ES2861316T3 - Métodos para pronosticar cáncer de próstata - Google Patents
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Abstract
Un método implementado por ordenador que comprende la etapa de: a) determinar un estado de progresión de cáncer de próstata con base en un perfil de expresión génica que incluye el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, en las que ninguna de las variantes de PDE4D sirven como un gen de referencia, y en las que el perfil de expresión génica se convierte en al menos un índice de PDE de cáncer de próstata (Índice-PDE) indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata, y en el que el al menos un Índice-PDE se selecciona de lo siguiente: i) Índice-PDE 1: expresión de PDE4D7 - expresión de PDE4D5 ii) Índice-PDE 2: MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5) iii) Índice-PDE 3: (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4) iv) Índice-PDE 4: (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/( expresión de PDE4D1 y expresión de PDE4D2) v) Índice-PDE 5: (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)).
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para pronosticar cáncer de próstata
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata en el que dicho método determina el estado del cáncer de próstata, con base en el nivel de expresión de las variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D). La invención se refiere además a un método de identificación de un individuo para la elegibilidad para terapia de cáncer de próstata. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas inhibidoras para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de próstata.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento incontrolado, invasión y, a veces, metástasis. Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados, no invaden ni hacen metástasis.
El cáncer de próstata (PCa) es la neoplasia maligna no cutánea que ocurre con más frecuencia en los hombres, con un estimado de 900.000 nuevos casos diagnosticados en todo el mundo en 2008. Debido al envejecimiento de las poblaciones, la incidencia de PCa aumentará drásticamente en los próximos años. El diagnóstico de rutina mediante la determinación de los niveles en sangre del antígeno prostático específico (PSA), el examen rectal digital (DRE) y el análisis de ultrasonido transrectal (TRUS) conduce a un sobrediagnóstico significativo de primera línea de afecciones prostáticas benignas no cancerosas: de las aproximadamente un millón de biopsias de próstata realizadas anualmente solo en los Estados Unidos solo se encuentran alrededor de 250.000 casos nuevos, aproximadamente el 75% se realizan innecesariamente, lo que genera complicaciones sustanciales (urosepsis, hemorragias, retención urinaria) en los pacientes y un costo total de > $ 2 mil millones de dólares aproximadamente US$ 2.100 por procedimiento de biopsia). Es probable que al menos 4 de cada 100 hombres con una biopsia negativa sean hospitalizados debido a los efectos secundarios y 9 de cada 10.000 pacientes a los que se les realizo biopsia corren el riesgo de morir por el procedimiento utilizado actualmente.
De los aproximadamente 250.000 casos de PCa recientemente detectados en los Estados Unidos por año, aproximadamente 200.000 se caracterizan inicialmente como enfermedad localizada, es decir, como cáncer confinado al órgano prostático. Esta afección es hasta cierto punto curable mediante enfoques de tratamiento primario, tales como la radioterapia o, en particular, la extirpación parcial o total de la próstata mediante cirugía (prostatectomía). Sin embargo, estas intervenciones suelen tener efectos secundarios graves, en particular incontinencia urinaria y/o disfunción eréctil como consecuencias muy frecuentes de la prostatectomía. Hasta el 50% de los hombres sometidos a prostatectomía radical desarrollan incontinencia urinaria. Los estudios han demostrado que, un año después de la cirugía, entre el 15% y el 50% de los hombres todavía informan de este tipo de problemas. Los problemas de erección también son efectos secundarios graves de la prostatectomía radical (PR). Solo aproximadamente la mitad de los hombres operados pueden recuperar parte de su capacidad para tener erecciones. Además, todos los tratamientos que se aplican de forma rutinaria para el PCa localizado son costosos (por lo general, del orden de $20.000 a $30.000 dólares) e incurren en costos directos totales de $5.000 millones de dólares cada año.
Entre los ~ 200.000 hombres en los Estados Unidos con enfermedad clínicamente localizada en el momento del diagnóstico, hasta el 50% tiene cáncer de muy bajo o bajo riesgo. En consecuencia, la NCCN (National Comprehensive Cancer Network) revisó recientemente sus pautas de tratamiento del PCa para expandir la vigilancia activa (VA) como una alternativa de tratamiento suave y conveniente para pacientes con una enfermedad de tan bajo riesgo. Al derivar a los pacientes apropiados a la VA, la calidad de vida de dichos pacientes mejora significativamente en comparación con los hombres que se han sometido al tratamiento primario y se informa que el costo de 5 años para la VA es inferior a US $ 10.000 por paciente.
Además, en caso de que se seleccione la cirugía (frente a VA) como el tratamiento de elección para un paciente dado, es una ventaja significativa estratificar la extensión de la cirugía de acuerdo con la agresividad potencial del tumor del paciente. Por ejemplo, las técnicas de operación para preservar los nervios podrían aplicarse de manera más general a los hombres con enfermedad de bajo riesgo prevista para minimizar los efectos adversos relacionados con la potencia de la prostatectomía radical. Asimismo, de acuerdo con las últimas directrices sobre el cáncer de próstata de la Asociación Europea de Urología (EAU), se recomienda la disección prolongada de los ganglios linfáticos en caso de un cáncer de alto riesgo previsto a pesar de que el procedimiento es complejo, requiere mucho tiempo y se asocia con mayores tasas de complicaciones en comparación con procedimientos más limitados. En consecuencia, mientras que la disección de los ganglios linfáticos menos limitada ha demostrado no detectar alrededor del 50% de las metástasis de los ganglios linfáticos, el tratamiento de los hombres con cáncer de próstata localizado requiere predicciones prequirúrgicas muy precisas del potencial de agresividad de un tumor individual para brindar la atención óptima para cada paciente.
El documento WO 2010/131194 A1 describe un método para diagnosticar o detectar cáncer de próstata maligno sensible a hormonas que comprende la etapa de determinar el nivel de expresión de la variante fosfodiesterasa 4D, PDE4D7. El documento también describe el uso de un índice de PDE para discriminar eficazmente entre enfermedades benignas y malignas, en las que la expresión de PDE4D7 se normaliza frente a PDE4D5 como control interno.
El documento WO 2010/131195 A1 describe un método para diagnosticar cáncer de próstata resistente a hormonas frente al sensible a hormonas que comprende la etapa de determinar el nivel de expresión de PDE4D7. El nivel de expresión de PDE4D7 se normaliza a un gen de referencia, que puede ser PDE4D5.
El artículo, "The cAMP phosphodiesterase-4D7 (PDE4D7) is downregulated in androgen-independent prostate cancer cells and mediates proliferation by compartmentalizing cAMP at the plasma membrane of VPCa prostate cancer cells” de Henderson et al., en el British Journal of Cancer, Volumen 110, Número 5, páginas 1278-1287, (2014), presenta evidencia de que PDE4D7 se expresa altamente en células de cáncer de próstata sensibles a los andrógenos, mientras que se subregula significativamente en las células de cáncer de próstata insensibles a los andrógenos y sugiere una potencial aplicación como biomarcador para el cáncer de próstata insensible a los andrógenos, así como posibilidades terapéuticas.
El documento EP 1471153 A2 está dirigido a un ensayo de actividad transcripcional para determinar la actividad biológica de un compuesto analizando su capacidad para modular la expresión génica. Entre los posibles productos de expresión objetivo se encuentran las isoenzimas PDE4D. Los compuestos identificados en los cribados descritos pueden ser anticuerpos, que tienen valor terapéutico en el tratamiento, por ejemplo, de cáncer de mama.
El documento WO 2010/059838 A2 se refiere a inhibidores de fosfodiesterasa-4 (PDE4) y su uso en el tratamiento y prevención de apoplejía, infarto de miocardio, enfermedades y trastornos inflamatorios cardiovasculares, así como trastornos del sistema nervioso central.
El documento WO 2004/090157 A1 describe el uso de PDE4D, en particular PDE4D5 o PDE4D7, como objetivo para la identificación de compuestos que pueden usarse para el tratamiento de la aterosclerosis o para el tratamiento de la reestenosis.
El documento US 2003/220273 A1 describe compuestos antisentido, composiciones y métodos para modular la expresión de fosfodiesterasa 4D y el uso de estos compuestos para el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión de fosfodiesterasa 4D.
El artículo, "Roles of cAMP and cAMP-dependent protein kinase in the progression of prostate cancer: Crosstalk with the androgen receptor' de Merkle y Hoffmann en Cellular Signaling, Volumen 23, Número 3, páginas 507-515, (2011) es un estudio sobre las funciones de cAMP y de la proteína quinasa dependiente de cAMP en la progresión del cáncer de próstata. En el contexto de este estudio se afirma que la expresión de PDE4D aumenta en los tejidos cancerosos. El artículo "Identification of PDE4D as a Proliferation Promoting Factor in Prostate Cancer Using a Sleeping Beauty Transposon-Based Somatic Mutagenesis Screen" de Rahrmann et al., en Cancer Research, 69: (10) (2009) describe que se observaron cambios en la expresión de la isoforma de ARNm de PDE4D en cánceres de próstata humanos. Se investigan los efectos de la inactivación de PDE4D sobre la tasa de crecimiento de los cánceres de próstata y se concluye que PDE4D funciona como un factor promotor de la proliferación en el cáncer de próstata.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a la identificación y uso de perfiles de expresión génica, firmas o patrones de genes biomarcadores de interés (también denominados genes marcadores) con relevancia clínica para el cáncer de próstata. En particular, la invención se basa en el análisis de expresión génica de ácidos nucleicos, preferiblemente transcriptos de genes biomarcadores, obtenidos a partir de muestras biológicas. En particular, el análisis de expresión de estos genes marcadores se usa para proporcionar un índice de PDE de cáncer de próstata (índice de p De ) indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata.
Por lo tanto, el índice de PDE proporciona un parámetro muy útil para la medicina personalizada en relación con el pronóstico y el tratamiento de los pacientes con cáncer de próstata. El índice de PDE se puede utilizar solo o en combinación con otros medios y métodos que proporcionan información sobre el estado de la enfermedad o el estadio de la enfermedad personal del paciente.
Los médicos y/o patólogos pueden utilizar ventajosamente el índice de PDE para confirmar los resultados obtenidos en otros métodos para diagnosticar, identificar y pronosticar pacientes. Los métodos y medios que proporciona la invención, por lo tanto, ayudan a establecer un mejor pronóstico, etc. para encontrar el mejor tratamiento para un paciente, y evitar cirugías innecesarias u otros tratamientos que son peligrosos por efectos secundarios, en ocasiones superfluos y que generan enormes costes para los sistemas de salud pública.
Un aspecto de la invención está dirigido a un método como se define en la reivindicación 1.
Se describe adicionalmente en el presente documento un método que comprende la etapa de:
a) determinar la presencia o ausencia de la fusión del gen TMPRSS2-ERG o el nivel de expresión del factor de transcripción ERG, con base en un perfil de expresión génica que incluye el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo formado por PDE4D1 PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, p De4D8 y PDE4D9, y en el que ninguna de las variantes de PDE4D sirve como gen de referencia.
El perfil de expresión génica se convierte en al menos un índice de PDE (Índice-PDE) de cáncer de próstata indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata. La introducción del índice-PDE proporciona una buena predicación en el pronóstico del cáncer de próstata o un buen desempeño en aplicaciones clínicas como se describe en este documento.
Las variantes de PDE4D que no sirven como gen de referencia proporcionan una buena predicción en el pronóstico del cáncer de próstata o un buen desempeño en aplicaciones clínicas como se describe en el presente documento. Las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9. Los genes seleccionados proporcionan una buena predicción en el pronóstico del cáncer de próstata o un buen desempeño en aplicaciones clínicas como se describe en este documento.
En algunas realizaciones, el perfil de expresión génica es un perfil de expresión génica de una muestra, preferiblemente una muestra de un individuo.
En algunas realizaciones, el perfil de expresión génica es un perfil de expresión génica normalizado que se obtiene normalizando el nivel de expresión de las variantes de PDE4D a la expresión de al menos un gen de referencia, comprendiendo el método opcionalmente, antes de la normalización, la etapa de determinar el nivel de expresión de al menos un gen de referencia en una muestra.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento son un método para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además identificar a un individuo como elegible para recibir una terapia de cáncer de próstata en el que el Índice-PDE del individuo indica la presencia de cáncer de próstata o en el que el Índice-PDE del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo o progresivo.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además tratar a un individuo apto para recibir una terapia de cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además, antes de la etapa a), la etapa de determinar el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9 en una muestra para obtener un perfil de expresión génica.
En una realización adicional, el estado de progresión del cáncer de próstata es no progresivo o progresivo.
En una realización, el nivel de expresión de PDE4D1 y PDE4D2 se determina para ambas variantes.
En otra realización, las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que comprende PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9. En una realización, en la etapa (a) se determina el nivel de expresión de al menos tres variantes de PDE4D.
Al menos un Índice-PDE se selecciona entre los siguientes:
i) Índice-PDE 1:
expresión de PDE4D7 - expresión de PDE4D5
ii) Índice-PDE 2:
MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5)
iii) Índice-PDE 3:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4) iv) Índice-PDE 4:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D1 y PDE4D2) v) Índice-PDE 5:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))
El cálculo del Índice-PDE proporciona una buena predicción en el pronóstico del cáncer de próstata o un buen desempeño en aplicaciones clínicas como se describe en este documento.
Además, se puede determinar el Índice-PDE 1 con el fin de distinguir la próstata no cancerosa de la próstata cancerosa.
En otra realización, al menos uno del Índice-PDE 2, Índice-PDE 3, Índice-PDE 4 e Índice-PDE 5 se determina para distinguir el cáncer de próstata no progresivo del progresivo, y/o en el que un Índice-PDE 2, Índice-PDE 3, Índice-PDE 4 o Índice-PDE 5 por encima de un valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo, y/o un Índice-PDE 2, Índice-PDE 3, Índice-PDE 4 o Índice-PDE 5 por debajo de valor de corte predeterminado es indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata progresivo.
La presencia del gen de fusión TMPRSS2-ERG también se puede determinar y/o el método puede llevarse a cabo con muestras positivas del gen de fusión TMPRSS2-ERG.
En una realización, la determinación del nivel de expresión en la etapa (a) se logra, o se logra adicionalmente, mediante la medición de los niveles de ácido nucleico o proteína o mediante la determinación de la actividad biológica de la variante de PDE4D.
En una realización, la determinación del nivel de expresión del gen de referencia se logra, o se logra adicionalmente, mediante la medición de los niveles de ácido nucleico o proteína o mediante la determinación de la actividad biológica de al menos un gen de referencia.
En algunas realizaciones, al menos un gen de referencia es un gen de mantenimiento, preferiblemente TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (= TUBA1B) o ALAS-1.
En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de tejido, una muestra de orina, una muestra de sedimento de orina, una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de semen, una muestra que comprende células tumorales circulantes, una muestra que contiene exosomas secretados por la próstata, o líneas celulares o líneas celulares cancerosas.
En otra realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden la etapa adicional de determinar la puntuación de pGleason y/o el estadio de pT.
En otra realización, el nivel de expresión génica se determina detectando la expresión de ARNm usando una o más sondas y/o uno o más conjuntos de sondas.
En una realización adicional, el nivel de expresión génica se determina mediante un método basado en amplificación y/o análisis de microarreglos y/o secuenciación de ARN.
En una realización adicional, el nivel de expresión génica se determina mediante secuenciación de ARN, PCR, qPCR o PCR multiplex.
En una realización específica, un individuo se identifica como elegible para recibir una terapia de cáncer de próstata seleccionada entre cirugía de próstata, extirpación de próstata, quimioterapia, radioterapia, disección de ganglios linfáticos limitada o extendida, en la que el índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata progresivo.
En una realización adicional, en la etapa (c) se identifica a un individuo como elegible para recibir vigilancia activa como terapia de cáncer de próstata en la que el índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo.
Se describe además en el presente documento un producto que comprende:
cebadores y/o sondas para determinar el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9;
que comprende además cebadores y/o sondas para determinar el nivel de expresión génica de un gen de referencia, preferiblemente un gen de mantenimiento, más preferiblemente TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 o ALAS-1.
El producto proporciona una base o entrada para realizar los métodos descritos en este documento, que a su vez proporcionan una buena predicación en el pronóstico del cáncer de próstata o un buen desempeño en aplicaciones clínicas como se describe en este documento.
El producto puede ser un kit, que incluye un kit de PCR, un kit de secuenciación de ARN o un kit de microarreglos. El producto también puede ser un microarreglo. El producto proporciona una forma eficaz de obtener los niveles de expresión requeridos.
El producto puede ser un producto para realizar cualquiera de los métodos, o el producto es un producto para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata o para identificar a un individuo para la elegibilidad para la terapia del cáncer de próstata.
El producto puede ser una composición que comprende un conjunto de moléculas de ácido nucleico que comprenden cada una al menos dos secuencias de sonda de oligonucleótidos para el análisis de la expresión génica de las variantes de PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, que comprenden al menos una secuencia de sonda de oligonucleótidos para el análisis de la expresión génica de genes de referencia seleccionados de TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1.
El producto puede ser un arreglo de ácido nucleico que comprende una o más sondas de oligonucleótidos complementarias e hibridables con una secuencia de codificación de al menos dos variantes de PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, que comprenden una o más sondas de oligonucleótidos complementarias e hibridables con al menos uno de los genes de referencia seleccionados de TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1, para determinar un Índice-PDE como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
El producto puede ser un kit para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata para identificar a un individuo para la elegibilidad para la terapia del cáncer de próstata que comprende: a) un arreglo como se definió anteriormente, b) un kit de control; y c) opcionalmente instrucciones de uso.
En el presente documento también se describe un método implementado por ordenador para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata, que comprende las etapas del método como se definió anteriormente en el presente documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un producto de programa informático, que comprende un código legible por ordenador almacenado en un medio legible por ordenador o descargable desde una red de comunicaciones, que, cuando se ejecuta en un ordenador, implementa las etapas de los métodos descritos en este documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por ordenador no transitorio con un programa ejecutable almacenado en el mismo, en el que el programa instruye a un microprocesador para que realice una o más de las etapas de cualquiera de los métodos descritos en este documento.
Se describe en este documento también un sistema que comprende el producto como se describe en este documento y el producto de programa informático o el medio de almacenamiento no transitorio legible por ordenador como se describe en este documento.
