BG67180B1 - Метод и кит за откриване на онкофузионен протеин - Google Patents

Abstract

Разработен е метод за откриване на онкофузионен протеин, който съчетава комбинация от имунологичен с молекулярно-биологичен метод, като позволява разпознаването на най-често срещания и с най-високо клинично значение функционално годен онкофузионен протеин при карцином на простатата - TMPRSS2-ERG. Предлаганото решение открива на протеиново ниво двете отделни части на TMPRSS2-ERG. Ако те не са на разстояние от порядъка на една молекула, както и ако са frame shift мутирали, тези две отделни части (домени) няма да бъдат разпознати и тестът ще бъде отрицателен. Обратно, ако има близко разположени домени на TMPRSS2 и ERG в близост от порядъка на една молекула, след първична детекция на двата домена се генерира междинен продукт, който се усилва във втора стъпка с помощта на амплифицираща технология, което позволява детекция на изключително слаб сигнал, получен от много малък брой детектирани фузионни молекули. Разработен е кит за детекция на протеинов продукт, получен при фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи съответни геномни локации в хромозома 21. За детекция на различни варианти, получени в резултат на различно генно реаранжиране, изследвания фузионен протеинов продукт може да се открие с помощта на специфични антитела, насочени към участъци от пълния функционален протеинов продукт на дивите варианти на гените TMPRSS2 и ERG. По този начин протеините TMPRSS2 и ERG могат да се открият поотделно. 4 претенции, 25 фигури

Description

(54) МЕТОД И КИТ ЗА ОТКРИВАНЕ НА ОНКОФУЗИОНЕН ПРОТЕИН

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод и кит за откриване на онкофузионен протеин, по-специално на функционално активен онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, приложими в изследователската, диагностична и терапевтична практика.

Предшестващо състояние на техниката

Известни са редица изследвания и анализи на генетичен материал на онкоген за идентифициране на променени гени, резултат от променливо генно сливане, които водят до променена активност на онкогени като част от по-нататъшното развитие на молекулярно-биологични решения и повишаване на информираността относно генетичния фон на дегенерация на клетките.

Откриването на наличие или отсъствие на онкофузионен протеин корелира и с най-често развиващият се неопластичен процес при мъжете в световен мащаб - карциномът на простатата, който е и втората по честота причина за смъртност сред туморните заболявания след белодробния, го превръща в сериозен социален и здравно-икономически проблем - едно от най- големите предизвикателства в момента пред медицината.

Известни са редица методи за своевременно откриване на онкофузионен протеин, като:

- Биопсично изследване за получаване на хистологичен материал за морфологична и имунохистохимична оценка на хистологичния и клиничния стадий на простатния карцином, които имат специфични характеристики за простатен карцином след палпаторно изследване за нодули в простатната жлеза.

- Скрининг на класическия маркер простатно-специфичен антиген (PSA), чрез ензимно-свързан имуно-сорбентен анализ (ELISA) и други методи в биологични течности.

Установено е, че за развитието на простатния карцином особено важни са транскрипционните фактори от семейството на Е26 трансформационно-специфични фактори (Е26 transformation-specific, ETS), тъй като секвенирането на пълния геном и транскриптом на пациенти показват наличието на новообразувани онкопротеини вследствие на драматично реаранжиране на генома [1]. TMPRSS2-ERG (TMPRSS2, Transmembrane protease, serine 2 - трансмембранна протеаза, серин 2; ERG, ETS- related gene - E26 трансформационно-специфичен фактор свързан ген) е уникална фузия за простатния аденокарцином между част от промотора на гена, кодиращ андроген-чувствителната простатспецифична серинова протеаза 2 (TMPRSS2) и транскрипционния фактор ERG от семейството на ETS [2], като съчетанието с генна амплификация води до влошена прогноза [3]. TMPRSS2-ERG фузията е с доказана специфичност и уникалност. Нейната разпространеност (над 40-50%) при пациентите с простатен карцином, има директен ефект при епигенетичната дисрегулация, съпътстваща простатната канцерогенеза, свързана с дълбокото разстройство на молекулния сигналинг на андрогенния рецептор, промотира епитело-мезенхимната трансформация на карциномните клетки, водещо до метастазиране [4].

Ранното откриване на посочената генна фузия с висок метастатичен потенциал би позволила ранен старт на химиотерапия с по-висока степен на токсичност [5].

Известен е метод за цитогенетично определяне на нови фузионни явления - флуоресцентна ин ситу хибридизация (FISH, Fluorescent in situ hibridisation) [6], при който специфични флуоресцентно

BG 67180 Bl маркирани сонди, съставени от комплементарни части от двата първични гена съставящи фузионния ген, се смесват със специално обработен хистологичен срез [8].

Основните недостатъци са: необходимост от биопсичен материал (болезнен метод, водещ до дискомфорт на пациента, изпълняван само от високо-квалифициран уролог) и получаване на парафинов срез с простатна тъкан (от квалифициран патолого-анатомичен персонал), последван от изпълняване на сравнително усложнена хистологична техника; нуждата от участие на специализирани лаборатории за цитогенетика е ограничено и няма възможност за скрининг приложение, поради което не може да се използва за бърз рутинен скрининг; изследването на биологични течности не е възможно; сондите би трябвало да детектират кратък участък от дивия тип на двата съставни за фузията гени, в резултат на което не биха могли да дискриминират in frame мутации (мутации без изместване рамката за четене), от frame shift мутации (мутации с изместване рамката за четене), като последните биха били позитивни чрез FISH метод, но не биха довели до функционална ERG или друга подобна молекула; цените на китовете за цитогенетика, валидирани за клинична употреба имат сравнително високи стойности.

