CN1717493A - 大环内酯化合物的产生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过生物转化产生具有抗肿瘤活性的12元环大环内酯化合物11107D的新方法。以式(I)所示的12元环大环内酯化合物11107B为原材料，在具有将12元环大环内酯化合物11107B转化成式(II)所示的11107D物质的能力并属于被孢霉属、链霉菌属或小单孢菌科(如链霉菌AB－1704株(FERM BP－8551))的菌株的存在下或在其经培养菌丝体的制备物存在下并在氧气存在下进行孵育，然后从处理液中收集到目的物质11107D物质。
Description
技术领域：
本发明涉及通过生物转化产生具有抗肿瘤活性的12元环大环内酯化合物11107D的方法，还涉及用于生产的新菌株。
现有技术：
12元环大环内酯化合物11107D是具有良好抗肿瘤活性的一种12元环大环内酯化合物，其是在链霉菌属(Streptomyces sp.)Mer-11107菌株的培养产物中与11107B物质一起发现的(WO-A02/060890)。所述11107D对应于11107B的16位具有羟基。11107D物质的产量低于11107B，因此期望建立一种高效的产生方法。
发明内容：
本发明的目的是提供以大环内酯化合物11107B为原材料通过生物转化来产生大环内酯化合物11107D的新方法。
为了解决上述问题，本发明的发明人已通过筛选范围广泛的微生物群进行了试验，以筛选出能将大环内酯化合物11107B的16位氢原子转化成羟基的微生物，结果发现了分类上属于丝状真菌被孢霉属(Mortierella)的菌株、分类上属于放线菌(Actinomycetes)链霉菌属的菌株以及分类上同样属于放线菌的小单孢菌科(Micromonosporaceae)的菌株具有上述的转化功能，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及到下面的(1)-(3)。
(1)产生式(II)所示的大环内酯化合物11107D的方法：
其中，大环内酯化合物11107D是由式(I)所示的大环内酯化合物11107B通过生物转化方法而产生的，该方法包括下列步骤(A)和方法(B)：
(A)将式(I)所示的大环内酯化合物11107B在具有前面所提及的生物转化能力并属于被孢霉属、链霉菌属或小单孢菌科的菌株的存在下或在其经培养菌丝体的制备物存在下进行孵育的步骤；以及
(B)从步骤(A)所获得的孵育溶液中收集式(II)所示的大环内酯化合物11107D的步骤。
(2)根据上述(1)的产生方法，其中属于被孢霉属的菌株是被孢霉F-1529株(FERM BP-8547)或F-1530株(FERM BP-8548)。
(3)根据上述(1)的产生方法，其中属于链霉菌属的菌株是链霉菌AB-1704株(FERM BP-8551)、A-1544株(FERM BP-8446)或A-1545株(FERMBP-8447)。
(4)根据上述(1)的产生方法，其中属于小单孢菌科的菌株是AB-1896株(FERM BP-8550)。
(5)链霉菌AB-1704株(FERM BP-8551)具有将式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力。
(6)被孢霉菌F-1529株(FERM BP-8547)或F-1530株(FERM BP-8548)具有将式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力。
(7)AB-1896株(FERM BP-8550)具有将式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力。
发明详述：
在本发明的生物转化方法中，任何一种属于被孢霉属、链霉菌属、小单孢菌科的微生物，不管它属于哪个种型，只要具有将式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力，都可以使用。但是，优选的微生物例子包括属于被孢霉属的被孢霉F-1529株和F-1530株，属于链霉菌属的链霉菌AB-1704株、A-1544株、A-1545株以及属于小单孢菌科的AB-1896株，每种菌株均已从土壤中分离。
Mer-11107株于2000年12月19日以保藏号FERMP-18144保藏在工业科学和技术院的国立生命科学和人体技术研究所(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3号)，随后，在2001年11月27日转为国际保藏，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPOD)(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)，国际保藏号为FERMBP-7812。
被孢霉F-1529株在2003年11月12日以国际保藏号FERM BP-8547保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)。同样，被孢霉F-1530株在2003年11月12日以国际保藏号FERM BP-8548保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)
链霉菌AB-1704株在2002年9月5日以保藏号FERM P-18999保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)，随后，在2003年11月12日转为国际保藏FERM BP-8551，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPOD)(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)。同样，A-1544株和A-1545在2002年7月23日分别以保藏号FERMP-18943和保藏号FERM P-18944保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)，随后在2003年7月30日分别转为国际保藏FERM BP-8446和国际保藏FERM BP-8447，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)。
属于小单孢菌科的AB-1896株在2003年11月12以国际保藏号FERMBP-8550保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1，中央第6)。
上述菌株的分类学特性如下所述：
(F-1529菌株的分类学特性)
(1)形态学的特征
在每块燕麦粉琼脂平板(在下文简写为OA)、麦芽琼脂平板(2％麦芽提取物+1.5％琼脂：在下文简写为MEA)以及马铃薯葡萄糖琼脂平板(在下文简写为PDA)上，菌落呈柔毛状，菌丝白色，表现为白色(1A-1)调。当菌株在25℃培养生长1周，菌落在OA平板上的直径达到75mm，在MEA平板上直径达到75-80mm，在PDA平板上直径达到75-80mm。菌落呈环纹形态，没有观察到背面着色和产生的可溶性色素。对色调的描述与“Methuen Handbook of Colour(Kornerup & Wanscher，1978)”一致。
光学显微镜观察到的结果是，营养菌丝无色，表面光滑、无隔壁，宽4-5μm。在部分菌丝体中观察到膨胀结构，类似于厚壁球形孢子，大小约26.5-33μm。在本试验所用的培养基中，培养时间不超过3周时，没有形成象生殖器官样的任何结构。
(2)18S rRNA基因分析
使用Fast Prep FP120(由Q-BIO基因公司制造)和Fast DNA试剂盒(由Q-BIO基因公司制造)对琼脂平板上培养的F-1529菌株的菌丝体提取DNA。使用puRetaq Ready-To-Go PCR珠(由Amersham Biosciences公司制造)以及由表1及表2所示的PCR引物NS1和NS8实施PCR。使用OIA QuickPCR纯化试剂盒(QIAGEN公司制造)纯化PCR产物，随后用ABI prism BigDye Terminator试剂盒处理(Applied Biosystems制造)。使用表1和表2中所示NS1、NS2、NS3、NS4、NS5、NS6、NS7及NS8作为测序引物。反应产物用Dye EX2.0Spin试剂盒纯化(QIAGEN公司制造)并用ABI PRISM 3100基因分析仪(Applied Biosystems制造)进行序列分析。随后，用Auto Assemble(Applied Biosystems制造)将经测序片段组合在一起以获得全长核苷酸序列。
表1用于确定18S rRNA基因的核苷酸序列的引物(正向)
| 序列号 | 名称 | 序列 |
| 1 | NS1 | 5′-gtagtcatatgcttgtct-3′ |
| 2 | NS3 | 5′-gcaagtctggtgccagcagcc-3′ |
| 3 | NS5 | 5′-aacttaaaggaattgacggaag-3′ |
| 4 | NS7 | 5′-gaggcaataacaggtctgtgatg-3′ |
表2用于确定18S rRNA基因的核苷酸序列的引物(反向)
| 序列号 | 名称 | 序列 |