En el presente documento también se describe una composición farmacéutica estimuladora para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer de próstata que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo de: (a) un compuesto que estimula o modula directamente la actividad de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9, preferiblemente un agonista alostérico de la actividad enzimática;
(b) un compuesto que estimula o modula indirectamente la actividad de la variante de PDE4D de (a);
(c) la proteína de la variante de PDE4D de (a) o un equivalente biológicamente activo de la misma;
(d) un ácido nucleico que codifica y expresa la variante de PDE4D de (a);
(e) un inhibidor de ARNpi específico para ARNpi de la variante de PDE4D de (a);
(f) un agente de desmetilación; y
(g) un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa, preferiblemente un péptido, un peptidomimético, una molécula pequeña, un anticuerpo o un aptámero,
en el que la variante de PDE4D se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9. Otro aspecto más de la invención se refiere a una composición farmacéutica inhibidora para uso en el tratamiento o prevención del cáncer de próstata como se define en la reivindicación 6.
En el presente documento también se describe una composición farmacéutica inhibidora para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer de próstata que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo de:
(a) un compuesto que inhibe directamente la actividad de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9,
(b) un compuesto que inhibe indirectamente la actividad de la variante de PDE4D de (a);
(c) una forma negativa dominante de la proteína de la variante de PDE4D de (a) o un equivalente biológicamente activo de la misma;
(d) un ácido nucleico que codifica y expresa una forma negativa dominante de la variante de PDE4D de (a), en el que la variante de PDE4D se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento proporcionan un enfoque eficaz para tratar una variedad de cánceres de próstata.
En algunas realizaciones, la variante de PDE4D se selecciona del grupo que consiste en PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9. La composición farmacéutica estimuladora o inhibidora puede ser para el tratamiento del cáncer de próstata, en el que la composición se administra a un individuo que depende del índice-PDE indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata.
La composición farmacéutica estimuladora o inhibidora puede ser para el tratamiento del cáncer de próstata, en el que la composición se administra a un individuo en el que el índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata progresivo.
La composición farmacéutica estimuladora o inhibidora puede ser para el tratamiento del cáncer de próstata, en el que al menos uno del Índice-PDE 2, Índice-PDE 3, Índice-PDE 4 o Índice-PDE 5 de la muestra del individuo está por debajo de un umbral predeterminado.
Se describe adicionalmente en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer de próstata, comprendiendo el método:
(i) seleccionar un sujeto que tiene cáncer de próstata en el que el Índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata progresivo, y
(ii) administrar la composición farmacéutica estimuladora o inhibidora como se describe en este documento al sujeto seleccionado.
El método proporciona un enfoque eficaz para tratar una variedad de cánceres de próstata.
En algunas realizaciones, el método comprende:
(i) seleccionar un sujeto que tiene cáncer de próstata, en el que al menos uno del Índice-PDE 2, Índice-PDE 3, Índice-PDE o el Índice-PDE de la muestra del individuo está por debajo de un umbral predeterminado, y
(ii) administrar la composición farmacéutica estimuladora o inhibidora como se describe en este documento al sujeto seleccionado.
En el presente documento se describe una variante de PDE4D seleccionada del grupo que comprende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 y PDE4D9 para su uso como marcador del estado de progresión del cáncer de próstata.
Se describe además el uso de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que comprende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 y PDE4D9 para controlar o pronosticar cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los conjuntos de sondas de el arreglo Affymetrix Human Exon 1.0 ST con la secuencia de referencia del gen de NCBI y el número de acceso a la proteína del NCPI de la correspondiente variante de PDE4D, así como las secuencias del cebador y la sonda específicas para la variante de PDE4D.
La Figura 2 enumera los genes de referencia con su ID de transcripto y su ID de proteína, así como las secuencias de cebador y sonda específicas para los genes de referencia.
La Figura 3 muestra el desempeño de PDE4D1 a PDE4D9 y el Índice-PDE 1 al Índice-PDE 5 para discriminar un tejido no canceroso, cáncer de próstata que no progresa y que progresa.
La Figura 4 muestra los resultados de desempeño de PDE4D1 a PDE4D9 y el Índice-PDE 1 al Índice-PDE 5 para discriminar tejido no canceroso y cáncer de próstata no progresivo.
La Figura 5 muestra los resultados de desempeño del Índice-PDE 1. Se proporciona una descripción general de un total de ocho conjuntos de datos de cáncer de próstata que comprenden en total más de 900 muestras de pacientes de las categorías de tejido adyacente normal, lesiones benignas, hiperplasia benigna y tejido tumoral.
La Figura 6 muestra los resultados de desempeño del Índice-PDE 2, Índice-PDE 3 de PDE, Índice-PDE 4 de PDE y Índice-PDE 5 de PDE para discriminar muestras de tumores de próstata que no progresan y que progresan.
La Figura 7 muestra los resultados de desempeño de PDE4D1 a PDE4D9 y el Índice-PDE 1 al Índice-PDE 5 para discriminar muestras de tejido no canceroso y de tumor de próstata que no progresa.
La Figura 8 muestra la correlación de PDE4D1 a PDE4D9 y el Índice-PDE 1 al Índice-PDE 5 y la puntuación de Gleason de patología en un grupo de cáncer de próstata.
La Figura 9 ofrece una descripción general del valor añadido de PDE4D1 a PDE4D9 y el Índice-PDE 1 al Índice-PDE 5 junto con datos clínicos sobre la supervivencia libre de progresión dependiendo del estado de fusión TMPRSS2-e Rg del tumor.
La Figura 10 muestra la expresión normalizada de PDE4D1/2, PDE4D3, PDE4D4 y PDE4D5 en seis tipos de tejido de cáncer de próstata diferentes en el conjunto de datos de Taylor et al., Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)).
La Figura11 muestra la expresión normalizada de PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9 en seis tipos de tejido de cáncer de próstata diferentes en el conjunto de datos de Taylor et al., Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)).
La Figura 12 muestra la expresión normalizada de PDE4D1/2, PDE4D3, PDE4D4 y PDE4D5 en seis tipos de tejido de cáncer de próstata diferentes en el conjunto de datos de Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer, Int J Cancer, 15 de julio de 2013; 133 (2): 335 - 45 (GSE41410 (NCBI GEO)). La Figura 13 muestra la expresión normalizada de PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9 en seis tipos de tejido de cáncer de próstata diferentes en el conjunto de datos de Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer, Int J Cancer, 15 de julio de 2013; 133 (2): 335 - 45 (GSE41410 (NCBI GEO)).
Descripción detallada de las realizaciones
Aunque la presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares, esta descripción no debe interpretarse en un sentido limitativo.
Antes de describir en detalle ejemplos de realizaciones de la presente invención, se presentan definiciones importantes para comprender la presente invención.
Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de "un" y "una, uno" también incluyen los plurales respectivos a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
En el contexto de la presente invención, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" denotan un intervalo de precisión que una persona experta en la técnica entenderá para garantizar aún el efecto técnico de la característica en cuestión. El término típicamente indica una desviación del valor numérico indicado de ± 20%, preferiblemente ± 15%, más preferiblemente ± 10% e incluso más preferiblemente ± 5%.
Debe entenderse que el término "que comprende" no es limitante. Para los propósitos de la presente invención, el término "que consiste en" se considera que es una realización preferida del término "que comprende". Si en lo sucesivo se define un grupo para que comprenda al menos un cierto número de realizaciones, se pretende que también abarque un grupo que preferiblemente consta únicamente de estas realizaciones.
Además, los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", etc. y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en este documento pueden funcionar en otras secuencias que las descritas o ilustradas en este documento.
En caso de que los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", etc. se relacionen con las etapas de un método o uso no hay coherencia de tiempo o intervalo de tiempo entre las etapas, es decir, las etapas pueden llevarse a cabo simultáneamente o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años entre dichos etapas, a menos que se indique lo contrario en la solicitud como se establece en este documento anteriormente o más adelante. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, proteínas, bacterias, vectores, reactivos, etc. particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.
Un aspecto de la invención está dirigido a un método como se define en la reivindicación 1.
En el presente documento también se describe un método que comprende la etapa de:
a) determinar la presencia o ausencia de la fusión del gen TMPRSS2-ERG o el nivel de expresión del factor de transcripción ERG, basándose en un perfil de expresión génica que incluye el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo formado por PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, p De4D8 y PDE4D9, y en el que ninguna de las variantes de PDE4D sirve como gen de referencia.
El término "variante del transcripto de PDE4D" o "isoterma de PDE4D" o "variante de PDE4D" se refiere a cualquiera de las variantes de empalme de PDE4D de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D, por ejemplo, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9.
Los términos "marcador" "gen marcador" "GOI" o "marcador de variante de PDE4D", se pueden usar indistintamente y se refieren a un gen, unidad genética o secuencia (una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos o de proteína) como se definió en el presente documento anteriormente, cuyo nivel de expresión está aumentado o disminuido en células o tejidos de cáncer de próstata maligno o benigno o en cualquier tipo de muestra que comprenda tales células o tejidos o porciones o fragmentos de los mismos, cuando se compara con un nivel de control, preferiblemente cuando se compara con la expresión en tejido normal. El término también se refiere a cualquier producto de expresión de dicha unidad o secuencia genética, en particular a un transcripto de ARNm variante de PDE4D, un polipéptido o proteína codificado por el transcripto de la variante de PDE4D o fragmentos de los mismos, así como sus derivados homólogos como se describió en este documento anteriormente. En particular, los términos "marcador', "gen marcador', "GOI" o "marcador variante de PDE4D" se refieren a cualquiera de las variantes de empalme de PDE4D de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D, por ejemplo, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9.
El término "fosfodiesterasa 4D1" o "PDE4D1" se refiere a la variante de empalme 1 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D1, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001197222.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 1, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D1, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 2, que corresponde a la secuencia de proteína definida en la secuencia de referencia de acceso de proteína del n Cb I NP_001184151.1 que codifica el polipéptido PDE4D1. El término "fosfodiesterasa 4D1" o "PDE4D1" también se refiere al amplicón que puede ser generado por el par de cebadores PDE1D1D2 directo (SEQ ID NO: 20) y PDE1D1D2 inverso (Se Q ID NO: 21) y puede ser detectado por la sonda de la SEQ ID NO.: 22.
El término "fosfodiesterasa 4D2" o "PDE4D2" se refiere a la variante de empalme 2 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D2, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001197221.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 3, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D2, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 4, que corresponde a la secuencia de proteína definida en la secuencia de referencia de acceso de proteína del n Cb I NP_001184150.1 que codifica el polipéptido PDE4D2. El término "fosfodiesterasa 4D2" o "PDE4D2" también se refiere al amplicón que puede ser generado por el par de cebadores PDE1D1D2 directo (SEQ ID NO: 20) y PDE1D1D2 inverso (Se Q ID NO: 21) y puede ser detectado por la sonda de la SEQ ID NO.: 22.
El término "fosfodiesterasa 4D3" o "PDE4D3" se refiere a la variante de empalme 3 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D3, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_006203.4, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 5, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D3, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 6, que corresponde a la secuencia de proteína definida en la secuencia de referencia de acceso de proteína del NCBI NP_006194.2 que codifica el polipéptido PDE4D3.
El término "fosfodiesterasa 4D4" o "PDE4D4" se refiere a la variante de empalme 4 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D4, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001104631.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 7, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D4, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 8, que corresponde a la secuencia de proteínas definida en la secuencia de referencia de acceso de proteínas del NCBI NP_001098101.1 que codifica el polipéptido PDE4D4.
El término "fosfodiesterasa 4D5" o "PDE4D5" se refiere a la variante de empalme 5 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D5, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001197218.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 9, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D5, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 10, que corresponde a la secuencia de proteínas definida en la secuencia de referencia de acceso de proteínas del NCBI NP_001184147.1 que codifica el polipéptido PDE4D5. El término "fosfodiesterasa 4D5" o "PDE4D5" también se refiere al amplicón que puede ser generado por el par de cebadores
PDEID5 directo (SEQ ID NO: 23) y PDE1D5 inverso (SEQ ID NO: 24) y puede ser detectado por la sonda de la SEQ ID NO.: 25.
El término "fosfodiesterasa 4D6" o "PDE4D6" se refiere a la variante de empalme 6 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D6, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001197223.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 11, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D6, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 12, que corresponde a la secuencia de proteínas definida en la secuencia de referencia de acceso de proteínas del NCBI NP_001184152.1 que codifica el polipéptido PDE4D6.
El término "fosfodiesterasa 4D7" o "PDE4D7" se refiere a la variante de empalme 7 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D7, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001165899.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 13, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D7, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 14, que corresponde a la secuencia de proteínas definida en la secuencia de referencia de acceso de proteínas del NCBI NP_001159371.1 que codifica el polipéptido PDE4D7. El término "fosfodiesterasa 4D7" o "PDE4D7" también se refiere al amplicón que puede ser generado por el par de cebadores PDE1D7 directo (SEQ ID NO: 26) y PDE1D7 inverso (SEQ iD NO: 27) y pueden ser detectado por la sonda de la SEQ ID NO.: 28.
El término "fosfodiesterasa 4D8" o "PDE4D8" se refiere a la variante de empalme 8 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D8, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001197219.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 15, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D8, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 16, que corresponde a la secuencia de proteínas definida en la secuencia de referencia de acceso de proteínas del NCBI NP_001184148.1 que codifica el polipéptido PDE4D8.
El término "fosfodiesterasa 4D9" o "PDE4D9" se refiere a la variante de empalme 9 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D9, preferiblemente a la secuencia definida en la secuencia de referencia del NCBI: NM_001197220.1, más preferiblemente a la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 17, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia del NCBI indicada anteriormente del transcripto de PDE4D9, y también se relaciona con la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 18, que corresponde a la secuencia de proteína definida en la secuencia de referencia de acceso de proteína del NCBI NP_001184149.1 que codifica el polipéptido PDE4D9. El término "fosfodiesterasa 4D9" o "PDE4D9" también se refiere al amplicón que puede ser generado por el par de cebadores PDE1D5 directo (SEQ ID NO: 29) y PDE1D5 inverso (SEQ ID NO: 30) y pueden ser detectados por la sonda de la SEQ ID NO.: 31.
Los términos "PDE4D1", "PDE4D2", "PDE4D3", "PDE4D4", "PDE4D5", "PDE4D6", "PDE4D7", "PDE4D8" y "PDE4D9" también comprenden secuencias de nucleótidos que muestran un alto grado de homología con PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9 respectivamente, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico son al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 o 17 respectivamente o las secuencias de aminoácidos son al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 respectivamente o secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que son al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 o las secuencias de aminoácidos están codificadas por secuencias de ácidos nucleicos que son al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 o 17.
El término "nivel de expresión", como se usa en este documento, se refiere a la cantidad de transcripto de la variante de PDE4D y/o proteína PDE4D derivable de un número definido de células o una porción de tejido definida, preferiblemente a la cantidad de transcripto de la variante de PDE4D y/o proteína variante de PDE4D obtenible en un procedimiento de extracción de proteína o ácido nucleico estándar (por ejemplo, ARN). Los expertos en la técnica conocen métodos de extracción adecuados.
El término "nivel de control" (o "estado de control"), como se usa en el presente documento, se refiere a un nivel de expresión que puede determinarse al mismo tiempo y/o bajo condiciones similares o comparables a las de la muestra de prueba usando (a) una muestra o muestras previamente recolectadas y almacenadas de un sujeto/sujetos cuya condición o estado de enfermedad, por ejemplo, tumores de próstata no cancerosos, normales o benignos, cáncer de próstata avanzado, etc. es/son conocidos. El término "estado de enfermedad" o "estado de enfermedad canceroso" se refiere a cualquier estado o tipo de condición celular o molecular entre un estado de células no cancerosas y (que
incluye) un estado terminal de células cancerosas. Preferiblemente, el término incluye diferentes etapas de proliferación/desarrollo canceroso o niveles de desarrollo tumoral en el organismo entre (y excluyendo) un estado celular no canceroso y (que incluye) un estado terminal de células cancerosas. Tales etapas de desarrollo pueden incluir todas las etapas del sistema de clasificación de TGM (Tumor, Ganglio, Metástasis) de tumores malignos según lo definido por la UICC, por ejemplo, etapas 0 y I a IV. El término también incluye etapas antes de la etapa 0 de TGM, por ejemplo, etapas del desarrollo en las que los biomarcadores del cáncer conocidos por el experto en la materia muestran una expresión o patrón de expresión modificado.
El nivel de expresión como se mencionó anteriormente puede ser preferiblemente el nivel de expresión de variantes de PDE4D como se definió en este documento anteriormente. Alternativa o adicionalmente, el nivel de expresión también puede ser el nivel de expresión de cualquier otro gen o elemento genético adecuado expresado en una célula, por ejemplo, el nivel de expresión de un gen de mantenimiento o el nivel de expresión de una combinación de genes de mantenimiento, por ejemplo, TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (= TUBA1B) o ALAS-1. En una realización preferida, el nivel de expresión se determina para una combinación de genes de referencia. En otra realización preferida, la combinación de genes de referencia comprende TBP, HPRT1 y al menos uno, al menos dos o al menos tres genes de referencia adicionales seleccionados del grupo que comprende ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 o ALAS-1.
En otra realización preferida, la combinación de genes de referencia comprende TBP, HPRT1 y al menos dos genes de referencia adicionales seleccionados del grupo que comprende ACTB, RPLPO, PUM1, K-ALFA-1 o ALAS-1. Una combinación particularmente preferida es TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO. Otra combinación particularmente preferida es TBP, HPRT1, PUM1, K-ALFA-1, ALAS-1.
El término "canceroso" se refiere en el contexto de la presente invención a un estado de enfermedad canceroso como se definió anteriormente en el presente documento.
El término "no canceroso" se refiere en el contexto de la presente invención a una condición en la que no se puede detectar ni proliferación benigna ni maligna. Los medios adecuados para dicha detección son conocidos en la técnica. Un nivel de control preferido en el contexto de la presente invención es la expresión de la variante de PDE4D en tejido normal, es decir, sano o no canceroso o la expresión de la variante de PDE4D en tejido de tumor de próstata benigno. El término "tumor de próstata benigno" como se usa en este documento se refiere a un tumor de próstata que carece de las tres propiedades malignas de un cáncer, es decir, no crece de manera ilimitada y agresiva, no invade los tejidos circundantes y no hace metástasis. Por lo general, un tumor de próstata benigno implica una enfermedad inflamatoria o neoplásica de próstata leve y no progresiva que carece de las propiedades invasivas de un cáncer. Además, los tumores de próstata benignos se encapsulan típicamente y, por lo tanto, se inhibe su capacidad para comportarse de manera maligna. Un tumor benigno o una condición sana se puede determinar mediante cualquier método molecular, histológico o fisiológico independiente adecuado conocido por el experto en la técnica.