Известни са подходи, основаващи се на метода на полимеразно-верижната реакция (PCR) [7], използва се модификация на обратно-транскриптазна количествена полимеразно верижна реакция (RTqPCR), при която иРНК резултат от транскрибирането на геномно реаранжирана онкофузия се амплифицира чрез специфични праймери, които подобно на FISH детектират комплиментарни участъци от иРНК [9,10,11 ]. При този подход остават нерешени няколко основни проблема: в научната литература постоянно се описва възникването на нови комбинации от различни по дължина фрагменти на TMPRSS2 и ERG, при което стандартните праймери ще произведат различен по дължина ампликон (продукт на амплификация); методологично, ампликона който би се получил не би могъл да се интерпретира дали е in-frame без секвениране; не е възможно клиничното приложение дори на таргетно секвениране на тази мутация, поради високата цена за масово приложение. Дори при секвениране, пак би се наложило и последващо молекулно моделиране за определяне на функционалното състояние на фузионния продукт.

Известна е модификация на метода RT-qPCR и т. нар. Scorpion праймери за по-високо ниво на детекция на 5' края на информационната РНК, кодираща TMPRSS2 [11]. Недостатъци на описания подход са: изследването не търси изобщо ERG или друг фузионен партньор; невъзможност да се разграничи нормален от фузионен TMPRSS2 фрагмент.

Известен е метод за откриване на панел от гени на ниво иРНК, който детектира предефинирани иРНК на туморни маркери, който се очаква да не съдържат високи степени на мутации сами по себе си [12]. Основен недостатък е възможността за възникване на точкови мутации в посочените гени, което не би било отчетено от метода, но би могло да доведе до функционални промени в протеиновите им продукти и до промяна в клиничното им значение.

Известно е решение, което търси фузионни феномени като TMPRSS2 и ERG, но само на ниво информационна РНК, използвайки PCR или други методи за детекция след амплификация на кДНК (т .нар. копи ДНК - получено при комплиментарна хибридизация копие на ген/ДНК последователност) или РНК, позволяващи по-висока степен на точност [9]. Тези подходи наследяват същия недостатък настъпването на нови мутации не би могло да се детектира с фиксирано множество праймери.

BG 67180 Bl

Друго решение отчита нивата на иРНК, кодираща фузионен феномен TMPRSS2/ERG в комбинация с ДНК метилационния статус на фузионния ген, както и на панел от други немутиращи гени. Този подход би могъл да се използва като индиректен маркер за протеиновата експресия на фузионния продукт, но в този подход има два недостатъка: метилационния статус е един от механизмите за регулация на транскрипцията на даден ген и протеиновите нива на получения продукт не са линейно зависими; подхода не отчита дали протеиновия продукт е функционален протеин, който би имал биологичен ефект и следователно клинично значение [10].

Откриването на посочената фузионна мутация не е решена на ниво протеинов продукт. Известно е решение, което предлага моноклонални антитела, които разпознават епитоп 42-66 на ERG, като по този начин са приложими при имунологични методи за откриване наличието му (имунохистохимични, ELISA) [13]. В момента все още няма фузия-специфично антитяло детектиращо TMPRSS2-ERG или само ERG в мутантно състояние. Получаването на такова антитяло може да доведе до откриване на определени, вече характеризирани фузионни феномени, но възникването на нови такива би могло да доведе до получаването на нови фузионни генни секвенции, което да доведе до загуба на специфичния епитоп разпознаван от моноклоналното антитяло.

Използваните до сега методи или демонстрират фузия чрез ДНК сонди (Е18Н)/количествен PCR (RT-qPCR), показващи началото на единия ген и края на другия, или още по-неточно използват имунохистохимия с антитела насочени към втория фузионен ген (ERG), който има генно-регулаторни функции. Използваните до момента в клиничната практика маркери и подходи за откриване на онкофузионнен протеин не позволяват разграничаването на клинично-важните злокачествени форми от неизявените карциноми, и не позволяват точна оценка на метастатичния потенциал на туморните образувания, въз основа на който да се направи прогноза за състоянието на пациента.

Задача на изобретението е да предложи метод за откриване на функционално активен онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, както и кит за неговото приложение, с които да е възможно високо специфично, бързо и лесно диагностициране на заболяването, позволявайки точна прогноза и фокусирана терапия.

Техническа същност на изобретението

Методът за откриване на функционално активен онкофузионнен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, съгласно настоящото изобретение, се основава на откриване наличието на фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи геномна локация в хромозома 21 съответно в: 41464551-41508065 и 38380028-38498504 (фигура 1), независимо от начина на тяхното реаранжиране. За целта, предварително разтворени в реакционен буфер антитяло-олигонуклеиден конюгат, специфично детектиращ гена TMPRSS2 и разтвор на антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ гена ERG, последователно се накапват към изследваната тестова проба в ямките на плака, съвместима с апаратите за количествена полимеразно верижна реакция (qPCR).

След инкубиране в продължение на 2 h при стайна температура следва двуетапно омрежване на конюгатите с използване на qPCR и последваща амплификация на продукта на омрежването чрез полимеразно верижна реакция в реално време. Получените данни се подлагат на регресионен анализ за определяне стойностите за протеинова експресия, съответстващи на стойностите за наличие на функционално активен онкофузионнен TMPRSS2-ERG протеин в изследваните проби (SEQ ID No.l).

BG 67180 Bl

От своя страна, антитяло-олигонуклеотидният конюгат, специфично детектиращ гена TMPRSS2, представлява конюгат на пречистен поливалентен TMPRSS2-cπeциφичeн имуноглобулин G (IgG) и разпознаващ епитопи с размер на 15-20 аминокиселинни остатъци, съответстващи на аминокиселинните остатъци при позиция 365 от молекулата на нативния TMPRSS2 ген (рефериран като антитяло 1) с лиофилизиран 40-60-мерен олигонуклеотид с молекулна маса от 12296 g/mol до 12690 g/mol, а антитялоолигонуклеотидният конюгат, специфично детектиращ гена ERG, представлява конюгат на пречистен поливалентен ERG-специфичен IgG, локализиран в карбокси края на протеина от молекулата на нативния ERG ген (рефериран като антитяло 2) с лиофилизиран 40-60-мерен олигонуклеотид с молекулна маса от 12296 g/mol до 12690 g/mol.

