ES2887201T3 - Variantes de empalme asociadas con mutantes neomórficos de SF3B1 - Google Patents

Variantes de empalme asociadas con mutantes neomórficos de SF3B1 Download PDF

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Jacob Feala
Silvia Buonamici
Yoshiharu Mizui
Peter Smith
Ping Zhu
Eunice Park
Michael Seiler
Marco Fekkes
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Abstract

Un método de identificación de un paciente que tiene cáncer con una mutación de SF3B1 neomórfica, que comprende detectar o medir la cantidad de una o más variantes de empalme seleccionadas de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 230 en una muestra que comprende una o más células del paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de empalme asociadas con mutantes neomórficos de SF3B1
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. La copia ASCII, creada el 16 de mayo de 2014, se denomina 12636.6-304_SL.txt y es de 183 kilobytes de tamaño.
El empalme del ARN, un acontecimiento molecular altamente regulado orquestado por el empalmosoma, provoca la eliminación de secuencias intrónicas del preARNm para generar el ARNm maduro. La desregulación del empalme del ARN se ha identificado como un efecto causante en varias enfermedades. Además, se ha propuesto que el empalme desregulado desempeña una función importante en la tumorigénesis y la resistencia a tratamiento; sin embargo, las causas moleculares del empalme desregulado en cáncer siguen siendo elusivas.
SF3B1 es una proteína implicada en el empalme del ARN. Forma parte del complejo de RNPnp U2 que se une al preARNm en una región que contiene el sitio de punto de ramificación y está implicado en al reconocimiento temprano y estabilización del empalmosoma en el sitio de empalme 3' (ss 3'). Se necesita un análisis profundo y sistemático de los efectos de las mutaciones de SF3B1 para definir sus efectos sobre el empalme del ARN en células y puede dar lugar a estrategias terapéuticas novedosas para cánceres mutantes de SF3B1.
Youzhong Wan et al. divulga que la mutación de SF3B1 altera la selección de sitios de empalme del ARN 3' en leucemia linfocítica crónica (véase Blood, 2013, 122(21); 117).
La descripción proporcionada en este documento demuestra que determinadas mutaciones de SF3B1 provocan actividad neomórfica con la producción de alteraciones de empalme conocidas y novedosas. Además, se identificaron aberraciones de empalme específicas de estirpe en leucemia linfocítica crónica (CLL), melanoma y cáncer de mama. Además, el tratamiento de líneas celulares cancerosas mutantes de SF3B1, xenoinjertos y muestras de pacientes con CLL con moduladores de SF3B1 redujo el empalme aberrante e indujo regresión tumoral.
Sumario
Los métodos descritos en este documento implican detectar o cuantificar la expresión de una o más variantes de empalme en una célula que contiene una proteína SF3B1 mutante neomórfica. Diversas realizaciones de la invención incluyen detectar o cuantificar variantes de empalme para determinar si un paciente tiene un cáncer con una o más mutaciones neomórficas de SF3B1. Realizaciones adicionales incluyen medir la cantidad de una variante de empalme para evaluar los efectos de un compuesto sobre una proteína SF3B1 mutante. Realizaciones adicionales incluyen compuestos moduladores de SF3B1 para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene células cancerosas con una proteína SF3B1 mutante neomórfica. Estas realizaciones se describen en más detalle en las reivindicaciones.
Diversas realizaciones abarcan un método de detección de una o más variantes de empalme seleccionadas de la tabla 1 en una muestra biológica, que comprende:
a) proporcionar una muestra biológica sospechosa de contener una o más variantes de empalme;
b) poner en contacto la muestra biológica con una o más sondas de ácido nucleico que pueden hibridar específicamente con la una o más variantes de empalme, y
c) detectar la unión de la una o más sondas a la una o más variantes de empalme.
En algunas realizaciones, la una o más sondas de ácido nucleico que pueden hibridar específicamente con la una o más variantes de empalme comprenden cada una un marcador. En algunas realizaciones, el método de detección de una o más variantes de empalme seleccionadas de la tabla 1 en una muestra biológica comprende además poner en contacto la muestra biológica con una o más sondas de ácido nucleico adicionales, en el que las sondas adicionales están marcadas cada una con un código de barras molecular.
También se divulgan métodos de modulación de la actividad de una proteína SF3B1 mutante neomórfica en una célula diana, que comprenden aplicar un compuesto modulador de SF3B1 a la célula diana, en los que se ha determinado que la célula diana expresa una o más variantes de empalme aberrantes seleccionadas de la tabla 1 a un nivel que está aumentado a o disminuido con respecto al nivel en una célula que no tiene la proteína SF3B1 mutante neomórfica.
También se divulgan métodos para evaluar la capacidad de un compuesto para modular la actividad de una proteína SF3B1 mutante neomórfica en una célula diana, que comprenden las etapas de:
a) proporcionar una célula diana que tiene una proteína SF3B1 mutante;
b) aplicar el compuesto a la célula diana; y
c) medir el nivel de expresión de una o más variantes de empalme seleccionadas de la tabla 1.
También se divulgan métodos para evaluar la capacidad de un compuesto de modular la actividad de una proteína SF3B1 mutante neomórfica en una célula diana, que comprenden además la etapa de medir el nivel de expresión de una o más variantes de empalme seleccionadas de la tabla 1 antes de la etapa (b).
En algunas realizaciones, la proteína SF3B1 mutante neomórfica se selecciona de K700E, K666N, R625C, G742D, R625H, E622D, H662Q, K666T, K666E, K666R, G740E, Y623C, T663I, K741N, N626Y, T663P, H662R, G740V, D781E, o R625L. En algunas realizaciones, la proteína SF3B1 mutante neomórfica se seleccionada de E622D, E622K, E622Q, E622V, Y623C, Y623H, Y623S, R625C, R625G, R625H, R625L, R625P, R625S, N626D, N626H, N626I, N626S, N626Y, H662D, H662L, H662Q, H662R, H662Y, T663I, T663P, K666E, K666M, K666N, K666Q, K666R, K666S, K666T, K700E, V701A, V701F, V701I, I704F, I704N, I704S, I704V, G740E, G740K, G740R, G740V, K741N, K741Q, K741T, G742D, D781E, D781G, o D781N.
En algunas realizaciones, la etapa de medir el nivel de expresión de una o más variantes de empalme comprende usar un ensayo para cuantificar un ácido nucleico seleccionado de generación de código de barras de ácido nucleico (por ejemplo, NanoString®), RT-PCR, micromatriz, secuenciación de ácido nucleico, sondas de nanopartícula (por ejemplo, SmartFlare™) e hibridación in situ (por ejemplo, RNAscope®).
En algunas realizaciones, la etapa de medir el nivel de expresión de una o más variantes de empalme comprende medir el número de copias del uno o más ARN variantes de empalme en la célula diana.
En otras realizaciones, el compuesto se selecciona de una molécula pequeña, un anticuerpo, una molécula de antisentido, un aptámero, una molécula de ARN y un péptido. En otras realizaciones, la molécula pequeña se selecciona de pladienolida y un análogo de pladienolida. En realizaciones adicionales, el análogo de pladienolida se selecciona de pladienolida B, pladienolida D, E7107, un compuesto de fórmula 1:
Figure imgf000003_0001
un compuesto de fórmula 2:
Figure imgf000003_0002
un compuesto de fórmula 3:
Figure imgf000003_0003
o un compuesto de fórmula 4:
La célula diana puede obtenerse de un paciente sospechoso de tener síndrome mielodisplásico, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielomonocítica crónica o leucemia mieloide aguda. En algunas realizaciones, la célula diana se obtiene de una muestra seleccionada de sangre o una fracción de la sangre o es una célula cultivada derivada de una célula obtenida de una muestra elegida de sangre o una fracción de la sangre. En algunas realizaciones, la célula diana es un linfocito.
En otras realizaciones, la célula diana se obtiene de un tumor sólido. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula de tejido mamario, célula pancreática, célula pulmonar o célula de piel.
Realizaciones abarcan además un compuesto modulador de SF3B1 para su uso en un método para tratar a un paciente con un trastorno neoplásico, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto modulador de SF3B1 al paciente, en el que una célula del paciente se ha determinado que:
a) contiene una proteína SF3B1 mutante neomórfica; y
b) expresa una o más variantes de empalme aberrantes seleccionadas de la tabla 1 a un nivel que está aumentado o disminuido con respecto al nivel en una célula que no tiene la proteína SF3B1 mutante neomórfica.
Se exponen realizaciones adicionales en la descripción que sigue.
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas únicamente y no son restrictivas de la invención, que se reivindica.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático que representa modos de empalme alternativo.
La figura 2 es un gráfico que representa niveles de expresión génica para genes con empalme anómalo entre diferentes cánceres en muestras de pacientes.
La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra las ubicaciones de determinadas mutaciones neomórficas en la proteína SF3B1 y regiones codificantes correspondientes del gen SF3B1.
La figura 4 es un gráfico que representa los niveles de variantes de empalme aberrantes detectados en ARN aislado de líneas celulares pancreáticas, de cáncer pulmonar y Nalm-6 isogénicas usando un ensayo NanoString®. Los datos se representan como la media de tres réplicas.
La figura 5 es un conjunto de imágenes de inmunoelectrotransferencia que confirman la sobreexpresión de proteínas SF3B1 en células 293FT.
La figura 6 es un gráfico que representa los niveles de variantes de empalme aberrantes en ARN aislado de células 293FT que expresan SF3B1 de tipo silvestre (SF3B1WT) o proteínas SF3B1 mutantes, medidos en un ensayo NanoString®. Los datos se representan como la media de tres réplicas.
La figura 7 es un conjunto de imágenes de inmunoelectrotransferencia que confirman la sobreexpresión de proteínas SF3B1 en células 293FT.
La figura 8 es un gráfico que representa los niveles de variantes de empalme aberrantes en ARN aislado de células 293FT que expresan SF3B1WT o proteínas SF3B1 mutantes, medidos en un ensayo NanoString®.
La figura 9A representa un conjunto de imágenes de inmunoelectrotransferencia que muestran la expresión de alelos SF3B1 antes y después de la atenuación con ARNhc en células Panc 05.04. La figura 9B representa un gráfico que muestra los niveles de ARN de SF3B1 detectados por qPCR en células Panc 05.04 antes y después de atenuación con ARNhc de todos los alelos SF3B1 (SF3B1PAN) o s F3B1wt o alelos SF3B1 mutantes (SF3B1MUT). Los datos de qPCR se representan como cambio factorial con respecto a pLKO sin tratar con doxiciclina (media ± DT, n = 3). Las barras rellenas negras, perfiladas y grises indican datos de qPCR específica de alelo SF3B1PAN, SF3B1WT y SF3B1MUT, respectivamente.
La figura 10A representa un conjunto de imágenes de inmunoelectrotransferencia que muestran la expresión de alelos SF3B1 antes y después de la atenuación con ARNhc en células Panc 10.05. La figura 10B representa un gráfico que muestra los niveles de ARN de SF3B1 detectados por qPCR en células Panc 10.05 antes y después de atenuación con ARNhc de alelos SF3B1. Los datos de qPCR se representan como cambio factorial con respecto a pLKO sin tratar con doxiciclina (media ± DT, n = 3). Las barras rellenas negras, perfiladas y grises indican datos de qPCR específica de alelo SF3B1PAN, SF3B1WT y SF3B1MUT, respectivamente.
Las figuras 11A y 11B son un conjunto de gráficos que representan los niveles de variantes de empalme en células Panc 05.04 (figura 11A) y Panc 10.05 (figura 11B) antes y después de atenuación con ARNhc de alelos SF3B1, medidos en un ensayo NanoString®. Los datos se representan como media de tres réplicas biológicas.
La figura 12 es un conjunto de gráficos que representan las curvas de crecimiento de células Pane 05.04 antes (círculos) y después (cuadrados) de atenuación con ARNhc de alelos SF3B1.