Un nivel de control más preferido en el contexto de la presente invención es la expresión de la variante de PDE4D en tejido normal, es decir, sano o no canceroso o la expresión de la variante de PDE4D en tejido tumoral de próstata no progresivo.
El nivel de control de la expresión puede determinarse mediante un método estadístico basado en los resultados obtenidos analizando el nivel o niveles de expresión previamente determinados del gen o genes marcadores de la presente invención en muestras de pacientes cuyo estado de enfermedad es conocido. Además, el nivel de control puede derivarse de una base de datos de patrones de expresión o niveles de expresión de pacientes, tejidos o células previamente probados. El nivel de control se puede determinar a partir de una muestra de referencia derivada de un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer de próstata, por ejemplo, del cáncer de próstata independiente de hormonas o resistente a hormonas. Además, el nivel de expresión de los genes marcadores de la presente invención en una muestra biológica a ensayar puede compararse con múltiples niveles de control, cuyos niveles de control se determinan a partir de múltiples muestras de referencia. Se contempla utilizar un nivel de control determinado a partir de una muestra de referencia derivada de un tipo de tejido similar al de la muestra biológica derivada del paciente. Se prefiere particularmente usar una muestra o muestras derivadas de un paciente cuyo estado de enfermedad es canceroso como se definió en el presente documento anteriormente.
Alternativamente, las muestras de referencia pueden comprender material derivado de líneas celulares, por ejemplo, líneas celulares cancerosas inmortalizadas, o derivarse de xenoinjertos de tejido. Preferiblemente, el material derivado de líneas celulares de cáncer de próstata o material derivado de xenoinjertos de tejido con tejido prostático humano, en particular con tejido prostático humano benigno y derivado de tumores, puede estar comprendido en una muestra de referencia de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de líneas celulares de cáncer preferidas comprenden las líneas celulares PC346P, PC346B, LNPCa, VPCa, DuPCa, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flu1, PC346Flu2. Ejemplos de xenoinjertos preferidos comprenden PC295, PC310, PC-EW, PC82, PC133, PC135, PC324
y PC374. Preferiblemente, puede usarse un panel completo de líneas celulares y xenoinjertos, por ejemplo, el panel de PC346 humana.
En una alternativa preferida adicional, las muestras de referencia pueden derivarse de tejidos de pacientes, o paneles de tejidos o colecciones de tejidos obtenidas en entornos clínicos. Las muestras pueden, por ejemplo, obtenerse de pacientes varones sometidos a cirugía. Las muestras pueden derivarse de cualquier tipo de tejido adecuado, por ejemplo, de tejido prostético o ganglios linfáticos. Los ejemplos preferidos de colecciones de tejido de pacientes se derivan de procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, prostatectomía).
Además, se prefiere usar el valor estándar de los niveles de expresión del marcador variante de PDE4D de la presente invención en una población con un estado de enfermedad conocido, por ejemplo, una población que tiene un tumor de próstata no progresivo o una población sana. El valor estándar puede obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un intervalo de media ± 2 DE (desviación estándar) o media ± 3 DE como valor estándar.
Además, el nivel de control también se puede determinar al mismo tiempo y/o en condiciones similares o comparables a las de la muestra de prueba usando (a) una muestra o muestras previamente recolectadas y almacenadas de un sujeto/sujetos cuyo estado de enfermedad se sabe que es canceroso, es decir, que han sido diagnosticados independientemente de que padecen cáncer de próstata, en particular cáncer de próstata maligno sensible a hormonas.
En el contexto de la presente invención, un nivel de control determinado a partir de una muestra biológica que se sabe que no es cancerosa, por ejemplo, es una muestra de tejido sano o una muestra de tumor de próstata no progresivo, se denomina "nivel de control normal".
Si el nivel de control se determina a partir de una muestra biológica cancerosa, en particular una muestra de un sujeto para el que se diagnosticó cáncer resistente a hormonas de forma independiente puede designarse como "nivel de control canceroso".
El término "cáncer de próstata" se refiere a un cáncer de la glándula prostática en el sistema reproductor masculino, que se produce cuando las células de la próstata mutan y comienzan a multiplicarse sin control. Normalmente, el cáncer de próstata está relacionado con un nivel elevado de antígeno prostático específico (PSA). En una realización de la presente invención, el término "cáncer de próstata" se refiere a un cáncer que muestra niveles de PSA superiores a 4,0. En otra realización, el término se refiere a un cáncer que muestra niveles de PSA por encima de 2,0. El término "nivel de PSA" se refiere a la concentración de PSA en la sangre en ng/ml.
El término "estado de cáncer de próstata no progresivo" significa que una muestra de un individuo no muestra valores de parámetros que indiquen "recurrencia bioquímica" y/o "recurrencia clínica".
El término "estado de cáncer de próstata progresivo" significa que una muestra de un individuo muestra valores de parámetros que indican "recurrencia bioquímica" y/o "recurrencia clínica".
En el contexto de la presente solicitud, la expresión "recurrencia bioquímica" se refiere, por ejemplo, a valores biológicos recurrentes de PSA aumentado que indican la presencia de células de cáncer de próstata en una muestra. Sin embargo, también es posible utilizar otros marcadores que puedan utilizarse en la detección de la presencia o que despierten sospechas de dicha presencia.
En el contexto de la presente solicitud, el término "recurrencia clínica" se refiere a la presencia de signos clínicos que indican la presencia de células tumorales según se mide, por ejemplo, usando imágenes in vivo.
El término "aumentado" o "nivel de expresión aumentado" o "nivel de expresión sobrerregulado" o "aumento del nivel de expresión" (que pueden usarse como sinónimos) en el contexto de la presente invención, por lo tanto, denota un aumento en el nivel de expresión entre una situación que se va a analizar, por ejemplo, una situación derivable de la muestra de un paciente, y un punto de referencia, que podría ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso derivable de cualquier tumor de próstata adecuado o estadio de cáncer conocido por el experto en la técnica. Se considera que los niveles de expresión están "aumentados" cuando la expresión del gen de la variante de PDE4D, por ejemplo, en una muestra a analizar, difiere, es decir, se eleva, por ejemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o más del 50% en comparación con un nivel de control, o al menos 0,1 veces, al menos 0,2 veces, al menos 1 vez, al menos 2 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces o más en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso como se definió en el presente documento anteriormente. Si se va a realizar una comparación con un nivel de control canceroso, se prefiere una comparación adicional con un nivel de control normal. Tal comparación adicional permite la determinación de una tendencia de la modificación, por ejemplo, se puede observar la magnitud de un aumento del nivel de expresión y/o se pueden extraer las conclusiones correspondientes. Se prefiere una comparación con un tumor de próstata benigno, o con un tejido sano o una muestra derivada de un individuo sano.
En una realización adicional, una similitud adicional en el patrón de expresión génica general entre una muestra obtenida de un sujeto y una referencia como se definió anteriormente en el presente documento, que es cancerosa, indica que el sujeto padece cáncer de próstata. En otra realización de la presente invención, el diagnóstico puede combinarse con la elucidación de niveles de expresión de biomarcadores de cáncer adicionales, en particular biomarcadores de cáncer de próstata. Los biomarcadores adecuados, en particular el biomarcador de cáncer de próstata, serían conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, se puede probar la expresión de biomarcadores como PSA.
Se puede considerar que se diagnostica un cáncer de próstata sensible a hormonas maligno cuando se aumenta el nivel de expresión del marcador de la variante de PDE4D de la presente invención, en comparación con el nivel de control normal como se definió anteriormente en el presente documento.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D1, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, se puede indicar un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D1, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D2, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, se puede considerar que se diagnostica un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D2, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Puede estar indicado un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D3, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, puede indicarse un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D3, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D4, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, puede indicarse un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D4, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Puede indicarse un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D5, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, puede indicarse un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D5, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D6, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, se puede indicar un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D6, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D7, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, puede indicarse un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D7, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D8, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, se puede indicar un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D8, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Se puede indicar un cáncer progresivo si el nivel de expresión de PDE4D9, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un valor de entre 20% y 80%, preferiblemente en un valor de 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso, como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, se puede indicar un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión de PDE4D9, como se definió anteriormente en el presente documento, se reduce en un factor de 1,5 a 10 veces, preferiblemente en un factor de 2 a 5 veces en una muestra de prueba en comparación con un nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo.
Puede detectarse una etapa de progresión del cáncer de próstata no progresivo cuando el nivel de expresión del marcador PDE4D7 aumenta en comparación con el nivel de control normal como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización preferida de la presente invención, se puede detectar un cáncer de próstata no progresivo si el nivel de expresión del marcador PDE4D7 es similar a un nivel de expresión de una célula o línea celular de cáncer de próstata establecido, por ejemplo, establecido independientemente, por ejemplo, una línea celular de cáncer no progresivo.
Puede detectarse una etapa de progresión de cáncer de próstata progresivo cuando el nivel de expresión del marcador PDE4D7 disminuye en comparación con el nivel de control normal, en particular un tejido sano o un tumor de próstata no progresivo. En una realización preferida de la presente invención, se puede detectar un cáncer de próstata progresivo si el nivel de expresión del marcador PDE4D7 es similar al nivel de expresión de una célula o línea celular de cáncer de próstata progresivo establecido, por ejemplo, establecido independientemente.
Se puede detectar un cáncer de próstata progresivo o no progresivo cuando el nivel de expresión de al menos uno de los marcadores PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 y PDE4D9 disminuye en comparación con el nivel de control normal como se definió anteriormente en el presente documento. En una realización preferida de la presente invención, se puede detectar un cáncer de próstata progresivo o no progresivo si el nivel de expresión de al menos uno de los marcadores PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 y PDE4D9 es similar a un nivel de expresión de una célula o línea celular de cáncer de próstata establecido, por ejemplo, establecido independientemente.
El término "seguimiento del cáncer de próstata", como se utiliza en este documento, se refiere al acompañamiento de una enfermedad o trastorno de cáncer de próstata diagnosticado o detectado, por ejemplo, durante un procedimiento de tratamiento o durante un cierto período de tiempo, generalmente durante 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 5 años, 10 años o cualquier otro período de tiempo. El término "acompañamiento" significa que los estados de enfermedad como se definieron anteriormente en el presente documento y, en particular, los cambios de estos estados de enfermedad pueden detectarse comparando el nivel de expresión del marcador variante de PDE4D de la presente invención en una muestra con un nivel de control normal, como se define en este documento anteriormente, preferiblemente un nivel de expresión de control derivado de un control tumoral progresivo, un control tumoral no progresivo o un control sano o al nivel de expresión de una célula o línea celular de cáncer de próstata establecido, por ejemplo, establecido independientemente, o una línea celular en cualquier tipo de segmento de tiempo periódico, por ejemplo, cada semana, cada 2 semanas, cada mes, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, cada 1,5 años, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años, durante cualquier período de tiempo, por ejemplo, durante 2 semanas, 3 semanas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 años, respectivamente. La célula o línea celular de cáncer de próstata establecido, por ejemplo, establecido independientemente que da lugar a un nivel de control adicional puede derivarse de muestras correspondientes a diferentes etapas del desarrollo del cáncer, por ejemplo, etapas 0 y I a IV del sistema de clasificación de TGM. En una realización preferida de la presente invención, el término se refiere al acompañamiento de un cáncer de próstata diagnosticado, más preferiblemente de
un cáncer de próstata progresivo o no progresivo. El seguimiento también puede incluir la detección de la expresión de genes o elementos genéticos adicionales, por ejemplo, genes de limpieza.
El término "cáncer de próstata pronóstico", como se usa en este documento, se refiere a la predicción del curso o resultado de un cáncer de próstata diagnosticado o detectado, por ejemplo, durante un cierto período de tiempo, durante un tratamiento o después de un tratamiento. El término también se refiere a una determinación de la probabilidad de supervivencia o recuperación de la enfermedad, así como a una predicción del tiempo de supervivencia esperado de un sujeto. Un pronóstico puede, específicamente, implicar establecer la probabilidad de supervivencia de un sujeto durante un período de tiempo en el futuro, tal como 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 5 años, 10 años o cualquier otro período de tiempo.
El término "factor de transcripción de ERG", como se usa en este documento, se refiere a una proteína nuclear que se une a secuencias de ADN ricas en purina, que está codificada por el gen ERG (gen relacionado con ETS), un oncogén. ERG es un miembro de la familia de factores de transcripción de ETS (específico de transformación de eritroblastos). El regulador transcripcional ERG es necesario para la adhesión plaquetaria al subendotelio y regula la hematopoyesis. Tiene un dominio de unión al ADN y un dominio PNT (puntiagudo).
La expresión sobrerregulada de PDE4D puede indicar un nivel de expresión sobrerregulado del factor de transcripción de e Rg o la presencia de fusión del gen TMPRSS2-ERG.
El término "gen de referencia" o "gen de control" como se usa en este documento se refiere a cualquier gen adecuado, por ejemplo, a cualquier gen, producto génico, producto de expresión, proteína o variante de proteína expresado de manera estable y detectable en forma continua en el organismo de elección. El término también incluye productos génicos tales como proteínas, péptidos, polipéptidos expresados, así como variantes modificadas de los mismos. Por lo tanto, la invención también incluye proteínas de referencia derivadas de un gen de referencia. También se incluyen todos los tipos de transcriptos derivables del gen de referencia, así como modificaciones del mismo o parámetros secundarios vinculados al mismo. Alternativa o adicionalmente, también se pueden usar otros parámetros de referencia con fines de referencia, por ejemplo, concentraciones metabólicas, tamaños de células, etc.
La expresión se puede llevar a cabo preferiblemente en la misma muestra, es decir, el nivel de una variante de PDE4D y del gen de referencia se determina en la misma muestra. Si la prueba se lleva a cabo en la misma muestra, se puede realizar una detección única o un enfoque de detección múltiple como se describe en este documento. Para la realización de la detección múltiple, se puede modificar la concentración de cebadores y/u oligonucleótidos sonda. Además, la concentración y presencia de otros ingredientes tales como tampones, iones, etc. se pueden modificar, por ejemplo, aumentado o disminuido en comparación con las indicaciones de los fabricantes.
En una realización específica de la presente invención, se puede determinar la expresión de más de un gen de referencia o gen expresado de manera constante. Por ejemplo, se puede determinar la expresión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o más genes de referencia. Los resultados de tales mediciones pueden calcularse por separado o pueden combinarse para obtener un índice de expresión promedio. Además, el patrón de expresión del gen de referencia puede determinarse y/o usarse como base para etapas posteriores. Tal patrón puede basarse en comportamientos de expresión conocidos de genes en ciertos cánceres, en particular estadios o estados del cáncer de próstata.
Además, los resultados de expresión pueden compararse con resultados ya conocidos de casos de referencia o bases de datos. La comparación puede incluir adicionalmente un procedimiento de normalización para mejorar la relevancia estadística de los resultados.
En una realización alternativa de la presente invención, en lugar de determinar el nivel de expresión de un gen de referencia en una muestra, se puede determinar la expresión de un marcador de cáncer adicional o gen expresado de forma no constante. Por ejemplo, se puede determinar la expresión de un gen, que se sabe que se reduce durante el cáncer de próstata resistente a hormonas, o que se sabe que aumenta durante el cáncer de próstata sensible a hormonas.
En una realización adicional, también se pueden llevar a cabo ambas determinaciones de expresión, es decir, la determinación de la expresión de un gen de referencia y de un gen de cáncer o biomarcador adicional.
Los ejemplos de genes de control incluyen, entre otros, la proteína de unión a la caja TATA (TBP) de Homo sapiens, la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, ARNm de actina beta (ACTB) de Homo sapiens, ARNm de fosfoproteína ribosomal P0 (RPLP0) ácida 60S de Homo sapiens, miembro de la familia de unión a ARN de pumilio (PUM1) de Homo sapiens, Polipéptido A de polimerasa II (dirigido a ADN), 220 kDa (POLR2A), Beta-2-microglobulina (B2M), tubulina-alfa-lb (K-ALFA-1), aminolevulinato-delta-sintasa (ALAS-1).
En una realización específica de los métodos descritos en el presente documento, se llevan a cabo las siguientes etapas (a2) que determinan el nivel de expresión de un gen de referencia en una muestra; (a3) que normalizan el nivel
de expresión medido de las variantes de PDE4D de la etapa (a) a la expresión del gen de referencia para obtener un perfil de expresión génico normalizado;
en el que el estado de progresión del cáncer de próstata y/o el índice de progresión del cáncer de próstata se basan en el perfil de expresión génica normalizado de las variantes de PDE4D de la etapa (a3).
El término "en el que ninguna de las variantes de PDE4D se usa como gen de referencia" significa que la variante de PDE4D no se usa como gen de referencia para normalizar el nivel de expresión medido.
En particular, PDE4D5 no se usa como gen de referencia.
Más en particular, ninguna de las variantes de PDE4D se usa como gen de referencia para normalizar el nivel de expresión de PDE4D7.
En una realización aún más particular, PDE4D5 no se usa como gen de referencia para normalizar el nivel de expresión de PDE4D7.
Los resultados de la expresión se pueden normalizar de acuerdo con cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. Normalmente, tales pruebas o la fórmula correspondiente, que sería conocida por el experto en la técnica, se usarían para estandarizar los datos de expresión para permitir la diferenciación entre variaciones reales en los niveles de expresión génica y variaciones debidas a los procesos de medición. Para microarreglos, el promedio robusto de múltiples arreglos (RMA) se puede utilizar como enfoque de normalización.
En una realización específica, los valores normalizados se generan aplicando lo siguiente:
N(Cqgen de interés) — Media(Cqgen de ref ) -(Cqgen de interés)
En la que N (Cqgen de interés) es el valor de expresión génica normalizada para genes de interés seleccionados; en la que Media (Cqgen de ref) es la media aritmética de los valores Cq de la PCR de la combinación seleccionada de genes los de referencia; donde (Cqgen de interés) es el valor de Cq de la PCR del gen de interés.
En una realización específica, los valores normalizados se generan aplicando lo siguiente:
N(Cqgen de interés) — Media(Cqgen de ref ) -(Cqgen de interés)
En la que N (Cqgen de interés) es el valor de expresión génica normalizado para genes de interés seleccionados; donde Media (Cqgen de ref) es la media aritmética de los valores de Cq de PCR de al menos dos genes de referencia seleccionados de TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, POLR2A, B2M, PUM1, K-ALFA-1 y ALAS-1; en la que (Cqgen de interés) es el valor Cq de PCR del gen de interés.