В качеството на тестова проба в метода, съгласно изобретението, се използват клетъчни линии, носещи генната фузия TMPRSS2-ERG или материал, получен от биологични течности като кръв, серум, урина, лимфна течност, цереброспинална течност, течност от кистозни формации или тъкани като цялостен лизат, получен от простатна биопсия, клетъчен лизат, получен от биопсичен материал от първичен тумор или метастатично огнище, циркулиращи метастатични клетки, изолирани от периферна кръв, единична клетка или малка група клетки, изолирани от тумори и други. Тестовата проба се калибрира с лизат от клетъчна линия ATCC VCaP.

Методът за откриване на наличието на функционално активен онкофузионнен протеин, съгласно настоящото изобретение, се осъществява с помощта на кит, включващ:

- Ямкова плака, съвместима с апарат за провеждане на количествена полимеразно верижна реакция (qPCR);

- Антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ TMPRSS2 гена, предварително разтворен в реакционен PBS буфер;

- Антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ ERG гена, предварително разтворен в реакционен PBS буфер и

- Тестова проба, подлежаща на изследване;

- Калибрационна проба, представляваща лизат от клетъчна линия ATCC VCaP.

Онкофузионният протеин при карцином на простатата е резултат от фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи съответни геномни локации в хромозома 21: 41464551-41508065 и 38380028-38498504 (фигура 1). Като илюстрация, един от описаните фузионни продукти е следната изоформа: GenBank: EU432099.1, Homo sapiens TMPRSS2-ERG prostate cancer specific isoform 1 (ERG) mRNA, complete cds, alternatively spliced (фигура 2). Генът и аминокиселинната секценция са представени в SEQUENCE LISTING, SEQ ID No. 1

Методът позволява откриване на наличие на двете отделни протеинови компоненти, съставящи фузия между гените TMPRSS2 и ERG, независимо от начина на ре-аранжиране (описан или все още неизвестен) (фигура 3). Ако те не са на разстояние от порядъка на една молекула, както и ако са frame shift мутирали, тези две отделни части (домени) няма да бъдат разпознати и тестът ще бъде отрицателен. Обратно, ако има близко разположени домени на TMPRSS2 и ERG в близост от порядъка на една молекула, след първична детекция на двата домена се генерира междинен продукт (фигура 4), който се усилва във втора стъпка с помощта на амплифицираща технология (фигура 5), което позволява откриване на наличие на изключително слаб сигнал, получен от много малък брой детектирани фузионни молекули.

BG 67180 Bl

Методът позволява определяне на протеиновия продукт-патологично формирана генна фузия в клетки, получени от карцином на простатата генна фузия, резултат от пренареждане на гени от хромозома 21 (фигура 1), водещи до образуването на продукт с променлива дължина и вариабилна функция - TMPRSS2-ERG.

Методът, съгласно изобретението, съчетава комбинация от имунологичен с молекулярнобиологичен метод, като позволява разпознаването на най-често срещания и с най-високо клинично значение функционално годен онко-фузионен протеин при карцином на простатата - TMPRSS2-ERG (SEQID No:l).

Тестът се калибрира със стандарт и изисква много малко количество (1 микролитър) клиничен материал (серум, кръв, лизат от пункционна биопсия), провежда се в два етапа, посредством накапване на тестовия материал и няколко стандарта в 96 ямков формат, накапване на реакционна смес и инкубация, и последващ анализ/детекция посредством апарат за количествена полимеразно верижна реакция (qPCR). Протичащият процес в qPCR апаратът не е типична полимеразно верижна реакция и не изисква получаване на крива на топене. Общото време е около 4-6 часа, което позволява бърз клиничен отговор с цел оптимизация на терапията.

Разработеният метод детектира протеинови продукти, получени в резултат както на известни, така и на още неизвестни (непредвидени) фузионни феномени, свързани с реанжирането на два конкретни гена при карцином на простатата.

Генно ре-аранжиране се нарича сливане на части от два гена, намиращи се на различни места (хромозоми) в генома и води до образуване на нови онко-фузионни протеини. При наличие на фузия, получените реаранжирани гени съдържат част от екзоните, кодиращи TMPRSS2 и част от екзоните, кодиращи ERG, като пренареждането може да се осъществи за сметка на деления на интроните между екзони на двата гена, но може да засяга част от екзони на TMPRSS2 или на ERG. Последните могат да са в правилна посока за четене (sense) или в обратна посока (anti-sense). Обикновено са известни началният край на единия ген и краят на вторият реаранжиран ген, но точните нуклеотидни последователности винаги варират. По тази причина кодираните от този фузионен ген аминокиселинни последователности се различават при различните индивиди и дори в рамките на един индивид ще се наблюдават няколко варианта на такова реаранжиране, и съответно различни аминокиселинни последователности на получените фузионни протеини.

Всеки белтък е изграден от различен набор от функционално независими структурно обусловени части, наречени домени. При образуването на онко-фузионните протеини, домени от два различни белтъка се кодират от нов ре-аранжиран ген, като полученият продукт може да бъде функционално активен частично, или напълно, или да представлява неправилно навит протеин (protein missfolding), който съдържа част от оригиналната последователност от амино-киселини, но не е функционално навит и не притежава оригиналните домени, и съответно не е способен да изпълнява функции на молекулярно ниво, или може да съдържа абсолютно нова аминокиселинна последователност, кодирана от изместена рамка за четене (“frame shift’) в резултат от генната реаранжировка. В последния случай полученият протеин няма функционално значение и не може да изпълнява генно-регулаторни функции.

BG 67180 Bl

Едно антитяло може да разпознава специфично само много малък участък от дадена молекула (епитоп, състоящ се от 10-20 амино киселинни остатъка), но при разпознаване на цялата нативна молекула, то не може да разпознае нейна мутантна форма (фигура 3).

По тази причина за откриване на наличие на разнообразните непредсказуеми варианти, получени в резултат на различно генно реаранжиране, получените фузионни протеинови продукти могат да се детектират с помощта на специфични поливалентни (поликлонални) антитела, насочени към участъци от пълния функционален протеинов продукт на дивите варианти на гените TMPRSS2 и ERG. По този начин се покрива етерично цялата таргетна молекула на всеки от елементите на фузията, т. к. загубата на специфичност към определени етерични участъци се компенсира със запазена специфичност към други. По този начин протеините TMPRSS2 и ERG могат да се открият поотделно, ако имат запазена поне частично нативна конформация.