La figura 13 es un conjunto de gráficos que representan las curvas de crecimiento de células Panc 10.05 antes (círculos) y después (cuadrados) de atenuación con ARNhc de alelos SF3B1.
Las figuras 14A y 14B son un conjunto de imágenes de placas de cultivo que muestran la formación de colonias de células Panc 05.04 (figura 14A) y Panc 10.05 (figura 14B) antes y después de atenuación con ARNhc de alelos SF3B1.
Las figuras 15A y 15B son un conjunto de gráficos que muestran el nivel de empalme de sustrato Ad2 de preARNm en extractos nucleares de (figura 15A) células 293F que expresan SF3B1WT o SF3B1K700E con marca Flag (paneles izquierdo y derecho [círculos y triángulos], respectivamente) y (figura 15B) células Nalm-6 (SF3B1WT) y Nalm-6 SF3B1K700E (paneles izquierdo y derecho [círculos y triángulos], respectivamente) tratadas con concentraciones variables de E7101, Los datos se representan como media ± DT, n = 2.
La figura 16A representan un par de gráficos que muestran la unión de un análogo de E7107 radiomarcado a SF3B1WT (círculos, panel izquierdo) o SF3B1K700E (triángulos, panel derecho) después de incubación de las proteínas con concentraciones variables de E7107. La figura 16B representa panales superiores, un par de gráficos que muestran los niveles de preARNm de EIF4A1 (cuadrados) y ARN maduro de SLC25A19 (triángulos invertidos) en células Nalm-6 SF3B1K700K (panel izquierdo) y células Nalm-6 SF3B1K700E (panel derecho) tratadas con concentraciones variables de E7107, medidos por qPCR. La figura 16B representa paneles inferiores, un par de gráficos que muestran los niveles de isoformas con empalme anómalo de genes con empale anómalo COASY (triángulos) y ZDHHC16 (rombos) en células Nalm-6 SF3B1K700K (panel izquierdo) y células Nalm-6 SF3B1K700E (panel derecho) tratadas con concentraciones variables de E7107, medidos por qPCR. Los datos de qPCR en (figura 16B) se presentan como media ± DT (n = 3).
La figura 17 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme en células Nalm-6 SF3B1K700K y Nalm-6 SF3B1K700E después de tratamiento de las células con E7107 durante dos o seis horas, medidos en un ensayo NanoString®. Los datos se expresan como cambio factorial de tratamiento solamente con DMSO.
La figura 18 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme en células Nalm-6 SF3B1K700K y Nalm-6 SF3B1K700E después de tratamiento de las células con E7107 durante seis horas, medidos por análisis de secuencia de ARN.
La figura 19 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme en células Nalm-6 SF3B1K700K y Nalm-6 SF3B1K700E después de tratamiento de las células con los compuestos numerados indicados encima de los gráficos, medidos por análisis de secuencia de ARN.
La figura 20 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme en células Nalm-6 SF3B1K700K y Nalm-6 SF3B1K700E en momentos variables después de tratamiento de las células con E7107, medidos por qPCR de ARN. Los datos se representan como media ± DT (n = 3). Los paneles superiores de la figura 20 representan los niveles de preARNm de EIF4A1 (cuadrados) y ARN maduro de SLC25A19 (triángulos invertidos) en células Nalm-6 SF3B1K700K (panel izquierdo) y células Nalm-6 SF3B1K700E (panel derecho) detectados en determinados momentos después de tratamiento con E7107. Los paneles inferiores de la figura 20 representan niveles de isoformas de empalme anómalo de genes con empalme anómalo COASY (triángulos) y ZDHHC16 (rombos) en células Nalm-6 SF3B1K700K (panel izquierdo) y células Nalm-6 SF3B1K700E (panel derecho) detectados en determinados momentos después de tratamiento con E7107. Los círculos vacíos muestran la concentración de E7107 (en pg/ml [eje vertical derecho]) determinada por espectrometría de masas de muestras de tumor.
La figura 21 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme canónicas y aberrantes en tumores de xenoinjerto Nalm-6 SF3B1K700K y Nalm-6 SF3B1K700E (conjuntos izquierdo y derecho de paneles, respectivamente) en determinados puntos temporales después de tratamiento de ratones con xenoinjerto con E7107, medidos en un ensayo NanoString®. Los datos se representan como media de tres réplicas.
La figura 22 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme canónicas y aberrantes en tumores de xenoinjerto Panc 05.04 en determinados puntos temporales después de tratamiento de ratones con xenoinjerto con E7107 a diversas concentraciones, medidos en un ensayo NanoString® (n = 4 ratones para cada grupo).
La figura 23 es un gráfico que representa volumen tumoral (mostrado como media ± ETM) en ratones con xenoinjerto Nalm-6 SF3B1K700E después de tratamiento con E7107, con ratones de control tratados con vehículo mostrados mediante círculos vacíos (n = 10 animales para cada grupo). Para animales tratados con E7107, triángulos invertidos = 1,25 mg/kg, triángulos = 2,5 mg/kg y cuadrados = 5 mg/kg.
La figura 24 es un gráfico que representa tasas de supervivencia en cohortes de 10 animales de ratones con xenoinjerto Nalm-6 SF3B1K700E después de tratamiento con E7107, con una cohorte sin tratar mostrada por la línea negra rellena. Para animales tratados con E7107, línea discontinua = 1,25 mg/kg, línea gris = 2,5 mg/kg y línea de puntos = 5 mg/kg.
La figura 25 es un conjunto de gráficos que representan niveles de variantes de empalme en muestras de células CLL SF3B1WT y neomórficas SF3B1 mutantes después de tratamiento con E7107 10 nM durante 6 horas, medidos por análisis. Los datos se representan como valores medios (n = 3).
Descripción
En determinados aspectos, los métodos de la invención proporcionan ensayos para medir la cantidad de una variante de empalme en una célula, determinando de ese modo si un paciente tiene un cáncer con una mutación neomórfica de SF3B1. En algunas realizaciones, al menos una de las variantes de empalme medidas es una variante de empalme aberrante asociada con una mutación neomórfica en una proteína SF3B1. En aspectos adicionales, la medición de una variante de empalme en una célula puede usarse para evaluar la capacidad de un compuesto de modular una proteína SF3B1 neomórfica mutante en una célula.
Para ayudar a entender la presente invención, en primer lugar, se definen determinados términos. Se proporcionan definiciones adicionales en toda la solicitud.
Como se usa en este documento, la expresión "proteína SF3B1 mutante" incluye proteínas SF3B1 que difieren en la secuencia de aminoácidos de la proteína SF3B1 de tipo silvestre humana expuesta en SEQ ID NO:1200 (número de acceso de GenBank NP_036565, versión NP_036565.2) (S. Bonnal, L. Vigevani, y J. Valcárcel, "The spliceosome as a target of novel antitumour drugs," Nat. Rev. Drug Discov. 11:847-59 [2012]). Determinadas proteínas SF3B1 mutantes son mutantes "neomórficas", que se refieren a proteínas SF3B1 mutantes que están asociadas con expresión diferencial de variantes de empalme aberrantes. En determinadas realizaciones, los mutantes de SF3B1 neomórficos incluyen K700E, K666N, R625C, G742D, R625H, E622D, H662Q, K666T, K666E, K666R, G740E, Y623C, T663I, K741N, N626Y, T663P, H662R, G740V, D781E, o R625L. En otras realizaciones, los mutantes de SF3B1 neomórficos incluyen E622D, E622K, E622Q, E622V, Y623C, Y623H, Y623S, R625C, R625G, R625H, R625L, R625P, R625S, N626D, N626H, N626I, N626S, N626Y, H662D, H662L, H662Q, H662R, H662Y, T663I, T663P, K666E, K666M, K666N, K666Q, K666R, K666S, K666T, K700E, V701A, V701F, V701I, I704F, I704N, I704S, I704V, G740E, G740K, G740R, G740V, K741N, K741Q, K741T, G742D, D781E, D781G, o D781N. Determinadas mutaciones SF3B1 no están asociadas con la expresión de variantes de empalme aberrantes, incluyendo K700R.
La expresión "variante de empalme", como se usa en este documento, incluye secuencias de ácido nucleico que abarcan una unión entre dos secuencias exónicas o a través de un límite entre intrón y exón en un gen, donde la unión puede tener empalme alternativo. El empalme alternativo incluye selección de sitio de empalme 3' alterno ("ss 3'"), selección de sitio de empalme 5' alterno ("ss 5'"), inclusión diferencial de exones, salto de exones y retención de intrones (figura 1). Determinadas variantes de empalme asociadas con una ubicación genómica dada pueden denominarse variantes de tipo silvestre o "canónicas". Estas variantes de empalme se expresan muy abundantemente en células que no contienen una proteína SF3B1 mutante neomórfica. Variantes de empalme adicionales pueden denominarse variantes de empalme "aberrantes", que difieren de la variante de empalme canónica y están asociadas principalmente con la presencia de una proteína SF3B1 mutante neomórfica en una célula. Las variantes de empalme aberrantes pueden denominar, como alternativa, variantes de empalme "anómalas" o "no canónicas". En determinadas circunstancias, las células con una proteína SF3B1 de tipo silvestre o no neomórfica tienen cantidades bajas o indetectadas de una variante de empalme aberrante, mientras que las células con una proteína SF3B1 neomórfica tienen niveles de una variante de empalme aberrante que están elevados con respecto a los niveles bajo o indetectados en las células con SF3B1 de tipo silvestre. En algunos casos, una variante de empalme aberrante es una variante de empalme que está presente en una célula con SF3B1 de tipo silvestre, pero se expresa de forma diferencial en una célula que tiene un mutante de SF3B1 neomórfico, por lo que la última célula tiene un nivel de la variante de empalme aberrante que está elevado o reducido con respecto al nivel en la célula con SF3B1 de tipo silvestre. Diferentes tipos de células que contienen un mutante de SF3B1 neomórfico, tales como diferentes tipos de células cancerosas, pueden tener niveles diferentes de expresión de determinadas variantes de empalme aberrantes. Además, determinadas variantes de empalme aberrantes presentes en un tipo de célula que contiene un mutante de SF3B1 neomórfico pueden no estar presentes en otros tipos de células que contienen un mutante de SF3B1 neomórfico. En algunos casos, pacientes con una proteína SF3B1 mutante neomórfica pueden no expresar una variante de empalme aberrante o pueden expresar una variante de empalme aberrante a niveles inferiores, debido a la baja frecuencia alélica del alelo SF3B1 neomórfico. La identidad y niveles de expresión relativos de variantes de empalme aberrantes asociadas con diversos tipos de células que contienen mutantes de SF3B1 neomórficos, tales como determinadas células cancerosas, serán evidentes a partir de la descripción y ejemplos proporcionados en este documento.
El término "evaluar" incluye determinar la capacidad de un compuesto para tratar una enfermedad asociada con una mutación neomórfica de SF3B1. En algunos casos, "evaluar" incluye determinar si un compuesto modula acontecimientos de empalme aberrante, o el grado en que lo hace, asociados con una proteína SF3B1 neomórfica. La modulación de la actividad de una proteína SF3B1 puede abarcar la regulación por aumento o la regulación por disminución de la expresión de variantes de empalme aberrantes asociada con una proteína SF3B1 neomórfica.
Además, "evaluar" incluye distinguir pacientes que pueden tratarse satisfactoriamente con un compuesto que modula la expresión de variantes de empalme asociadas con una proteína SF3B1 neomórfica.
El uso de la palabra "un/o", "una" o "el/la" cuando se usa junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". "O" tiene que leerse de forma inclusiva para indicar "y/o", salvo que se indique explícitamente que se refiera a alternativas solamente, tal como cuando las alternativas son mutuamente excluyentes.