| 5 | NS2 | 5′-cgttcagaccacggtcgtcgg-3′ |
| 6 | NS4 | 5′-ttgaatttccttaactgccttc-3′ |
| 7 | NS6 | 5′-ctccgttattgtccagacactac-3′ |
| 8 | NS8 | 5′-aggcatccacttggacgcct-3′ |
由此获得的该菌株18S rRNA基因具有在序列号9中所述的核苷酸序列。
从日本DNA数据库(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/)获得了已知菌株的DNA序列，用于检测18S rRNA的同源性。结果是，该18S rRNA基因(上游803个碱基)与透明被孢霉(Mortierella hyalina)18S rRNA基因(Genbank登录号AY157493)同源性为99％，与厚垣孢被孢霉(Mortierella chlamydospora)的18S rRNA基因(Genbank登录号AF157143)的同源性为98％(全长)，与Mortierella multidivaricata 18SrRNA基因(Genbank登录号AF157144)的同源性为98％(全长)。
根据上述的真菌学特性，本发明的发明者确定该菌株属于被孢霉属。(F-1530菌株的分类学特性)
(1)形态学特征
在每块燕麦粉琼脂平板、麦芽琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上，菌落呈棉絮状，菌丝白色，表现为白色(1A-1)调。当菌株在25℃培养生长1周，菌落在OA平板上的直径达到80-85mm，MEA平板上直径达到85mm，PDA平板上直径达到85mm。菌落呈环纹形态，没有观察到背面着色和可溶性色素产生。对色调的描述与“Methuen Handbook of Colour(Kornerup & Wanscher，1978)”一致。
光学显微镜观察到的结果是，营养菌丝无色，表面光滑，无隔壁，宽2.5-5μm。在部分菌丝体中观察到膨胀结构，类似于厚壁球形孢子，大小约10μm。试验所用的培养基中，培养时间不超过3周时，没有形成象生殖器官样的任何结构。
(2)18S rRNA基因分析
用与F-1529菌株一样的方法对F-1530菌株的18S rRNA基因进行分析。由此所获得的F-1530菌株的18S rRNA基因具有在序列号10中所述的核苷酸序列。
从日本DNA数据库(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/)获得了已知菌株的DNA序列用于检测18S rRNA的同源性。结果是，该18S rRNA基因(上游803个碱基)与透明被孢霉的18S rRNA(Genbank登录号AY157493)的同源性为100％，与厚垣孢被孢霉的18S rRNA(Genbank登录号AF157143)的同源性为98％(全长)，与Mortierella multidivaricata 18SrRNA(Genbank登录号AF157144)的同源性为98％(全长)。
根据上述的微生物学特征，本发明的发明者确定该菌株属于被孢霉属。(AB-1704菌株的分类学特性)
(1)形态学特征
该菌株营养菌丝上延伸出具有直型(Rectiflexibiles)的气生菌丝。在成熟的气生菌丝末端形成的孢子链由约20-50个圆柱形孢子组成。孢子大小约0.6-0.8×1.0-1.1μm，孢子表面光滑，没有观察到象孢子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在不同培养基上的培养特征
表3所示的是该菌株在不同培养基上28℃孵育两周后的培养特征。用Tresner’s Color wheels所示的颜色名称和括号内的符号对色调进行了描述。
表3
| 培养基 | 生长状况 | 气生菌丝 | 营养菌丝的颜色 | 可溶性的色素 |
| 酵母提取物-麦芽提取物琼脂(ISP-2) | 良好 | 厚的乳白色(2db) | 肉褐色(Nudetan)(4gc) | 无 |
| 燕麦粉琼脂(ISP-3) | 良好 | 丰富的乳白色(2db) | 浅瓜黄色(Lightmelon yellow)(3ea) | 无 |
| 无机盐-淀粉琼脂(ISP-4) | 良好 | 厚的油灰-乳白色(11/ | 软木塞似的褐色(Cork tan)(4ie) | 无 |
| 2ec-2db) | ||||
| 丙三醇-天冬酰胺琼脂(ISP-5) | 良好 | 厚的羊皮纸似的(11/2db) | 肉褐色(4gc) | 无 |
| 蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂(ISP-6) | 良好 | 丰富的白色(a) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 酪氨酸琼脂(ISP-7) | 良好 | 厚的乳白色(2db) | 肉褐色(4gc) | 无 |
(3)不同碳源的利用
将不同碳源加入到Pridham-Gottlieb琼脂中并在28℃培养两周，菌株的生长情况如表4所示。
表4
| D-葡萄糖 | + | 肌醇 | - |
| L-阿拉伯糖 | ± | L-鼠李糖 | + |
| D-木糖 | + | D-甘露醇 | + |
| D-果糖 | + | 棉子糖 | - |
| 蔗糖 | ± |
(+：同化，±：轻微同化，-：不同化)
(4)多种生理学特性
该菌株的多种生理学特性如下
(a)生长温度(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)为5℃-33℃。
(b)最适生长温度(酵母提取物-麦芽浸膏物琼脂，孵育两周)为15℃-33℃。
(c)明胶液化作用(葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基)：呈阳性。
(d)牛奶凝固作用(脱脂乳培养基)：呈阳性。
(e)牛奶胨化作用(脱脂乳培养基)：呈阳性。
(f)淀粉水解作用(无机盐-淀粉琼脂)呈阳性。
(g)类黑素色素的形成(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阴性，(酪氨酸琼脂)呈阴性。
(h)硫化氢的产生(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阴性。
(i)硝酸盐的还原(含0.1％硝酸钾的肉汤)呈阳性。
(j)氯化钠耐性(酵母提取物-麦芽提取物琼脂培养两周)含盐量≤7％，能生长。
(5)化学分类
在本菌株的细胞壁检测到LL-二氨基庚二酸。
根据上述的微生物特征，本发明人确定该菌株属于链霉菌属。(A-1544菌株的分类学特性)
(1)形态学特征
该菌株的营养菌丝上延伸出螺旋型气生菌丝。在成熟的气生菌丝末端形成的孢子链由约10-20个圆柱形孢子组成。孢子的大小约1.0×1.2-1.4μm。孢子表面多刺，没有观察到象胞子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在不同培养基上的培养特征
表5所示的是该菌株在不同培养基上于28℃孵育两周后的培养特征。用Tresner’s Color wheels所示的颜色名称和括号内的符号对色调进行了描述。
表5
| 培养基 | 生长 | 气生菌丝 | 营养菌丝颜色 | 可溶性色素 |
| 酵母提取物-麦芽提取物琼脂 | 良好 | 厚的银灰色(3fe) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| (ISP-2) | ||||
| 燕麦粉琼脂(ISP-3) | 良好 | 丰富的浅灰色-银灰色(d-3fe) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 无机盐-淀粉琼脂(ISP-4) | 良好 | 丰富的银灰色(3fe) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 丙三醇-天冬酰胺琼脂(ISP-5) | 良好 | 丰富的灰(5fe) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂(ISP-6) | 良好 | 无 | 浅瓜黄色(3ea) | 淡黑褐色 |
| 酪氨酸琼脂(ISP-7) | 良好 | 丰富的暗灰色(2fe) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
(3)不同碳源的利用
不同碳源加入到Pridham-Gottlieb琼脂中并在28℃培养两周，菌株的生长情况见表6。
| D-葡萄糖 | + | 肌醇 | - |
| L-阿拉伯糖 | + | L-鼠李糖 | + |
| D-木糖 | + | D-甘露醇 | + |
| D-果糖 | + | 棉子糖 | - |
| 蔗糖 | - |
(+：同化，-：不同化)
(4)多种生理学特性
本菌株的多种生理学特性如下
(a)生长温度(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)为15℃-41℃。
(b)最适的生长温度(酵母提取物--麦芽提取物琼脂，孵育两周)为20℃-37℃。