Разработеният, съгласно изобретението, метод позволява да се разпознаят по отделно части от домените, съставляващи двата оригинални протеина, само когато са в много голяма близост (наличие на фузия) и ако са правилно функционално навити и евентуално биха имали физиологичен ефект, т. е. биха предизвикали действително повишена малигнизация на клетките, носители на този феномен. На следващ етап в провеждането на теста, при наличие на детекция на фузионно събитие, следва усилване на сигнала, което позволява много нисък праг на откриване на наличие на особено малък брой фузионни молекули. Това е възможно, тъй като се използват антитяло-олигонуклеотидни конюгати, които при етерична близост (свързване по повърхността на фузионен протеин, но не и нативните протеини поотделно), създават междумолекулен мост между олигонуклеотидните конюгати (омрежване) (фигура 4). В следващ етап последният се усилва и този сигнал се отчита с помощта на конвенционален qPCR метод (фигура 5).

Методът, съгласно настоящото изобретение се осъществява посредством специално създаден за целта кит, позволяващ неговото лесно, бързо и ефективно прилагане в изследователската, диагностична и терапевтична практика.

Китът, съгласно изобретението, открива протеиновите продукти получавани при свързаната с карцинома на простатата фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи съответни интактни геномни локации в хромозома 21:41464551 -41508065 и 383 80028-38498504, с минимален праг на детекция 2,6.10^-5 amol/pL тотален протеин, еквивалентни на 6,44.10^-5 fg фузионен протеин, еквивалентен на 15 молекули TMPRSS2-ERG в единична VCaP клетка, динамичен обхват до 10⁵.

Китът за оценка на протеиновата експресия на TMPRSS2-ERG може да се използва за оценка на нивата на функционален протеин на генната фузия TMPRSS2-ERG, при експериментална работа с клетъчни линии носещи фузията (VCaP, NCI Н660), както и в материал получен от биологични течности (кръв, серум, урина, лимфна течност, церебро-спинална течност, течност от кистозни формации) и/или тъкани (цялостен лизат получен от простатна биопсия, клетъчен лизат получен от биопсичен материал от първичен тумор или метастатично огнище, циркулиращи метастатични клетки изолирани от периферна кръв, единична клетка или малка група клетки изолирани от фиксирани с формалин и включени в парафин тумори с помощта на техники като ласер захващаща микродисекция и други).

Едно от приложенията на изобретения метод и кит е по същество и разработка на нов подход за оценка на състоянието (т. нар. стратификация) на пациенти с простатен карцином и позволява

BG 67180 Bl положителните за TMPRSS2-ERG функционален протеин пациенти да бъдат лекувани с терапия, насочена към най-агресивни форми на простатен карцином (химиотерапия), докато пациенти позитивни за тази фузия на RT-qPCR, но негативни по предлагания кит, да бъдат лекувани с конвенционални схеми за лечение (андроген депривационна терапия и пр.).

Изобретението има редица предимства в сравнение с известните методи съгласно цитираната литература.

- Методът позволява решение на широк кръг проблеми по откриване на протеиновите продукти, в резултат от фузионни явления. В настоящият момент няма друго реализирано технологично решение предоставящо тази възможност.

- Предложен е кит, позволяващ бърза (4-6 часа), високо-специфична детекция от минимално количество кръв (например 1 μΐ) на уникално за простатния карцином генно сливане, свързано с повишена злокачественост и най-неблагоприятна прогноза. Тестът е единствен по рода си тъй като разграничава наличието на функционално активни и клинично значими ново-образувани генно реаранжирани онкопротеини, от техните нормални немутантни предшественици, и от нефункционалните мутанти, позволявайки точна прогноза на заболяването и фокусирана терапия.

- Разработеният метод открива само протеинов продукт на рекурентни фузионни феномени като TMPRSS2 и ERG, независимо от типа на настъпилите реаранжировки и мутации, които биха могли да възникнат.

- Дава възможност за откриване на „функционални варианти на карциномната фузия.

- Налице е откриване на ERG или друг фузионен партньор при детекцията, както и възможността да се разграничи нормален от фузионен TMPRSS2 фрагмент.

- Основното предимство на разработения метод се състои в откриване на епитопи, които са поотдалечени от местата на фузия (на практика в области, които не подлежат на фузия, или които при фузия биха довели до функционално негоден протеинов продукт, а следователно и до биологично неактивен продукт, т. е. такъв без клинично значение).

- Възможност за бързо и евтино откриване на фузионен протеин в биологични течности получени от пациенти, като за разлика от горепосочените патенти, при които също се ползва биологична течност, тук е нужно количество от само 1 микролитьр, което е от порядъци по-малко от нужното за изолиране на ДНК или РНК в конвенционалните методи, основаващи се на PCR или на други хибридизационни подходи. Възможността за пре-амплификация би могла да доведе до намаляване на изходното количество проба, но различната амплификационна ефективност в зависимост от съдържанието на гуанинови и цитозинови бази и вторичната структура на иРНК би могла да доведе до грешки при определяне на количеството на новообразувани фузионни явления.

- Възможност да се използват антитела срещу интактните немутантни форми на двата протеинови продукти на гените, които търпят фузия при простатен карцином.

- Освен това, откривайки епитопи, които са по-отдалечени от местата на фузия (на практика в области, които не подлежат на фузия, или които при фузия биха довели до функционално негоден протеинов продукт, а следователно и до биологично неактивен продукт, т. е. такъв без клинично значение) дава възможност да се откриват и нови фузионни феномени.

BG 67180 Bl

Предимствата на настоящето изобретение са и по отношение на:

Времетраене - досега използваните методи изискват предварителна обработка на клетки или тъкани, което увеличава технологичното време над 24 часа, докато продължителността на метода, съгласно изобретението, се свежда до 4-5 часа.