En una realización específica, los valores normalizados se generan aplicando lo siguiente:
N(Cqgen de interés) — Media(Cqgen de ref ) -(Cqgen de interés)
En la que N(Cqgen de interés ) es el valor de expresión génica normalizada para genes de interés seleccionados; donde Media(Cqgen de ref ) es la media aritmética de los valores de Cq de la PCR de los genes de referencia TBP, HPRT1, ACTB y RPLP0; en la que (Cqgen de interés) es el valor de Cq de la PCR del gen de interés.
En una realización específica, los valores normalizados se generan aplicando lo siguiente:
N(Cqgen de interés) — Media(Cqgen de ref ) -(Cqgen de interés)
En la que N(Cqgen de interés ) es el valor de expresión génica normalizada para genes de interés seleccionados; en la que Media(Cqgen de ref ) es la media aritmética de los valores de Cq de la PCR de los genes de referencia TBP, HPRTl, PUM1, K-ALFA-1 y ALAS-1; en la que (Cqgen de interés) es el valor Cq de la PCR del gen de interés.
Los ejemplos de genes de control incluyen, entre otros, la proteína de unión a la caja TATA (TBP), hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, ARNm de actina beta (ACTB) de Homo sapiens, ARNm de fosfoproteína ribosomal P0 (RPLP0) ácida 60S de Homo sapiens, miembro de la familia de unión a ARN de pumilio (P uM l) de Homo sapiens, Polipéptido A (ARN) polimerasa II (dirigido a ADN), 220 kDa (POLR2A), Beta-2-microglobulina (B2M), tubulina-alfa-lb (K-ALFA-1), aminolevulinato-delta-sintasa (ALAS-1). Una combinación particularmente preferida es TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO. Otra combinación particularmente preferida es TBP, HPT1, PUM1, K-ALFA-1, ALAS-1.
En otra realización preferida, la combinación de genes de referencia comprende TBP, HPRT1 y al menos uno, al menos dos o al menos tres genes de referencia adicionales seleccionados del grupo que comprende ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1.
En otra realización preferida, la combinación de genes de referencia comprende TBP, HPRT1 y al menos dos genes de referencia adicionales seleccionados del grupo que comprende ACTB, RPLPO, PUM1, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1.
Una combinación particularmente preferida es TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO. Otra combinación particularmente preferida es TBP, HPRT1, PUM1, K-ALFA-1, ALAS-1.
Se divulga una descripción detallada de los genes de referencia que incluyen su ID del Transcripto (Secuencia de referencia del NCBI) y la SEQ ID NO de la secuencia de nucleótidos correspondiente, la ID de la proteína (acceso a la proteína) y la SEQ ID NO de la secuencia de aminoácidos correspondiente en la Figura 2. Además, la Figura 2 describe para cada gen de referencia un cebador directo, un cebador inverso para la generación de un amplicón que es específico para el gen de referencia y una secuencia de sonda que se une específicamente al amplicón.
En particular, el gen de referencia no es una variante de PDE4D.
Las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que comprende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9.
En una realización específica, las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que comprende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9.
En otra realización, las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que comprende PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9.
En otra realización específica, las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que comprende PDE4D5 y PDE4D7. En otra realización específica, las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que comprende PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9.
En otra realización específica, las variantes de PDE4D se seleccionan del grupo que consiste en PDE4D5 y PDE4D7. En una realización preferida, el nivel de expresión de al menos tres variantes de PDE4D, de al menos cuatro variantes de PDE4D, de al menos 5 variantes de PDE4D se selecciona en la etapa (a).
En una realización más preferida, el nivel de expresión de al menos tres variantes de PDE4D se selecciona en la etapa (a).
En una realización adicional, el nivel de expresión de diferentes variantes de PDE4D se determina conjuntamente, por ejemplo, mediante una sonda que detecta varias variantes de PDE4D juntas.
En una realización preferida, el nivel de expresión de PDE4D1 y PDE4D2 se determina para ambas variantes juntas. Eso significa que solo se utiliza una única sonda para informar la expresión de estas variantes PDE4D muy estrechamente relacionadas PDE4D1 y PDE4D2 juntas.
En el contexto de la presente invención, los términos "diagnosticar' y "pronosticar' también pretenden abarcar predicciones y análisis de probabilidad. Por consiguiente, las variantes de PDE4D como marcadores pueden usarse clínicamente para tomar decisiones sobre las modalidades de tratamiento, incluida la intervención terapéutica o los criterios de diagnóstico, tales como la vigilancia de la enfermedad. De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar un resultado intermedio para examinar la condición de un sujeto. Dicho resultado intermedio puede combinarse con información adicional para ayudar a un médico, enfermera u otro profesional a diagnosticar que un sujeto padece la enfermedad. Alternativamente, la presente invención puede usarse para detectar células cancerosas en un tejido derivado de un sujeto y proporcionar a un médico información útil para diagnosticar que el sujeto padece la enfermedad.
Un sujeto o individuo que va a ser diagnosticado, controlado o pronosticado con cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata de acuerdo con la presente invención es un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
Es particularmente preferido el uso de herramientas de formación de imágenes moleculares conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo, la tecnología de formación de imágenes de resonancia magnética (IRM) y/o imágenes de resonancia magnética de fotones (IRMF) en el contexto del uso de variantes de PDE4D como marcador para diagnosticar, controlar o pronosticar el cáncer de próstata maligno sensible a hormonas de la progresión hacia cáncer de próstata sensible a hormonas. Por ejemplo, las variantes de PDE4D pueden usarse como un marcador para diagnosticar, controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata en enfoques tales como IRM o IRMF que permiten la detección en línea del marcador de diagnóstico en un sujeto humano.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata, que comprende las etapas de
(a) determinar el nivel de expresión de al menos dos variantes de PDE4D seleccionadas del grupo que comprende p De4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9 en una muestra para obtener un perfil de expresión génica;
(b) determinar al menos un Índice-PDE indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata con base en el perfil de expresión génica obtenido en la etapa (a).
En algunas realizaciones, se proporciona un método de identificación de un individuo para la elegibilidad para la terapia del cáncer de próstata que comprende:
(a) determinar en una muestra obtenida de un individuo el nivel de expresión de al menos dos variantes de PDE4D seleccionadas del grupo que comprende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9 para obtener un perfil de expresión génica;
(b) determinar al menos un índice de progresión del cáncer de próstata con base en el perfil de expresión génica de las variantes de PDE4D indicativas del estado de progresión del cáncer de próstata de la etapa (a);
(c) identificar al individuo como elegible para recibir una terapia contra el cáncer de próstata en la que el Índice-PDE de la muestra del individuo indica la presencia de cáncer de próstata o en la que el Índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo o progresivo.
El término "Índice-PDE" se refiere a la combinación de los valores de expresión de al menos dos isoformas de PDE4D en un único modelo de datos. El Índice-PDE proporciona así un poder de clasificación significativamente mejorado para predecir el estado de progresión del cáncer de próstata.
En una realización específica, el estado de progresión del cáncer de próstata es progresivo o no progresivo.
El Índice-PDE se selecciona de:
i) Índice-PDE 1:
expresión de PDE4D7 - expresión de PDE4D5
ii) Índice-PDE 2:
MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5)
iii) Índice-PDE 3:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4) o iv) Índice-PDE 4:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D1 y PDE4D2) v) Índice-PDE 5:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))
El término "expresión de PDE4D4" denota el nivel de expresión normalizado (a los genes de referencia) de PDE4D4, el término "expresión de PDE4D5" denota el nivel de expresión normalizado (a los genes de referencia) de PDE4D5, el término "expresión de PDE4D7" denota el nivel normalizado (a los genes de referencia) de PDE4D7 y el término "expresión de PDE4D9" denota el nivel de expresión normalizado (a los genes de referencia) de PDE4D9. El término expresión de "PDE4D1 y PDE4D2" denota los niveles de expresión normalizados (a los genes de referencia) de PDE4D1 y PDE4D2, detectados juntos mediante un único ensayo.
El índice de progresión de cáncer de próstata Índice-PDE 1 se determina mediante la expresión de PDE4D7 -expresión de PDE4D5. El Índice-PDE 1 en particular distingue el cáncer de próstata no canceroso del cáncer de próstata. Preferiblemente, el Índice-PDE 1 distingue la próstata no cancerosa de la próstata cancerosa.
Por ejemplo, un Índice-PDE 1 por debajo de un valor de corte predeterminado es indicativo de próstata no cancerosa y un Índice-PDE 1 por encima del valor de corte predeterminado es indicativo de cáncer de próstata.
El Índice-PDE 2 está determinado por la MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5). El Índice-PDE 2 discrimina entre el estado de progresión del cáncer no progresivo y progresivo.
Por ejemplo, un Índice-PDE 2 por debajo de un valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 2 por encima del valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo.
En otra realización, un Índice-PDE 2 por debajo de los niveles de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 2 por encima del nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo.
El Índice-PDE 3 está determinado por (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4).
El Índice-PDE 3 discrimina entre el estado de progresión del cáncer no progresivo y progresivo.
Por ejemplo, un Índice-PDE 3 por debajo de un valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 3 por encima del valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo.
El Índice-PDE 4 está determinado por (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/( expresión de PDE4D1 y PDE4D2).
El Índice-PDE 4 discrimina entre el estado de progresión del cáncer no progresivo y progresivo.
El Índice-PDE 5 está determinado por (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)).
El Índice-PDE 5 discrimina entre el estado de progresión del cáncer no progresivo y progresivo.
Por ejemplo, un Índice-PDE 4 por debajo de un valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 4 por encima del valor de corte predeterminado es indicativo de un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo.
El término "corte predeterminado" puede definirse con base en un nivel de control, es decir, un índice de PDE que se determina para tejido no canceroso o tejido de próstata no progresivo. En una realización específica, el corte se puede establecer en el nivel de control. En otra realización, el corte puede diferir del nivel de control.
Un Índice-PDE 1 por debajo de un nivel de control es indicativo de próstata no cancerosa y un Índice-PDE 1 por encima de un nivel de control es el valor de corte predeterminado indicativo de cáncer de próstata.
Un Índice-PDE 1 por debajo de un nivel de control es indicativo de próstata no cancerosa y un Índice-PDE 1 por encima de un nivel de control es el valor de corte predeterminado indicativo de cáncer de próstata, en el que el nivel de control es el Índice-PDE 1 de tejido no canceroso.
En otra realización, un Índice-PDE 2 por debajo de un nivel de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 2 por encima de un nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo.
En una realización preferida, un Índice-PDE 2 por debajo de los niveles de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 2 por encima del nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo, en el que el nivel de control es el Índice-PDE 2 de tejido tumoral que no progresa. En otra realización, un Índice-PDE 3 por debajo de un nivel de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 3 por encima de un nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo.
En una realización preferida, un Índice-PDE 3 por debajo de los niveles de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 3 por encima del nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo, en el que el nivel de control es el Índice-PDE 3 de tejido tumoral que no progresa. En otra realización, un Índice-PDE 4 por debajo de un nivel de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 4 por encima de un nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo.
En una realización preferida, un Índice-PDE 4 por debajo de los niveles de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 4 por encima del nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo, en el que el nivel de control es el Índice-PDE 4 de tejido tumoral que no progresa. En otra realización, un Índice-PDE 5 por debajo de un nivel de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 5 por encima de un nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo.
En una realización preferida, un Índice-PDE 5 por debajo de los niveles de control es indicativo de un estado de tumor de próstata progresivo y un Índice-PDE 5 por encima del nivel de control es indicativo de un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo, en el que el nivel de control es el Índice-PDE 5 de tejido tumoral que no progresa.
También se puede determinar la presencia del gen TMPRSS2-ERG, es decir, se puede determinar si la muestra es positiva o negativa para TMPRSS2-ERG. En particular, se determina si se expresa TMPRSS2-ERG como se describe en Tomlins, SA et al., "Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer". Science 310, 644-648 (2005). TMPRSS2-ERG es un reordenamiento genómico entre la serina proteasa regulada por andrógenos TMPRSS2 y el factor de transcripción de ERG2, que es miembro de la familia de transcripción de eTs . Los métodos descritos en el presente documento proporcionan un poder de clasificación particularmente mejorado para predecir la progresión del cáncer de próstata en muestras en las que se puede detectar el gen TMPRSS2-ERG o la expresión de TMPRSS2-ERG.
En una realización preferida, los métodos de la invención se aplican a muestras en las que está presente TMPRSS2-ERG.
El nivel de la variante de PDE4D se puede determinar a nivel de ácido nucleico, nivel de proteína o nivel de actividad como se describe en el presente documento. Se prefiere la determinación de la cantidad de transcripto o transcriptos de la variante de PDE4D y/o proteína. Además, se puede determinar el nivel de un gen de referencia en la muestra. En una realización preferida de la presente invención, el seguimiento o pronóstico como se mencionó anteriormente debe llevarse a cabo en una muestra obtenida de un individuo. El término "muestra obtenida de un individuo" como se usa en este documento se refiere a cualquier material biológico obtenido de un individuo mediante métodos adecuados conocidos por el experto en la técnica. La muestra usada en el contexto de la presente invención debe recolectarse preferiblemente de una manera clínicamente aceptable, más preferiblemente de una manera que se conserven los ácidos nucleicos (en particular, el ARN) o las proteínas.
Las muestras biológicas pueden incluir tejidos y fluidos corporales, tales como sangre, sudor y orina. Además, la muestra biológica puede contener un extracto celular derivado de una población celular que incluye una célula epitelial, preferiblemente una célula epitelial cancerosa o de una célula epitelial derivada de tejido sospechoso de ser canceroso. Incluso más preferiblemente, la muestra biológica puede contener una población celular derivada de un tejido glandular, por ejemplo, la muestra puede provenir de la próstata de un individuo masculino. Además, las células pueden purificarse a partir de tejidos y fluidos corporales obtenidos si es necesario, y luego usarse como muestra biológica.
Las muestras, en particular después del procesamiento inicial, pueden agruparse. Sin embargo, también pueden usarse muestras no agrupadas.
En una realización específica de la presente invención, el contenido de una muestra biológica también puede someterse a una etapa de enriquecimiento. Por ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con ligandos específicos para la membrana celular u orgánulos de ciertos tipos de células, por ejemplo, células prostáticas, funcionalizadas, por ejemplo, con partículas magnéticas. El material concentrado por las partículas magnéticas se puede utilizar posteriormente para las etapas de detección y análisis como se describió en el presente documento anteriormente o a continuación.
En una realización específica de la invención, se pueden obtener y/o utilizar muestras de biopsia o resecciones. Tales muestras pueden comprender células o lisados celulares.
Además, las células, por ejemplo, células tumorales, se pueden enriquecer mediante procesos de filtración de fluidos o muestras líquidas, por ejemplo, sangre, orina, etc. Dichos procesos de filtración también pueden combinarse con etapas de enriquecimiento basadas en interacciones específicas de ligando como se describió anteriormente en el presente documento.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, una muestra puede ser una muestra de tejido, una muestra de biopsia, una muestra de orina, una muestra de sedimento de orina, una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de semen, una muestra que comprende células tumorales en circulación o una muestra que contiene exosomas secretados por la próstata. Una muestra de sangre puede ser, por ejemplo, una muestra de suero o una muestra de plasma.
En realizaciones de la invención, el patrón de expresión del gen marcador (o el Índice-PDE) puede correlacionarse con los niveles de PSA antes o después de la cirugía, la puntuación de Gleason y el estadio de pT.
En una realización preferida de la presente invención, el método descrito en el presente documento comprende la etapa adicional de determinar la puntuación de pGleason y/o el estadio de pT.
En una realización más preferida de la presente invención, el método como se describe en este documento comprende la etapa adicional de determinar la puntuación de pGleason y el estadio de pT.
"Puntuación de Gleason" o "pGleason" se refiere a la clasificación de una muestra de cáncer de próstata por un patólogo capacitado de acuerdo con el sistema de Gleason, que asigna una puntuación de Gleason utilizando números
del 1 al 5 en función de las similitudes en las células de una muestra de tejido de próstata a tejido canceroso o tejido de próstata normal. El tejido que se parece mucho al tejido de próstata normal se le asigna una puntuación o calificación de 1, mientras que un tejido que carece de características normales y las células parecen diseminarse al azar a través de la próstata recibe una puntuación o calificación de 5. Puntuaciones o calificaciones de 2 a 4, inclusive, tienen características entre estas posibilidades. Pero debido a que los cánceres de próstata pueden tener áreas con diferentes puntuaciones o calificaciones, se asignan puntuaciones o calificaciones separados a las dos áreas que componen la mayor parte del tejido. Las dos puntuaciones o calificaciones se suman para obtener una puntuación de Gleason (o suma de Gleason) entre 2 y 10.
En un aspecto adicional, el análisis de los niveles de expresión se puede realizar en combinación con, o en lugar de, otras evaluaciones o indicadores de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el análisis se realiza en combinación con un método para determinar el grado de cáncer de próstata en una muestra que comprende células de cáncer de próstata de un sujeto. En otras realizaciones, la combinación es con un método para determinar el estadio del cáncer de próstata en la muestra. Una tercera posibilidad es la combinación con la detección o determinación de los niveles de PSA en el sujeto, opcionalmente antes de un procedimiento utilizado para aislar las células de cáncer de próstata. Por supuesto, es posible una combinación con uno, dos o los tres de estos ejemplos representativos. Siempre que se utiliza más de un tipo de evaluación, el resultado es un análisis multivariado. La invención incluye expresamente todas las posibles combinaciones de evaluaciones descritas en el presente documento como realizaciones multivariadas.
Generalmente, se puede utilizar cualquier método aceptado para evaluar el grado y/o estadio del cáncer de próstata conocido por el experto. En algunos casos, el método para determinar el grado de cáncer de próstata comprende la determinación de una puntuación de Gleason (o calificación de Gleason). En otros casos, el método para determinar el estadio del cáncer de próstata comprende una determinación de acuerdo con el sistema de estadificación de tumores de la American Joint Committee on Cancer (AJCC) para evaluar el estadio del cáncer de próstata. Y como se describe en el presente documento, el análisis de los niveles de expresión de genes (secuencia) se puede realizar en lugar de la puntuación de Gleason o la determinación del estadio tumoral de la AJCC. En los casos de niveles de PSA, su evaluación puede realizarse antes de una prostatectomía que se usa para proporcionar una muestra que comprende células de cáncer de próstata para usar en cualquier método descrito en este documento.