(c)明胶液化作用(葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基)呈阳性。
(d)牛奶凝固作用(脱脂乳培养基)呈阳性。
(e)牛奶胨化作用(脱脂乳培养基)呈阳性。
(f)淀粉水解作用(无机盐-淀粉琼脂)呈阳性。
(g)类黑素色素形成(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阳性，(酪氨酸琼脂)呈阴性。
(h)硫化氢的产生(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阳性。
(i)硝酸盐的还原(含0.1％硝酸钾的肉汤)呈阴性。
(j)氯化钠耐性(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)含盐量≤7％，能生长。
(5)化学分类
在本发明菌株的细胞壁上检测到LL-二氨基庚二酸。
根据上文提及到微生物特征，本发明人确定该菌株属于链霉菌属。(A-1545菌株的分类学特性)
(1)形态学特征
该菌株的营养菌丝上延伸出直柔韧(Rectiflexibililes)型气生菌丝。在成熟气生菌丝末端形成的孢子链由约50个孢子组成。孢子的大小约0.8×1.0μm，孢子表面光滑，没有观察到象孢子囊、菌核和鞭毛等特殊器官。
(2)在不同培养基上的培养特征
表7所示的是该菌株在不同培养基上于28℃孵育两周后的培养特征。用Tresner’s Color wheels所示的颜色名称和括号内的符号对色调进行了描述。
表7
| 培养基 | 生长状况 | 气生菌丝 | 营养菌丝颜色 | 可溶性色素 |
| 酵母提取物-麦芽提取物琼脂(ISP-2) | 良好 | 丰富的略带浅灰浅黄的粉色(5cb) | 浅瓜黄色-肉褐色(3ea-4gc) | 无 |
| 燕麦粉琼脂(ISP-3) | 中等 | 薄的略带浅灰浅黄的粉色(5cb) | 珠光粉红(3ca) | 无 |
| 无机盐-淀粉琼脂(ISP-4) | 良好 | 薄的略带浅灰浅黄的粉色(5cb) | 浅乳白色(2ca) | 无 |
| 丙三醇-天冬酰胺琼脂(ISP-5) | 良好 | 丰富的略带浅灰浅黄的粉色(5cb) | 珠光粉红(3ca) | 无 |
| 蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂(ISP-6) | 中等 | 无 | 浅瓜黄色(3ea) | |
| 酪氨酸琼脂(ISP-7) | 良好 | 丰富的略带浅灰浅黄的粉色(5cb) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
(3)不同碳源的利用
不同碳源加入到Pridham-Gottlieb琼脂中并在28℃培养两周，菌株的生长情况见表8。
表8
| D-葡萄糖 | + | 肌醇 | ± |
| L-阿拉伯糖 | + | L-鼠李糖 | + |
| D-木糖 | + | D-甘露醇 | + |
| D-果糖 | + | 棉子糖 | + |
| 蔗糖 | - |
(+：同化，±：轻微同化，-：不同化)
(4)多种生理学特性
本菌株的多种生理学特性如下。
(a)生长温度(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周，)为10℃-37℃。
(b)最适的生长温度(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)为20℃-33℃。
(c)明胶液化作用(葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基)呈阴性。
(d)牛奶凝固作用(脱脂乳培养基)呈阳性。
(e)牛奶胨化作用(脱脂乳培养基)呈阳性。
(f)淀粉水解作用(无机盐-淀粉琼脂)呈阳性。
(g)类黑素色素形成(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阴性，(酪氨酸琼脂)阴性。
(h)硫化氢的产生(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阳性。
(i)硝酸盐的还原(含0.1％硝酸钾的肉汤)呈阴性。
(j)氯化钠耐性(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)含盐量为≤7％，能生长。
(5)化学分类
在本菌株的细胞壁上检测到LL-二氨基庚二酸。
根据上述的微生物特征，本发明人确定该菌株属于链霉菌属。
(AB-1896株的分类学特性)
(1)形态学特征
AB-1896菌株在该菌的鉴别培养基上，28℃培养7-14天后生长良好或适度。在培养期间没有观察到菌丝，在每个营养菌丝上只看到一个孢子。孢子呈球形，大小约0.8-0.9μm，孢子表面疣状。没有观察到象孢子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在不同培养基上的培养特征
表9所示的是该菌株在不同培养基上于28℃孵育两周后的培养特征。用Tresner’s Color wheels所示的颜色名称和括号内的符号对色调进行了描述。
表9
| 培养基 | 生长(状况) | 营养菌丝颜色 | 可溶性色素 |
| 酵母提取物-麦芽提取物琼脂(ISP-2) | 良好Berver(3li) | 桔黄色(3ec) | 无 |
| 燕麦粉琼脂(ISP-3) | 中等软木塞似的褐色(4ie) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 无机盐-淀粉琼脂(ISP-4) | 良好Berver(3li) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 丙三醇-天冬酰胺琼脂(ISP-5) | 中等浅橄榄褐色(Lightolive drab)(1li) | 珠光粉红(3ca) | 无 |
| 蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂(ISP-6) | 良好Berver(3li) | 浅瓜黄色(3ea) | 无 |
| 酪氨酸琼脂(ISP-7) | 良好浅橄榄灰色(11/2ge) | 珠光粉红(3ca) | 无 |
(3)不同碳源的利用
不同碳源加入到Pridham-Gottlieb琼脂中并在28℃培养两周，菌株的生长情况见表10。
表10
| D-葡萄糖 | + | 肌醇 | - |
| L-阿拉伯糖 | + | L-鼠李糖 | - |
| D-木糖 | + | D-甘露醇 | - |
| D-果糖 | + | 棉子糖 | + |
| 蔗糖 | + |
(+：同化，-：不同化)
(4)多种生理学特性
本菌株的多种生理学特性如下。
(a)生长温度(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)为20℃-41℃。
(b)最适的生长温度(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)为25℃-37℃。
(c)明胶液化作用(葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基)呈阴性。
(d)牛奶凝固作用(脱脂乳培养基)呈阳性。
(e)牛奶胨化作用(脱脂乳培养基)呈阳性。
(f)淀粉水解作用(无机盐-淀粉琼脂)呈阳性。
(g)类黑素色素形成(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阴性，(酪氨酸琼脂)呈阴性。
(h)硫化氢的产生(蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂)呈阴性。
(i)硝酸盐的还原(含0.1％硝酸钾的肉汤)呈阳性。
(j)氯化钠耐性(酵母提取物-麦芽提取物琼脂，孵育两周)在含盐量达4％时，不能生长。
(5)化学分类
从AB-1896菌株的细胞壁上检测到内消旋型-二氨基庚二酸。检测到了作为整个菌丝体主要结构糖的木糖和甘露糖。细胞壁肽聚糖的酰基类型为乙醇酰类型。没有检查到霉菌酸，而检测到了作为主要甲基萘醌类成分的MK-9(H4)、MK-9(H6)、MK-10(H4)、MK-10(H6)。
(6)16S rRNA基因的分析
使用Fast DNA试剂盒(由Q-BIO基因公司制造)对从肉汤培养基中收集的AB-1896菌株提取DNA。在反应条件为96℃20秒，50℃20秒，72℃1分钟，共30个循环，实施了PCR。使用的引物为9F(5’-GTGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(序列号为11)和(536R(5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’)(序列号为12)。PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司制造)纯化后以提供测序样品。
使用ABI PRISM 3100基因分析仪(Applied Biosystems制造)并按照BigDye Terminator试剂盒标准操作程序进行了测序，使用的引物为9F和536R。
由此获得的在该菌株16S rRNA基因的5’端约500个核苷酸序列在序列号13中进行了描述。