Специфичност - откриването на отделните части (домени) на онко-фузионния протеин има специфичност от порядъка на високо специфични и високо авидни антитела, но позволява разграничаване на фузионния феномен от отделните нативни не-мутантни форми. Тестът може да разпознава всякакви реаранжирания на нормалните гени предшественици, стига те да водят до функционално навит протеин и следователно до функционална фузия.

Удобство - използва се 1 микролитър кръв/плазма, количество многократно по-ниско от използването при ELISA и други методи, позволяващо съхраняването на ценния клиничен материал за други изследвания. При използване на клетъчен лизат от биопсия, количеството може да бъде и по-малко, т. к. в клетъчни линии и клетъчни лизати от биопсия наличието на онко-фузионния протеин е достатъчно за получаване на много висок сигнал.

Достъпност - Тестът изисква използване на конвенционален real-time PCR и не изисква промени в оптиката, нито в софтуера; В момента такива апарати са налични във всяка една от големите болници в страната; Последователността на действията изисквани от медицинския персонал, който би прилагал метода са много близки до тези на real-time PCR, като включват няколко предварителни стъпки, които не се нуждаят от допълнително оборудване.

- Изобретението може широко да се прилага в клиничната онкология и урология при установяване на степента на малигненост (злокачественост) на простатния карцином, с цел оптимизация на терапията на пациентите с лоша прогноза.

- Дава лесна възможност за развитие на кита е мултиплексен (едновременен) анализ на допълнителни клинично значими фузионни мутации и други онкологични маркери в един клиничен тест, както при простатен карцином, така и при други онкологични заболявания (напр. левкози).

Разработеният тест използва за контроли клетъчни линии с различна андрогенна рецептивност, носители на фузионната мутация и такива с див тип на съставящите я гени (без фузия). Тестът запазва своята чувствителност при разреждания на клетъчните лизати до 1:10'⁷ и до 1:10'¹⁰. Като зона за сигурност се препоръчва 1:1 O'⁴ -1:10'⁵.

За по-голяма яснота, изобретението се илюстрира със следните фигури:

Фигура 1. Геномна локализация на гените кодиращи TMPRSS2 и ERG;

Фигура 2. Геномна локализация на фузионен ген, кодиращи TMPRSS2-ERG изоформа;

Фигура 3. Рекомбинацията на различни по дължина фрагменти от двата гена имат за резултат различно комбинирани по размер фузионни протеини;

Фигура 4. При физическа близост на разпознаваните от антителата молекулни фрагменти от продукта на реаранжиране, между конюгираните към антителата секвенции изгражда мост;

Фигура 5. В следващ етап сигналът от моста се усилва като секвенцията се намножава многократно с помощта на qPCR;

BG 67180 Bl

Фигура 6. VCaP клетъчната линия има 2 от изследваните 4 основни типа реаранжиране на TMPRSS2 и ERG;

Фигура 7. Амплификационни криви, получени с помощта на qPCR от реакционна смес след инкубация на антителата с проби за изследване и преминаване през стъпката за изграждане на мост между тях. Лизати от LNCaP клетки спрямо лизати от VCaP клетки;

Фигура 8. Амплификационни криви, получени с помощта на qPCR от реакционна смес след инкубация на антителата с проби за изследване Серийно разредени лизати на VCaP клетки;

Фигура 9. Стандартна калибровъчна крива получена чрез регресия между стойностите на Ct и концентрациите на калибровъчните лизати;

Фигура 10. Амплификационна крива, получена при стъпка 2 от кита за детекция на TMPRSS2ERG протеин;

Фигура 11. Пример за линейност на резултатите от серийните разреждания;

Фигура 12. Резултати, получени с помощта на новия метод (кит) за детекция на протеиновия продукт;

Фигура 13. Анализ на експресията на микро-РНК 204 в различни линии от простатен карцином, с помощта на RT-qPCR;

Фигура 14. Анализ на експресията на транскриптите на TMPRSS2-ERG в линия VCaP от простатен карцином, с помощта на RT-qPCR;

Фигура 15. Амплификационни криви, получени с помощта на qPCR от реакционна смес след инкубация на антителата с проби за изследване;

Фигура 16. Амплификационни криви, получени при стъпка 2 от кита за детекция на TMPRSS2ERG протеин;

Фигура 17. Стандартна калибровъчна крива, получена чрез регресия между стойностите на Ct и концентрациите на калибровъчните лизати;

Фигура 18. Резултати, получени с помощта на новия метод (кит) за детекция на протеиновия продукт на реаранжирания фузионен продукт TMPRSS2-ERG в клетки и серуми от пациенти;

Фигура 19. Селекция на пациентите от фигура 18, имащи ниски нива на експресия, с цел елиминиране на пациентите, имащи порядъци по-високи нива и сравняването им;

Фигура 20. Селекция на пациентите от фигура 18 имащи най-високи на експресия;

Фигура 21. Амплификационни крива на стандартен RT-qPCR за определяне нивата на транскриптите на TMPRSS2-ERG;

Фигура 22. Дисоциационни криви (крива на топене) от стандартен RT-qPCR за определяне разновидностите на транскриптите на TMPRSS2-ERG;

Фигура 23. Амплификационни крива на стандартен RT-qPCR за определяне нивата на транскриптите на TMPRSS2-ERG, детектирани с праймерна двойка специфична за вариант 3 на фузията в серуми от пациенти с простатен карцином;

Фигура 24. Дисоциационни криви (крива на топене) от стандартен RT-qPCR за определяне разновидностите на транскриптите на TMPRSS2-ERG;

Фигура 25. Разновидности на дисоциационните криви на TMPRSS2-ERG иРНК при други серумни проби от същия пациент с №31

BG 67180 Bl

Изобретението се илюстрира със следните Примери без да ограничават неговия обхват.

Пример 1. Метод за откриване наличие на онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин в клетки от линията VCaP и генериране на калибрационна крива и функция.