Variantes de empalme
Las variantes de empalme de la invención se enumeran en la tabla 1. La tabla 1 proporciona la ubicación genómica de cada unión de empalme canónica ("WT") y aberrante ("Ab."), así como la secuencia. Cada secuencia enumerada en la tabla contiene 20 nucleótidos de cada uno de los lados 3' y 5' de una unión de empalme (es decir, la unión de empalme está en el punto medio de la secuencia de nucleótidos enumerada). Las columnas de "% prom. WT" y "% prom. Ab." proporcionan el recuento porcentual promedio que la variante de empalme canónica (WT) o aberrante, respectivamente, representaba de los recuentos totales de todas las variantes de empalme que utilizan un sitio de empalme compartido, donde los recuentos se determinaron como se expone en el ejemplo 1. La columna de "cambio factorial log2" proporciona el log2 del cambio factorial observado entre los recuentos porcentuales de cohortes canónicas y aberrantes (véase el ejemplo 1). La columna de "valor de Q FDR" proporciona, como una medida de significación estadística, valores de q calculados usando el procedimiento de Benjamini-Hochberg de valores de p, que a su vez se determinaron usando el ensayo de la t moderada definido en el paquete limma de Bioconductor (disponible en http://www.bioconductor.org) (véase el ejemplo 1). La columna de "acontecimiento" indica la naturaleza de la variante de empalme aberrante, donde "ss 3'" indica selección de sitio de empalme 3' alterno, "ss 5'" indica selección de sitio de empalme 5' alterno, "incl. exón" indica inclusión diferencial de exones y "salto exón" indica salto de exones. La columna de "tipo" se refiere al tipo de cáncer de la muestra en que la variante de empalme aberrante se identificó, donde "Br." indica cáncer de mama, "CLL" indica leucemia linfocítica crónica y "Mel." indica melanoma.
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Determinadas variantes de empalme están asociadas con más de una enfermedad y, por tanto, aparecen en la tabla 1 más de una vez. En determinados casos, las variantes de empalme asociadas con más de un tipo de cáncer pueden tener diferentes niveles de expresión en cada enfermedad, de modo que puede haber más de un conjunto de datos de expresión para una variante de empalme dada. Las variantes expresadas de manera diferencial entre todos los tipos de cáncer ensayados pueden usarse para evaluar células que tienen mutaciones neomórficas de SF3B1 en tipos de cáncer adicionales. Dichas variantes se muestran en las siguientes filas de la tabla 1 (los triplicados representan la misma unión de empalme, medida en diferentes tipos de cáncer): [21, 372, 545], [31, 279, 528], [81, 543, 443], [51, 426, 548] y [118, 401,566]. En determinadas realizaciones, las variantes que son no específicas para un tipo de cáncer particular pueden elegirse de las siguientes filas de la tabla 1: [21,372, 545], [31,279, 528], [81,543, 443] o [51,426, 548].
Determinadas realizaciones de la invención proporcionan variantes de empalme como marcadores de cáncer. En determinadas circunstancias, las células cancerosas con una proteína SF3B1 neomórfica demuestran expresión diferencial de determinadas variantes de empalme en comparación con células sin una proteína SF3B1 neomórfica. La expresión diferencial de una o más variantes de empalme, por lo tanto, puede usarse para determinar si un paciente tiene cáncer con una mutación neomórfica de SF3B1. En determinadas realizaciones, también se determina que el paciente tiene una célula cancerosa que tiene una proteína SF3B1 mutante. En estos métodos, una o más de las variantes de empalme enumeradas en la tabla 1 pueden medirse para determinar si un paciente tiene cáncer con una mutación neomórfica de SF3B1. En determinadas realizaciones, se mide una o más variantes de empalme aberrantes de la tabla 1. En otras realizaciones, se mide una o más variantes de empalme canónicas. A veces, se miden tanto las variantes aberrantes como las canónicas.
En algunas realizaciones, puede medirse una o más variantes de empalme aberrantes seleccionadas de las filas 279, 372 o 443 de la tabla 1 en un paciente sospechoso de tener CLL. En realizaciones adicionales, puede identificarse un paciente sospechoso de tener CLL midiendo las cantidades de una o más de las siguientes variantes de empalme aberrantes enumeradas en la tabla 1: fila 443. En realizaciones adicionales, puede identificarse un paciente sospechoso de tener CLL midiendo las cantidades de una o más de las siguientes variantes de empalme aberrantes enumeradas en la tabla 1: fila 443. En otras realizaciones adicionales, puede identificarse un paciente sospechoso de tener CLL midiendo la cantidad de una o más de las siguientes variantes de empalme aberrantes enumeradas en la tabla 1: fila 433.
En otras realizaciones, puede medirse una o más variantes de empalme aberrantes seleccionadas de las filas 21, 31 u 81 de la tabla 1 en un paciente sospechoso de tener cáncer de mama.
En realizaciones adicionales, puede medirse una o más variantes de empalme aberrantes seleccionadas de las filas 528, 543 o 545 de la tabla 1 en un paciente sospechoso de tener melanoma.
La una o más de las variantes aberrantes se seleccionan de las filas 21,31,51,81, 118, 279, 372, 401,426, 443, 528, 543, 545, 548 o 566 de la tabla 1. Un paciente sospechoso de tener cáncer puede identificarse midiendo la cantidad de una o más de las variantes aberrantes seleccionadas de 21, 31, 51, 81, 118, 279, 372, 401, 426, 443, 528, 543, 545, 548 o 566. En diversas realizaciones, el cáncer puede ser CLL, cáncer de mama o melanoma, por ejemplo.
Métodos adicionales incluyen predecir o supervisar la eficacia de un tratamiento para el cáncer midiendo el nivel de una o más variantes de empalme aberrantes en muestras obtenidas de pacientes antes o durante el tratamiento. Por ejemplo, una disminución en los niveles de una o más variantes de empalme aberrantes durante el ciclo de tratamiento puede indicar que el tratamiento es eficaz. En otros casos, la ausencia de una disminución o un aumento en los niveles de una o más variantes de empalme aberrantes durante el ciclo de tratamiento puede indicar que el tratamiento no es eficaz y debe ajustarse, complementarse o terminarse. En algunas realizaciones, las variantes de empalme se usan para rastrear y ajustar la eficacia de tratamiento del paciente individual.
También se divulgan métodos de estratificación de pacientes con cáncer en diferentes categorías basándose en la presencia o ausencia de una o más variantes de empalme particulares en muestras de pacientes o la detección de una o más variantes de empalme particulares a niveles que están elevados o reducidos con respecto a los de muestras celulares normales. Las categorías pueden ser diferentes categorías pronósticas, categorías de pacientes con tasas variables de recidiva, categorías de pacientes que responden al tratamiento y los que no, y categorías de pacientes que pueden tener efectos secundarios negativos particulares, y similares. De acuerdo con las categorías en que entran los pacientes individuales, después pueden seleccionarse los tratamientos óptimos para esos pacientes, o pueden seleccionarse pacientes particulares para ensayos clínicos.
También se divulgan métodos de distinción de células cancerosas con mutaciones neomórficas de SF3B1 de células normales usando las variantes de empalme divulgadas en este documento como marcadores. Dichos métodos pueden emplearse, por ejemplo, para evaluar el crecimiento o pérdida de células cancerosas y para identificar células cancerosas a tratar o eliminar. En algunas realizaciones, las variantes de empalme se miden en tejido canceroso que tiene células con una mutación neomórfica de SF3B1 antes y después de tratamiento antineoplásico, con el propósito de supervisar el efecto del tratamiento sobre la progresión del cáncer.
Administrar un modulador de SF3B1 a una célula, tal como una célula cancerosa, puede alterar la expresión diferencial de variantes de empalme. Por consiguiente, el cambio en la expresión de una o más variantes de empalme puede usarse para evaluar el efecto del modulador de SF3B1 sobre la proteína SF3B1. Por ejemplo, el efecto de un modulador de SF3B1 sobre una célula de CLL se evalúa aplicando un modulador de SF3B1 a dicha célula, después detectando o cuantificando una o más de las variantes de empalme de la tabla 1. La una o más variantes de empalme se eligen de las filas 279, 372 o 443 de la tabla 1. La una o más variantes de empalme se eligen de la fila 443 de la tabla 1.
El efecto de un modulador de SF3B1 sobre una célula de cáncer de mama se evalúa aplicando un modulador de SF3B1 a dicha célula, después detectando o cuantificando una o más de las variantes de empalme de la tabla 1. En realizaciones adicionales, la una o más variantes de empalme se eligen de las filas 21,31 o 81 de la tabla 1.
El efecto de un modulador de SF3B1 sobre una célula de melanoma se evalúa aplicando un modulador de SF3B1 a dicha célula, después detectando o cuantificando una o más de las variantes de empalme de la tabla 1. En realizaciones adicionales, la una o más variantes de empalme se eligen de las filas 528, 543 o 545 de la tabla 1.
El efecto de un modulador de SF3B1 sobre una célula cancerosa se evalúa aplicando un modulador de SF3B1 a dicha célula, después detectando o cuantificando una o más de las variantes aberrantes seleccionadas de las filas 21, 31, 51, 81, 118, 279, 372, 401, 426, 443, 528, 543, 545, 548 o 566 de la tabla 1. En diversas realizaciones, la célula cancerosa puede ser una célula de CLL, una célula de cáncer de mama o una célula de melanoma, por ejemplo.
Las variantes de empalme específicas que son útiles para demostrar el efecto de un modulador de SF3B1 sobre un tipo de célula cancerosa pueden no ser útiles para demostrar un efecto del modulador sobre otro tipo de célula cancerosa. Las variantes de empalme aberrantes que son apropiadas para revelar dichos efectos en células cancerosas particulares serán evidentes a partir de la descripción y ejemplos proporcionados en este documento.
En algunas realizaciones, las variantes de empalme aberrantes que están presentes a niveles elevados en una célula que tiene una proteína SF3B1 neomórfica se usan como marcadores. En otras realizaciones, las variantes de empalme que tienen niveles reducidos en una célula que tiene una proteína SF3B1 neomórfica se usan como marcadores. En algunas realizaciones, se medirá más de una variante de empalme. Cuando se usa más de una variante de empalme, todas pueden tener niveles elevados, todas pueden tener niveles reducidos o puede usarse una mezcla de variantes de empalme con niveles elevados y reducidos. En determinadas realizaciones de los métodos descritos en este documento, se mide más de una variante de empalme aberrante. En otras realizaciones, se mide al menos una variante de empalme aberrante y al menos una canónica. En algunos casos, se medirá tanto una variante de empalme aberrante como una canónica asociada con una ubicación genómica particular. En otras circunstancias, una variante de empalme canónica medida estará en una ubicación genómica diferente de la una o más variantes de empalme aberrantes medidas.
Antes de realizar un ensayo para variantes de empalme en una célula, se puede determinar si la célula tiene una proteína SF3B1 mutante. En determinadas realizaciones, el ensayo para variantes de empalme se realiza si se ha determinado que la célula tiene una proteína SF3B1 mutante neomórfica.
Muestras
Pueden obtenerse muestras celulares de una diversidad de fuentes biológicas. Muestras celulares ejemplares incluyen, aunque sin limitación, un cultivo celular, una línea celular, un tejido, tejido bucal, tejido gastrointestinal, un órgano, un orgánulo, un líquido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de piel y similares. Las muestras de sangre pueden ser sangre completa, sangre parcialmente purificada o una fracción de sangre completa o parcialmente purificada, tal como leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC). La fuente de una muestra celular puede ser una muestra de tejido sólido tal como una biopsia de tejido. Las muestras de biopsia de tejido pueden ser biopsias de tejido mamario, piel, pulmón o ganglios linfáticos. Las muestras pueden ser muestras de médula ósea, incluyendo aspirados de médula ósea y biopsias de médula ósea.
En determinadas realizaciones, las células son células humanas. Las células pueden ser células cancerosas, por ejemplo, células de cáncer hemático o células de tumor sólido. Los cánceres hemáticos incluyen leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano y mieloma múltiple. Los tumores sólidos incluyen carcinomas, tales como adenocarcinomas, y pueden seleccionarse de cáncer de mama, pulmón, hígado, próstata, pancreático, colon, colorrectal, piel, ovario, uterino, cervicouterino o renal. Las muestras celulares pueden obtenerse directamente de un paciente o derivar de células obtenidas de un paciente, tal como células cultivadas derivadas de un líquido biológico o muestra de tejido. Las muestras pueden ser muestras archivadas, tales como muestras crioconservadas, de células obtenidas directamente de un sujeto o de células derivadas de células obtenidas de un paciente.