从日本DNA数据库(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/)中获得了已知菌株的序列以检测16S rRNA 5’端的400-500个碱基的同源性。结果是，该16S rRNA基因与小单胞菌属DSM44396菌株的16S rRNA(Genbank登录号AJ560637)同源性为98％，与Micromonospora purpureochromogenes(Genbank登录号X92611)同源性为98％，与小单胞菌属菌株M.ChalceaIFO12135菌株基因(Genbank登录号D85489)同源性为95％。与疣孢子属(verrucosispora)菌株verrucosispora gifhornensis菌株基因(Genbank登录号Y15523)的同源性为95％。
尽管AB-1896菌株与小单胞菌属几乎具有相同特征，但它与小单胞菌属不完全符合点在于作为整个菌丝体的主要结构糖，没有检测到阿拉伯糖，而检测到了甘露糖。同样，AB-1896菌株与疣孢子属不完全符合点在于在鉴别该菌株的培养基上没有观察到verrucosispora gifhornensis的特征性孢子。本发明的发明人考虑到上述的分类学特征推断AB-1896菌株属于小单胞菌科的放线菌。
根据本发明，首先在步骤A中，原材料(底物)大环内酯化合物11107B在上述菌株或其经培养菌丝体的制备物存在下，进一步在有氧存在下进行孵育。将底物加入到有氧条件下正在培养的上述菌株的培养肉汤中，或视情况而定，可将底物加入到上述菌株经培养的菌丝体或通过匀浆这些细胞制备的产物并含有氧气的流动气体(例如空气)的悬浮液体中，可以实施这种处理。
可以在培养前或培养开始后经过一定时间将这种底物加入到培养肉汤中。任何一种上述菌株在含有营养物并在有氧培养下孵育都可以产生上述菌丝体。用于产生菌丝体制备物的菌株的培养或添加底物而进行菌株的培养原则上是根据培养一般微生物的方法进行的。然而，整体上说，优选在有氧的条件下培养，例如，对于液体培养，可通过烧瓶摇动培养和发酵罐培养。
对于用于培养的培养基，任何培养基只要它含有属于被孢霉属、链霉菌属的菌株或小单孢菌科的微生物能利用的营养物都可以用，多种合成培养基、半合成培养基、天然培养基都可以利用。作为培养基组成成分，可单独或联合使用多种碳源如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘油、糊精、淀粉、糖蜜、大豆油。
作为氮源，可以使用单一的或复合的有机氮源如pharma培养基、蛋白胨、肉膏、大豆粉、鱼粉、谷蛋白粉、酪蛋白、干酵母、氨基酸、酵母提取物、NZ-case、尿素，也可以使用无机氮源如硝酸钠、硫酸铵。此外，例如，可加入并使用盐，如氯化钠、氯化钾、碳酸钙、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、硫酸铜、硫酸铁、氯化锰或氯化钴；重金属盐；维生素如维生素B或生物素；如果需要的话，还包括包接剂如环状糊精。此外，培养期间如有明显的泡沫，需要时，在培养基中可适量加入多种去泡剂。加入去泡剂时，其加入浓度不会对目的物质的产量产生不利影响。
培养条件可以在微生物菌株生长良好并能产生上述物质的范围内作适当地选择。例如，培养基的pH值约为5-9，优选地一般接近中性。发酵的温度通常保持在20-40℃，并优选24-30℃。发酵时间约1-8天，通常约2-5天。上述的发酵条件根据所用的微生物的种类和特性、外部条件等可相应地作适当改变，当然可选择最适条件。
另外，培养结束后，通过离心或过滤或在合适的溶液中匀浆分离得到了菌丝体，悬浮菌丝体制备得到了培养菌丝体的制备物。用于悬浮菌丝体的溶液例子包括上文提及的培养基或缓冲液如Tris-乙酸、Tris-盐酸、丁二酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、磷酸钾，这些缓冲液或单一或联合使用。缓冲液的pH值为5.0-9.0，优选6.0-7.5。
11107B物质作为底物可本身作为粉末或者作为溶解在水溶性溶剂例如乙醇、甲醇、丙酮或二甲基亚砜中的溶液加入到培养肉汤中或菌丝体的悬浮液中。在培养肉汤中，11107B物质加入量优选地为50-5000mg/L培养肉汤。在底物加入后，在有氧条件下，如烧瓶摇动或罐培养等过程在20-31℃下进行，经过约1-5天运行了一个反应。由此，作为底物的11107B物质可以转变成11107D物质。
下一步，在步骤(B)中，从上述步骤(A)中获得的孵育溶液中回收目的11107D物质。从通常用于分离微生物代谢产物的多种已知纯化方法中选择合适的方法，并联合用于从步骤(A)的反应混合物中分离11107D物质。例如，通过有机溶剂如甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸丁酯、氯仿或甲苯的提取；不同种类的离子交换层析法；使用SephadexLH-20的凝胶过滤层析法；通过使用疏水性吸附树脂如Diaion HP-20、活性炭或硅胶吸附层析法进行吸附层析、或通过薄层色谱进行解吸附层析；或使用反相柱的高效液相色谱法等，这些方法可单独或联合或反复使用，由此，11107D物质得到了分离与纯化。
实施例
本发明将通过实施例的方式作详尽的说明，这些实施例不用于限制本发明的范围。在下文的实施例中，除非有另外的注释，所有％表示重量百分数(wt.％)
参考实施例1作为原材料的11107B物质的产生
将链霉菌Mer-11107(FERMBP-7812)菌株的斜面培养物(ISP-2培养基)的一菌环量接种入含50mL种子培养基(2.0％葡萄糖、1.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd公司制造)、0.5％的酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)、0.25％的氯化钠、0.32％碳酸钙，灭菌前pH6.8)的500mL锥形瓶中，并在28℃培养两天以提供第一批种子培养肉汤。将0.1mL的培养肉汤接种到含100mL相同种子培养基的500mL锥形瓶中，并在28℃培养一天以提供第二批种子培养肉汤。由此获得的第二批种子培养肉汤(800mL)接种入含100L生产培养基(5.0％的可溶性淀粉、0.8％的pharmamedia、0.8％谷蛋白粉、0.5％的酵母提取物和0.1％的碳酸钙，灭菌前pH6.8)200L的罐中，在培养温度：28℃、搅拌速度：90转/分钟、通气量换气：1.0vvm、内部压力：20千帕斯卡的条件下，通气搅拌培养5天以得到培养肉汤。
由此获得的部分培养肉汤(10L)用10L的1-丁醇抽提，再将得到的丁醇层蒸发至干，产生100g粗活性级分。将粗活性级分应用于SephadexLH-20(1500mL；由Pharmacia Co.Ltd.公司制造)，用四氢呋喃-甲醇(1∶1)作为溶剂洗脱。将540mL至660mL的洗脱级分浓缩至干燥，得到残留物(660mg)。将产生的残留物溶解在乙酸乙酯和甲醇(9∶1，v/v)的混合液中，并用于硅胶柱层析(WAKO GEL C-200，50g)。柱子用由正己烷和乙酸乙酯(1∶9，v/v)组成的混合液洗脱，收集468mL至1260mL的洗脱级分，经蒸发得到25mg粗活性级分。
在下述的制备性HPLC条件(A)下，将获得的粗活性级分进行制备性高效液相色谱(HPLC)，收集保留时间为34分钟的洗脱级分；去除乙腈后，在下述的制备性HPLC条件(B)下，每一级分通过HPLC去盐以得到11107B(保留时间：37分钟，6mg)。
制备性HPLC条件A：
柱：YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM，φ20mm×250mm(YMC公司制造)
温度：室温
流速：10mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/0.15％磷酸二氢钾(pH3.5)(2∶8至8∶2.V/V，0-50分钟，线性梯度)
制备性HPLC条件B：
柱：YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM，φ20mm×250mm(YMC公司制造)
温度：室温
流速：10mL/分钟
检测：240nm
洗脱：甲醇/水(2∶8至10∶0.V/V，0-40分钟，线性梯度)
实施例1 AB-1704 菌株的分离
将从土壤中分离的菌株的斜面培养物(0.5％可溶性淀粉、0.5％葡萄糖、0.1％鱼粉提取物(Wako Pure Chemical Industries，Ltd公司生产)、0.1％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)、0.2％NZ-case(由HumkoSheffield Chemical Co公司制造)、0.2％氯化钠、0.1％的碳酸钙和1.6％琼脂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd公司生产)一菌环量接种入含有7mL种子培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(NihonPharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental YeastCo.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在旋转摇床于28℃培养3天以得到种子培养肉汤。