В клетъчната линия VCaP, както и в серуми от пациенти с простатен карцином е възможна появата на повече от един пик в кривите на топене, получени с RT-qPCR, при амплификация на целия участък, обхващащ началото на гена за TMPRSS2 и края на гена за ERG (фигура 6). Този феномен се дължи на наличието на два вида реаранжиране в клетките от клетъчната линия VCaP. При това, тези реаранжировки са такива, че едната съдържа цели екзони от TMPRSS2 и ERG в правилна посока за четене, докато другата реаранжировка съдържа една правилна и една обратна по посоки част от гените. Това позволява получаването на два пика с помощта на RT-qPCR, съответстващи на двата модела на реаранжиране, без да може с този конвенционален метод да се определи дали продуктът е функционален или не. Това позволява линията VCaP да бъде използвана като модел за проверка на работоспособността и калибриране на кита за приложение на метода, съгласно изобретението.

Така методът, съгласно настоящият вариант на изпълнение на изобретението, включва следната последователност от операции:

Предварително подготвени антитела (1:200 разреждане в стандартен буфер) срещу TMPRSS2 и ERG в стандартизирана концентрация, се добавят към изследвана реакционна смес - 1 pL (съдържаща лизат от клетки от клетъчна линия VCaP или клиничен тестов материал - серум) и се инкубира за 2 часа. С помощта на PCR машина се осъществява реакция, създаваща мост - на 37°С, като по този начин се извършва удължаване на конюгирани към антителата секвенции за 20 min, последвано от дезактивиране на специфичния ензим. Следва реакция на амплификация с помощта на qPCR, при която получения мост се намножава и количеството му се детектира с помощта на флуоресцентна боя. Следва се протокол, включващ:

1. Детектиране на протеинов продукт

а) Конюгираните антитела се смесват с проба за изследване - 1 uL;

б) Получаване и анализ на калибрационна стандартна крива - лизат от VCaP клетки се разрежда серийно, започвайки от стартово разреждане 1:1, 1:10, 1:100 и така до разреждане 1.10 ¹¹, прави се анализ на получените стойности на Ct от qPCR и се анализира регресионна зависимост между стойностите на Ct и разрежданията на концентрациите на лизата от VCaP клетки; обикновено се вземат в предвид първите 6 степени на разреждане; на основа на протеиновата концентрация в лизата и на известните абсолютни концентрации на най-често намиращата се във фузиите секвенция, част от фузионния протеин се изчислява количество молекули TMPRSS2-ERG на единица обем (единица количество белтък в пробата);

2. Амплификация на междинните продукти от изследването на конкретни проби с неизвестно съдържание на търсената TMPRSS2-ERG фузия във функционална форма;

а) Определяне на концентрацията на TMPRSS2-ERG протеин в относителни единици (или amol/pL, attomoles/pL или fg, femtograms) с помощта на получената калибрационна крива, определяне на броя молекули TMPRSS2-ERG;

BG 67180 Bl

б) Нормализиране на данните към нивата на експресия в клетъчна линия LNCaP, не съдържаща изследваната транслокация TMPRSS2-ERG с помощта на определените относителни единици за целите на сравнителни експериментални анализи или конвертиране на данните към абсолютен брой молекули,

в) Контрол на качеството и резултатите с помощта на негативни контроли - определяне нивата на експресия на TMPRSS2-ERG в серуми от клинично здрави мъже и от здрави жени (1 pL серум без разреждане или разреден 1:100);

Описаният метод има добра чувствителност и разграничава TMPRSS2-ERG протеин в лизати на LNCaP клетки, които не съдържат или слабо съдържат мутацията, от лизати на VCaP клетки, съдържащи високи нива на търсения мутантен протеин (фигура 7). Получената разлика между двете групи е от порядъка на 3 и повече единици в праговият цикъл Ct, което означава разлика в броя на молекулите от порядъка на 3-та степен.

Получаването на стандартна крива има за цел определяне на регресионна зависимост между стойностите на праговия цикъл С_т (фигура 8) от амплификационните цикли на qPCR реакцията и познатите стойности за концентрация на общ протеин в лизатите на VCaP клетки (фигура 9).

Получено е регресионно уравнение:

у = -0.052 * log(x) + 23.74

Протеиновата концентрация, съответстваща на лизата от VCaP клетки е измерена с Bradford метод и отговаря на очакваната 0.210 mg/ml общ белтък, за клетки култивирани в 24 ямкова плака при пълна 100% конфлуентност. Така в 1 pL лизат има 210 pg тотален протеин.

Използвайки концентрацията на пептиди от двата нативни протеини, които не се засягат от реаранжирането и винаги присъстват във фузиите на при VCaP клетките (секвенции HMPPPNMTTNER и VIVPADPTLWSTDHVR), теоретично може да се определи концентрацията на TMPRSS2-ERG в клетъчна линия VCaP - 1240 amol/pL тотален протеин. По този начин се определя и броя молекули TMPRSS2-ERG (п) и количеството съответстващ им белтък (fg) което е налично в 1 pL VCaP или в съответна неизвестна проба: 1240 amol/pL * 210 pg тотален протеин в 1 pL VCaP лизат съответства на 260.4 amol или 6.10²³.10'¹⁸ * 240 = 156240000 молекули; аналогично това съответства на 643.968 fg.

Серийното разреждане на лизати от различни експериментални условия показва линейност на промяната на С_т получена при използването на стъпка-2 от метода и промяната на фактора на разреждане (фигури 10, 11).

Параметрите на метода за определяне на протеинова концентрация на TMPRSS2-ERG в биологични течности и клетъчни лизати са: праг на минимално откриваема концентрация-максимално разреждане на VCaP клетки, при което все още има сигнал - 1.10‘°⁷, еквивалентно на 2.604.10⁵ amol/pL тотален протеин или на 6.43968.10’⁰⁵ fg, или респективно 15 молекули TMPRSS2-ERG, Максимално измерени нива на TMPRSS2-ERG в 1 pL протеинов лизат от VCaP (210 pg) е 156240000 молекули за pL, или 744000 молекули за 1 pg лизат (74,4.10⁶). Това количество протеин се получава от около 0,2.10⁶ клетки, следователно около 781 протеинови молекули TMPRSS2-ERG се падат средно на клетка от линията VCaP. За LNCaP клетките това количество е 0.