En determinadas realizaciones, las células se obtienen de pacientes sospechosos de tener cáncer. Los pacientes pueden mostrar signos y síntomas de cáncer, tal como uno o más síntomas comunes de CLL, que incluyen ganglios linfáticos, hígado o bazo agrandados, recuentos de glóbulos blancos mayores de los normales, infecciones recurrentes, pérdida de apetito o saciedad rápida, magulladuras anómalas, fatiga y sudores nocturnos. En realizaciones adicionales, las células tienen una proteína SF3B1 mutante.
Las muestras celulares descritas en este documento pueden usarse en cualquiera de los métodos divulgados en la presente.
Detección de variantes de empalme
Determinadas realizaciones de los métodos descritos en este documento implican la detección o cuantificación de variantes de empalme. Existe una diversidad de métodos para detectar y cuantificar ácidos nucleicos, y cada uno pueden adaptarse para la detección de variantes de empalme en las realizaciones descritas. Métodos ejemplares incluyen un ensayo para cuantificar ácido nucleico, tal como generación de código de barras de ácido nucleico, sondas de nanopartículas, hibridación in situ, micromatriz, secuenciación de ácido nucleico y métodos basados en PCR, incluyendo PCR instantánea (RT-PCR).
Pueden realizarse ensayos de ácido nucleico que utilizan tecnología de generación de código de barras, tal como ensayos NanoString® (NanoString Technologies), por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 8.519.115; la patente de Estados Unidos n.° 7.919.237; y en Kulkarni, M. M., 20 l l , "Digital Multiplexed Gene Expression Analysis Using the NanoString nCounter System." Current Protocols in Molecular Biology, 94:25B.10.1-25B.10.17. En un ensayo ejemplar, se usa un par de sondas para detectar una secuencia de nucleótidos particular de interés, tal como una variante de empalme particular de interés. El par de sondas consiste en una sonda de captura y una sonda indicadora y que incluyen, cada una, una secuencia de aproximadamente 35 a 50 bases de longitud que es específica para una secuencia diana. La sonda de captura incluye un marcador de afinidad tal como biotina en su extremo 3' que proporciona un mango molecular para la fijación superficial de ARNm diana para detección digital, y la sonda indicadora incluye un código de color único en su extremo 5' que proporciona generación de código de barras molecular de la secuencia diana de ARNm hibridada. Los pares de sondas de captura e indicadoras se hibridan con ARNm diana en solución, y después de eliminar el exceso de sondas, se inmovilizan los complejos de ARNm dianasonda en un cartucho nCounter®. Un analizador digital adquiere imágenes directas de la superficie del cartucho para detectar códigos de color correspondientes a secuencias de variante de empalme de ARNm específicas. El número de veces que se detecta un código de narras con código de color para una variante de empalme particular refleja los niveles de una variante de empalme particular en la colección de ARNm. Para la detección de variantes de empalme, la sonda de captura o la indicadora pueden abarcar una unión de exón-exón o intrón-exón de la variante de empalme dada. En otras realizaciones, una o las dos secuencias diana de las sondas de captura e indicadora corresponden a las secuencias terminales de dos exones en una unión de exón-exón o a las secuencias terminales de un intrón y un exón en una unión de intrón-exón, por lo que una sonda se extiende hasta la unión de exón-exón o intrón-exón, pero no abarca la unión, y la otra sonda se une a una secuencia que se empieza en el lado opuesto de la unión y se extiende al exón o intrón respectivo.
En métodos basados en PCR ejemplares, puede detectarse una variante de empalme particular amplificando específicamente una secuencia que contiene la variante de empalme. Por ejemplo, el método puede emplear un primer cebador diseñado específicamente para hibridar con una primera parte de la variante de empalme, donde la variante de empalme es una secuencia que abarca una unión de exón-exón o intrón-exón en que se produce empalme alternativo. El método puede emplear además un segundo cebador opuesto que hibrida con un segmento del producto de extensión de PCR del primer cebador, que corresponde a otra secuencia en el gen, tal como una secuencia en una ubicación en dirección 5' o en dirección 3'. El método de detección por PCR puede ser PCR cuantitativa (o instantánea). En algunas realizaciones de PCR cuantitativa, se detecta un producto de PCR amplificado usando una sonda de ácido nucleico, en la que la sonda puede contener uno o más marcadores detectables. En determinados métodos de PCR cuantitativa, la cantidad de una variante de empalme de interés se determina detectando y comparando los niveles de la variante de empalme con un control interno apropiado.
Métodos ejemplares para detectar variantes de empalme usando un ensayo de hibridación in situ tal como RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics) incluyen los descritos por Wang, F., et al., "RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues," J. Mol. Diagn. enero 2012; 14(1 ):22-9. Pueden usarse ensayos RNAscope® para detectar variantes de empalme diseñando un par de sondas que se dirigen a una variante empalme dada, y se hibridan con un ARN diana en células fijadas y permeabilizadas. Se diseñan sondas diana para que hibriden como pares que, cuando hibridan con la secuencia diana, crean un sitio de unión para un ácido nucleico preamplificador. El ácido nucleico preamplificador, a su vez, aloja múltiples sitios de unión para ácidos nucleicos amplificadores que, a su vez, contienen múltiples sitios de unión para una sonda marcada que porta una molécula cromogénica o fluorescente. En algunas realizaciones, una de las sondas diana de RNAscope® abarca una unión de exón-exón o intrón-exón de una variante de empalme dada. En otras realizaciones, las secuencias diana de las sondas diana corresponden a las secuencias terminales de dos exones en una unión de exón-exón o a las secuencias terminales de un intrón y un exón en una unión de intrón-exón, por lo que una sonda en el par de sondas diana se extiende hasta la unión de exón-exón o intrón-exón, pero no abarca la unión, y la otra sonda se une a una secuencia que empieza en el lado opuesto de la unión y se extiende al exón o intrón respectivo.
Métodos ejemplares para detectar variantes de empalme usando sondas de nanopartícula tales como SmartFlare™ (Millipore) incluyen los descritos en Seferos et al., "Nano-flares: Probes for Transfection and mRNA Detection in Living Cells," J. Am. Chem. Soc. 129(50):15477-15479 (2007) y Prigodich, A.E., et al., "Multiplexed Nanoflares: mRNA Detection in Live Cells," Anal. Chem. 84(4):2062-2066 (2012). Pueden usarse sondas de detección SmartFlare™ para detectar variantes de empalme generando nanopartículas de oro que se modifican con uno o más ácidos nucleicos que incluyen secuencias de reconocimiento nucleotídicas que (1) cada una es complementaria a una variante de empalme particular a detectar y (2) cada una hibrida con un ácido nucleico complementario indicador marcado con fluoróforo. Tras la captación de la sonda por una célula, una secuencia variante de empalme diana puede hibridar con la una o más secuencias de reconocimiento nucleotídicas y desplazar el ácido nucleico indicador marcado con fluoróforo. El ácido nucleico indicador marcado con fluoróforo, cuyo fluoróforo se había inactivado debido a la proximidad con la superficie de la nanopartícula de oro, entonces se libera de la nanopartícula de oro, y el fluoróforo entonces puede detectarse cuando está libre del efecto inactivador de la nanopartícula. En algunas realizaciones, las secuencias de reconocimiento nucleotídicas en las sondas reconocen una secuencia que abarca una unión de exónexón o intrón-exón de una variante de empalme dada. En algunas realizaciones, las secuencias de reconocimiento nucleotídicas en las sondas reconocen una secuencia que está únicamente en un lado de la unión de exón-exón o intrón-exón de la variante de empalme, incluyendo una secuencia que termina en la unión y una secuencia que termina a uno o más nucleótidos de la unión.
Métodos ejemplares para detectar variantes de empalme usando secuenciación de ácidos nucleicos incluyen secuenciación de ARN (sec. ARN) descrita en Ren, S. et al. "RNA-Seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifies recurrent gene fusions, cancer-associated long noncoding RNAs and aberrant alternative splicings." Cell Res 22, 806-821, doi:10.1038/cr.2012.30 (2012); y van Dijk et al., "Ten years of next-generation sequencing technology." Trends Genet 30(9):418-26 (2014). En algunas realizaciones, puede usarse secuenciación de alto rendimiento, tal como tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS), para detectar variantes de empalme. Por ejemplo, el método puede emplear plataformas de secuenciación comerciales disponibles para sec. ARN, tales como, por ejemplo, Illumina, SOLID, Ion Torrent y Roche 454. En algunas realizaciones, el método de secuenciación puede incluir pirosecuenciación. Por ejemplo, una muestra puede mezclarse con enzimas de secuenciación y cebador y exponerse a un flujo de un nucleótido no marcado a la vez, permitiendo la síntesis de la hebra de ADN complementaria. Cuando se incorpora un nucleótido, se libera pirofosfato, dando lugar a emisión de luz, que se supervisa instantáneamente. En algunas realizaciones, el método de secuenciación puede incluir secuenciación con semiconductores. Por ejemplo, puede liberarse protón en lugar de pirofosfato durante la incorporación del nucleótido y se detecta instantáneamente mediante detectores de iones. En algunas realizaciones, el método puede incluir secuenciación con terminadores reversibles. Por ejemplo, los reactivos de síntesis pueden incluir cebadores, ADN ■ polimerasa y cuatro nucleótidos terminadores reversibles marcados de manera diferente. Después de la incorporación de un nucleótido, que se identifica por su color, el terminador 3' en la base y el fluoróforo se retiran, y se repite el ciclo. En algunas realizaciones, el método puede incluir secuenciación por ligamiento. Por ejemplo, un cebador de secuenciación puede hibridarse con un adaptador, hibridando con la secuencia adyacente el extremo 5' del cebador disponible para ligamiento con un oligonucleótido. Una mezcla de octámeros, en que las bases 4 y 5 están codificadas por uno de cuatro marcadores de color, puede competir por el ligamiento con el cebador. Después de la detección del color, el octámero ligado puede escindirse entre la posición 5 y 6 para retirar el marcador, y puede repetirse el ciclo. De ese modo, en la primera ronda, el proceso puede determinar posibles identidades de bases en las posiciones 4, 5, 9, 10, 14, 15, etc. El proceso puede repetirse, compensado por una base usando un cebador de secuenciación más corto, para determinar las posiciones 3, 4, 8, 9, 13, 14, etc., hasta que se alcanza la primera base en el cebador de secuenciación.
Pueden utilizarse otros métodos de detección y analíticos de ácidos nucleicos que también distinguen entre variantes de empalme de una unión de exón-exón o intrón-exón dada en un gen identificando la secuencia de nucleótidos en ambos lados de la unión para detectar o cuantificar las variantes de empalme divulgadas en este documento. Por ejemplo, las variantes de empalme de una unión de exón-exón pueden detectarse por métodos de extensión de cebador en que un cebador que se une a un exón se extiende al exón en el otro lado de la unión de acuerdo con la secuencia de ese exón adyacente. Véase, por ejemplo, McCullough, R.M., et al., "High-throughput alternative splicing quantification by primer extension and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry," Nucleic Acids Research, 20 de junio 2005; 33(11):e99; y Milani, L., et al., " Detection of alternatively spliced transcripts in leukemia cell lines by minisequencing on microarrays," Clin. Chem. 52: 202-211 (2006). La detección de variantes a gran escala puede realizarse usando micromatrices de expresión que portan sondas de unión de exón-exón o intrónexón, como se describe, por ejemplo, en Johnson, J.M. et al., "Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays," Science 302: 2141-2144 (2003); y Modrek, B., et al., "Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes," Nucleic Acids Res 29: 2850-2859 (2001).
