de siembra (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co . , Ltd.) y carbonato calcico al 0,1%) , y se cultivó a 28 °C durante 3 días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,5 mi de caldo de cultivo de siembra en un tubo de ensayo de 65 mi que contenía 7 mi de un medio de producción (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), y carbonato calcico al 0,1%), y se cultivó a 28 °C durante tres días en un agitador rotatorio.
Después, se preparó una solución de 25 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en etanol, y se añadieron 0,2 mi de la solución al cultivo. Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 48 horas para realizar la reacción de conversión. Después de la reacción, la mezcla de reacción se analizó por HPLC en las siguientes condiciones de HPLC analítica (a) , para dar una cepa AB-1704 (FER BP-8551) por la que se formó la sustancia 11107D en la mezcla de reacción. Condiciones de HPLC analítica (a) Columna: CAPCELL PAK C18 SG120 (p4,6 mm x 250 mm (fabricado por SHISEIDO CO.) Temperatura : 40 ° C Velocidad de flujo: 1 ml/min. Detección: 240 nm Eluyente: acetonitrilo/dihidrogenofosfato potásico al 0,15% (pH 3,5) (3:7 a 5:5, v/v, 0 a 18 minutos, gradiente lineal), acetonitrilo/ dihidrogenofosfato potásico al 0,15% (pH 3,5) (5:5 a 85:15, v/v, 18 a 22 minutos, gradiente lineal) Tiempo de retención: 9,9 min para la sustancia 11107D, 19,4 min para la sustancia 11107B. Ejemplo 2 Aislamiento de la cepa A-1544 y la cepa A-1545 Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (agar de levadura-malta) de la cepa asilada de la tierra en un matraz Erlenmeyer de 250 mi que contenía 20 mi de "un medio de siembra (almidón soluble al 2,4%, glucosa al 0,1%, harina de soja al 0,5% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.), extracto de ternera al 0,3% (fabricado por Difco) , extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Difco) , triptona-peptona al 0,5% (fabricado por Difco) , y carbonato cálcico al 0,4%), y se cultivó a 28°C durante tres dias en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,6 mi del caldo de cultivo de siembra en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 60 mi de un medio de producción (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 2,0%, harina de soja al 2,0% (ESUS N-MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.)/ extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), cloruro sódico al 0,25%, carbonato cálcico al 0,32%, sulfato de cobre al 0,0005%, cloruro de manganeso al 0,0005%, sulfato de cinc al 0,0005%, pH 7,4 antes de esterilización), y se cultivó a 28 °C durante cuatro dias en un agitador rotatorio. Se extendieron 2 mi del cultivo resultante en tubos de ensayo de 15 mi . A continuación, se preparó una solución de 20 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en sulfóxido de dimetilo, y se añadieron 0,05 mi de la solución. Después de la adición, se agitó a 28°C durante 23 horas para realizar la conversión. Después de la reacción, la mezcla de reacción se analizó por HPLC en las siguientes condiciones de HPLC analítica (b) para dar una cepa A-1544 (FERM BP- 8446) y una cepa A-1545 (FERM BP-8447) por las que se formó la sustancia 11107D en la mezcla de reacción. Condiciones de HPLC analítica (b) Columna: CAPCELL PA C18 SG120 (p4,6mm x 250 mm (fabricado por SHISEIDO CO.) Temperatura : 40 °C Velocidad de flujo: lml/min Detección; 240 nm Eluyente: acetonitrilo/agua (50:50, v/v) Isocrático Tiempo de retención: 7, 2 min para la sustancia 11107B, 3,6 min para la sustancia 11107D. Ejemplo 3 Conversión por la cepa AB-1704 en una escala de matraz Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (almidón soluble al 0,5%, glucosa al 0,5%, extracto de carne de pescado al 0,1% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), extracto de levadura al 0,1% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), NZ-case al 0,2% (fabricado por Humko Sheffield Chemical Co.), cloruro sódico al 0,2%, carbonato calcico al 0,1%, y agar al 1,6% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)) de la cepa AB-1704 de Streptomyces sp. (FERM BP-8551) asilada de la tierra, en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 100 mi de medio de siembra (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co . , Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) y carbonato cálcico al 0,1%), y se cultivó a 28 °C durante tres días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 2 mi del caldo de cultivo de siembra en 150 matraces Erlenmeyer que tenían una capacidad de 500 mi y contenían 100 mi de un medio de producción (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co . , Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) y carbonato cálcico al 0,1%), y se cultivó a 28 °C durante dos días en un agitador rotatorio. Se preparó una solución de 20 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en etanol, y se añadieron 0,44 mi de la solución al cultivo resultante (matraz Erlenmeyer de 100 ml/500ml, 150 matraces) . Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 9 horas para realizar la reacción de conversión. Después de que se completara la reacción, se recogieron los cultivos y se separaron en el sobrenadante de cultivo y los micelios por centrifugación a 2700 rpm durante 10 minutos. Los micelios se extrajeron con 5 litros de metanol y se filtraron para dar la solución de extracto de metanol . Esta solución de extracto de metanol se evaporó para retirar el metanol, se combinó con el sobrenadante de cultivo y se extrajo con 10 litros de acetato de etilo. La solución de acetato de etilo se evaporó para dar 2090 mg de una fracción activa en bruto. La fracción activa en bruto se disolvió en 4 mi de una mezcla de tetrahidrofurano-metanol (1:1, v/v) y 6 mi de una solución acuosa al 50% de acetonitrilo, se sometió a cromatografía en columna ODS (fabricada por Y C Co. , ODS-AM 120-S50 f3 , 6 cm x 43 cm) y se eluyó con una solución acuosa al 40% de acetonitrilo. Se concentró "una fracción eluida de 336 mi a 408 mi a sequedad a presión reducida para dar 560 mg del residuo. Además, el residuo se disolvió en 10 mi de una solución de metanol acuosa al 50%, se sometió a cromatografía en columna ODS (fabricada por YMC Co . , ODS-AM 120-S50 cp3,6 cm x 40 cm) y se eluyó con una solución acuosa al 50% de metanol. Se concentró una fracción eluida de 1344 mi a 1824 mi a sequedad a presión reducida para dar 252 mi de sustancia 11107D. Ejemplo 4 Conversión por la cepa A-1545 en una escala de matraz Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (agar de levadura-malta) de la cepa A-1545 (FERM BP-8447) en un matraz Erlenmeyer de 250 mi que contenxa 25 mi de un medio de siembra (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 2,0%, harina de soja al 2,0% {ESUSAN- EAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.)/ extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Difco) , cloruro sódico al 0,25%, y carbonato calcico al 0,32%, pH 7,4 antes de esterilización), y se cultivó a 28°C durante dos días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Se extendieron 0,75 mi del caldo en tubos de suero de 2 mi (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) y se añadió una cantidad igual de una solución acuosa al 40% de glicerol . Después de agitación, se congeló a -70°C para dar una siembra congelada. La siembra congelada se fundió, se inocularon 0,25 mi de la misma en un matraz Erlenmeyer de 250 mi que contenxa 25 mi de un medio de siembra (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 2,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co . , Ltd.), cloruro sódico al 0,25% y carbonato calcico al 0,32%, pH 7,4 antes de esterilización), y se cultivó a 28°C durante dos dias en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, el caldo de cultivo de siembra (0,5 mi) se inoculó en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenxa 100 mi de un medio de producción (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 2,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), cloruro sódico al 0,25%, y carbonato cálcico al 0,32%, pH 7,4 antes de esterilización), y se cultivó a 28 °C durante tres días en un agitador rotatorio. Cada uno de los caldos de cultivo resultantes (matraz Erlenmeyer de 100 ml/500 mi, 10 matraces) se sometió a centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos para recoger las células de los microorganismos, y se suspendieron las células en 10 mi de una solución de tampón fosfato 50 mM (pH 6,0) . A continuación, se preparó una solución de 100 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en sulfóxido de dimetilo, y se añadió 1 mi de la solución. Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 24 horas para realizar la reacción de conversión. Después de que se completara la reacción, se recogieron las soluciones de reacción y se separaron en el sobrenadante y los micelios por centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Los micelios se extrajeron con 500 mi de metanol y después se filtraron para obtener un extracto de metanol . El extracto de metanol se evaporó para retirar el metanol y se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Cada una de las fases de acetato de etilo se lavó con agua, se secó y se deshidrató sobre sulfato sódico anhidro, y las fases combinadas se evaporaron para dar 937 mg de una fracción en bruto. La fracción en bruto se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (gel Kiesel 60, 50 g) y se eluyó con 1200 mi de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (90:10; v/v) para obtener 234 mg de una fracción que contenía la sustancia 11107D. La fracción activa resultante se sometió a cromatografía líquida de alta resolución preparativa (HPLC) en las siguientes condiciones de HPLC preparativa (C) , y el eluido resultante se analizó por HPLC en las siguientes condiciones de HPLC analítica (c) . El disolvente se retiró de la fracción que contenía la sustancia 11107D obtenida de este modo, para dar 80 mg de la sustancia 11107D. Condiciones de HPLC preparativa (C) Columna: CAPCELL PA C18 UG120 q>30 mm x 250 mm (fabricado por SHISEIDO Co.) Velocidad de flujo: 20 ml/min Detección: 240 nm Eluyente: acetonitrilo/agua (30:70 v/v) isocrático Condiciones de HPLC analítica (c) Columna: CAPCELL PAK C18 SG120 f4 , 6 mm x 250 (fabricado por SHISEIDO Co. ) Temperatura : 40 °C Velocidad de flujo: Iml/min Detección: 240 nm Eluyente: acetonitrilo/agua (35:65, v/v) isocrático Tiempo de retención: 7,8 min para la sustancia 11107D.
Ejemplo 5 Conversión por la cepa A-1544 en una escala de matraz Cada cultivo de la cepa A-1544 (FERM BP-8446) (matraz Erlenmeyer de 100 ml/500 mi, 10 matraces) obtenidos por un método similar al descrito en el Ejemplo 4 se sometió a centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos para recoger las células del microorganismo, y las células se resuspendieron en 100 mi de una solución de tampón fosfato 50 mM (pH 6,0) . A continuación, se preparó una solución de 100 mg/ml del sustrato 11107B en sulfóxido de dimetilo, y se añadió 1 mi de la solución. Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 24 horas para realizar una reacción de conversión. Después de que se completara la reacción, las soluciones de reacción se recogieron y se separaron en el sobrenadante y los micelios por centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Los micelios se extrajeron con 500 mi de acetona, y después se filtraron para dar un extracto de acetona. La solución de extracto de acetona se evaporó para retirar la acetona, y después el residuo se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Cada una de las fases de acetato de etilo se lavó con agua, se secó y se deshidrató sobre sulfato sódico anhidro, y las fases combinadas se evaporaron para dar 345 g de una fracción en bruto. La fracción en bruto se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (gel Kiesel 60, 50 g) , se eluyó con 100 mi de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (50:50; v/v) , 200 mi de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (75:25; v/v) y una mezcla (600 mi) de acetato de etilo y n-hexano (90:10; v/v), para dar 463 mg de una fracción que contenía la sustancia 11107D. La fracción resultante se sometió a cromatografía líquida de alta resolución preparativa (HPLC) en las condiciones de HPLC preparativa (C) descritas en el Ejemplo 4 y el eluido resultante se analizó por HPLC en las condiciones de HPLC al analítica (c) descritas en el Ejemplo 4. El disolvente se retiró de la fracción que contenía la sustancia 11107D obtenida de este modo, para dar 304 mg de la sustancia 1110713. Ejemplo 6 Aislamiento de la cepa F-1529 y la cepa F-1530 Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado
(agar de dextrosa de patata) de la cepa asilada de la tierra en un matraz Erlenmeyer de 250 mi que contenia 20 mi de un medio de siembra (almidón de patata al 2,0%, glucosa al 1,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Aj inomoto Co . , Ltd.), dihidrogenofosfato potásico al 0,1% y sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05%), y se cultivó a 25°C durante tres días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,6 mi del caldo de cultivo de siembra en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 60 mi de un medio de producción (almidón de patata al 2,0%, glucosa al 1,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Aj inomoto Co., Ltd.), dihidrogenofosfato potásico al 0,1% y sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05%), y se cultivó a 28°C durante cuatro días en un agitador rotatorio. Se extendieron 2 mi del caldo de cultivo resultante en tubos de ensayo de 15 mi . Cada tubo de ensayo se sometió a centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger las células del microorganismo y después se suspendieron en 2 mi de una solución de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) . Después, se preparó una solución de 20 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en sulfóxido de dimetilo, y se añadieron 0,05 mi de la solución. Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 23 horas para realizar una reacción de hidroxilación. Después de la reacción, la mezcla de reacción se analizó por HPLC en las condiciones analíticas (c) descritas en el Ejemplo 4 para dar la cepa F-1525 (FERM BP-8547) y la cepa F-1530 (FERM BP-8548) que tuvieron ambas el pico de la sustancia 11107D en HPLC. Ejemplo 7 Conversión por la cepa F-1529 en una escalada de matraz Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (agar de dextrosa de patata) de la cepa F-1529 de Mortierella sp. (FERM BP-8547) en un matraz Erlenmeyer de 250 mi que contenia 25 mi de un medio de siembra (almidón de patata al 2,0%, glucosa al 1,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.), dihidrogenofosfato potásico al 0,1% y sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05%), y se cultivó a 25°C durante dos días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,6 mi del caldo de cultivo de siembra en cada matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenían 60 mi de un medio de producción (almidón de patata al 2,0%, glucosa al 1,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.), dihidrogenofosfato potásico al 0,1% y sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05%), y se cultivó a 25°C durante tres días en un agitador rotatorio . Cada caldo de cultivo resultante (matraz Erlenmeyer de 60 ml/500 mi, 18 matraces) se sometió a centrifugación realizada a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger las células del microorganismo y después se suspendieron en 60 mi de una solución de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) . A continuación, se preparó una solución de 100 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en sulfóxido de dimetilo, y se añadió 0,6 mi de la solución. Después de la adición, se agitó a 25 °C durante 22 horas para realizar una reacción de conversión. Después de que se completara la reacción, se separó el caldo de cultivo en el sobrenadante y los micelios por centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Los micelios se extrajeron con 500 mi de acetona y se filtraron para dar una solución de extracto de acetona. La solución de extracto de acetona se evaporó para retirar la acetona y después se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Las fases de acetato de etilo se lavaron respectivamente con agua, se deshidrataron y se secaron sobre sulfato sódico anhidro y después se combinaron entre sí y se evaporaron, para dar 1,21 g de una fracción en bruto que incluía la sustancia 11107D. La fracción en bruto que incluía la sustancia 11107D se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (gel Kiesel 60, 50 g) , se eluyó con 1200 mi de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (90:10; v/v) , para dar 369 mi de una fracción que contenía la sustancia 11107D. La fracción resultante se sometió a cromatografía líquida de alta resolución preparativa (HPLC) en las condiciones de HPLC preparativas (C) descritas en el Ejemplo 4 para dar una fracción eluida que contenía la sustancia 11107D. Después, se retiró el disolvente para dar 180 mg de la sustancia 11107D. Ejemplo 8 Conversión por la cepa F-1530 en una escala de matraz Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (agar de dextrosa de patata) de la cepa F-1530 de Mortierella sp. (FERM BP-8548) en un matraz Erlenmeyer de 250 mi que contenía 25 mi de un medio de siembra (almidón de patata al 2,0%, glucosa al 1,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSA -MEAT fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.), dihidrogenofosfato potásico al 0,1% y sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05%), y se cultivó a 25°C durante dos dias en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,6 mi del caldo de cultivo de siembra en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 60 mi de un medio de producción (almidón de patata al 2,0%, glucosa al 1,0%, harina de soja al 2,0% (ESUSAN-MEAT fabricado por Ajinomoto Co . , Ltd.), dihidrogenofosfato potásico al 0,1% y sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05%), y se cultivó a 25°C durante tres días en un agitador rotatorio. Cada caldo de cultivo obtenido (matraz Erlenmeyer de 60 ml/500 mi, 18 matraces) se sometió