Пример 2. Използване на кит за откриване на TMPRSS2-ERG протеин за оценка на количеството протеин в клетки от линията VCaP след третирането им с микро-РНК 204 мимик (miR-204 mimic), или

BG 67180 Bl индивидуалното или в комбинация с подтискане на гените RUNX2, cMYB или ETS1, с помощта на siRNA (siRNA RUNX2, siRNA cMYB, siRNA ETS1).

Клетъчни лизати от клетки VCaP и LNCaP, култивирани по изискванията на Американската банка за клетъчни линии (АТСС), са получени с помощта на последователни цикли на дълбоко замразяване (70°С) и размразяване (24°С) и добавянето на коктейл протеазни инхибитори.

Преди лизирането клетките са трансфектирани с нетаргетиращ конкретен ген мимик - отрицателна контрола (non-sense miR mimic), синтетичен аналог (мимик) на микро-РНК 204 (miR-204 mimic), малки интерфериращи РНК-и (siRNA) срещу транскрипционните фактори RUNX2, cMYB и ETS1 (транскрипционни фактори, свързани с метастазирането - реаранжиран при острата миелоидна левкемия онкоген, миобластозен онкоген и хомолог на еритобластозния онкоген). Трансфекцията е осъществена с Atractene (Qiagen) разтворен в нормална култивационна среда, където са кулитвирани в продължение на 48 часа, след което са лизирани по гореописаният начин. Разработеният кит за откриване наличие на TMPRSS2-ERG протеин е приложен по гореописаният начин. Получените резултати са сравнени с резултати от същата постановка, но изследвана с помощта на количествена полимеразно верижна реакция (RT-qPCR), като за целта вместо протеолиза е изолирана тотална РНК, извършена е реакция на обратна транскриптаза и получаване на комплементарна кДНК и с полученият шаблон е направена амплификация с помощта на специфични праймери на участъци от кДНК, съответстващи на иРНК на гените RUNX2, cMYB и ETS1, както и на транскрипта на фузионния продукт TMPRSS2-ERG. За последния е използвана двойка праймери, която да фланкира първия екзон на TMPRSS2 и последния екзон на ERG, като по този начин биха били намножени всички възможни комбинации на TMPRSS2ERG.

Получените резултати показват следното (фигура 12):

1. При представяне на данните като релативна експресия на TMPRSS2-ERG, спрямо експресията му в контролни VCaP (100%), се установи понижаване на експресията с около 20-25 % на

TMPRSS2-ERG след подтискане на транскрипционните фактори RUNX2 и ETS1, и с 40% след подтискане на транскрипционния фактор cMYB. По подобен начин, комбинацията от подтискането на повече от един от транскрипционните фактори води до кумулативно подтискане на протеиновите нива на TMPRSS2-ERG.

2. Свръхекспресията на микро РНК 204 води до понижение на нива на TMPRSS2- ERG с 40%.

3. В клетъчната линия LNCaP няма експресия на TMPRSS2-ERG протеинов продукт.

Данните са представени като относителна експресия на TMPRSS2-ERG в експерименталните условия, спрямо средната им експресия в нетретирани или трансфектирани с нетаргетиращ мимик (или с нонсенс siRNA) VCaP клетки, където тази експресия е 100%.

С цел проверка на разултатите и сравнението им със стандартен метод на изследване, се използва RT-qPCR за да се проследят нивата на микро РНК 204 в и LNCaP линии (фигура 13) и се установява сигнификантно повишение (над 10⁴) в линията VCaP спрямо ниво, детектирано в линията LNCaP.

На тази основа, анализира се експресията на транскриптите на TMPRSS2-ERG в линията VCaP от простатен карцином, с помощта на RT-qPCR (фигура 14). Клетките са предварително трансфектирани за 48 часа с siRNA срещу RUNX2, ETS1, cMYB или комбинация от RUNX2 и cMYB, RUNX2 и ETS1. За контрола са използвани клетки, трансфектирани или с нетаргетиращ мимик, или с мимик, имитиращ miRBG 67180 Bl

204. Получените резултати показват, че поведението на транскриптите на TMPRSS2-ERG следва наблюдаваното с помощта на новия разработен кит и на протеиново ниво: повишаването на микроРНК204 води до сигнификантно подтискане на транскрипта на TMPRSS2-ERG (фигура 14), подобно на неговия протеинов продукт (фигура 12).

Установена е и аналогична зависимост между нивата на TMPRSS2-ERG транскриптите (иРНК) и ефекта на siRNA срещу RUNX2, ETS1, cMYB или комбинации от тях.

Различните нива на подтискане на TMPRSS2-ERG като иРНК продукт и като протеинов продукт се влияят от свързаните с простатния карцином активиране и дисрегулация на протеазомата и системите за убиквитиниране.

Пример 3. Използване на кит за откриване на наличие на онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин в серум от пациенти с простатен карцином в напреднал стадий на възраст от 60-80 години.

Серуми от пациенти с простатен карцином в напреднал стадий на възраст от 60-80 години и клетъчни лизати от клетки VCaP и LNCaP, култивирани по изискванията на АТСС, се съхраняват в условия на дълбоко замразяване (-70°С). При използване на разработения кит за откриване на наличие на TMPRSS2-ERG пробите се размразяват и се изпълнява описания - по-горе протокол.

С помощта на серийни разреждания на лизати от клетки VCaP и LNCaP се изготвят калибрационни регресионни криви (фигури 15, 16, 17) за калкулиране на концентрациите, получени при анализа на серумите.

Получени са следните резултати:

1. Регресионната крива има същия фактор за умножение на х в регресионното уравнение, както полученият в Примери 1 и 2, показващ константна зависимост между стойностите на С_т и тези на разреждането. Ако има промяна в афинитета на системата детектиран антиген - двойка антитела, qPCR, този фактор за умножение би бил променен.