También se divulgan reactivos para detectar variantes de empalme de la invención. En un ejemplo, los reactivos incluyen sondas NanoString® diseñadas para medir la cantidad de una o más de las variantes de empalme aberrantes enumeradas en la tabla 1. Las sondas para ensayos de cuantificación de ácidos nucleicos tales como generación de código de barras (por ejemplo, NanoString®), sondas de nanopartículas (por ejemplo, SmartFlare™), hibridación in situ (por ejemplo, RNAscope®), micromatrices, secuenciación de ácidos nucleicos y ensayos basados en PCR pueden diseñarse como se expone anteriormente.
En estos métodos ejemplares o en otros métodos para detección de ácidos nucleicos, las variantes de empalme aberrantes pueden identificarse usando sondas, cebadores u otros reactivos que reconocen específicamente la secuencia de ácido nucleico que está presente en la variante de empalme aberrante, pero ausente en la variante de empalme canónica. En otras realizaciones, la variante de empalme aberrante se identifica detectando la secuencia que es específica para la variante de empalme aberrante en el contexto de la unión en que se produce, es decir, la secuencia única está flanqueada por las secuencias que están presentes en cada lado de la unión de empalme en la variante de empalme canónica. En dichos casos, la parte de la sonda, cebador u otro reactivo de detección que reconoce específicamente su secuencia diana puede tener una longitud que corresponde a la longitud de la secuencia aberrante o a una parte de la secuencia aberrante. En otras realizaciones, la parte de la sonda, cebador u otro reactivo de detección que reconoce específicamente su secuencia diana puede tener una longitud que corresponde a la longitud de la secuencia aberrante más la longitud de un número elegido de nucleótidos desde una o ambas secuencias que flanquean la secuencia aberrante en la unión de empalme. En general, la sonda o cebador debe diseñarse con una longitud suficiente para reducir la unión no específica. Pueden diseñarse sondas, cebadores y otros reactivos que detectan variantes de empalme aberrantes o canónicas de acuerdo con los rasgos característicos técnicos y formatos de una diversidad de métodos para la detección de ácidos nucleicos.
Moduladores de SF3B1
Se conoce en la técnica una diversidad de compuestos moduladores de SF3B1 y pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el compuesto modulador de SF3B1 es una a pladienolida o análogo de pladienolida. Un "análogo de pladienolida" se refiere a un compuesto que está estructuralmente relacionado con un miembro de la familia de productos naturales conocidos como pladienolidas. Las pladienolidas se identificaron por primera vez en las bacterias Streptomyces platensis (Sakai, Takashi; Sameshima, Tomohiro; Matsufuji, Motoko; Kawamura, Naoto; Dobashi, Kazuyuki; Mizui, Yoshiharu. "Pladienolides, New Substances from Culture of Streptomyces platensis Mer-11107. I. Taxonomy, Fermentation, Isolation and Screening." The Journal of Antibiotics. 2004, vol. 57, n.° 3). Uno de estos compuestos, pladienolida B, se dirige al empalmosoma SF3B para inhibir el empalme y alterar el patrón de expresión génica (Kotake etal., "Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide", Nature Chemical Biology 3:570-575 [2007]). Determinados análogos de pladienolida B se describen en los documentos WO 2002/060890; WO 2004/011459; WO 2004/011661; WO 2004/050890; WO 2005/052152; WO 2006/009276; y WO 2008/126918.
Las patentes de Estados Unidos n.° 7.884.128 y 7.816.401, tituladas ambas "Process for Total Synthesis of Pladienolide B and Pladienolide D," describen métodos para sintetizar pladienolida B y D. La síntesis de pladienolida B y D también puede realizarse usando métodos descritos en Kanada et al., "Total Synthesis of the Potent Antitumor Macrolides Pladienolide B and D," Angew. Chem. Int. Ed. 46:4350-4355 (2007). Kanada et al., patente de Estados Unidos n.° 7.550.503, y la publicación internacional n.° WO 2003/099813 (WO '813), titulada "Novel Physiologically Active Substances," describen métodos para sintetizar E7107 (compuesto 45 de w O '813) a partir de pladienolida D (11107D de WO '813). En algunas realizaciones, el modulador de SF3B1 es pladienolida B. En otras realizaciones, el modulador de SF3B1 es pladienolida D. En otras realizaciones, el modulador de SF3B1 es E7107.
En algunas realizaciones, el modulador de SF3B1 es un compuesto descrito en la publicación de Estados Unidos número 2015-0329528, presentada el 13 de mayo de 2015. En algunas realizaciones, el compuesto modulador de SF3B1 es un compuesto que tiene una de las fórmulas 1 -4 como se expone en la tabla 2.
Tabla 2. Compuestos moduladores de SF3B1 ejemplares.
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Los métodos descritos en este documento pueden usarse para evaluar compuestos moduladores de SF3B1 conocidos y novedosos.
Usos
Diversas realizaciones de la invención incluyen el uso de un modulador de SF3B1 en un método de tratamiento de un paciente diagnosticado con cáncer. En determinados casos, se ha determinado que las células cancerosas del paciente tienen una proteína SF3B1 mutante. Mutantes de SF3B1 específicos incluyen E622D, E622K, E622Q, E622V, Y623C, Y623H, Y623S, R625C, R625G, R625H, R625L, R625P, R625S, N626D, N626H, N626I, N626S, N626Y, H662D, H662L, H662Q, H662R, H662Y, T663I, T663P, K666E, K666M, K666N, K666Q, K666R, K666S, K666T, K700E, V701A, V701F, V701I, I704F, I704N, I704S, I704V, G740E, G740K, G740R, G740V, K741N, K741Q, K741T, G742D, D781E, D781G, o D781N. En determinadas realizaciones, los mutantes de SF3B1 se eligen de K700E, K666N, R625C, G742D, R625H, E622D, H662Q, K666T, K666E, K666R, G740E, Y623C, T663I, K741N, N626Y, T663P, H662R, G740V, D781E, o R625L. En realizaciones adicionales, las células cancerosas se han ensayado para medir la cantidad de una o más variantes de empalme seleccionadas de la tabla 1. Se muestran variantes de empalme específicas asociadas con mutaciones de SF3B1 neomórficas en la tabla 1 y se describen en la sección sobre variantes de empalme anterior.
En determinadas realizaciones, un paciente con cáncer que se ha determinado que tiene una proteína SF3B1 mutante se trata con un modulador de SF3B1 como se describe en la publicación de Estados Unidos número 2015-0329528, presentada el 13 de mayo de 2015.
Ejemplos
Ejemplo 1: Mutaciones de SF3B1 inducen empalme anómalo de una manera específica de estirpe
Para investigar las alteraciones de empalme asociadas con mutaciones de SF3B1 ("SF3B1MUT") entre múltiples tipos de tumor, se desarrolló una cuantificación por sec. ARN y línea de empalme diferencial y se usó para analizar perfiles de sec. ARN a partir de las siguientes muestras:
□ todas las muestras SF3B1MUT en The Cancer Genome Atlas (TCGA; de 81 pacientes en total, que representan 16 tipos de cáncer), y 40 muestras SF3B1 de tipo silvestre (SF3B1WT) de cada una de las cohortes de cáncer de mama (20) y melanoma (20) en TCGA,
□ siete muestras de pacientes con CLL SF3B1MUT y siete SF3B1WT obtenidas del Lymphoma/Myeloma Service en la Division of Hematology/Oncology en el New York Weill Cornell Medical Center.
Métodos de cuantificación por sec. ARN
Las uniones de empalme se cuantificaron directamente de las alineaciones (archivos BAM) para facilitar el descubrimiento de variantes de empalme no anotadas. Para datos de sec. ARN generados internamente, las lecturas se alinearon con el genoma de referencia humano hg19 (GRCh37) por MapSplice y se cuantificaron por RSEM frente a la isoforma TCGA GAF 2.1 y definición génica, emulando la línea TCGA "RNASeqV2"
(Véase https://cghub.ucsc.edu/docs/tcga/UNC_mRNAseq_summary.pdf). Los recuentos de unión de empalme generados por MapSplice se usaron para procesamiento posterior. Para los datos de sec. ARN de TCGA, los recuentos exhaustivos de unión de empalme generados por MapSplice no estaban disponibles; en su lugar, los datos de unión de empalme de TCGA de "nivel 3" presentan recuentos de lectura cartografiados para un conjunto predefinido de uniones de empalme a partir de transcriptomas de referencia. Para reconstruir los recuentos de unión de empalme de todo el genoma comparables con las muestras de sec. ARN generadas internamente, se obtuvieron las alineaciones de sec. ARN sin procesar (archivos BAM) de CGHub (https://cghub.ucsc.edu/) y se contó directamente cualquier lectura que abarcara a través de una posible unión de empalme. Se reunieron los recuentos de lectura de expresión génica estimados por RSEM directamente de las matrices de datos de nivel 3 de TCGA RNA-SeqV2.
Como MapSplice proporciona solamente recuentos de unión de exón-exón, se requirieron estimaciones de recuentos de lectura que abarcaban cada unión de intrón-exón para la identificación de variantes de empalme de retención de intrones. Para cada unión de empalme en cada archivo BAM, se contaron lecturas con al menos un saliente de 3 pb a través de cada una de las uniones de intrón-exón 3' y 5'.
Para toda manipulación de lecturas con empalme dentro de los archivos BAM, se usó un módulo Python personalizado "splicedbam" (disponible en https://github.com/h3biomed/splicedbam), que usa la extensión "pysam" de samtools (Li, H., et al., "The Sequence Alignment/Map format and SAMtools." Bioinformatics, 15 de agosto de 2009; 25(16):2078-9).
En algunos casos, las uniones de empalme tenían recuentos muy bajos, ocasionalmente debidos a errores de secuenciación y alineación. Por lo tanto, solamente las uniones de empalme que tenían al menos un total de 10 recuentos de promedio de cohortes SF3B1WT o SF3B1MUT se incluyeron en análisis posteriores.
Métodos de detección de empalme diferencial
Para detectar el uso diferencial de una variante de empalme en una cohorte con respecto a otra, independiente de cambios de expresión génica y modelos de empalme alternativo predefinidos, se desarrolló una línea de empalme diferencial informática que convierte los recuentos de unión de empalme en porcentajes de uso de unión en sitios de empalme con múltiples uniones posibles. El porcentaje de uso de unión es una medición de la aparición de una variante de empalme con respecto a todas las demás variantes de empalme que comparten el mismo sitio de empalme. Por ejemplo, una variante de empalme con un sitio de empalme 3' alternativo debe compartir su sitio de empalme 5' con otra variante de empalme. Por lo tanto, por cada sitio de empalme compartido, los recuentos sin procesar de cada variante de empalme se dividieron por los recuentos totales de todas las variantes de empalme que utilizan el sitio de empalme compartido para obtener una relación. Esta relación entonces se multiplicó por 100 para convertirla en un porcentaje. Por cada muestra, la suma de todos los porcentajes de variantes de empalme que comparten el mismo sitio de empalme será igual a 100. La transformación de los recuentos sin procesar de cada variante de empalme en un porcentaje de todas las variantes de empalme que comparten un sitio de empalme es en sí misma una normalización para reducir el efecto de los cambios de expresión génica. Los porcentajes para uniones canónicas y aberrantes se enumeran en la tabla 1 como "% prom. WT" y "% prom. Ab.", respectivamente. Se evaluaron las diferencias entre estos porcentajes para la significación estadística usando el ensayo de la t moderado definido en el paquete limma de Bioconductor (disponible en http://www.bioconductor.org). Los valores de p estadísticos se corrigieron en valores de q usando el procedimiento de Benjamini-Hochberg, y se enumeran como "valores de Q FDR" en la tabla 1. Cualquier variante de empalme que satisficiera un valor de q de menos de o igual a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
La conversión de los recuentos de unión sin procesar en porcentaje de uso de unión puede introducir interferencias en algunos casos, es decir, cuando un gen en que se produce una variante de empalme se expresa en una cohorte, pero tiene expresión muy baja o no se expresa en absoluto en otra cohorte. Para abordar esto, se introdujo una etapa de filtrado adicional. Por cada variante de empalme regulada por aumento en una muestra SF3B1MUT que satisface el umbral de valor de q anterior, su correspondiente variante de empalme canónica debe estar regulada por disminución en la muestra SF3B1MUT y también debe satisfacer el umbral de valor de q para la variante de empalme regulada por aumento para considerarla una variante de empalme aberrante.