然后，将0.5mL的种子培养肉汤接种到含有7mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在旋转摇床于28℃培养3天。下一步，准备了25mg/mL溶于乙醇的底物11107B物质的溶液，并将0.2mL溶液加入到培养基中。加入后，28℃振摇48小时以实施转换反应。反应完后，在下述HPLC分析条件(a)下通过HPLC分析了反应混合物，得到了在反应混合物中形成11107D物质的AB-1704菌株(FERM BP-8551)。
HPLC分析条件(a)
柱：CAPCELL PAK C18SG120φ4.6mm×250mm(SHISEIDO CO.，公司制造)
温度：40℃
流速：1mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/0.15％磷酸二氢钾(pH3.5)(3∶7至5∶5，V/V，0-18分钟，线性梯度)、乙腈/0.15％磷酸二氢钾(pH3.5)(5∶5至85∶15，V/V，18-22分钟，线性梯度)
保留时间：11107D物质9.9分钟，11107B物质19.4分钟。
实施例2 A-1544菌株和A-1545菌株的分离
将从土壤中分离的菌株的斜面培养物(酵母-麦芽琼脂)一菌环量接种入含有20mL种子培养基(2.4％可溶性淀粉、0.1％葡萄糖、0.5％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.3％牛肉浸膏(Difco公司制造)、0.5％酵母提取物(Difco公司制造)、0.5％胰蛋白胨(Difco公司制造)和0.4％碳酸钙)的250mL烧瓶中，并在旋转摇床于28℃培养3天以得到种子培养肉汤。
然后，将0.6mL的种子培养肉汤接种到装有60mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、2.0％葡萄糖、2％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由AjinomotoCo.，Ltd.公司制造)、0.5％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)、0.25％氯化钠、0.32％碳酸钙、0.0005％硫酸铜，0.0005％氯化锰、0.0005％硫酸锌，灭菌前pH为7.4)的500mL锥形瓶中，并在旋转摇床于28℃培养4天。将每2mL的所得培养物分装到15mL的试管中。下一步，制备了20mg/mL溶于二甲亚砜的底物11107B物质的溶液，并将0.05mL的该溶液加入。加入后，28℃摇动23小时以实施转换反应。反应完后，在下述HPLC分析条件(b)下用HPLC分析了反应混合物，得到了在反应混合物中形成11107D物质的A-1544菌株(FERM BP-8446)和A-1545菌株(FERM BP-8447)。
HPLC分析条件(b)
柱：CAPCELL PAK C18 SG120φ4.6mm×250mm(SHISEIDO CO.，公司制造)
温度：40℃
流速：1mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/水(50∶50，V/V)，等度洗脱
保留时间：11107B物质7.2分钟，11107D物质3.6分钟。
实施例3 在烧瓶规模通过AB-1704株的转换
将从土壤中分离的链霉菌AB-1704菌株(FERM BP-8551)的斜面培养物(0.5％可溶性淀粉、0.5％葡萄糖、0.1％鱼粉提取物(Wako PureChemical Industries，Ltd公司生产)、0.1％酵母提取物(由Oriental YeastCo.，Ltd公司制造)、0.2％的NZ-case(由Humko Sheffield Chemical Co公司制造)、0.2％氯化钠、0.1％碳酸钙和1.6％琼脂(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd公司生产)的一菌环量接种入含有100mL种子培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的500mL锥形瓶中，并在旋转摇床于28℃培养3天。接下来，将2mL种子培养基接种入150个含有100mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的500mL锥形瓶中，并在28℃旋转摇床内培养2天。
准备了20mg/mL溶于乙醇的底物11107B物质的溶液，在每瓶培养产物中(100mL/500mL锥形瓶，150瓶)加入0.44mL溶液。然后，28℃振摇9小时以进行转换反应。反应完成后，收集培养物并经2700转/分钟离心10分钟后分成上清和菌丝体。菌丝体用5L的甲醇抽提并过滤，得到了甲醇抽提溶液。甲醇抽提溶液经蒸发以除掉甲醇，与培养物上清合并在一起并用10L乙酸乙酯抽提。所得的乙酸乙酯溶液经蒸发得到2090mg粗活性级分。粗活性级分溶于4mL四氢呋喃-甲醇混合液(1∶1，V/V)和6mL50％乙腈水溶液后，用于ODS柱层析(YMC Co.，ODS-AM 120-S50φ3.6cm×43cm)并用40％乙腈水溶液洗脱。从336mL到408mL的洗脱级分在减压的条件下浓缩至干燥以得到560mg的残留物。然后，将残留物溶解于10mL 50％甲醇水溶液中，用于ODS柱层析(YMC Co.，ODS-AM120-S50φ3.6cm×43cm)并用50％甲醇水溶液洗脱。从1344mL到1824mL的洗脱级分在减压的条件下浓缩至于燥以得到252mg 11107D物质。
实施例4 在烧瓶规模通过A-1545株转换
将A-1545菌株(FERM BP-8447)的斜面培养物(酵母-麦芽琼脂)一菌环量接种入含有25mL种子培养基(2.0％可溶性淀粉、2.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.5％酵母提取物(Difco公司制造)、0.25％氯化钠和0.32％碳酸钙，灭菌前的pH值为7.4)的250mL烧瓶中，并在旋转摇床内于28℃培养2天以得到种子培养肉汤。然后将每0.75mL的肉汤分装到2mL的血清管(Sumitomo BakeliteCo.，Ltd.公司制造)中，并加入等量的40％甘油水溶液。混匀后冻于-70℃以得到冻存的种子。将冻存的种子融化后，取出0.25mL接种入含有25mL种子培养基(2.0％可溶性淀粉、2.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.5％酵母提取物(Oriental Yeast Co.，Ltd.公司制造)、0.25％氯化钠和0.32％碳酸钙，灭菌前的pH值为7.4)的250mL的锥形瓶中，并在旋转摇床内于28℃培养2天以得到种子培养肉汤。然后，将种子培养肉汤(0.5mL)接种到装有100mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、2.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.5％酵母提取物(Oriental Yeast Co.，Ltd.公司制造)、0.25％氯化钠和0.32％的碳酸钙，灭菌前的pH7.4)的500mL锥形瓶中，并在28℃旋转摇床内培养3天。
将每瓶得到的培养肉汤(100mL/500mL锥形瓶，10瓶)经3000转/分钟离心10分钟收集到微生物细胞，并将细胞悬浮于100mL的含50mM磷酸缓冲液(pH6.0)中。下一步，制备了100mg/mL溶于二甲亚砜的底物11107B物质的溶液，将每份1mL溶液加入。然后，28℃振摇24小时以实施转换反应。反应完后，收集反应液并经5000转/分钟离心20分钟后分成上清和菌丝体。上清用1L乙酸乙酯抽提。菌丝体用500mL甲醇提取并过滤，得到了甲醇抽提溶液。甲醇抽提溶液经蒸发以除掉甲醇，用1L乙酸乙酯抽提。每一乙酸乙酯层用水洗涤，并用无水硫酸钠干燥、脱水，合并层并经蒸发得到937mg粗级分。粗级分用于硅胶柱层析(Kiesel gel 60，50g)，并用1200ml的乙酸乙酯和正己烷混合液(90∶10；V/V)洗脱获得了234mg含11107D物质的级分。所得活性级分在下述制备性HPLC条件(C)下实施制备性高效液相色谱(HPLC)，并且所得的洗脱液在下述HPLC条件分析(c)下通过HPLC进行了分析。将溶剂从由此获得的含有11107D物质的级分去除后得到了80mg 11107D物质。
制备性HPLC条件(C)
柱：CAPCELL PAK C18UG120φ30mm×250mm(SHISEIDO CO.，公司制造)
流速：20mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/水(30∶70，V/V)，等度洗脱
HPLC分析条件(c)
柱：CAPCELL PAK C18SG120φ4.6mm×250mm(SHISEIDO CO公司制造)
温度：40℃
流速：1mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/水(35∶65，V/V)，等度洗脱