En una realización adicional de la presente invención, el método descrito anteriormente en el presente documento puede combinarse además con uno o más métodos de identificación similares, con base en la expresión de uno o más biomarcadores diferentes. Se prefiere la determinación del nivel de antígeno prostático específico (PSA) en sangre. Por lo tanto, si se encuentra que el nivel de PSA en sangre está un intervalo de aproximadamente 2 a 5 o más ng/ml, preferiblemente de aproximadamente 2,2 a 4,8 ng/ml o más, de 2,4 a 4,4 ng/ml o más, de 2,6 a 4,2 ng/ml o más o 2,8 a 4,0 ng/ml o más, más preferiblemente de aproximadamente 2,5 a 4 ng/ml o más, se puede considerar que un individuo padece cáncer de próstata maligno sensible a hormonas, o es probable que desarrolle cáncer de próstata maligno sensible a hormonas en un futuro próximo, es decir, en los próximos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14, 48 meses. La prueba para la expresión de variantes de PDE4D puede llevarse a cabo de acuerdo con las etapas definidas en este documento. Como controles o muestras de control, se pueden utilizar los controles definidos anteriormente en el presente documento. En una realización particularmente preferida, las etapas de prueba pueden basarse en el uso de un anticuerpo que se une específicamente a una variante específica de PDE4D o varias variantes de PDE4D, por ejemplo, un anticuerpo anti-PDE4D7 disponible comercialmente como NB300-652 o GTX14629.
En una realización, el nivel de expresión génica se determina detectando la expresión de ARNm usando una o más sondas y/o uno o más conjuntos de sondas.
En algunas realizaciones, se proporciona con métodos para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata, por ejemplo, en un individuo, que comprende al menos la etapa de determinar el nivel del gen o genes marcadores o de GOI en una muestra. Los términos "determinación del nivel del gen o genes marcadores o de GOI" o "determinación del nivel de expresión génica" o "determinación del nivel de expresión de las variantes de PDE4D" se refieren a la determinación de la presencia o cantidad de gen o genes marcadores o de GOI o productos de expresión de la variante de PDE4D. El término "nivel de gen o genes marcadores o de GOI" significa por lo tanto la presencia o cantidad de un gen o genes marcadores o productos de expresión de GOI, por ejemplo, transcripto o transcriptos, y/o la determinación de la presencia o cantidad de gen o genes marcadores o de GOI. La determinación de la presencia o cantidad de gen o genes marcadores o productos de expresión de GOI, puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica.
En una realización preferida de la presente invención, la determinación de la presencia o cantidad de gen o genes marcadores o productos de expresión de GOI se logra mediante la medición de ácido nucleico. Por lo tanto, el nivel o niveles de expresión pueden determinarse mediante un método que implica la detección de un ARNm codificado por el gen.
Por ejemplo, la medición del nivel de ácido nucleico del gen o genes marcadores o la expresión de GOI puede evaluarse mediante la purificación de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADNc) obtenidas de la muestra, seguida de hibridación con sondas oligonucleotídicas específicas como se definió anteriormente en el presente
documento. La comparación de los niveles de expresión se puede realizar visualmente o por medio de un dispositivo apropiado. Los expertos en la técnica conocen métodos para la detección de ARNm o productos de expresión.
Alternativamente, el nivel de ácido nucleico del gen o genes marcadores o la expresión de GOI se puede detectar en un arreglo de ADN o un enfoque de microarreglos. Normalmente, los ácidos nucleicos de muestra derivados de pacientes que se van a analizar se procesan y etiquetan, preferiblemente con un marcador fluorescente. Posteriormente, tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse en un enfoque de hibridación con sondas de captura inmovilizadas correspondientes a los genes marcadores de la presente invención. Los expertos en la técnica conocen medios adecuados para realizar análisis de microarreglos.
En una configuración estándar, un arreglo o microarreglo de ADN comprende sondas inmovilizadas de alta densidad para detectar varios genes. Las sondas en el arreglo son complementarias a una o más partes de la secuencia de los genes marcadores. Normalmente, los ADNc, los productos de PCR y los oligonucleótidos son útiles como sondas.
Un método de detección basado en un arreglo o microarreglo de ADN típicamente comprende las siguientes etapas: (1) Aislar el ARNm de una muestra y convertir opcionalmente el ARNm en ADNc y posteriormente marcar este a Rn o ADNc. Los métodos para aislar el ARN, convertirlo en ADNc y marcar los ácidos nucleicos se describen en los manuales de tecnología de microarreglos. (2) Hibridar los ácidos nucleicos de la etapa 1 con sondas para los genes marcadores. Los ácidos nucleicos de una muestra se pueden marcar con un tinte, tal como los tintes fluorescentes Cy3 (rojo) o Cy5 (azul). Generalmente, una muestra de control se marca con un tinte diferente. (3) Detectar la hibridación de los ácidos nucleicos de la muestra con las sondas y determinar al menos cualitativamente, y más particularmente cuantitativamente, las cantidades de ARNm en la muestra para los genes marcadores investigados. La diferencia en el nivel de expresión entre la muestra y el control se puede estimar basándose en una diferencia en la intensidad de la señal. Estas se pueden medir y analizar mediante el software apropiado tal como, entre otros, el software proporcionado, por ejemplo, por Affymetrix.
No existe limitación en el número de sondas correspondientes a los genes marcadores usados, que se encuentran en un arreglo de ADN. Además, un gen marcador puede estar representado por dos o más sondas, hibridando las sondas con diferentes partes de un gen. Las sondas están diseñadas para cada gen marcador seleccionado. Dicha sonda es típicamente un oligonucleótido que comprende de 5 a 50 residuos de nucleótidos. Los ADN más largos se pueden sintetizar mediante PCR o químicamente. Los métodos para sintetizar tales oligonucleótidos y aplicarlos sobre un sustrato son bien conocidos en el campo de los microarreglos. También se pueden detectar genes distintos de los genes marcadores en el arreglo de ADN. Por ejemplo, una sonda para un gen cuyo nivel de expresión no se altera significativamente puede ubicarse en el arreglo de ADN para normalizar los resultados del ensayo o para comparar los resultados del ensayo de múltiples arreglos o diferentes ensayos.
Alternativamente, el nivel de ácido nucleico del gen o genes marcadores o la expresión de GOI puede detectarse en un enfoque de RT-PCR cuantitativa, preferiblemente en un enfoque de PCR en tiempo real siguiendo los transcriptos de transcripción inversa de interés. Normalmente, como primera etapa, un transcripto se transcribe de forma inversa en una molécula de ADNc de acuerdo con cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. Posteriormente, se puede llevar a cabo un enfoque de PCR cuantitativa o en tiempo real basándose en una primera cadena de ADN obtenida como se describió anteriormente.
Preferiblemente, las sondas Taqman o Molecular Beacon como sondas principales basadas en FRET de este tipo pueden usarse para la detección por PCR cuantitativa. En ambos casos, las sondas sirven como sondas internas que se usan junto con un par de cebadores opuestos que flanquean la región objetivo de interés, preferiblemente un conjunto de oligonucleótidos específicos de un gen o genes marcadores como se definió anteriormente en el presente documento. Tras la amplificación de un segmento objetivo, la sonda puede unirse selectivamente a los productos en una secuencia de identificación entre los sitios del cebador, provocando así aumentos en la señalización de FRET en relación con aumentos en la frecuencia objetivo.
Preferiblemente, una sonda Taqman que se va a utilizar en un enfoque de PCR cuantitativa de acuerdo con la presente invención puede comprender un oligonucleótido específico como se definió anteriormente de aproximadamente 22 a 30 bases que está marcado en ambos extremos con un par FRET. Por lo general, el extremo 5' tendrá un fluoróforo de longitud de onda más corta, tal como la fluoresceína (por ejemplo, FAM) y el extremo 3' se marca comúnmente con un atenuador fluorescente de longitud de onda más larga (por ejemplo, TAMRA) o un compuesto atenuador no fluorescente (por ejemplo, atenuador Black Hole). Se prefiere que las sondas que se van a utilizar para la PCR cuantitativa, en particular las sondas como se definieron anteriormente en el presente documento no tengan guanina (G) en el extremo 5' adyacente al tinte indicador para evitar la atenuación de la fluorescencia del indicador después de que la sonda se degrada.
Una sonda Molecular Beacon que se utilizará para un enfoque de PCR cuantitativa de acuerdo con la presente invención preferiblemente usa interacciones FRET para detectar y cuantificar un producto de PCR, teniendo cada sonda un extremo 5' marcado con fluorescencia y un extremo 3' marcado con atenuador. Esta configuración de horquilla o vástago-bucle de la estructura de la sonda comprende preferiblemente un vástago con dos extremos cortos autoadhesivos y un bucle con una región específica de objetivo interna larga de aproximadamente 20 a 30 bases.
Los mecanismos de detección alternativos que también pueden emplearse en el contexto de la presente invención están dirigidos a una sonda fabricada con solo una estructura de bucle y sin una región de tallo complementaria corta. Un enfoque alternativo basado en FRET para PCR cuantitativa que también puede usarse en el contexto de la presente invención se basa en el uso de dos sondas de hibridación que se unen a sitios adyacentes en el objetivo en el que la primera sonda tiene un marcador donante fluorescente en el extremo 3' y la segunda sonda tiene un marcador aceptor fluorescente en su extremo 5'.
En una realización específica, el nivel de expresión génica se determina mediante un método basado en amplificación y/o análisis de microarreglos y/o secuenciación de ARN.
En una realización específica, en la etapa (c) del método de identificación de un individuo para la elegibilidad para la terapia del cáncer de próstata, se identifica a un individuo como elegible para recibir una terapia de cáncer de próstata seleccionada entre cirugía de próstata, extirpación de próstata, quimioterapia, radioterapia, Disección de ganglios linfáticos limitada o extendida, en la que el índice de progresión de cáncer de próstata de la muestra del individuo indica un estado de progresión de cáncer de próstata progresivo.
En algunas realizaciones, se proporciona un método de identificación de un individuo para la elegibilidad para la terapia de cáncer de próstata que comprende:
(a) determinar en una muestra obtenida de un individuo el nivel de expresión de al menos dos variantes de PDE4D seleccionadas del grupo que comprende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9 para obtener un perfil de expresión génica;
(b) determinar al menos un índice de progresión de cáncer de próstata basado en el perfil de expresión génica de las variantes de PDE4D indicativas del estado de progresión de cáncer de próstata de la etapa (a);
(c) identificar al individuo como elegible para recibir una terapia de cáncer de próstata en la que el índice de PDE de la muestra del individuo indica la presencia de cáncer de próstata o en la que el Índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo o progresivo.
En una realización preferida, en la etapa (c) del método de identificación de un individuo para la elegibilidad para la terapia de cáncer de próstata, se identifica a un individuo como elegible para recibir una terapia de cáncer de próstata seleccionada entre cirugía de próstata, extirpación de próstata, quimioterapia, radioterapia, disección de ganglios linfáticos limitada o extendida, en la que el índice de progresión de cáncer de próstata de la muestra del individuo indica un estado de progresión de cáncer de próstata progresivo y un individuo se identifica como elegible para recibir como terapia de cáncer de próstata vigilancia activa cuando el índice de progresión de cáncer de próstata de la muestra del individuo indica un estado de progresión de cáncer de próstata no progresivo.
En el presente documento también se describe un producto que comprende:
cebadores y/o sondas para determinar el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9;
que comprende además cebadores y/o sondas para determinar el nivel de expresión génica de un gen de referencia, preferiblemente un gen de mantenimiento, más preferiblemente TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 o ALAS-1.
Se describe además una composición que comprende un conjunto de moléculas de ácido nucleico que comprenden cada una al menos una secuencia de sonda de oligonucleótido para el análisis de la expresión génica de al menos dos variantes de PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, que comprende al menos una secuencia de sonda de oligonucleótido para el análisis de la expresión génica de genes de referencia seleccionados de TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1.
Se describe además un arreglo de ácido nucleico que comprende una o más sondas de oligonucleótidos complementarias e hibridables con una secuencia codificante de al menos dos variantes de PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, que comprende una o más sondas de oligonucleótidos complementarias e hibridables con al menos uno de los genes de referencia seleccionados de TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1, para determinar un índice de PDE como se definió anteriormente en el presente documento.
Un "microarreglo" es un arreglo lineal o bidimensional de regiones discretas, cada una de las cuales tiene un área definida, formada en la superficie de un soporte generalmente sólido tal como, pero no limitado a, vidrio, plástico o membrana sintética. La densidad de las regiones discretas en un microarreglo está determinada por el número total de oligonucleótidos inmovilizados que se detectarán en la superficie de un único soporte de fase sólida, tal como al menos aproximadamente 50/cm2, al menos aproximadamente 100/cm2, al menos aproximadamente 500/cm2, pero por debajo de aproximadamente 1.000/cm2 en algunas realizaciones. Los arreglos pueden contener menos de aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500 o aproximadamente 3000 oligonucleótidos inmovilizados en total. Como se usa en el presente documento, un
microarreglo de ADN es un arreglo de oligonucleótidos u oligonucleótidos colocados en un chip u otras superficies usadas para hibridar con oligonucleótidos amplificados o clonados de una muestra. Debido a que se conoce la posición de cada grupo particular de oligonucleótidos en el arreglo, las identidades de los oligonucleótidos de una muestra se pueden determinar con base en su unión a una posición particular en el microarreglo.
Un "oligonucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, este término incluye ADN y ARN de cadena doble y sencilla. También incluye tipos conocidos de modificaciones que incluyen etiquetas conocidas en la técnica, metilación, "protectores", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo y modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), así como formas no modificadas del oligonucleótido.
El término "amplificar' se usa en el sentido amplio para significar que la creación de un producto de amplificación puede prepararse enzimáticamente con ADN o ARN polimerasas. "Amplificación", como se usa en este documento, generalmente se refiere al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada, particularmente las de una muestra. "Copias múltiples" significa al menos 2 copias. Una "copia" no significa necesariamente una complementariedad o identidad de secuencia perfecta con la secuencia molde. Es posible utilizar además cualquier método de secuenciación conocido en la técnica para identificar las secuencias de GOI.
El término "que corresponde" puede referirse, cuando sea apropiado, a una molécula de ácido nucleico que comparte una cantidad sustancial de identidad de secuencia con otra molécula de ácido nucleico. Cantidad sustancial significa al menos el 95%, habitualmente al menos el 98% y más habitualmente al menos el 99%, y la identidad de secuencia se determina utilizando el algoritmo BLAST, como se describe en Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410 (utilizando la configuración predeterminada publicada, es decir, los parámetros w = 4, t = 17). Los métodos para amplificar ARNm son generalmente conocidos en la técnica e incluyen PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y los descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 10/062.857 (presentada el 25 de octubre de 2001), así como las solicitudes de patente provisional de los Estados Unidos Nos. 60/298.847 (presentada el 15 de junio de 2001) y 60/257.801 (presentada el 22 de diciembre de 2000), todas las cuales son incorporadas en el presente documento como referencia en su totalidad como si estuvieran completamente expuestas. Otro método que puede usarse es la PCR cuantitativa (o Q-PCR). Alternativamente, el ARN puede marcarse directamente como el correspondiente ADNc mediante métodos conocidos en la técnica.
Debido a que la invención se basa en la identificación de genes (o secuencias expresadas) que están sobreexpresadas o subexpresadas, una realización de la invención implica determinar la expresión por hibridación de ARNm, o una versión amplificada o clonada del mismo (tal como ADN o ADNc), de una célula de muestra con un oligonucleótido que es único para una secuencia génica particular. Los oligonucleótidos de este tipo pueden contener al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 22, al menos aproximadamente 24, al menos aproximadamente 26, al menos aproximadamente 28, al menos aproximadamente 30, o al menos aproximadamente 32 pares de bases consecutivas de una secuencia génica que no se encuentra en otras secuencias génicas. El término "aproximadamente" como se usa en la oración anterior se refiere a un aumento o disminución de 1 del valor numérico establecido. Otras realizaciones pueden usar oligonucleótidos de al menos o aproximadamente 50, al menos o aproximadamente 100, al menos aproximadamente o 150, al menos o aproximadamente 200, al menos o aproximadamente 250, al menos o aproximadamente 300, al menos o aproximadamente 350, o al menos al menos o aproximadamente 400 pares de bases de una secuencia génica que no se encuentra en otras secuencias génicas. El término "aproximadamente" como se usa en la oración anterior se refiere a un aumento o disminución del 10% del valor numérico establecido. Dichos oligonucleótidos también pueden denominarse sondas de oligonucleótidos que son capaces de hibridar con secuencias de genes, o porciones únicas de los mismos, descritas en el presente documento. En muchos casos, las condiciones de hibridación son condiciones rigurosas de aproximadamente 30% v/v a aproximadamente 50% de formamida y de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,15 M de sal para hibridación y de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,15 M de sal para condiciones de lavado a aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 65 °C o más, o condiciones equivalentes a las mismas.
Las sondas de oligonucleótidos para usar en la invención pueden tener aproximadamente o 95%, aproximadamente o 96%, aproximadamente o 97%, aproximadamente o 98%, o aproximadamente o 99% de identidad con las secuencias génicas del marcador cuya expresión se determinará. La identidad se determina utilizando el algoritmo BLAST, como se describió anteriormente. Estas sondas también pueden describirse sobre la base de la capacidad de hibridar con genes marcadores expresados usados en métodos de la invención en condiciones rigurosas como se describió anteriormente o condiciones equivalentes a las mismas.
En muchos casos, las secuencias son las de ARNm codificado por los genes marcadores, el ADNc correspondiente a tales ARNm y/o versiones amplificadas de tales secuencias. Las sondas de oligonucleótidos se pueden inmovilizar en un arreglo, otros dispositivos o en puntos individuales que localizan las sondas.
Los marcadores adecuados que se pueden utilizar incluyen radioisótopos, cromóforos de nucleótidos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, fracciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, fracciones bioluminiscentes y similares. Como tal, un marcador es cualquier composición detectable por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. El término "soporte" se refiere a soportes convencionales tales como perlas, partículas, varillas, fibras, filtros, membranas y soportes de silano o silicato tales como portaobjetos de vidrio.
También se describe en el presente documento un kit para controlar o pronosticar cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata para identificar a un individuo para la elegibilidad para la terapia del cáncer de próstata que comprende: a) un arreglo que comprende una o más sondas de oligonucleótidos complementarias e hibridables con una secuencia de codificación de al menos dos variantes de PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, que comprenden una o más sondas de oligonucleótidos complementarias e hibridables con al menos uno de los genes de referencia seleccionados de TBP, HPRT1, ACTB, RPLPO, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALFA-1 (TUBA1B) o ALAS-1, para determinar un Índice-PDE como se define en cualquiera de los ítems anteriores, b) un kit de control; y c) opcionalmente instrucciones de uso.