Identificación de variantes de empalme aberrantes en muestras de pacientes con SF3B1MUT neomórfica
Inicialmente, este marco se aplicó a un subconjunto de cánceres SF3B1MUT conocidos o equivalentes de tipo silvestre de The Cancer Genome Atlas (TCGA; cáncer de mama primario luminal A: 7 SF3B1K700E y 20 SF3B1WT; melanoma metastásico: 4 SF3B1MUT; y 20 SF3B1WT) y muestras de pacientes con CLL generadas internamente 7 SF3B1MUT y 7 SF3B1WT. Este análisis reveló que 626 uniones de empalme aberrantes estaban significativamente reguladas por aumento en SF3B1MUT en comparación con SF3B1WT. La inmensa mayoría de los acontecimientos de empalme aberrantes usan un ss 3' alternativo (véase la tabla 1, columna de "acontecimiento").
El cribado informático de acontecimientos de empalme aberrantes reveló un patrón de acontecimientos de empalme específicos de tumor en cáncer de mama, melanoma y CLL en muestras de SF3B1MUT neomórfico (tabla 1). Además, se observó un conjunto de acontecimientos no específicos de tumor (es decir, acontecimientos de empalme encontrados en al menos dos tipos de tumor). Algunas variantes de empalme de genes con acontecimientos de empalme específicos de tumor se producen en genes con mayor expresión de ARNm, lo que indica que algo del empalme específico de tumor observado resulta de diferencias en la expresión génica (figura 2).
Para caracterizar el efecto de empalme aberrante en todas las variantes de SF3B1 entre tipos de cáncer, se cuantificaron los datos de sec. ARN para los 70 pacientes SF3B1MUT restantes de 14 tipos de cáncer en TCGA, y se hizo un análisis de agrupación no supervisada usando las 136 muestras. Esta agrupación separó los acontecimientos de empalme asociados con mutantes de SF3B1 neomórficos de los asociados con SF3B1 de tipo silvestre o mutantes de SF3B1 no neomórficos. Por ejemplo, se observaron patrones de empalme asociados con mutantes de SF3B1 neomórficos en muestras de pacientes con cáncer de mama (SF3B1K666E, SF3B1N626D), adenocarcinoma pulmonar (SF3B1K741N, SF3B1G740V) y cáncer de vejiga (SF3B1R625C), como acontecimientos de empalme en estas muestras agrupadas con aquellos en muestras neomórficas SF3B1K700E, mientras que los perfiles de empalme para otras muestras mutantes de SF3B1 fueron similares a los de muestras SF3B1WT del mismo tipo de tumor. Se proporciona una lista de mutantes de SF3B1 cuyos perfiles de empalme se agruparon con los de mutantes de SF3B1 neomórficos en la tabla 3, columna 1. Se enumeran mutaciones adicionales de SF3B1 que se prevé que sean neomórficas en la tabla 3, columna 2. Se muestra un diagrama esquemático que muestra las ubicaciones de todas las mutaciones proporcionadas en la tabla 3 en la figura 3.
Tabla 3. Mutaciones de SF3B1 selectas
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Ejemplo 2: Validación de variantes de empalme aberrantes en líneas celulares
Se analizó el empalme aberrante en modelos de línea celular recogiendo perfiles de sec. ARN para un panel de líneas celulares con mutaciones neomórficas de SF3B1 endógenas (adenocarcinoma pancreático Panc 05.04: mutante doble SF3B1Q699H/K700E; melanoma metastásico Colo829: SF3B1P718L; y cáncer pulmonar NCI-H358: SF3B1A745V; obtenidas de la American Type Culture Collection [ATCC] o RIKEN BioResource Center y se cultivaron según se indica) y de varias líneas celulares SF3B1WT de cualquiera de los mismos tipos de tumor (adenocarcinoma pancreático Panc 10.05, HPAF-II, MIAPaCa-2, Panc04.03, PK-59, cáncer pulmonar NCI-H358, NCI-H1792, NCI-H1650, NCI-H1975, NCI H1838) o células de control normales del mismo paciente (linfoblastos B transformados con virus de Epstein-Barr [EBV] colo829BL). También se recogieron perfiles de sec. ARN de líneas celulares pre-B isogénicas (Nalm-6) manipuladas mediante homología mediada por AAV para que expresen SF3B1K700E (Nalm-6 SF3B1K700E) o una mutación sinónima (Nalm-6 SF3B1K700K). Las líneas celulares isogénicas Nalm-6 SF3B1K700E y Nalm-6 SF3B1K700K, generadas en Horizon Discovery, se cultivaron en presencia de Geneticina (0,7 mg/ml, Life Technologies) para selección. Todo el análisis de sec. ARN se realizó usando la misma línea descrita para muestras de pacientes en el ejemplo 1. La agrupación no supervisada de líneas celulares usando las uniones de empalme aberrantes identificadas en pacientes provocó la clara segregación de Panc 05.04 y Nalm-6 SF3B1K700E de células de tipo silvestre y otras células mutantes de SF3B1.
Se desarrolló un ensayo NanoString® para cuantificar las variantes de empalme aberrantes y canónicas y se validó usando el mismo panel de células. Para el ensayo NanoString®, se usaron 750 ng de ARN total purificado como molde para el ensayo de expresión nCounter® (NanoString Technologies®) usando un panel personalizado de sondas NanoString®. La preparación de muestras se estableció como se recomienda (protocolo de NanoString® Technologies n.° C-0003-02) para una hibridación durante una noche a 65 °C. El siguiente día, las muestras se procesaron a través de la estación de preparación automatizada del sistema de análisis nCounter® usando el protocolo de alta sensibilidad (protocolo de NanoString® Technologies n.° MAN-C0029-05) seguido de procesamiento a través del analizador digital del sistema de análisis nCounter® (protocolo n.° MAN-C0021-01) usando 1150 FOV para la detección. Los datos se descargaron y analizaron para la métrica de control de calidad y la normalización usando el programa informático de análisis nSolver™ (NanoString Technologies®). En primer lugar, se normalizaron los datos para la variación entre carriles usando los controles de ensayo positivos proporcionados por el fabricante (controles positivos de NanoString® A-F [que contienen transcritos de a Rn transcritos in vitro a concentraciones de 128 fM, 32 fM, 8 fM, 2 fM, 0,5 fM y 0,125 fM, cada uno premezclado con sondas indicadoras CodeSet NanoString®]). Cualquier muestra con factores de normalización <0,3 y >3 no se consideró para análisis posterior. Esto estuvo seguido de la normalización de contenido usando la media geométrica de GAPDH, EEF1A1 y RPLP0. Todas las muestras estaban dentro del intervalo de factor de normalización recomendado de 0,1-10. Cada valor normalizado entonces se comprobó para garantizar que era al menos dos desviaciones típicas mayor que el promedio de la señal de fondo registrada para ese carril. Cualquier valor por debajo se consideró por debajo del límite de detección. Estos valores normalizados se cogieron para análisis bioinformático y estadístico adicional.
Como se observa en el análisis de sec. ARN, solamente las líneas celulares Panc 05.04 y Nalm-6 SF3B1K700E isogénicas mostraron clara presencia de empalme aberrante (figura 4).
Análisis del mutante de SF3B1 SF3B1Q699H
La línea celular Panc 05.04 porta la mutación neomórfica SF3B1K700E y una mutación adicional en la posición 699 (SF3B1Q699H). Para evaluar la relevancia funcional de esta segunda mutación, se expresaron las proteínas SF3B1 mutantes SF3B1Q699H y SF3B1K700E en solitario o en combinación en células 293FT (figura 5) para análisis de ARN por NanoString®. Para expresar los mutantes en células 293FT, se generaron plásmidos de expresión de mamífero usando la tecnología Gateway (Life Technologies). En primer lugar, se clonó mxSF3B1 de tipo silvestre con marca HA (Yokoi, A. etal. "Biological validation that SF3b is a target of the antitumor macrolide pladienolide." FEBS J 278:4870-4880 [2011]) por PCR en el pDONR221, después se introdujeron las mutaciones usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio (QuikChange II XL, Agilent). Se realizó la reacción de LR para clonar todos de mxSF3B1 de tipo silvestre con marca HA y mutantes en el pcDNA-DEST40 (Life Technologies). Las células 293FT (Life Technologies), cultivadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se sembraron en 6 pocillos/placa y se transfectaron con plásmido generado usando Fugene (Roche). Se usó un pg de ADN por construcción pcDNA-DEST40 HA-mxSF3B1 para cada transfección transitoria, generada por triplicado. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron para aislar la proteína y el ARN para inmunoelectrotransferencia y análisis NanoString®, respectivamente. Los extractos proteínicos se prepararon lisando las células con RIPA (Boston BioProducts). Se cargaron veintitrés pg de proteína en un gel de SDS-PAGE y se identificaron usando anticuerpo contra SF3B1 (a-SAP 155, MBL) y anti-GAPDH (Sigma). Se usaron 800CW de burro antirratón Li-Cor y 800CW de burro anticonejo Li-Cor como anticuerpos secundarios y se detectaron mediante el sistema de imágenes Odyssey (Li-Cor). Se aisló el ARN de las células y se retrotranscribió usando MagMax para micromatriz y Superscript VILO II (Life Technologies), respectivamente, de acuerdo con el manual del fabricante, y después se analizó con el ensayo NanoString®.
La expresión de SF3B1K700E y SF3B1Q699H/K700E indujo empalme aberrante, mientras que SF3B1Q699H en solitario o SF3B1A745V o SF3B1R1074H (una sustitución que confiere resistencia al inhibidor del empalmosoma pladienolida B) no inducía empalme aberrante (figura 6), lo que indica que SF3B1Q999H es una sustitución no funcional.
Estos datos confirman que las células isogénicas Panc 05.04 y Nalm-6 SF3B1K700E son modelos representativos para estudiar la actividad funcional de mutaciones neomórficas de SF3B1 y la actividad de los inhibidores de empalme in vitro e in vivo.
Ejemplo 3: Mutaciones neomórficas de SF3B1 inducen empalme anómalo de ARNm
Se analizó la actividad funcional de mutaciones neomórficas encontradas en cánceres SF3B1MUT expresando SF3B1WT, mutantes de SF3B1 neomórficos o SF3B1K700R (la mutación observada en un paciente de carcinoma renal de células claras que se agrupa con pacientes SF3B1WT) en células 293FT y determinando aberraciones de empalme por NanoString®. La expresión de todas las construcciones se confirmó por inmunoelectrotransferencia (figura 7). Todas las mutaciones neomórficas de SF3B1 ensayadas demostraron el mismo uso de sitios de empalme alternativos observados en muestras de pacientes (''isoforma MUT" en la figura 8), pero SF3B1K700R y SF3B1WT no mostraron empalme aberrante (figura 8). Además, la expresión de ninguna de las construcciones de SF3B1 cambió la expresión génica global ("gen general" en la figura 8) o las isoformas de empalme canónicas ("isoforma WT" en la figura 8). Esto indicó tanto una correlación entre la presencia de mutaciones neomórficas de SF3B1 como empalme alternativo, así como actividad funcional similar de las diferentes mutaciones neomórficas, como se indicó por el análisis de sec. ARN de muestras de pacientes.
La correlación entre la mutación neomórfica SF3B1K700E y el empalme aberrante se analizó usando ARNhc inducible por tetraciclina para atenuar selectivamente el mutante neomórfico de SF3B1 o el alelo SF3B1WT en líneas celulares Panc 05.04 y Panc 10.05 (líneas celulares neomórficas SF3B1MUT y SF3B1WT, respectivamente; obtenidas de la American Type Culture Collection [ATCC] o de RIKEN BioResource Center y cultivadas como se indica).