保留时间：11107D物质7.8分钟
实施例5 在烧瓶规模通过A-1544株的转换
与上述实施例4类似的方法将得到的A-1544菌株(FERM BP-8446)每瓶培养物(100mL/500mL锥形瓶，10瓶)经3000转/分钟离心10分钟，以收集微生物细胞，并将细胞悬浮于100mL 50mM磷酸缓冲液(pH6.0)中。然后，制备了100mg/mL溶于二甲亚砜的底物11107B物质。将每份1mL溶液加入。加入后，28℃振摇24小时以实施转换反应。反应完后，收集培养物并经5000转/分钟离心20分钟后分成上清和菌丝体。上清用1L的乙酸乙酯抽提。菌丝体用500mL的丙酮抽提并过滤，得到了丙酮抽提溶液。丙酮抽提溶液经蒸发以除掉丙酮，残留物用1L乙酸乙酯抽提。每一乙酸乙酯层用水洗涤，并用无水硫酸钠干燥、脱水，合并层并经蒸发得到945mg粗级分。粗级分用于硅胶柱层析(Kiesel gel 60，50g)，经100ml乙酸乙酯和正己烷混合液(50∶50；V/V)、乙酸乙酯和正己烷混合液(75∶25；V/V)(600mL)、200mL乙酸乙酯和n-己烷混合液(90∶10；V/V)洗脱获得了463mg含11107D物质的级分。在实施例4所述的制备性HPLC条件(C)下用制备性高效液相色谱(HPLC)对得到的级分进行色谱分析，并将所得的洗脱液在实施例4所述的HPLC分析条件(c)下用HPLC进行了分析。将溶剂从由此获得的含有11107D物质的级分去除后得到了304mg 11107D物质。
实施例6 F-1529菌株和F-1530菌株的分离
将从土壤中分离的所述菌株的斜面培养物(马铃薯葡萄糖琼脂)一菌环量接种到含有20mL种子培养基(2.0％马铃薯淀粉、1.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.1％磷酸二氢钾以及0.05％的7水合硫酸镁)的250mL锥形瓶中，并在旋转摇床内于25℃培养3天以得到种子培养基。然后，将0.6mL的种子培养肉汤接种到含有60mL生产培养基(2.0％马铃薯淀粉、1.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Aiinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.1％磷酸二氢钾以及0.05％的7水合硫酸镁)的500mL锥形瓶中，并在旋转摇床内于28℃培养4天。将2mL所得培养肉汤分装入每一15mL的试管中。将每支试管经3000转/分钟离心5分钟以收集微生物细胞，并将细胞悬浮于2mL的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。然后，制备了20mg/mL溶于二甲亚砜的底物11107B物质的溶液，并加入0.05mL溶液。加入后，28℃振摇23小时以实施羟基化反应。反应完后，在实施例4所述的HPLC分析条件(c)下用HPLC对反应混合物进行了分析，得到了其肉汤在HPLC中含有11107D物质的峰的F-1529菌株(FERM BP-8547)和F-1530菌株(FERM BP-8548)。
实施例7 在烧瓶规模通过F-1529菌株的转换
将被孢霉F-1529菌株(FERM BP-8547)的斜面培养物(马铃薯葡萄糖琼脂)一菌环量接种到含有25mL种子培养基(2.0％马铃薯淀粉、1.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.1％磷酸二氢钾以及0.05％的7水合硫酸镁)的250mL锥形瓶中，并在旋转摇床内于25℃培养2天以得到种子培养肉汤。然后，将0.6mL种子培养肉汤接种到每一含有60mL生产培养基(2.0％马铃薯淀粉、1.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.1％磷酸二氢钾以及0.05％的7水合硫酸镁)的500mL锥形瓶中，并在旋转摇床内于25℃培养3天。
每个烧瓶内的培养肉汤(60mL/500mL锥形瓶，18瓶)经3000转/分钟离心5分钟以收集微生物细胞，然后将细胞悬浮于60mL 50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。然后，制备了100mg/mL溶于二甲亚砜的底物11107B物质的溶液并将每份0.6mL溶液加入。加入后，25℃振摇22小时以完成转换反应。反应完后，培养肉汤经5000转/分钟离心20分钟后分成上清和菌丝体。上清用1L的乙酸乙酯抽提。菌丝体用500mL的丙酮抽提并过滤，得到了丙酮抽提溶液。丙酮抽提溶液经蒸发以去除丙酮，然后用1L乙酸乙酯抽提。每一乙酸乙酯层用水洗涤，并用无水硫酸钠干燥、脱水，合并所有层并经蒸发至干得到1.21g含11107D物质的粗级分。含11107D物质的粗级分用于硅胶柱层析(Kiesel gel 60，50g)，经1200ml乙酸乙酯和正己烷混合液(90∶10；V/V)洗脱获得了369mg含11107D物质的级分。
在实施例4所述的制备性高效液相色谱(HPLC)条件(C)下用制备性高效液相色谱(HPLC)对得到的级分进行色谱分析以得到含有11107D物质的洗脱级分。然后，将溶剂去除后得到了180mg的11107D物质。
实施例8 在烧瓶规模通过F-1530菌株的转换
将被孢霉F-1530菌株(FERM BP-8548)的斜面培养物(马铃薯葡萄糖琼脂)一菌环量接种到含有25mL种子培养基(2.0％马铃薯淀粉、1.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.1％磷酸二氢钾以及0.05％的7水合硫酸镁)的250mL锥形瓶中，并在旋转摇床内于25℃培养2天以得到种子培养基。然后，将0.6mL的种子培养肉汤接种到含有60mL生产培养基(2.0％马铃薯淀粉、1.0％葡萄糖、2.0％大豆粉(ESUSAN-MEAT，由Ajinomoto Co.，Ltd.公司制造)、0.1％磷酸二氢钾以及0.05％的7水合硫酸镁)的500mL锥形瓶中，并在旋转摇床内于25℃培养3天。
每个烧瓶内的培养肉汤(60mL/500mL锥形瓶，18瓶)经3000转/分钟离心5分钟以收集微生物细胞，然后将细胞悬浮于60mL的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。然后，制备了100mg/mL溶于二甲亚砜的底物11107B物质的溶液，并将每一份0.6mL溶液加入。加入后，25℃振摇22小时以完成转换反应。反应完后，培养肉汤经5000转/分钟离心20分钟后分成上清和菌丝体。上清用1L的乙酸乙酯抽提。菌丝体用500mL的丙酮抽提并过滤，得到丙酮抽提溶液。丙酮抽提溶液经蒸发以去除丙酮，然后用1L乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯层用水洗涤，并用无水硫酸钠干燥、脱水，合并层并经蒸发至干得到0.89g含11107D物质的粗级分。含11107D物质的粗级分用于硅胶柱层析(Kiesel gel 60，50g)，经1200ml乙酸乙酯和正己烷混合液(90∶10；V/V)然后经500mL乙酸乙酯的洗脱获得了163mg含11107D物质的粗级分。在实施例4所述的制备性高效液相色谱(HPLC)条件(C)下用制备性高效液相色谱(HPLC)对得到的级分进行色谱分析，以得到含有11107D物质的洗脱级分。然后，去除溶剂后得到了30mg的11107D物质。
实施例9AB-1896菌株的分离
将从土壤中分离的菌株的斜面培养物(0.5％可溶性淀粉、0.5％葡萄糖、0.1％鱼粉提取物(Wako Pure Chemical Industries，Ltd公司生产)、0.1％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)、0.2％的NZ-case(由Humko Sheffield Chemical Co公司制造)、0.2％氯化钠、0.1％碳酸钙和1.6％琼脂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd公司生产)的一菌环量接种到含有5mL种子培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由OrientalYeast Co.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在旋转摇床内于28℃培养10天以得到种子培养肉汤。然后将0.1mL的种子培养肉汤接种到含有5mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由OrientalYeast Co.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在旋转摇床内于28℃培养3天。然后，将种子培养肉汤(0.1mL)接种到装有5mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在28℃旋转摇床内培养3天。接下来，准备了40mg/mL溶于乙醇的底物11107B物质的溶液，并在培养物中加入0.05mL溶液。加入后于28℃振摇24小时以实施羟基化反应。反应完后，在下述的HPLC分析条件(d)下用HPLC对培养肉汤进行了分析，得到了形成11107D物质的AB-1896菌株。