Normalmente, el kit contiene uno o más agentes que permiten la detección específica de un gen o genes marcadores o de GOI como se definió anteriormente en el presente documento. Los agentes o ingredientes de un kit pueden, de acuerdo con la presente invención, estar comprendidos en uno o más recipientes o entidades separadas. La naturaleza de los agentes está determinada por el método de detección para el que está destinado el kit.
Además, el kit puede comprender una cantidad de una molécula de ácido nucleico conocida, que puede usarse para una calibración del kit o como control interno. Por lo general, un kit para la detección de un gen o genes marcadores o productos de expresión de GOI puede comprender ingredientes accesorios tal como tampones de PCR, dNTP, una polimerasa, iones tales como cationes bivalentes o cationes monovalentes, soluciones de hibridación, etc. Dichos ingredientes son conocidos por la persona experto en la técnica y puede variar dependiendo del método de detección llevado a cabo. Además, el kit puede comprender un folleto de instrucciones y/o puede proporcionar información sobre la relevancia de los resultados obtenidos.
También se describe en este documento un dispositivo para realizar un método como se describe en este documento, que comprende: a) una base de datos que incluye registros que comprenden valores de expresión génica de referencia asociados con estados de progresión del cáncer de próstata, comprendiendo cada perfil de referencia los niveles de expresión de al menos dos variantes de PDE4D seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, y/o b) una interfaz de usuario capaz de recibir y/o ingresar una selección de valores de expresión génica de un conjunto de genes, comprendiendo el conjunto los niveles de expresión de al menos dos variantes de PDE4D seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, para su uso en la comparación con los perfiles de expresión de referencia génica en la base de datos; c) una salida que muestra una predicción del estado del cáncer de acuerdo con los niveles de expresión del conjunto de genes.
En el presente documento también se describe un método implementado por ordenador para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata, que comprende las etapas del método como se describe en el presente documento.
En el contexto de la presente solicitud, la expresión "método implementado por ordenador para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata", se refiere a un método en el que los algoritmos de software calculan un Índice-PDE y, en base a él, proporcionan un pronóstico. para el paciente que se analiza, en el que este método usa datos sin procesar obtenidos tras la medición del nivel de expresión génica de los genes a los que se hace referencia en este documento y la conversión de estos en un Índice-PDE usando la ecuación descrita anteriormente.
En el presente documento se describe una composición farmacéutica estimuladora para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer de próstata que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo de:
(a) un compuesto que estimula o modula directamente la actividad de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9, preferiblemente un agonista alostérico de la actividad enzimática;
(b) un compuesto que estimula o modula indirectamente la actividad de la variante PDE4D de (a);
(c) la proteína de la variante PDE4D de (a) o un equivalente biológicamente activo de la misma;
(d) un ácido nucleico que codifica y expresa la variante de PDE4D de (a);
(e) un inhibidor de miARN específico para los miARN de la variante de PDE4D de (a);
(f) un agente de desmetilación; y
(g) un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa, preferiblemente un péptido, un peptidomimético, una molécula pequeña, un anticuerpo o un aptámero.
Puede estar provisto de una composición farmacéutica estimuladora para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer de próstata que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo de:
(a) un compuesto que estimula o modula directamente la actividad de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D5, PDE4D8 y PDE4D9, preferiblemente un agonista alostérico de la actividad enzimática; (b) un compuesto que estimula o modula indirectamente la actividad de la variante de PDE4D de (a);
(c) la proteína de la variante de PDE4D de (a) o un equivalente biológicamente activo de la misma;
(d) un ácido nucleico que codifica y expresa la variante de PDE4D de (a);
(e) un inhibidor de miARN específico para los miARN de la variante de PDE4D de (a);
(f) un agente de desmetilación; y
(g) un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa, preferiblemente un péptido, un peptidomimético, una molécula pequeña, un anticuerpo o un aptámero.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica inhibidora para uso en el tratamiento o prevención del cáncer de próstata como se define en la reivindicación 6.
También se describe en el presente documento una composición farmacéutica inhibidora para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer de próstata que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo de:
a) un compuesto que inhibe directamente la actividad de una variante de PDE4D seleccionada del grupo consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9,
b) un compuesto que inhibe indirectamente la actividad de la variante de PDE4D de (a);
c) una forma negativa dominante de la proteína de la variante de PDE4D de (a) o un equivalente biológicamente activo de la misma;
d) un ácido nucleico que codifica y expresa una forma negativa dominante de la variante de PDE4D de (a), en la que la variante de PDE4D se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9. Puede proporcionarse con una composición farmacéutica estimuladora o inhibidora para el tratamiento del cáncer de próstata, en la que la composición se administra a un individuo que depende del Índice-PDE indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata.
Se puede proporcionar una composición farmacéutica estimuladora o inhibidora para el tratamiento de cáncer de próstata, en la que la composición se administra a un individuo en el que el Índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata progresivo.
En una realización preferida, al menos uno del Índice-PDE 2, el Índice-PDE 3, el Índice-PDE 4 o el Índice-PDE 5 de la muestra del individuo está por debajo de un corte predeterminado.
En otra realización preferida, al menos uno del Índice-PDE 2, el Índice-PDE 3, el Índice-PDE 4 o el Índice-PDE 5 de la muestra del individuo está por debajo del nivel de control.
En otra realización preferida, al menos uno del Índice-PDE 2, el Índice-PDE 3, el Índice-PDE 4 o el Índice-PDE 5 de la muestra del individuo está por debajo del nivel de control, en el que el nivel de control es el Índice-PDE 2, el Índice-PDE 3, el Índice-PDE 4 o el Índice-PDE 5 respectivamente de la muestra del individuo.
También se describe en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer de próstata, comprendiendo el método
(i) seleccionar un sujeto que tiene cáncer de próstata cuando el índice de PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata progresivo, y
(ii) administrar la composición farmacéutica estimuladora o inhibidora como se describe en este documento.
También se describe en este documento un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer de próstata, comprendiendo el método
(i) seleccionar un sujeto que tiene cáncer de próstata cuando el Índice-PDE de la muestra del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata progresivo, y
(ii) administrar la composición farmacéutica estimuladora o inhibidora como se describe en este documento.
Un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer de próstata, comprendiendo el método
(i) seleccionar un sujeto que tiene cáncer de próstata, cuando al menos uno del Índice-PDE 2, el Índice-PDE 3,el Índice-PDE 4 o el Índice-PDE 5 de la muestra del individuo está por debajo de un umbral predeterminado, y (ii) administrar la composición farmacéutica estimuladora o inhibidora como se describe en este documento.
Un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer de próstata, comprendiendo el método
(i) seleccionar un sujeto que tiene cáncer de próstata, cuando al menos uno del Índice-PDE 2, el Índice-PDE 3, el Índice-PDE 4 o el Índice-PDE 5 de la muestra del individuo está por debajo de un umbral predeterminado, y (ii) administrar la composición farmacéutica estimuladora o inhibidora como se describe en este documento.
El término "un compuesto que estimula o modula directamente la actividad de una variante de PDE4D" como se usa en este documento se refiere a un compuesto que es capaz de aumentar la actividad de una variante de PDE4D para degradar cAMP mediante una interacción directa con la variante de PDE4D. Dicho compuesto puede ser cualquier interactuador directo de la variante de PDE4D, que tiene una influencia positiva sobre la actividad catalítica de la variante de PDE4D. Tal compuesto puede ser preferiblemente un agonista alostérico de la actividad catalítica de la variante de PDE4D, por ejemplo, un modulador alostérico homotrópico. Los agonistas alostéricos preferidos de la variante de PDE4D son cAMp o análogos de cAMP. Otros compuestos estimuladoras directos previstos por la presente invención son iones, preferiblemente cationes, mono y bivalentes biológicamente activos tales como Ca2+, Mg2+.
El término "un compuesto que estimula o modula directamente la actividad de PDE4D" como se usa en este documento se refiere a un compuesto que es capaz de aumentar la actividad de PDE4D sin ser selectivo para una variante específica para degradar cAMp mediante una interacción directa con PDE4D. Dicho compuesto puede ser cualquier interactuador directo de PDE4D, que tiene una influencia positiva sobre la actividad catalítica de PDE4D. Tal compuesto puede ser preferiblemente un agonista alostérico de la actividad catalítica de PDE4D, por ejemplo, un modulador alostérico homotrópico. Los agonistas alostéricos preferidos de PDE4D son cAMP o análogos de cAMP. Otros compuestos estimuladoras directos previstos por la presente invención son iones, preferiblemente cationes, mono y bivalentes biológicamente activos tales como Ca2+, Mg2+.
El término "un compuesto que estimula o modula indirectamente la actividad de PDE4D" como se usa en este documento se refiere a un compuesto que es capaz de aumentar la actividad de PDE4D sin ser selectivo para una variante específica para degradar el cAMP mediante una interacción con un interactuador directo de PDE4D ("interactuador indirecto") o mediante una vía de trabajo indirecta que no implica una interacción con PDE4D. Tal compuesto puede ser cualquier interactuador directo de un interactuador de PDE4D. El efecto transmitido por el interactuador directo de un interactuador de PDE4D puede ser positivo si el interactuador de PDE4D en sí mismo tiene un efecto positivo sobre la actividad de PDE4D, o negativo, si el interactuador de PDE4D tiene un efecto negativo sobre la actividad de PDE4D. Normalmente, los interactuadores indirectos que funcionan positivamente pueden estimular el efecto agonista de los interactuadores directos, por ejemplo, provocar el aumento de la concentración de compuestos que funcionan alostéricamente tales como cAMP o análogos de los mismos inhibiendo los procesos de degradación de cAMP no conferidos por PDE4D7, aumentando la producción de cAMP, etc.
Alternativamente, tales integradores indirectos que funcionan positivamente pueden provocar una modificación del comportamiento de unión de proteínas que se unen directamente, lo que conduce a una mayor actividad de PDE4D sin ser selectiva para una variante específica. Normalmente, los interactuadores indirectos que funcionan negativamente pueden tener un efecto inhibidor sobre los inhibidores de PDE4D. Ejemplos de tales interactuadores son las actividades enzimáticas que degradan los inhibidores de PDE4D, o proteínas capaces de unirse e inactivar los inhibidores de PDE4D. Alternativamente, dichos interactuadores pueden inhibir actividades que conducen a una degradación de PDE4D, por ejemplo, inhibidores de proteinasa. El experto en la materia conocerá más ejemplos y su implementación.
El término "un compuesto que estimula o modula indirectamente la actividad de una variante de PDE4D" como se usa en este documento se refiere a un compuesto que es capaz de aumentar la actividad de una variante de PDE4D para degradar cAMP mediante una interacción con un interactuador directo de PDE4D7 ("interactuador indirecto") o mediante una vía de trabajo indirecta que no implica una interacción con la variante de PDE4D. Tal compuesto puede ser cualquier interactuador directo de un interactuador de la variante de PDE4D. El efecto transmitido por el interactuador directo de un interactuador de la variante de PDE4D puede ser positivo si el interactuador de la variante de PDE4D en sí mismo tiene un efecto positivo sobre la actividad de la variante de PDE4D, o negativo, si el interactuador de la variante de PDE4D tiene un efecto negativo sobre la actividad de la variante de PDE4D. Normalmente, los interactuadores indirectos que funcionan positivamente pueden estimular el efecto agonista de los interactuadores directos, por ejemplo, provocar el aumento de la concentración de compuestos que funcionan alostéricamente tales como cAMP o análogos del mismo inhibiendo los procesos de degradación de cAMP no conferidos por PDE4D7, aumentando la producción de cAMP, etc.
Alternativamente, tales integradores indirectos que funcionan positivamente pueden provocar una modificación del comportamiento de unión de proteínas que se unen directamente, lo que conduce a una mayor actividad de la variante de PDE4D. Normalmente, los interactuadores indirectos que funcionan negativamente pueden tener un efecto inhibidor sobre los inhibidores de la variante de PDE4D. Ejemplos de tales interactuadores son las actividades enzimáticas que degradan los inhibidores de la variante de PDE4D, o proteínas capaces de unirse e inactivar los inhibidores de la variante de PDE4D. Alternativamente, tales interactuadores pueden inhibir actividades que conducen a una degradación de la variante de PDE4D, por ejemplo, los inhibidores de proteinasa. El experto en la materia conocerá más ejemplos y su implementación.
Alternativamente, una estimulación indirecta de la actividad de PDE4D puede ser transmitida por compuestos que activan, protegen o mantienen la expresión del gen endógeno de PDE4D. Ejemplos de tales compuestos son factores de transcripción específicos de PDE4D, actividades estabilizadoras de ARNm específicas de PDE4D o de variantes específicas de PDE4D o factores de empalme de PDE4D/factores de empalme específicos de PDE4D. El experto en la materia conocerá más ejemplos y su implementación.
La "proteína variante de PDE4D" comprendida en la composición farmacéutica estimuladora puede ser una proteína variante de PDE4D como se definió anteriormente en el presente documento. En particular, puede ser una proteína codificada por la variante de empalme 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9 de la fosfodiesterasa humana PDE4D como se definió anteriormente en el presente documento. La "proteína variante de PDE4D" como se usa en este contexto también comprende secuencias de aminoácidos que son al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 o 18 y las secuencias de aminoácidos están codificadas por secuencias de nucleótidos que son al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9, 7, 9, 11, 15 o 17.
La "proteína PDE4D" comprendida en la composición farmacéutica estimuladora puede ser una proteína variante de PDE4D como se definió anteriormente en el presente documento, una mezcla de varias variantes de PDE4D o una versión truncada de la variante de PDE4D que es común a al menos dos variantes de PDE4D.
El término "equivalente biológicamente activo de PDE4D" o como se usa en el presente documento se refiere a una proteína PDE4D que es capaz de realizar todas o la mayoría de las funciones de PDE4D que son comunes a varias variantes de PDE4D. Preferiblemente, se refiere a proteínas que pueden degradar cAMP.
El término "equivalente biológicamente activo de la variante de PDE4D" o como se usa en este documento se refiere a una proteína variante de PDE4D que es capaz de realizar todas o la mayoría de las funciones variantes de PDE4D. Preferiblemente, se refiere a proteínas que pueden degradar cAMP.
PDE4D, variantes de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D o variantes de PDE4D sede acuerdo con la presente invención pueden producirse de forma recombinante mediante cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. La presente invención, por lo tanto, también abarca métodos para la producción de PDE4D, variantes de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D o variantes de PDE4D.
Por consiguiente, la presente invención contempla vectores que contienen los oligonucleótidos que codifican PDE4D, variantes de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D o variantes de PDE4D como se definieron anteriormente en el presente documento, células huésped y la producción de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D mediante técnicas recombinantes.
Un vector adecuado puede ser, por ejemplo, un vector fago, plásmido, viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. En el último caso, la propagación viral se producirá generalmente sólo en células huésped complementarias. Los polinucleótidos que codifican PDE4D, variantes de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D o variantes de PDE4D pueden unirse a un vector o portador que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. Un inserto polinucleotídico correspondiente se puede unir operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de LTR retrovirales o el promotor PsA. El experto en la materia conoce otros promotores adecuados. Los constructos de expresión pueden contener además sitios para el inicio y la terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La parte codificante de los transcriptos expresados por los constructos incluirá preferiblemente un codón de inicio de la traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) adecuadamente posicionado al final del polipéptido a traducir.
Los polipéptidos o proteínas pueden estar o no glicosilados o pueden modificarse de otro modo. Además, los polipéptidos o proteínas también pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el huésped. Además, el polipéptido, proteína o péptido puede modificarse mediante acetilación, pegilación, hesilación, formilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión química específica, escisión proteolítica, un enlace a un ligando celular u otra proteína o hapilación, es decir, una fusión con un polímero homoaminoácido rico en glicina (HAP), etc. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo mediante técnicas adecuadas conocidas por el experto en la técnica. Además, el polipéptido, péptido o variante puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Además, PDE4D, variantes de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D o variantes de PDE4D de la invención pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos.
Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, este término incluye ADN y ARN
bicatenarios y monocatenarios. También incluye tipos conocidos de modificaciones que incluyen etiquetas conocidas en la técnica, metilación, "protectores", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo y modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), así como formas no modificadas del oligonucleótido.
El "ácido nucleico que codifica y expresa PDE4D" comprendido en la composición farmacéutica estimuladora como se definió anteriormente en el presente documento se refiere a cualquier elemento portador adecuado, por ejemplo, como se describió anteriormente en el presente documento, que comprende un gen de PDE4D expresable.
El "ácido nucleico que codifica y expresa una variante de PDE4D" comprendido en la composición farmacéutica estimuladora como se definió anteriormente en el presente documento se refiere a cualquier elemento portador adecuado, por ejemplo, como se describió anteriormente en el presente documento, que comprende un gen de PDE4D expresable. Preferiblemente, dicho elemento portador puede comprender la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 y 17. Dicho elemento portador también puede comprender secuencias de nucleótidos que muestran un alto grado de homología con la variante de PDE4D, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que son al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 y 17 o secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que son al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 18. Alternativamente, el portador puede comprender la secuencia genómica de PDE4D, preferiblemente la secuencia como se define en la entrada de la base de datos ENSEMBL ENSG00000113448 (Versión ENSG00000113448.8, Ensembl release 53 - marzo de 2009), que corresponde a la SEQ ID NO: 19, o derivable del Genbank acceso No. AC008934 (Versión AC008934.5, GI: 17386235 a partir del 24 de marzo de 2009) en combinación con el Genbank acceso No. AC034234 (Versión AC034234.4, GI: 18390182 a partir del 24 de marzo de 2009) o como la derivable de Wang et al., 2003, Cell Signal., 15 (9): 883-91. Más preferiblemente, el portador puede comprender la secuencia genómica de PDE4D como se define en la SEQ ID NO: 19.
Además, los equivalentes biológicamente activos de PDE4D o variantes de PDE4D como se definieron anteriormente en el presente documento pueden estar comprendidos en un portador.
El polinucleótido que codifica PDE4D o las variantes de PDE4D se puede unir preferiblemente a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en una célula humana. En una realización preferida, el inserto polinucleotídico puede unirse operativamente a un promotor de PSA.