Para el experimento de atenuación, se preparó virus que codificaba ARNhc en células LentiX-293T (Clontech), que se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARNhc inducible se clonó en AgeI y EcoRI del vector pLKO-iKD-H1 puro. Las secuencias de las horquillas fueron:
shRNA #13 SF3B1PAN GCGAGACACACTGGTATTAAG (SEQ ID NO: 1180),
shRNA #8 SF3B1WT TGTGGATGAGCAGCAGAAAGT (SEQ ID NO: 1181); y
shRNA #96 SF3B1MUT GATGAGCAGCATGAAGTTCGG (SEQ ID NO: 1182).
Las células se transfectaron con 2,4 pg de plásmido pLKO-ARNhc diana, más 2,4 pg de p A 8.91 (empaquetado), y 0,6 pg de VSVG (envuelta) usando reactivo TransIT (Mirus). El virus se usó para infectar Panc 05.04 y Panc 10.05 mediante infección giratoria usando polibreno (Millipore). El día después de la infección, las células se cultivaron en medio de selección (1,25 pg/ml de puromicina [Life Technologies]) durante 7 días para seleccionar células que expresen ARNhc. Las células seleccionadas se cultivaron en presencia o ausencia de hiclato de doxiciclina (100 ng/ml; Sigma) para inducir el ARNhc. Las células se recogieron para las proteínas y el ARN en el día 4 después de la inducción. Además, las células se sembraron para el ensayo de formación de colonias y ensayo CellTiter-Glo® (Promega). En el día 9, las células se fijaron con formaldehído y se tiñeron con violeta de genciana.
Para confirmar la atenuación de SF3B1 usando inmunoelectrotransferencias, los extractos proteínicos se prepararon lisando las células con RIPA (Boston BioProducts). Se separaron de veinte a 25 pg de proteína de cada muestra por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (iblot, Life Technologies). En primer lugar, se bloquearon las membranas con tampón de bloqueo Odyssey (Li-Cor) y después se incubaron con anticuerpo contra SF3B1 (a-SAP 155, MBL) y anti-GAPDH (Sigma). Se usaron 800CW de burro antirratón Li-Cor y 800CW de burro anticonejo Li­ Cor como anticuerpos secundarios y se detectaron mediante el sistema de imágenes Odyssey (Li-Cor).
Para confirmar la atenuación de SF3B1 por qPCR específica de alelo, se aisló el ARN de las células y se retrotranscribió usando MagMax para micromatriz y Superscript VILO II (Life Technologies), respectivamente de acuerdo con el manual de fabricante. La qPCR se realizó usando ViiA7 (Life Technologies). La reacción incluyó 20-50 ng de ADNc, mezcla fundamental de verde Power SYBR (Life Technologies) y cebadores 300 nM. Se usaron los siguientes cebadores:
SF3B1WT: FW 5'-GACTTCCTTCTTTATTGCCCTTC (SEQ ID NO: 1183) y
RW 5'-AGCACTGATGGTCCGAACTTTC (SEQ ID NO: 1184),
SF3B1MUT: FW 5'-GTGTGCAAAAGCAAGAAGTCC (SEQ ID NO: 1185) y
RW 5'-GCACTGATGGTCCGAACTTCA (SEQ ID NO: 1186),
SF3B1PAN: FW 5'-GCTTGGCGGTGGGAAAGAGAAATTG (SEQ ID NO: 1187) y
RW 5'-AACCAGTCATACCACCCAAAGGTGTTG (SEQ ID NO: 1188),
p-actin (control interno): FW 5'-GGCACCCAGCACAATGAAGATCAAG (SEQ ID NO: 1189) y
RW 5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTGATC (SEQ ID NO: 1190).
Se realizaron triplicados biológicos y técnicos.
La inmunoelectrotransferencia y PCR específica de alelo confirmaron ambas la atenuación de los alelos SF3B1 (figuras 9 y 10).
Para determinar la asociación entre la expresión de mutaciones de SF3B1 y el empalme aberrante, el ARN aislado de las células después de atenuación inducida por doxiciclina se analizó por NanoString®. En Panc 05.04, después de la atenuación del alelo SF3B1MUT neomórfico, las variantes de empalme aberrantes estaban reguladas por disminución y las variantes de empalme canónicas estaban reguladas por aumento, mientras que se observó lo opuesto con reducción selectiva del alelo SF3B1WT (figura 11A), lo que indica que la proteína SF3B1MUT neomórfica no posee actividad de empalme de tipo silvestre. La expresión de un ARNhc general indujo la regulación de todas las variantes de empalme, así como la reducción de SF3B1WT en células Panc 10.05 (figura 11B). La atenuación de SF3B1PAN alteró al crecimiento y la formación de colonias en ambas líneas celulares, mientras que se observó un efecto mínimo con reducción selectiva de SF3B1MUT neomórfica en células Panc05.04 (figuras 12 y 13). Cuando el alelo SF3B1WT se atenuaba en células Panc 05.04, se observaba solamente un efecto de viabilidad parcial, mientras que la atenuación de SF3B1PAN evitaba la formación de colonias y la proliferación celular (figuras 12 y 14), lo que indica que la inhibición general de SF3B1 da lugar a actividad antitumoral in vitro e in vivo.
Ejemplo 4: Modulación de empalme de SF3B1MUT neomórfica
Efecto global de E7107 sobre el empalme
E7107 es un compuesto micromolecular que inhibe el empalme abordando el complejo de SF3B asociado a RNPnp U2 (Kotake, Y. et al. "Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide." Nat Chem Biol 3, 570-575, doi:10.1038/nchembio.2007.16 [2007]). La capacidad de E7107 de inhibir el empalme se observó en un ensayo de empalme in vitro (IVS) usando el sustrato Ad2 (Pellizzoni, L., Kataoka, N., Charroux, B. y Dreyfuss, G. "A novel function for SMN, the spinal muscular atrophy disease gene product, in pre-mRNA splicing." Cell 95, 615-624 [1998]) y extractos nucleares de las líneas celulares isogénicas Nalm-6 o células 293F (Life Technologies; cultivadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante) que expresan SF3B1WT o SF3B1K700E con marca Flag, como sigue.
Se prepararon los extractos nucleares a partir de células 293F transfectadas con plásmidos pFLAG-CMV-2-SF3B1, o a partir de células Nalm-6 isogénicas (SBH Sciences). Los plásmidos se generaron clonando el gen mxSF3B1 en los sitios HindIII y KpnI de pFLAG-CMV2 (Sigma), y se introdujeron las mutaciones mxSF3B1K700E, mxSF3B1R1074H y mxSF3B1K700E-R1074H usando el mismo kit de mutagénesis dirigida al sitio. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón hipotónico (se usó HEPES 10 mM pH 7,9, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM, PMSF 0,2 mM y DTT 0,5 mM; para células Nalm-6, KCl 40 mM). La suspensión se llevó hasta un total de cinco volúmenes de células empaquetadas (PCV). Después de centrifugación, se descartó el sobrenadante, y las células se llevaron hasta 3 PCV con tampón hipotónico, y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Las células se lisaron usando un homogeneizador Dounce y después se centrifugaron. El sobrenadante se descartó, y el sedimento se resuspendió con / volumen nuclear empaquetado (PNV) de tampón de baja salinidad (HEPES 20 mM pH 7,9, MgCl21,5 mM, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM, glicerol al 25 %, PMSF 0,2 mM, DTT 0,5 mM), seguido de / PNV de tampón de alta salinidad (igual que el tampón de baja salinidad excepto que se usó KCl 1,4 M). Los núcleos se mezclaron suavemente durante 30 minutos antes de centrifugarlos. El sobrenadante (extracto nuclear) se dializó entonces en tampón de almacenamiento (HEPES 20 mM pH 7,9, KCl 100 mM, EDTA 0,2 mM, glicerol al 20 %, PMSF 0,2 mM, DTT 0,5 mM). La concentración de proteína se determinó usando espectrofotómetro NanoDrop 8000 UV-Vis (Thermo Scientific).
Para reacciones de empalme in vitro (IVS), se clonó una secuencia derivada de Ad2 (Pellizzoni, L., Kataoka, N., Charroux, B. y Dreyfuss, G. "A novel function for SMN, the spinal muscular atrophy disease gene product, in pre-mRNA splicing." Cell 95, 615-624 [1998]) en el vector pGEM-3Z (Promega) usando sitios de restricción EcoRI y Xbal. El plásmido pGEM-3Z-Ad2 resultante se linealizó usando Xbal, se purificó, se resuspendió en tampón TE y se usó como molde de ADN en la reacción de transcripción in vitro. Se generó el preARNm de Ad2 y se purificó usando kits MEGAScript T7 y MegaClear, respectivamente (Invitrogen). Se prepararon reacciones de empalme de veinte pl usando 80 pg de extractos nucleares, 20 U de inhibidor de ribonucleasa RNAsin (Promega), 10 ng de preARNm de Ad2 y concentraciones variables de E7107. Después de una preincubación de 15 minutos, se añadió tampón de activación (ATP 0,5 mM, fosfato de creatina 20 mM, MgCl21,6 mM) para iniciar el empalme y las reacciones se incubaron durante 90 minutos. Se extrajo el ARN usando un protocolo modificado de un kit RNeasy 96 (Qiagen). Las reacciones de empalme se interrumpieron en 350 pl de tampón RLT Plus (Qiagen) y se añadió 1,5 volúmenes de etanol. La mezcla se transfirió a una placa RNeasy 96, y las muestras se procesaron como se describe en el protocolo del kit. El ARN se diluyó 1/10 con dH2Ü. Se prepararon reacciones de RT-qPCR de 10 pl usando el kit de 1 etapa TaqMan RNA-to-Ct (Life Technologies), 8,5 pl de ARN y 1 pl de conjunto de cebadores/sonda de ARNm de Ad2 (FW 5' ACTCTCTTCCGCATCGCTGT (SEQ ID NO: 1191), RW 5'-CCGACGGGTTTCCGATCCAA (SEQ ID NO: 1192) y sonda 5' CTGTTGGGCTCGCGGTTG (SEQ ID NO: 1193)).
Para evaluar pSF3B1, se prepararon reacciones de empalme in vitro como describe anteriormente. Para interrumpir las reacciones, se añadió tampón de Laemmli 6X (Boston Bioproducts), y las muestras se sometieron a geles de SDS-PAGE (Life Technologies). Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, después se bloquearon con tampón de bloqueo (tampón de bloqueo Odyssey al 50 % (Li-Cor Biosciences) y TBST al 50 %). Las transferencias se incubaron con anticuerpo anti-SF3B1 durante una noche, después de varios lavados en TBST, se incubaron con anticuerpo de burro-a-ratón-IgG IRDye 680LT y se visualizaron usando un sistema de imágenes Odyssey CLx (Li-Cor Biosciences).
E7107 podía inhibir el empalme en extractos nucleares de células Nalm-6 o las células 293F que expresan SF3B1WT o SF3B1K700E con marca Flag (figuras 15A y 15B).
E7107 se une a proteínas tanto SF3B1WT como SF3B1K700E
La capacidad de E7107 de unirse a proteínas tanto SF3B1WT como SF3B1K700E se evaluó en un ensayo de unión competitiva usando proteínas SF3B1 con marca Flag inmunoprecipitadas con anticuerpo anti-Flag de células 293F transfectadas de forma transitoria. Se preparó la inmovilización por lotes de anticuerpo a microesferas incubando 80 pg de anticuerpo anti-SF3B1 (MBL International) y 24 mg de microesferas de centelleo PVT SPA antirratón (PerkinElmer) durante 30 minutos. Después de centrifugación, la mezcla de anticuerpos-microesferas se resuspendió en PBS complementado con cóctel inhibidor de fosfatasa PhosSTOP (Roche) y cóctel inhibidor de proteasa ULTRA completo (Roche). Los extractos nucleares se prepararon diluyendo 40 mg en un volumen total de 16 ml de PBS con inhibidores de fosfatasa y proteasa, y la mezcla se centrifugó. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio, y se añadió la mezcla de anticuerpos-microesferas y se incubó durante dos horas. Las microesferas se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con PBS Triton X-100 al 0,1 %, y se resuspendieron con 4,8 ml de PBS. Se prepararon reacciones de unión de 100 pl usando suspensión y concentraciones variables de E7107. Después de 15 minutos de preincubación a temperatura ambiente, se añadió molécula de H3-sonda uno nM (descrita en Kotake, Y. et al. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat Chem Biol 3, 570-575, doi:10.1038/nchembio.2007.16 [2007]). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, y las señales de luminiscencia se leyeron usando un contador de placa MicroBeta2 (PerkinElmer).