a centrifugación realizada a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger las células del microorganismo y después se suspendieron en 60 mi de una solución de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) . A continuación, se preparó una solución de 100 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en sulfóxido de dimetilo, y se añadieron 0,6 mi de la solución. Después de la adición, se agitó a 25 °C durante 22 horas para realizar una reacción de conversión. Después de que se completara la reacción, el caldo de cultivo se separó en el sobrenadante y los micelios por centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Los micelios se extrajeron con 500 mi de acetona y se filtraron para dar una solución de extracto de acetona. La solución de extracto de acetona se evaporó para retirar la acetona y después se extrajo con 1 litro de acetato de etilo. Las fases de acetato de etilo se lavaron respectivamente con agua, se deshidrataron y se secaron usando sulfato sódico anhidro y después se combinaron entre si y se evaporaron para dar 0,89 g de una fracción en bruto que incluía la sustancia 11107D. La fracción en bruto que incluía la sustancia 11107D se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (gel Kiesel 60, 50 g) , se eluyó con 1200 mi de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (90:10; v/v) y después con 500 mi de acetato de etilo, para dar 163 mg de una fracción en bruto que contenía la sustancia 11107D. La fracción resultante se sometió a cromatografía líquida de alta resolución preparativa (HPLC) en las condiciones de HPLC (C) descritas en el Ejemplo 4 para dar una fracción eluida que contenía la sustancia 11107D. Después, se retiró el disolvente para dar 30 mg de la sustancia 11107D. Ejemplo 9 Aislamiento de la cepa AB-1896 Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (almidón soluble al 0,5%, glucosa al 0,5%, extracto de carne de pescado al 0,1% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), extracto de levadura al 0,1% (fabricado por Oriental Yeast . , Ltd.), NZ-case al 0,2% (fabricado por Humko Sheffield Chemical Co . ) , cloruro sódico al 0,2%, carbonato calcico al 0,1%, y agar al 1,6% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)) de la cepa aislada de la tierra en un tubo de ensayo de 65 mi que contenía 5 mi de un medio de siembra (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.)/ y carbonato cálcico al 0,1%), y se cultivó a 28 °C durante diez días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,1 mi del caldo de cultivo de siembra en un tubo de ensayo de 65 mi que contenía 5 mi de un medio de producción (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), y carbonato de cálcico al 0,1%), y se cultivó a 28°C durante tres días en un agitador rotatorio. A continuación, se preparó una solución de 40 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en etanol, y se añadieron 0,05 mi de la solución al cultivo. Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 24 horas para realizar la reacción de hidroxilación . Después de la reacción, el caldo de cultivo se sometió a análisis por HPLC de acuerdo con las siguientes condiciones analíticas (d) para dar la cepa AB-1896 por la que se formó la sustancia 11107D. Condiciones de HPLC analítica (d) Columna: UNISON UK-C18, f , 6 mm x 50 mm (fabricado por Imtakt) Temperatura : 30 °C Velocidad de flujo: 2 ml/min Detección: 240 nm Eluyente: agua/acetonitrilo/ácido fórmico (1000:10:1 a 10:1000:1, v/v/v, 0 a 4 minutos, gradiente lineal) Tiempo de retención: 2,5 minutos para la sustancia 11107D Ejemplo 10 Conversión por la cepa AB-1896 en una escala de tubo de ensayo Se inoculó una carga completa del cultivo inclinado (almidón soluble al 0,5%, glucosa al 0,5%, extracto de carne de pescado al 0,1% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), extracto de levadura al 0,1% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), NZ-case al 0,2% (fabricado por Humko Sheffield Chemical Co . ) , cloruro sódico al 0,2%, carbonato cálcico al 0,1%, y agar al 1,6% (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)) de la cepa AB-18S6 en un tubo de ensayo de 65 mi que contenía 5 mi de un medio de siembra (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) y carbonato cálcico al 0,1%), y se cultivó a 28 °C durante 10 días en un agitador rotatorio para dar un caldo de cultivo de siembra. Además, se inocularon 0,1 mi del caldo de cultivo de siembra en un tubo de ensayo de 65 mi que contenía 5 mi de un medio de producción (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5% (fabricado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), extracto de levadura al 0,5% (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), y carbonato cálcico al 0,1%) y se cultivó a 28 °C durante tres días en un agitador rotatorio . Se preparó una solución de 40 mg/ml de la sustancia 11107B sustrato en etanol, y se añadieron 0,05 mi de la solución al caldo de cultivo resultante (tubo de ensayo de 5 ml/65 mi) . Después de la adición, se agitó a 28 °C durante 24 horas para realizar una reacción de hidroxilación. Se recogieron por separado 3 mi del caldo de cultivo resultante, se añadieron 2 mi de 1-butanol al mismo, se agitaron, y después se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante resultante, para preparar una solución de metanol de 2 mi del residuo. Se sometió a análisis por HPLC de acuerdo con las siguientes condiciones analíticas (e) y (f) para confirmar que la sustancia 11107D se formó en la mezcla de reacción. Condiciones de HPLC analítica (e) Columna: UNISON UK-C18, f4,6 mm x 50 mm (fabricado por Imtakt) Temperatura : 40 °C Velocidad de flujo: 2 ml/min Detección: 240 nm Eluyente: acetonitrilo/ácido trifluoroacético al 0,01% (2:8 a 5:5, v/v, 0 a 10 minutos, gradiente lineal) Tiempo de retención: 6,1 minutos para la sustancia 11107D. Condiciones de HPLC analítica (f) Columna: UNISON UK-C18, <p , 6 mm x 50 mm (fabricado por Imtakt) Temperatura -. 40 °C Velocidad de flujo: 2ml/min Detección: 240 nm Eluyente: metanol/ácido trifluoroacético al 0,01% (4:6 a 7:3, v/v, 0 a 10 minutos, gradiente lineal) Tiempo de retención: 6,1 minutos para la sustancia 11107D.
Claims (7)
1. Un método para producir el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) : (?) donde el compuesto macrolido 11107D se produce a partir del compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) : por un método de transformación biológica, que comprende los siguientes procesos (A) y (B) : (A) un proceso de incubar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) en presencia de una cepa que tiene la capacidad de realizar el método de transformación biológica mencionado anteriormente y que pertenece al género 49 Mortierella, el género Streptomyces o la familia Micromonosporaceae o una preparación de sus micelios cultivados ; y (B) un proceso de recoger el compuesto macrólido 11107D representado por la fórmula (II) a partir de la solución incubada obtenida en la etapa (A) .
2. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, donde la cepa que pertenece al género Mortierella es la cepa F-1529 (FER BP-8547) o la cepa F-1530 (FERM BP-8548) de Mortierella sp.
3. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, donde la cepa que pertenece al género Streptomyces es la cepa AB-1704 (FERM BP-8551) , la cepa A-1544 (FERM BP-8446) o la cepa A-1545 (FERM BP-8447) de Streptomyces sp .
4. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, donde la cepa que pertenece a la familia Micromonosporaceae es la cepa AB-1896 (FERM BP-8550) .
5. La cepa AB-1704 de Streptomyces sp. (FERM BP-8551) que tiene la capacidad de transformar el compuesto macrólido 11107B representado por la fórmula (I) anterior en el compuesto macrólido 11107D representado por la fórmula (II) anterior .
La cepa F-1529 (FERM BP-8547) o la cepa F-1530 (FERM BP- ) de Mortierella sp . que tiene la capacidad de 50 transformar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) anterior en el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) anterior.
7. La cepa AB-1896 (FERM BP-8550) que tiene la capacidad de transformar el compuesto macrolido 11107B representado por la fórmula (I) anterior en el compuesto macrolido 11107D representado por la fórmula (II) anterior. 51 RESUMEN La presente invención proporciona un nuevo método para producir el compuesto macrólido 11107D con un anillo de 12 miembros que tiene una actividad antitumoral por transformación biológica. El material de partida que es el compuesto macrólido 11107B con un anillo de 12 miembros representado por la fórmula (I) se incuba en presencia de una cepa que pertenece al género Mortierella, el género Streptomyces o la familia Micromonosporaceae (por ejemplo, cepa AB-1704 de Streptomyces sp . (FERM BP-8551) ) , cada una de las cuales tiene la capacidad de transformar el compuesto macrólido 11107B con un anillo de 12 miembros en una sustancia 11107D representada por la fórmula (II) , o una preparación de sus micelios cultivados y oxígeno, y después se recoge la sustancia 11107D que es un material diana de la solución de tratamiento. 52
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