En una realización de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican y expresan PDE4D o variantes de PDE4D como se definieron anteriormente en el presente documento pueden proporcionarse mediante terapéutica viva. El término "terapéutica viva" significa que PDE4D o una variante de PDE4D o equivalentes biológicamente activos de PDE4D o una variante de PDE4D como se definió anteriormente en el presente documento se expresan en cualquier portador vivo adecuado. Por consiguiente, la presente invención se refiere a los polinucleótidos correspondientes que son adecuados para la expresión en una célula viva. La presente invención también se refiere a vectores que contienen tales polinucleótidos, células huésped apropiadas y la producción de polipéptidos mediante técnicas recombinantes en dichas células huésped.
El término "portador vivo" se refiere a cualquier célula huésped viva o virus apropiados conocidos por el experto en la técnica. Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas tales como Escherichia coli o Lactobacillus, células fúngicas, tales como células de levadura, protozoos, células de insectos o células animales. Preferiblemente, el término se refiere a bacterias atenuadas, células fúngicas atenuadas o protozoos atenuados. Los ejemplos representativos de virus apropiados incluyen virus del grupo de adenovirus, retrovirus o lentivirus, preferiblemente virus atenuados del grupo de adenovirus, retrovirus o lentivirus. En una realización preferida, pueden usarse células bacterianas probióticas, en particular células probióticas de Escherichia coli o Lactobacillus. Más preferiblemente, se pueden utilizar células de Escherichia coli Nissle 1973 e incluso más preferiblemente células de Lactobacillus casei o Lactobacillus zeae 393.
El "inhibidor de miARN específico para miARN de PDE4D" comprendido en la composición farmacéutica estimuladora como se definió anteriormente en el presente documento se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de ácido nucleico complementaria a una molécula de miARN o microARN de PDE4D sin selectividad por una variante específica de PDE4D.
El "inhibidor de miARN específico para miARN de la variante de PDE4D" comprendido en la composición farmacéutica estimuladora como se definió anteriormente en el presente documento se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de ácido nucleico complementaria a una molécula de miARN o microARN de la variante de PDE4D.
El término "complementario" como se usa en este documento se refiere a un complemento perfecto entre el ácido nucleico inhibidor de miARN (molécula sentido) y miARN (molécula antisentido) sin ningún desajuste, así como situaciones en las que el ácido nucleico contiene cualquier desajuste de bases y/o nucleótidos adicionales o faltantes
en comparación con la molécula de miARN. En otras realizaciones, las dos moléculas comprenden uno o más desajustes de bases o difieren en su número total de nucleótidos (debido a adiciones o eliminaciones). En realizaciones adicionales, la molécula de ácido nucleico inhibidora de miARN "complementaria" comprende al menos diez nucleótidos contiguos que muestran una complementariedad perfecta con una secuencia comprendida en la molécula de miARN.
Normalmente, las moléculas de ácido nucleico inhibidoras de miARN son moléculas de ADN o ARN naturales o moléculas de ácido nucleico sintéticas que comprenden en su secuencia uno o más nucleótidos modificados que pueden ser del mismo tipo o de uno o más tipos diferentes.
Se prevé, por ejemplo, en la presente invención que dicha molécula de ácido nucleico inhibidora de miARN comprenda al menos una unidad de la cadena principal del ribonucleótido y al menos una unidad de la cadena principal del desoxirribonucleótido. Además, la molécula de ácido nucleico inhibidora de miARN puede contener una o más modificaciones de la cadena principal de ARN en un grupo 2'-O-metilo o un grupo 2'-O-metoxietilo (también denominado "2'-O-metilación"), que impidió la degradación de nucleasas en los medios de cultivo y, lo que es más importante, también impidió la escisión endonucleolítica por la nucleasa del complejo de silenciamiento inducido por a Rn , lo que condujo a una inhibición irreversible del miARN. Otra posible modificación, que es funcionalmente equivalente a la 2'-O-metilación, implica ácidos nucleicos bloqueados (LNA) que representan análogos de ácidos nucleicos que contienen uno o más monómeros de nucleótidos de LNA, como se definió anteriormente en el presente documento.
Otra clase de silenciadores de la expresión de miARN para usar en el contexto de la presente invención comprende oligonucleótidos manipulados químicamente denominados "antagomirs", que representan moléculas de ARN monocatenarias conjugadas con colesterol. Las moléculas pueden comprender entre 19 y 25 nucleótidos. Preferiblemente, la molécula comprende 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos. Más preferiblemente, la molécula comprende 23 nucleótidos (se pueden derivar más detalles de Krutzfeldt et al., 2005, Nature, 438: 685-689).
En otra realización de la presente invención, los inhibidores de miARN como se definieron anteriormente en el presente documento pueden proporcionarse en forma de vectores de expresión para introducirse en tejidos o células. Alternativamente, dichos vectores también pueden introducirse en terapéuticos vivos como se definió anteriormente en el presente documento.
Normalmente, los ARN se pueden producir a partir de transgenes proporcionados en forma de vectores o portadores de expresión de transfección o transitorios. Por ejemplo, pueden proporcionarse inhibidores de miARN competitivos como transcriptos expresados a partir de promotores fuertes, que contienen más de uno, preferiblemente múltiples, sitios de unión en tándem a un microARN de interés. Una "esponja de microARN" como se describe en Ebert et al., 2007, Nat. Methods, 4: 721-726 es un ejemplo ilustrativo y no limitativo de esta técnica.
El "agente de desmetilación" comprendido en la composición farmacéutica estimuladora como se definió anteriormente en el presente documento se refiere a un agente capaz de desmetilar estructuras de cromatina, preferiblemente regiones promotoras, más preferiblemente el promotor de PDE4D o de variante de PDE4D. Ejemplos de agentes de desmetilación para ser utilizados en el contexto de la presente invención son 5-aza-2'-desoxicitidina y 5-azacitidina, que reactivan genes inapropiadamente silenciados por cambios estructurales de cromatina que involucran la metilación del ADN y que pueden revertir estos cambios y, por lo tanto, restaurar las principales vías celulares. Esto normalmente da como resultado la reexpresión génica y la reversión de algunos aspectos del estado transformado. La 5-azacitidina y la 5-aza-2'-desoxicitidina normalmente inactivan la ADN citosina C5-metiltransferasas mediante la formación de complejos estables entre los residuos de 5-aza-2'-desoxicitidina en el ADN y la enzima, imitando así un estado de transición estable intermedio cuando se unen a la enzima metiltransferasa.
Un agente adicional, que puede estar comprendido en una composición farmacéutica estimuladora descrita en este documento, ya sea per se o en combinación con 5-aza-2'-desoxicitidina y/o 5-azacitidina, es tricostatina A (TSA).
El "factor de desplazamiento de fosfodiesterasa" comprendido en la composición farmacéutica estimuladora como se definió anteriormente en este documento se refiere a un compuesto que es capaz de perturbar o interrumpir la interacción de fosfodiesterasas, en particular PDE4D con o sin selectividad por una variante específica de PDE4D, con un compañero de interacción o interactuadores. Tal proceso puede conducir finalmente a una asociación de PDE, en particular PDE4D con o sin selectividad por una variante específica de PDE4D, con diferentes compañeros de interacción que antes y, en consecuencia, con una redistribución de PDE. Dichos nuevos compañeros de interacción pueden secuestrar PDE, en particular PDE4D con o sin selectividad por una variante específica de PDE4D, y modificar correspondientemente los comportamientos celulares, por ejemplo, provocar influencias en la unión del receptor u otras actividades posteriores. Ejemplos de proteínas asociadas que pueden estar involucradas en dicha reacción de desplazamiento y/o son capaces de secuestrar PDE, en particular PDE4D7 son proteínas de anclaje tales como AKAP, proteínas de andamio tales como DISCI, beta-arrestina o RACK1, proteínas reguladoras tales como XAP2/AIP/ARA9, proteínas de unión a cAMP tales como subunidades de PKA-R o EPAC o receptores tales como el adrenoceptor beta1, así como enzimas tales como ERK.
Los factores de desplazamiento de fosfodiesterasa preferidos son péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, anticuerpos y aptámeros.
Un "péptido" en el contexto de un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa se refiere a un tramo de aminoácidos presentes en o que representan la molécula de fosfodiesterasa, ya sea común a varias variantes de PDE4D o específicos para una determinada variante de PDE4D, o una proteína de interacción o secuestrante como se definió anteriormente en el presente documento. El tramo de aminoácidos comprendido en el péptido puede tener una longitud de 5 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 50 aminoácidos, más preferiblemente de 20 a 30 aminoácidos. Los tramos pueden ser completamente idénticos a la PDE o proteína interactuadora o una porción de la misma o pueden comprender variaciones de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de péptidos puede comprender residuos de aminoácidos modificados en hasta el 25% de todas las posiciones, preferiblemente modificaciones que no cambien las propiedades estructurales o las propiedades de unión de la molécula. La secuencia de aminoácidos presente en el péptido puede representar alternativamente dominios espaciales de la PDE o proteína interactuadora y, correspondientemente, comprender una yuxtaposición de tramos de aminoácidos que no están unidos en la secuencia primaria de las moléculas.
Un "peptidomimético" en el contexto de un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa se refiere a una pequeña cadena similar a una proteína diseñada para imitar un péptido. Tal peptidomimético puede surgir de una modificación de un péptido existente, por ejemplo, un péptido como se definió anteriormente en el presente documento, con el fin de alterar las propiedades de la molécula. Un peptidomimético puede surgir de una modificación que cambia la estabilidad o capacidad de unión de la molécula. Estas modificaciones normalmente implican cambios en el péptido que no se producirán de forma natural. Por ejemplo, un peptidomimético de acuerdo con la presente invención puede tener estructuras peptídicas alteradas o puede comprender aminoácidos no naturales. Preferiblemente, un peptidomimético de acuerdo con la presente invención puede representar una molécula de fosfodiesterasa, común a varias variantes de PDE4D o específica para una determinada variante de PDE4D, o una proteína secuestrante o de interacción como se definió anteriormente en el presente documento.
En una realización de la presente invención, un peptidomimético puede bloquear la interacción entre PDE, ya sea de varias variantes de PDE4D o selectivamente de una variante específica de PDE4D, y su interactuador. En otra realización de la presente invención, un peptidomimético puede potenciar la interacción entre PDE, ya sea de varias variantes de PDE4D o selectivamente de una variante específica de PDE4D, y su interactuador.
Los expertos en la técnica conocen métodos y técnicas para la preparación de peptidomiméticos, así como ensayos para la prueba de peptidomiméticos.
"Moléculas pequeñas" en el contexto de un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa se refiere a un compuesto orgánico pequeño que es preferiblemente biológicamente activo, es decir, una biomolécula, pero preferiblemente no es un polímero. Dicho compuesto orgánico puede tener cualquier forma o propiedad química adecuada. El compuesto puede ser un compuesto natural, por ejemplo, un metabolito secundario o un compuesto artificial, que ha sido diseñado y generado de nuevo. En una realización de la presente invención, una molécula pequeña es capaz de bloquear la interacción entre PDE, ya sea de varias variantes de PDE4D o selectivamente de una variante específica de PDE4D, y su interactuador. En otra realización de la presente invención, una molécula pequeña puede potenciar la interacción entre PDE, en particular PDE4D7, y su interactuador. Los expertos en la técnica conocen métodos y técnicas para la identificación y preparación de moléculas pequeñas, así como ensayos para la prueba de moléculas pequeñas.
Un "anticuerpo" o un "aptámero" en el contexto de un factor de desplazamiento de fosfodiesterasa se refiere a un anticuerpo específico de PDE4D, ya sea específico para varias variantes de PDE4D o selectivamente para una variante específica de PDE4D, o una variante o fragmento de anticuerpo como se definió anteriormente en el presente documento, o para un aptámero específico de PDE4D7, ya sea específico para varias variantes de PDE4D o selectivamente para una variante específica de PDE4D, como se definió anteriormente en el presente documento, que tiene la capacidad de perturbar o interrumpir la interacción entre PDE, ya sea de varias variantes de PDE4D o selectivamente de una variante específica de PDE4D, y uno o más de sus interactuadores. Alternativamente, los términos también pueden referirse a anticuerpos o aptámeros que se unen a uno o más de los interactuadores de PDE4D/variante de PDE4D como se describió anteriormente en el presente documento, que también tienen la capacidad de perturbar o interrumpir la interacción entre PDE, ya sea de varias variantes de PDE4D o selectivamente de una variante específica de PDE4D y uno o más de sus interactuadores. Los métodos para la producción o prueba de anticuerpos o aptámeros se han descrito anteriormente en el presente documento y/o son conocidos por los expertos en la técnica.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un producto de programa informático, que comprende un código legible por ordenador almacenado en un medio legible por ordenador o descargable desde una red de comunicaciones, que, cuando se ejecuta en un ordenador, implementa las etapas de los métodos descritos en este documento.
Puede utilizarse cualquier combinación de uno o más medios legibles por ordenador. El medio legible por ordenador puede ser un medio de señal legible por ordenador o un medio de almacenamiento legible por ordenador. Un medio de almacenamiento legible por ordenador puede ser, por ejemplo, pero no limitado a, un sistema, aparato o dispositivo
electrónico, magnético, óptico, electromagnético, infrarrojo o semiconductor, o cualquier combinación adecuada de los anteriores. Ejemplos más específicos (una lista no exhaustiva) del medio de almacenamiento legible por ordenador incluiría lo siguiente: una conexión eléctrica que tiene uno o más cables, un disquete de ordenador portátil, un disco duro, una memoria de acceso aleatorio (RAM), una memoria solamente de lectura (ROM), una memoria solamente de lectura programable y borrable (EPROM o memoria Flash), una fibra óptica, una memoria solamente de lectura de disco compacto portátil (CD-ROM), un dispositivo de almacenamiento óptico, un dispositivo de almacenamiento magnético o cualquier combinación adecuada de los anteriores. En el contexto de este documento, un medio de almacenamiento legible por ordenador puede ser cualquier medio tangible que pueda contener o almacenar un programa para uso mediante o en conexión con un sistema, aparato o dispositivo de ejecución de instrucciones. Un medio de señal legible por ordenador puede incluir una señal de datos propagada con un código de programa legible por ordenador incorporado en el mismo, por ejemplo, en una banda base o como parte de una onda portadora. Tal señal propagada puede tomar cualquiera de una variedad de formas, que incluyen, pero no se limitan a, electromagnética, óptica o cualquier combinación adecuada de las mismas. Un medio de señal legible por ordenador puede ser cualquier medio legible por ordenador que no sea un medio de almacenamiento legible por ordenador y que pueda comunicar, propagar o transportar un programa para su uso por o en conexión con un sistema, aparato o dispositivo de ejecución de instrucciones.
El código de programa incorporado en un medio legible por ordenador se puede transmitir utilizando cualquier medio apropiado, incluyendo, pero sin limitarse a, inalámbrico, alámbrico, cable de fibra óptica, RF, etc., o cualquier combinación adecuada de los anteriores.
El código de programa informático para llevar a cabo operaciones para aspectos de la presente invención se puede escribir en cualquier combinación de uno o más lenguajes de programación, incluido un lenguaje de programación orientado a objetos tales como Java, Smalltalk, C++ o similares y lenguajes de programación de procedimientos convencionales, tales como el lenguaje de programación "C" o lenguajes de programación similares. El código del programa puede ejecutarse completamente en el ordenador del usuario, parcialmente en el ordenador del usuario, como un paquete de software independiente, parcialmente en el ordenador del usuario y parcialmente en un ordenador remoto o completamente en la ordenador o servidor remoto. En el último escenario, el ordenador remoto puede estar conectado al ordenador del usuario a través de cualquier tipo de red, incluida una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN), o la conexión puede realizarse con un ordenador externo (por ejemplo, ejemplo, a través de la Internet utilizando un proveedor de servicios de Internet).
Estas instrucciones del programa de ordenador también pueden almacenarse en un medio legible por ordenador que puede dirigir un ordenador, otro aparato de procesamiento de datos programable u otros dispositivos para que funcionen de una manera particular, de modo que las instrucciones almacenadas en el medio legible por ordenador produzcan un artículo de fabricación que incluye instrucciones que implementan la función/acto especificado en este documento.
Las instrucciones del programa de ordenador también se pueden cargar en un ordenador, otro aparato de procesamiento de datos programable u otros dispositivos para hacer que se realicen una serie de etapas operativas en el ordenador, otro aparato programable u otros dispositivos para producir un proceso implementado por ordenador de tal manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable proporcionan procesos para implementar las funciones/actos especificados en este documento.
Ejemplos
Selección de genes para construir el índice de PDE de cáncer de próstata (Índice-PDE):
Para seleccionar genes candidatos para construir el Índice-PDE, se investigaron varios transcriptos de PDE4D (aparte de las nueve isoformas de PDE anotadas actualmente, PDE4D1 a PDE4D9) para determinar la correlación del marcador de gen pronóstico putativo PDE4D7 como se describe en los documentos WO2010131194 y WO2010131195.
Para construir el índice de PDE de cáncer de próstata se usaron los siguientes conjuntos de datos:
1) Taylor BS et al. Integrative Genomic Profiling of Human Prostate Cancer. Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (ID del conjunto de datos de GEO: GSE21032)
2) Boormans JL et al. Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer. Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (ID del conjunto de datos de GEO: GSE41408)
3) Brase JC et al; TMPRSS2-ERG-specific transcriptional modulation is associated with prostate cancer biomarkers and TGF-b signaling. BMC Cancer 2011, 11, 507-515 (ID del conjunto de datos de GEO; GSE29079J
Para probar y validar aún más el índice de PDE de cáncer de próstata construido, se utilizó el siguiente conjunto de datos:
1) Erho N et al. Discovery and Validation of a Prostate Cáncer Genomic Classifier that Predicts Early Metástasis Following Radical Prostatectomy. PLoS One 8(6), e66855 (2013) (ID del conjunto de datos de GEO: GSE46691)
Procesamiento de los datos de expresión del gen GSE
Los archivos CEL respectivos se descargaron de GEO (Gene Expression Omnibus): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Los datos del archivo CEL se cargaron en Expression Console (Affymetrix Inc; Compilación 1.3.1.187) y se preprocesaron utilizando los archivos de anotación de conjuntos de sondas apropiados proporcionados por Affymetrix Inc. cuando corresponda, es decir, conjuntos de datos ejecutados en una plataforma Affymetrix Inc: GSE21032, GSE41408, GSE25136.