Como se muestra en la figura 16A, E7107 pudo inhibir de forma competitiva la unión de la molécula de 3H-sonda de una manera similar a SF3B1WT (CI50 : 13 nM) o SF3B1K700E (CI50 : 11 nM).
Efecto de E7107 y otros compuestos sobre empalme normal y aberrante
E7107 también se ensayó in vitro en líneas celulares isogénicas Nalm-6 para la capacidad de modular el empalme normal y aberrante inducido por proteína SF3B1WT y SF3B1K700E. Las células isogénicas Nalm-6 se trataron con concentraciones crecientes de E7107 durante seis horas y se analizó el ARN por qPCR. Como se muestra en la figura 16B, se observó empalme canónico, con acumulación de preARNm para EIF4A1 y regulación por disminución del ARNm maduro de SLC25A19 observado en ambas líneas celulares. Además, se observó regulación por disminución del ARNm maduro de las dos isoformas de empalme anómalo de COASY y ZDHHC16 en Nalm-6 SF3B1K700E (figura 16B).
Para investigar la actividad más amplia de E7107 sobre empalme normal y aberrante, se analizó el ARN de células isogénicas Nalm-6 tratadas durante dos y seis horas a 15 nM por NanoString®. Se observó solamente inhibición parcial del empalme a las dos horas en ambas líneas celulares isogénicas, y a nivel de gen, las isoformas asociadas a WT, y la expresión de la isoforma asociada a MUT. Después de seis horas de tratamiento, se detectó clara inhibición para todas las isoformas cuantificadas (figura 17). Se obtuvieron resultados similares por análisis de sec. ARN de líneas celulares isogénicas durante seis horas con E7107 a 15 nM (figura 18). También se analizó el empalme normal y aberrante en las líneas celulares isogénicas por sec. ARN después de tratamiento con uno de los compuestos adicionales que tienen fórmulas 1 o 2. Como E7107, cada uno de estos compuestos adicionales inhibía la expresión tanto de las isoformas de ARN asociadas a WT como de las asociadas a MUT (figura 19; el compuesto se indica por el número de fórmula encima de cada par vertical de gráficos). Para el análisis de sec. ARN, las células se lavaron con PBS después de tratamiento con E7107 u otro compuesto de ensayo, y se aisló el ARN usando PureLink (Life Technology) como se indica en el manual del fabricante. La preparación de la colección de ADNc, la secuenciación y el filtrado de las lecturas sin procesar se realizaron como se describe en Ren, S. et al. "RNA-Seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifies recurrent gene fusions, cancer-associated long noncoding RNAs and aberrant alternative splicings." Cell Res 22, 806-821, doi:10.1038/cr.2012.30 (2012).
Además, se ensayó la capacidad de E7107 de modular el empalme en ratones que portaban xenoinjertos de tumor humano. Se generaron ratones de xenoinjerto isogénico Nalm-6 implantando de forma subcutánea 10x106 células isogénicas Nalm-6 en el flanco de ratones CB17-SCID, y los tumores de estos ratones se recogieron en diferentes puntos temporales después de una sola dosis intravenosa (IV) de E7107 (5 mg/kg) y se analizaron para determinar las concentraciones de compuesto y la regulación del empalme. Se aisló el ARN de los tumores usando kit de purificación de ARN RiboPure™ (Ambion®) y se usó para ensayo NanoString® o qPCR. El ARN se retrotranscribió de acuerdo con las instrucciones del kit de síntesis de ADNc SuperScript® VILO™ (Invitrogen™) y se usaron 0,04 gl de ADNc para qPCR. La qPCR para preARNm de EIF4A1 y ARNm maduro de SLC24A19 y la evaluación farmacocinética se realizaron como se describe en Eskens, F. A. et al. "Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the first-in-class spliceosome inhibitor E7107 in patients with advanced solid tumors." Clin Cancer Res 19, 6296-6304, doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0485 (2013). Los cebadores y sondas usados para ZDHHC16 fueron los siguientes: FW 5'-TCTTGTCTACCTCTGGTTCCT (SEQ ID NO: 1194), RW 5' CCTTCTTGTTGATGTGCCTTTC (SEQ ID NO: 1195) y sonda 5' FAM CAGTCTTCGCCCCTCTTTTCTTAG (SEQ ID NO: 1196). Los cebadores y sondas usados para COASY fueron los siguientes: FW 5'-CGGTGGTGCAAGTGGAA (SEQ ID NO: 1197), RW 5'-GCCTTGGTGTCCTCATTTCT (SEQ ID NO: 1198) y sonda 5'-FAM-CTTGAGGTTTCATTTCCCCCTCCC (SEQ ID NO: 1199). E7107 alcanzó concentraciones de fármaco similares y moduló el empalme canónico (acumulación de preARNm para EIF4A1 y regulación por disminución del ARNm maduro de SLC25A19) en ambos modelos Nalm-6 SF3B1K700K y Nalm-6 SF3B1K700E y reguló por disminución el empalme anómalo de COa Sy y ZDHHC16 en las células Nalm-6 SF3B1K700E (figura 20), como se observa in vitro. Las isoformas de ARNm de empalme canónico y aberrante se regularon por disminución por E7107 tan pronto como una hora después de la administración del compuesto, y la expresión se normalizó poco después del tratamiento (figura 21), coherente con el perfil farmacocinético de E7107. Se observaron resultados similares en un modelo de xenoinjerto de neomórfica SF3B1 Panc 05.04 (figura 22). Todos estos datos indican que E7107 es un modulador de empalme general que puede unirse e inhibir las proteínas SF3B1WT y SF3B1K700E in vitro e in vivo.
Ejemplo 5: E7107 tiene actividad antitumoral mediante modulación de SF3B1
El modulador de SF3B1 E7107 se ensayó para la actividad antitumoral in vivo determinando el efecto de E7107 en un modelo subcutáneo de Nalm-6 SF3B1K700E. Se implantaron por vía subcutánea 10x106 Nalm-6 SF3B1K700E en el flanco de ratones CB17-SCID, y a los ratones se les administró por vía intravenosa E7107 una vez al día durante 5 días consecutivos (QDx5) a tres niveles de dosis bien tolerados (1,25, 2,5 y 5 mg/kg). Después de esta dosificación, los animales se supervisaron hasta que alcanzaron alguno de los siguientes criterios de valoración: 1) volumen excesivo del tumor medido tres veces a la semana (volumen del tumor calculado usando la fórmula elipsoide: (longitud x anchura2)/2), o 2) desarrollo de algún problema de salud tal como parálisis o excesiva pérdida de peso corporal. La regresión parcial (PR) y la regresión completa (CR) se definen como 3 mediciones consecutivas del tumor <50 % y <30 % del volumen de partida, respectivamente.
En el grupo de 1,25 mg/kg, todos los animales (n = 10) alcanzaron regresión completa (CR) en el grupo de xenoinjerto de Nalm-6 SF3B1K700E. En el grupo de 2,5 mg/kg, se observaron 10/10 CR en el grupo de Nalm-6 SF3B1K700E para el día 9. En el grupo de 5 mg/kg todos los animales con xenoinjerto de Nalm-6 SF3B1K700E alcanzaron CR tan pronto

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método de identificación de un paciente que tiene cáncer con una mutación de SF3B1 neomórfica, que comprende detectar o medir la cantidad de una o más variantes de empalme seleccionadas de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 230 en una muestra que comprende una o más células del paciente.
2. Un método de identificación de una célula cancerosa con una mutación de SF3B1 neomórfica, que comprende detectar o medir la cantidad de una o más variantes de empalme seleccionadas de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 230 en una célula.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra o célula comprende:
(a) una célula humana;
(b) una célula de un paciente sospechoso de tener cáncer;
(c) una célula de un paciente que muestra un signo o síntoma de cáncer; o
(d) una muestra seleccionada de un cultivo celular, una línea celular, una muestra de tejido, una muestra de tejido sólido, una biopsia de tejido, una muestra de tejido bucal, una muestra de tejido gastrointestinal, una muestra de un órgano, un líquido biológico, una muestra de sangre, una fracción de sangre, una muestra de médula ósea, una muestra de orina y una muestra de piel.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cáncer es un cáncer hemático o tumor sólido.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cáncer se selecciona de cáncer de mama, melanoma y leucemia linfocítica crónica.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende
a) poner en contacto la muestra o célula con una o más sondas de ácido nucleico que pueden hibridar específicamente con la una o más variantes de empalme, y
b) detectar la unión de la una o más sondas a la una o más variantes de empalme.
7. El método de la reivindicación 6, en el que la una o más sondas de ácido nucleico comprenden cada una un marcador.
8. El método de la reivindicación 6, que comprende además poner en contacto la muestra biológica con una o más sondas de ácido nucleico adicionales, en el que las sondas adicionales están marcadas cada una con un código de barras molecular.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de medir el nivel de expresión de una o más variantes de empalme comprende usar un ensayo de cuantificación de ácido nucleico seleccionado de generación de código de barras de ácido nucleico, RT-PCR, micromatriz, secuenciación de ácidos nucleicos, sondas de nanopartícula e hibridación in situ.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de medir el nivel de expresión de una o más variantes de empalme comprende medir el número de copias del uno o más ARN variantes de empalme en la célula diana.
11. Un compuesto modulador de SF3B1 para su uso en un método para tratar a un paciente con un trastorno neoplásico, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto modulador de SF3B1 al paciente, en el que una célula del paciente se ha determinado que:
a) contiene una proteína SF3B1 mutante neomórfica; y
b) expresa una o más variantes de empalme aberrantes seleccionadas de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 230 a un nivel que está aumentado o disminuido con respecto al nivel en una célula que no tiene la proteína SF3B1 mutante neomórfica.
12. El método o compuesto modulador de SF3B1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína SF3B1 mutante neomórfica se selecciona de E622D, E622K, E622Q, E622V, Y623C, Y623H, Y623S, R625C, R625G, R625H, R625L, R625P, R625S, N626D, N626H, N626I, N626S, N626Y, H662D, H662L, H662Q, H662R, H662Y, T663I, T663P, K666E, K666M, K666N, K666Q, K666R, K666S, K666T, K700E, V701A, V701F, V701I, I704F, I704N, I704S, I704V, G740E, G740K, G740R, G740V, K741N, K741Q, K741T, G742D, D781 E, D781G y D781N.
13. Un modulador de SF3B1 para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente, en el que una o más células cancerosas del paciente se han ensayado para medir la cantidad de una o más variantes de empalme seleccionadas de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 230.
14. Un modulador de SF3B1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 13, en el que el método comprende identificar un paciente que tiene cáncer con una mutación de neomórfica SF3B1 o identificar una célula cancerosa con una mutación neomórfica de SF3B1, mediante un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o 12.
15. El modulador de SF3B1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que el modulador de SF3B1 se selecciona de una molécula pequeña, un anticuerpo, una molécula de antisentido, un aptámero, una molécula de ARN y un péptido.
16. El modulador de SF3B1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el modulador de SF3B1 es una pladienolida o un análogo de pladienolida.
17. El modulador de SF3B1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el análogo de pladienolida se selecciona de pladienolida B, pladienolida D, E7107, un compuesto de fórmula 1:
Figure imgf000140_0001
un compuesto de fórmula 2:
Figure imgf000140_0002
un compuesto de fórmula 3:
Figure imgf000140_0003
y un compuesto de fórmula 4:
Figure imgf000140_0004
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