HPLC分析条件(d)
柱：UNISON UK-C18，φ4.6mm×50mm (Imtakt公司制造)
温度：30℃
流速：2mL/分钟
检测：240nm
洗脱：水/乙腈/甲酸(1000∶10∶1至10∶1000∶1，V/V/V，0-4分钟，线性梯度)
保留时间：11107D物质2.5分钟。
实施例10试管规模内AB-1896菌株的转换
将AB-1896菌株的斜面培养物(0.5％可溶性淀粉、0.5％葡萄糖、0.1％鱼粉提取物(Wako Pure Chemical Industries，Ltd公司生产)、0.1％酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd公司制造)、0.2％的NZ-case(由HumkoSheffield Chemical Co公司制造)、0.2％氯化钠、0.1％碳酸钙和1.6％琼脂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd公司生产)的一菌环量接种到含有5mL种子培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(NihonPharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental YeastCo.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在旋转摇床内于28℃培养10天以得到种子培养肉汤。然后，将0.1mL的种子肉汤接种到含有5mL生产培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨(NihonPharmaceutical Co.，Ltd.公司生产)、0.5％酵母提取物(由Oriental YeastCo.，Ltd公司制造)和0.1％碳酸钙)的65mL试管中，并在28℃旋转摇床内培养3天。
然后，准备了40mg/mL溶于乙醇的底物11107B物质的溶液，并将0.05mL溶液加入到所得的培养肉汤(5mL/65mL试管)中。加入后于28℃振摇24小时以实施羟基化反应。分别收集3mL所得培养肉汤，将2mL的1-丁醇加入其中，摇匀，然后经3000转/分钟离心10分钟。去掉上清，制备了2mL残留物的甲醇溶液。按照下述HPLC分析条件(e)和(f)对其进行了HPLC分析以确定在反应混合物中形成了11107D物质。
HPLC分析条件(e)
柱：UNISON UK-C18，φ4.6mm×50mm(Imtakt公司制造)
温度：40℃
流速：2mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/0.01％三氟乙酸(2∶8至5∶5，V/V，0-10分钟，线性梯度)
保留时间：11107D物质6.1分钟。
HPLC分析条件(f)
柱：UNISON UK-C18，φ4.6mm×50mm(Imtakt公司制造)
温度：40℃
流速：2mL/分钟
检测：240nm
洗脱：乙腈/0.01％三氟乙酸(4∶6至7∶3，V/V，0-10分钟，线性梯度)
保留时间：11107D物质6.1分钟。
序列表
<110>美露香株式会社
卫材株式会社
<120>大环内酯化合物的产生方法
<130>03074PCT
<160>11
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gtagtcatat gcttgtct 18
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gcaagtctgg tgccagcagc c 21
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
aacttaaagg aattgacgga ag 22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gaggcaataa caggtctgtg atg 23
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cgttcagacc acggtcgtcg g 21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttgaatttcc ttaactgcct tc 22
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ctccgttatt gtccagacac tac 23
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aggcatccac ttggacgcct 20
<210>9
<211>1733
<212>DNA
<213>被孢霉F-1529株
<400>9
aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa acaactttgt actgtgaaac tgcgaatggc 60
tcattaaatc agttatagtt tatttgatta taccttacta cttggataac cgtggtaatt 120
ctagagctaa tacatgctaa aaatcccgac ttctggaagg gatgtattta ttagataaaa 180
aaccaatgcg ggcaaccgct tttctggtga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct 240
tgtgctagcg atgtttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg 300
cctaccatgg ttttaacggg taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga 360
gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgatacgg 420
ggaggtagtg acaataaata acaatacagg gctttatagt cttgtaattg gaatgagtac 480
aatttaaatc tcttaacgag gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta 540
attccagctc caatagcgta tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaattt 600
taggtctggt tggacggtct gctctctagg gtttgtactg tcctgaccgg gccttacctt 660
ctggtgagct gtcgtgttgt ttactcagtg cggcagggaa ccaggacttt tactttgaaa 720
aaattagagt gtttaaagca ggcattcgct tgaatacatt agcatggaat aatagaatag 780
gactttggtt ctattttgtt ggtttctagg accgaagtaa tgattaatag ggatagttgg 840
gggcattagt atttaattgt cagaggtgaa attcttggat ttattaaaga ctaacttctg 900
cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac 960
gatcagatac cgtcgtagtc ttaaccataa actatgccga ctagggatca ggcaaggata 1020
ttttgacttg tttggcacct tatgagaaat caaagttttt gggttccggg gggagtatgg 1080
tcgcaaggct gaaacttaaa ggaattgacg gaagggcacc accaggagtg gagcctgcgg 1140
cttaatttga ctcaacacgg ggaaactcac caggtccaga catagtaagg attgacagat 1200
tgagagctct ttcttgattc tatgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg 1260
atttgtctgg ttaattccgt taacgaacga gaccttaacc tgctaaatag ttaggtcaac 1320
gattgttgat cgtcaacttc ttagagggac tattgactat tagtcaatgg aagtttgagg 1380
caataacagg tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgatcaa 1440
gtcaacgagt ttacaacctt ggccggaagg tctgggtaat cttttgaaac ttgatcgtgc 1500