Los valores de expresión de las isoformas PDE4D individuales PDE4D1-PDE4D9 se estimaron utilizando los valores de señal del arreglo de exones de los conjuntos de sondas del arreglo Affymetrix Human Exon 1.0 ST como se describe en la Figura 1. Nota: para el interrogatorio de la expresión de las isoformas PDE4D1 y PDE4D2 muy estrechamente relacionadas solo se utilizó un único conjunto de sondas y se informó la actividad correspondiente para ambas isoformas juntas (PDE4D1 y 2). Para todos los demás transcriptos de PDE4D, se utilizaron varios conjuntos de sondas para calcular la expresión de isoformas respectivas que se informa como la media de los diferentes conjuntos de sondas medidas para una única variante de PDE4D.
Procedimiento de normalización de datos de qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real)
Se supone que los genes de referencia tienen una expresión estable independientemente de la muestra que se está procesando y, por lo tanto, se pueden usar como un estándar interno para normalizar los valores de Cq de salida de un análisis de PCR para que los resultados sean comparables independientemente de la cantidad de muestra utilizada de entrada. Aunque se supone que estos genes son estables, siempre existe cierta variabilidad en su expresión, y esta estabilidad también puede depender del tejido que se analiza. Por tal motivo se recomienda utilizar más de un gen de referencia en la normalización de los valores de Cq por PCR y utilizar un conjunto de genes que presente baja variabilidad en el tipo específico de tejido/muestra que se analiza. CL Andersen, JL Jensen y TF 0rntoft, "Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets," Cancer Res., Vol. 64, no. 15, páginas 5245-5250, agosto de 2004, J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe y F. Speleman, "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes", Genome Biol., vol. 3, no. 7, p. RESEARCH0034, junio de 2002).
Se realizó una selección inicial de 9 genes de referencia para usar en este estudio. La selección final del conjunto de genes de referencia utilizado para la normalización se realizó ejecutando la herramienta de software Biogazelle (qBase+ con análisis GeNorm J. Hellemans, G. Mortier, AD Paepe, F. Speleman y J. Vandesompele, "qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data", Genome Biol., vol. 8, no. 2, p. R19, febrero de 2007) en todas las muestras clínicas analizadas.
Los valores de Cq de salida de un ensayo de PCR son intrínsecamente logarítmicos (base 2) e inversamente proporcionales a la cantidad de ARNm presente en la muestra. Se uso la siguiente fórmula para normalizar los valores sin procesar de Cq:
N(Cqgen de interés ) = Media(Cqgen de referencia ) -(Cqgen de interés)
En la que (Cqgen de interés) es el valor de expresión génica normalizado para un gen de interés; en la que Media (Cqgen de referencia ) es la media aritmética de los valores de Cq de la PCR de la combinación seleccionada de genes de referencia; en la que (Cqgen de interés) es el valor Cq de la PCR del gen de interés.
En caso de que se utilicen otras tecnologías distintas a qRT-PCR para medir la expresión de los genes de referencia o los genes de interés, el valor de Cq de la PCR se reemplazará por una medición normalizada de la tecnología respectiva (por ejemplo, un RMA (promedio robusto de múltiples arreglos) valor de expresión génica normalizada para microarreglos de ADN, o un valor de expresión génica normalizado FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) para secuenciación de ARN).
Niveles de expresión normalizados de los transcriptos de PDE4D a través de diferentes tejidos de cáncer de próstata de los dos conjuntos de datos de Taylor et al., Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)) y Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer, Int J Cancer, 15 de julio de 2013; 133 (2): 335-45 (GSE41410 (GEO del NCBI)) se muestran en las Figuras 10 a 13. La expresión de los transcriptos se ha normalizado a los siguientes genes de referencia: HPRT1, PUM1, TBP y TUBA1B. Los datos usados se basan en datos de expresión del arreglo de exones públicamente disponibles, es decir, para cada gen, un intervalo de conjuntos de sondas de exones dirigidos a varios exones del gen respectivo mide la expresión de los diferentes exones como se describió anteriormente. En la primera etapa, se usa la expresión log2 de todos los conjuntos de sondas para los genes de referencia para calcular una expresión génica de referencia promediada. Se hace lo mismo para los diferentes conjuntos de sondas dirigidas a los transcriptos 4D individuales. Luego, el promedio de los genes de referencia se resta de la expresión del transcripto 4D promedio. El
resultado es la expresión del transcripto de PDE4D normalizado. Como se puede observar, los diferentes transcriptos 4D están regulados de una manera específica de isoforma a través de los diferentes tejidos (desde próstata normal, cáncer de próstata primario con diferente potencial de progresión después del tratamiento primario (b Cr = recurrencia bioquímica; CR = recurrencia clínica hasta metástasis) al tejido metastásico (sin tratamiento hormonal, es decir, antes de cualquier terapia antiandrogénica; y resistente a hormonas, es decir, después de la terapia antiandrogénica). Por ejemplo, PDE4D3 y PDE4D6 no se expresan mucho en comparación con otros transcriptos 4D; PDE4D4 realmente no cambia a través de los tejidos; PDE4D5 y PDE4D9 están subregulados a partir de tejidos normales a resistentes a hormonas, mientras que PDE4D7 se sobreexpresa en el cáncer de próstata primario y luego se vuelve más subregulado en los otros tejidos.
Cálculo del Índice-PDE (con base en datos cuantitativos de PCR en tiempo real)
i) Índice-PDE 1: expresión de PDE4D7 - expresión de PDE4D5, en la que
la expresión de PDE4D7 es (N(CqPDE4D7)) y la expresión de PDE4D5 es (N(CqPDE4D5))
ii) Índice-PDE 2: MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5), en la que
la expresión de PDE4D7 es (N(CqPDE4D7)) y la expresión de PDE4D5 es (N(CqPDE4D5))
iii) Índice-PDE 3: (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4), en la que
expresión de PDE4D5 es (N(CqPDE4D5)), expresión de PDE4D7 es (N(CqPDE4D7)), expresión de PDE4D9 es (N (CqPDE4D9)) y la expresión de PDE4D4 es (N(CqPDE4D4)), en la que
(MEDIA (la expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)) es la media aritmética de la expresión de PDE4D5, la expresión de PDE4D7 y la expresión de PDE4D9
iv) Índice-PDE 4: (MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(PDE4D1 y expresión de PDE4D2), en la que
la expresión de PDE4D5 es (N (CqPDE4D5)), la expresión de PDE4D7 es (N (CqPDE4D7)), la expresión de PDE4D9 es (N (CqPDE4D9)) y PDE4D1 y la expresión de PDE4D2 es (N(CqPDE4D1 y 2)), en la que
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)) es la media aritmética de la expresión de PDE4D5, la expresión de PDE4D7 y la expresión de PDE4D9
v) Índice-PDE 5: (MEDIA (PDE5_exp y PDE7_exp y expresión de PDE4D9)), en la que
la expresión de PDE4D5 es (N(CqPDE4D5)), la expresión de PDE4D7 es (N(CqPDE4D7)) y la expresión de PDE4D9 es (N (CqPDE4D9)), en la que
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)) es la media aritmética de la expresión de PDE4D5, la expresión de PDE4D7 y la expresión de PDE4D9
Los Índices-PDE calculados se usaron para cualquier análisis de datos estadísticos adicionales.
Análisis de correlación del Índice-PDE frente a los parámetros clínicos para el resultado del paciente
Todo el análisis estadístico (por ejemplo, análisis de regresión logística, análisis ROC, análisis de regresión COX, etc.) del Índice-PDE y su correlación con el resultado del paciente en comparación con parámetros clínicos tales como PSA, pGleason, estadio de pT se realizó con XLSTAT Versión 2014.1.03
Resultados
La Figura 3 muestra una descripción general de la expresión diferencial normalizada de las isoformas de PDE4D individuales, así como las cuatro variantes de los índices de PDE para diferentes comparaciones de grupos de pacientes a través de dos conjuntos de datos de expresión génica. Las comparaciones de pacientes por parejas analizadas fueron las siguientes:
i) NAT frente a PCa primario, NP
ii) PCa primario, NP frente a PCa primario, BCR y CR
iii) PCa primario, NP y BCR frente a PCa primario, CR
iv) PCa primario (todos) frente a metástasis
v) PCa primario (todos) frente a CRPC
en las que,
- NAT es tejido adyacente normal, es decir, tejido recolectado junto a una lesión tumoral del material del paciente, pero sin cáncer según la histología
- PCa primario, NP es tejido tumoral primario recolectado del paciente que no mostró progresión del tumor durante el seguimiento clínico
- PCa primario, BCR y CR es tejido tumoral primario recolectado del paciente que mostró progresión del tumor durante el seguimiento clínico hasta la primera recurrencia bioquímica y posteriormente clínica
- PCa primario, NP y BCR es tejido tumoral primario recolectado del paciente que no mostró progresión del tumor durante el seguimiento clínico o demostró la primera recurrencia bioquímica
- PCa primario, CR es tejido tumoral primario recolectado del paciente que mostró progresión del tumor durante el seguimiento clínico hasta la recurrencia clínica
- Metástasis es tejido tumoral metastásico recolectado de un paciente sin tratamiento hormonal
- CRPC es tejido recolectado de un paciente con enfermedad resistente a la castración
Como puede verse a partir de los datos, los diversos Índices-PDE se pueden usar para diferentes aplicaciones en el diagnóstico de cáncer de próstata y/o el pronóstico de la progresión del cáncer de próstata. La variante
Índice-PDE Variante 1: Expresión de PDE4D7 - Expresión de PDE4D5
es principalmente útil para discriminar entre tejido adyacente normal (NAT) y tejido canceroso primario de la próstata con un poder de discriminación muy alto (véase la Figura 3). El cálculo de este índice en varios otros conjuntos de datos para la discriminación entre nAt y cáncer de próstata primario en comparación con las otras variantes del Índice-PDE (véase la Figura 4) confirma que el Índice-PDE Variante 1 proporciona un fuerte poder de discriminación. La abreviatura "BL" indica lesiones benignas y "H" indica hiperplasia benigna de la próstata.
La Figura 5 proporciona una descripción general de un total de ocho conjuntos de datos de cáncer de próstata que comprenden en total> 900 muestras de pacientes de las categorías de tejido adyacente normal, lesiones benignas, hiperplasia benigna, así como tejido tumoral. Todas las comparaciones por pares entre diferentes categorías de tejidos demuestran un poder de discriminación muy alto entre los grupos de tejidos utilizando el Índice-PDE Variante 1. Como se puede ver además en la Figura 3, las variantes del Índice-PDE Índice-PDE 2, Índice-PDE 3 E Índice-PDE 4 están correlacionadas con una enfermedad más agresiva.
Índice-PDE 2 (Índice-PDE Variante 2):
MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5)
Índice-PDE 3 (Índice-PDE Variante 3):
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4) Índice-PDE 4 (Índice-PDE Variante 4):
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(PDE4D1 y expresión de PDE4D2) Índice-PDE 5 (Índice-PDE Variante 5):
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))
Cuando el término "expresión de PDE4D4" denota el nivel de expresión de PDE4D4, el término "expresión de PDE4D5" denota el nivel de expresión de PDE4D5, el término "expresión de PDE4D7" denota el nivel de expresión de PDE4D7 y el término "expresión de PDE4D9" denota el nivel de expresión de PDE4D9. El término expresión de "PDE4D1 y PDE4D2" denota los niveles de expresión de PDE4D1 y PDE4D2, detectados juntos mediante una sola sonda.
Las comparaciones por pares de los siguientes grupos de pacientes generalmente proporcionan una diferencia de expresión significativa (véase la Figura 3):
i) PCa primario, NP frente a PCa primario, BCR y CR
ii) PCa primario, NP y BCR frente a PCa primario, CR
iii) PCa primario (todos) frente a metástasis
iv) PCa primario (todos) frente a CRPC
Esto está respaldado además por un análisis ROC como se describe para los índices PDE 2-4 en la Figura 6. El AUC (área bajo la curva) del análisis ROC para las comparaciones por pares anteriores demuestra un poder de discriminación positivo. Estos datos subrayan el poder de pronóstico de las combinaciones de varios transcriptos de PDE4D para predecir el cáncer de próstata progresivo.
También se probaron los diversos índices de PDE para la expresión diferencial entre tumores negativos para TMPRSS2-ERG y positivos para TMRSS2-ERG en comparación con tejido adyacente normal (NAT, negativo para TMRPSS2-ERG). Los resultados se resumen en la Figura 7. Es interesante notar que se observó una fuerte correlación entre la presencia de una fusión génica TMPRSS2-ERG positiva y la expresión de la isoforma PDE4D7, mientras que la expresión de otro transcripto de PDE4D (en particular PDE4D1 y 2, PDE4D5 y PDE4D9) está más correlacionada con la ausencia de la fusión génica TMPRSS2-ERG. Este efecto es muy fuerte para PDE4D5. Esta observación, es decir, la correlación de expresión positiva de la presencia de PDE4D7, de la fusión génica TMPRSS2-ERG y la correlación positiva de la expresión de PDE4D5 con la ausencia de la fusión génica TMPRSS2-ERG, con lo que se confirma en cuatro conjuntos de datos de cáncer de próstata independientes (Figura 7) proporciona una razón muy
fuerte para la combinación de PDE4D5 y PDE4D7 en el Índice-PDE Variante 1 para representar un fuerte discriminador entre cáncer y tejido de próstata no canceroso (véase también la Figura 5).
Además, se analizó la correlación de las variantes del Índice-PDE con la puntuación de la patológica de Gleason en un conjunto de datos de cáncer de próstata. El análisis se realizó dependiendo del estado de la fusión génica específica de cáncer de próstata TMPRSS2-ERG (Tomlins S. et al, Nature, 2005). Este reordenamiento genómico entre la serina proteasa regulada por andrógenos TMPRSS2 y el factor de transcripción ERG2 que es un miembro de la familia de factores de transcripción de ETS. Como se describe en la Figura 8, hubo una asociación positiva significativa con los índices de PDE 2-4 y la presencia de la fusión TMPRSS2-ERG.
La Figura 9 representa una descripción general del valor añadido de los Índices-PDE junto con datos clínicos sobre la supervivencia sin progresión (bioquímica y clínica) dependiendo del estado de fusión TMPRSS2-ERG del tumor. El valor añadido se ve en el aumento del AUC en el análisis ROC del modelo clínico únicamente (pGleason y estadio de pT) frente a un modelo de combinación del Índice-PDE y pGleason y estadio de pT. Cabe señalar que solo se pudo detectar un aumento significativo en el AUC para las variantes del Índice-PDE investigadas en caso de la presencia de la fusión TMPRSS2-ERG para ambos criterios de valoración probados, a saber, la supervivencia sin progresión bioquímica y la supervivencia sin progresión clínica.
Familia de factores. Como se describe en la Figura 8, hubo una asociación positiva significativa con los Índices-PDE 2-4 y la presencia de la fusión TMPRSS2-ERG.
La Figura 9 representa una descripción general del valor añadido de los Índices-PDE junto con los datos clínicos sobre la supervivencia sin progresión (bioquímica y clínica) dependiendo del estado de fusión TMPRSS2-ERG del tumor. El valor añadido se observa en el aumento del AUC en el análisis ROC del modelo clínico solamente (pGleason y estadio de pT) frente a un modelo de combinación de Índice-PDE y pGleason y estadio de pT. Cabe señalar que solo se pudo detectar un aumento significativo en el AUC para las variantes del Índice-PDE investigadas en caso de presencia de la fusión TMPRSS2-ERG para ambos criterios de valoración probados, a saber, la supervivencia sin progresión bioquímica, así como la supervivencia sin progresión clínica.
Claims (6)
1. Un método implementado por ordenador que comprende la etapa de:
a) determinar un estado de progresión de cáncer de próstata con base en un perfil de expresión génica que incluye el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, en las que ninguna de las variantes de p De4D sirven como un gen de referencia, y en las que el perfil de expresión génica se convierte en al menos un índice de PDE de cáncer de próstata (Índice-PDE) indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata, y en el que el al menos un Índice-PDE se selecciona de lo siguiente:
i) Índice-PDE 1:
expresión de PDE4D7 - expresión de PDE4D5
ii) Índice-PDE 2:
MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5)
iii) Índice-PDE 3:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4) iv) Índice-PDE 4:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/( expresión de PDE4D1 y expresión de PDE4D2)
v) Índice-PDE 5:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)).
2. Un método que comprende la etapa de:
a) determinar un estado de progresión del cáncer de próstata con base en un perfil de expresión génica que incluye el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9, en las que ninguna de las variantes de p De4D sirven como un gen de referencia, y en las que el perfil de expresión génica se convierte en al menos un índice de PDE de cáncer de próstata (Índice-PDE) indicativo del estado de progresión del cáncer de próstata, y en el que al menos un Índice-PDE se selecciona de lo siguiente:
i) Índice-PDE 1:
expresión de PDE4D7 - expresión de PDE4D5
ii) Índice-PDE 2:
MEDIA (expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D5)
iii) Índice-PDE 3:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D4) iv) Índice-PDE 4:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9))/(expresión de PDE4D1 y PDE4D2) v) Índice-PDE 5:
(MEDIA (expresión de PDE4D5 y expresión de PDE4D7 y expresión de PDE4D9)) en la que antes de la etapa (a) el nivel de expresión de al menos dos variantes de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionadas del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D9 en una muestra se determina para obtener un perfil de expresión génica, comprendiendo opcionalmente el método la etapa de determinar el nivel de expresión de al menos un gen de referencia en una muestra.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el perfil de expresión génica es un perfil de expresión génica normalizado que se obtiene normalizando el nivel de expresión de las variantes de PDE4D a la expresión de al menos un gen de referencia.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
que es un método para controlar o pronosticar el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata; o
que es un método para identificar a un individuo para la elegibilidad para una terapia de cáncer de próstata, que además comprende identificar a un individuo como elegible para recibir una terapia de cáncer de próstata en la que el Índice-PDE del individuo indica la presencia de cáncer de próstata o en la que el Índice-PDE del individuo indica un estado de progresión del cáncer de próstata no progresivo o progresivo.
5. Un producto de programa informático, que comprende un código legible por ordenador almacenado en un medio legible por ordenador o descargable desde una red de comunicaciones, que, cuando se ejecuta en un ordenador, implementa las etapas de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4.
6. Una composición farmacéutica inhibidora para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer de próstata que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo de:
e) un miARN específico para una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9;
f) una molécula antisentido para una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9;
g) un ARNpi específico para una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9;
h) un aptámero específico para el producto de expresión de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9 o para la proteína de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9;
i) una molécula pequeña o peptidomimético capaz de unirse específicamente a la proteína de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en p De4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9; y
j) un anticuerpo específico para la proteína de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9 y/o una variante de anticuerpo específica para la proteína de una variante de PDE4D seleccionada del grupo que consiste en PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9,
en la que la variante de PDE4D se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
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