tggggatagt ccattgcaat tattggactt caacgaggaa ttcctagtaa gcgtgagtca 1560
tcagctcgcg ttgattacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt 1620
gaatggctta gtgaggcttt cggattggac tttggcagct ggcaacagca gctagggact 1680
gaaaagtcat ccaaacttgg tcatttagag gaagtaaaag tcgtaacaag gtt 1733
<210>10
<211>1731
<212>DNA
<213>被孢霉F-1530株
<400>10
aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa acaactttgt actgtgaaac tgcgaatggc 60
tcattaaatc agttatagtt tatttgatta taccttacta cttggataac cgtggtaatt 120
ctagagctaa tacatgctaa aaatcccgac ttctggaagg gatgtattta ttagataaaa 180
aaccaatgcg ggcaaccgct tttctggtga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct 240
tgtgctagcg atgtttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg 300
cctaccatgg ttttaacggg taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga 360
gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgatacgg 420
ggaggtagtg acaataaata acaatacagg gctttatagt cttgtaattg gaatgagtac 480
aatttaaatc tcttaacgag gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta 540
attccagctc caatagcgta tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaattt 600
taggcctggt tggacggtct gctctagggt ttgtactgtc ctgactgggt cttaccttct 660
ggtgagctgt cgtattgttt actcagtgcg gcagggaacc aggactttta ctttgaaaaa 720
attagagtgt ttaaagcagg cattcgcttg aatacattag catggaataa tagaatagga 780
ctttggttct attttgttgg tttctaggac cgaagtaatg attaataggg atagttgggg 840
gcattagtat ttaattgtca gaggtgaaat tcttggattt attaaagact aacttctgcg 900
aaagcatttg ccaaggatgt tttcattaat caagaacgaa agttagggga tcgaagacga 960
tcagataccg tcgtagtctt aaccataaac tatgccgact agggatcagg caaggatatt 1020
ttgacttgtt tggcacctta tgagaaatca aagtttttgg gttccggggg gagtatggtc 1080
gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggagtgga gcctgcggct 1140
taatttgact caacacgggg aaactcacca ggtccagaca tagtaaggat tgacagattg 1200
agagctcttt cttgattcta tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttg gtggagtgat 1260
ttgtctggtt aattccgtta acgaacgaga ccttaacctg ctaaatagtt aggccaacgt 1320
ttgttggtcg tcaacttctt agagggacta ttgactatta gtcaatggaa gtttgaggca 1380
ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgatcaagt 1440
caacgagttt acaaccttgg ccggaaggtc tgggtaatct tttgaaactt gatcgtgctg 1500
gggatagtcc attgcaatta ttggacttca acgaggaatt cctagtaagc gtgagtcatc 1560
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atggcttagt gaggctttcg gattggactt tggcagctgg caacagcagc tagggactaa 1680
aaagtcatcc aaacttggtc atttagagga agtaaaagtc gtaacaaggt t 1731
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
gtgtttgatc ctggctcag 19
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gtattaccgc ggctgctg 18
<210>13
<211>414
<212>DNA
<213>AB-1896
<400>13
gtcgagcgga aggcccttcg gggtactcga gcggcgaacg ggtgagtaac acgtgagcaa 60
cctgccctag gctttgggat aaccccggga aaccggggct aataccgaat atgacttctg 120
gtcgcatgac cggtggtgga aagtttttcg gcctgggatg ggctcgcggc ctatcagctt 180
gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg 240
ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 300
acaatgggcg gaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta 360
aacctctttc agcagggacg aagcgtaagt gacggtacct gcagaagaag cgcc 414
Claims (7)
1.式(II)所示大环内酯化合物11107D的产生方法：
其中大环内酯化合物11107D是由式(I)所示的大环内酯化合物11107B通过生物转化方法而产生，该方法包括下列步骤(A)和步骤(B)：
(A)将式(I)所示的大环内酯化合物11107B在具有进行前述生物转化方法的能力并属于被孢霉属、链霉菌属或小单孢菌科的菌株存在下或在其经培养菌丝体的制备物存在下孵育的步骤；以及
(B)从步骤(A)所获得的孵育液中收集式(II)所示的大环内酯化合物11107D的步骤。
2.根据权利要求1所述的产生方法，其中属于被孢霉属的菌株是被孢霉F-1529株(FERM BP-8547)或F-1530株(FERM BP-8548)。
3.根据权利要求1所述的产生方法，其中属于链霉菌属的菌株是链霉菌AB-1704株(FERM BP-8551)、A-1544株(FERM BP-8446)或A-1545株(FERM BP-8447)。
4.根据权利要求1所述的产生方法，其中属于小单孢菌科的菌株是AB-1896株(FERM BP-8550)。
5.链霉菌AB-1704株(FERM BP-8551)，其具有将上述式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成上述式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力。
6.被孢霉F-1529株(FERM BP-8547)或F-1530株(FERMBP-8548)，其具有将上述式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成上述式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力。
7.AB-1896株(FERM BP-8550)，其具有将上述式(I)所示的大环内酯化合物11107B转化成上述式(II)所示的大环内酯化合物11107D的能力。
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