2. Протеиновият продукт на реаранжирания фузионен продукт TMPRSS2-ERG в клетки и серуми от пациенти (п = 35) на възраст 60-80 години с простатен карцином в напреднал стадий има висока вариация (фигури 18, 19, 20), като позитивни за функционален TMPRSS2-ERG протеин са под половината от пациентите. В литературата се съобщава за над или около 50% позитивна фузионна реаранжировка, но детектирана на ниво геном или транскриптом. До момента няма данни какъв е процента на истински физиологично навитите и функционални TMPRSS2-ERG протеини.

3. Отделно са разгледани пациентите с изключително високи нива на TMPRSS2-ERG протеин (фигура 20). При тези пациенти нивата надхвърлят тези във VCaP клетки с над 1000 до 10³³ пъти.

4. Клетъчни лизати от VCaP линията са използвани като позитивна контрола, клетъчни лизати от линията LNCaP и серуми от здрави мъже и жени са използвани като отрицателни контроли. Данните са представени като брой протеинови молекули TMPRSS2-ERG.

5. При сравняване на данните за експресия на TMPRSS2-ERG протеин с тези за експресия на неговия транскрипт се установяват следните разлики. Напр. пациент № 33 е позитивен и при двата теста - ново разработеният кит за откриване на наличие на протеин TMPRSS2-ERG и конвенционалният метод RT- qPCR за откриване на наличие на TMPRSS2-ERG иРНК транскрипт (фигури 21,23).

6. Получените данни за позитивни за TMPRSS2-ERG иРНК, както при 1, така и при използването на праймерна двойка амплифицираща фузия тип 3 имат позитивни амплификационни криви (фигури 21, 23).

7. За разлика от този пациент, пациенти с № 31 и № 32 имат позитивна амплификация за TMPRSS2-ERG иРНК транскрипт, но са негативни при използване на кита за откриване на наличие на функционален протеинов TMPRSS2-ERG продукт (фигура 18).

8. Тези разлики могат да се обяснят с наблюдаваните варианти между пациентите при анализа на техните дисоциационни криви в резултат на амплификацията на TMPRSS2-ERG иРНК с помощта на детектиращи две различни фузионни форми 1 и 3 праймерни двойки (фигури 22,24, 25). Пациент 31, има различни дисоциационни криви от тези на 32 и 33 при амплифициране на фузия тип 1 (фигура 22). Същите праймери амплифицират продукт при серумите на здравите жени и мъже контроли, който има по-голяма дължина и еднакъв температурен пик, но различен от този на пациентите с карцином. Кривите на пациент 32 и 33 имат еднакъв температурен пик.

9. Пациент 32 и 33 имат еднакъв температурен пик по рекомбинация тип 1, но имат различни температурни пикове по рекомбинация тип 3 (фигура 24) - дисоциационна крива с три пика, показваща леки промени в пикове 1 и 3 между пациент 31 и тези на пациент 33 - втория пик на пациент 33 е 68°С, докато този на пациент 32 е 71 °C (таблица 1).

Откриването на по-малък брой пациенти позитивни за TMPRSS2-ERG функционален протеин позволява по-добра стратификация на пациентите и оптимизиране на терапията.

Таблица 1- Данни за пациенти от изследваната група, изследвани и за транскрипт на TMPRSS2ERG с помощта на RT-qPCR. Посочени са Ct на амплификационната крива и Тт на пирковете образувани от получените PCR продукти:

BG 67180 Bl

Проба	Тип	Ct (dRn)	Tm Product 1 (-Rn'(T))	Tm Product 2 (-Rn'(T()
пациент № 31	серум	3016	71 42	N/A
пациент Νβ 32	серум	27 34	7365	71 42
пациент № 31	серум	29 42	71 42	N/A
пациент № 31	серум	29.92	73.12	68 63
пациент № 33	серум	27 18	7308	68 02
пациент № 32	серум	27 72	73 65	71 97
донорска кръв - кл здрава жена	серум	36 25	7863	N/A
донорска кръв - кл. здрав мъж	серум	3541	792	N/A
—	NTC (контрола)	No Ct	N/A	N/A

Методът се прилага по следната технологична схема:

1. Откриване на протеинови продукти от генна фузия, при която предварително подготвени разтворени в реакционен буфер антитяло-олигонуклеотиден конюгат 1 - специфично детектиращ TMPRSS2 и антитяло-олигонуклеотиден конюгат 2 - специфично детектиращ ERG и изследваната тестова проба, се накапват в 24/96/384/х-ямкова плака, инкубират се (в специфична последователност) за 2 h при стайна температура, подлагат се на предварително омрежване при + 37°С за 5 min и пълно омрежване с използване на qPCR апарат и последваща амплификация с помощта на оптимизиран qPCR

BG 67180 Bl протокол, като резултатите за С_т от амплификационните криви се експортират като структурирани данни (електронен файл) и се обработват с помощта на софтуер за регресионен анализ за определяне стойностите за протеинова експресия. Серийни разреждания на лизат от клетъчната линия ATCC VCaP служат като калибрационна проба и се използват за построяване на калибрационна крива.

2. Подготовката на антитяло-олигонуклеотиден конюгат 1, посочен в т. 1, наименуван по-нататък като конюгирано антитяло 1 или само конюгат 1, детектиращ специфично TMPRSS2 се осъществява, чрез:

2.1 Използва се антитяло 1, представляващо пречистен поливалентен (поликлонален) TMPRSS2специфичен имуноглобулин G (IgG) и разпознаващо епитопи с размер от 15-20 амино киселинни остатъци, съответстващ на остатъци до позиция 365 от молекулата на нативен TMPRSS2 (рефериран като антитяло 1).

2.2 Използва се общо стартово количество 10 pg от антитяло 1, което се пречиства през молекулноситова концентрационна колона (напр. Millipore или illustra MicroSpin G-50 Columns spin column, GE Healthcare), c цел подмяна на буфера в който е разтворено с PBS (Phosphate Buffered Saline изотоничен солеви буфер съдържащ натриев фосфат, натриев хлорид, калиев хлорид и калиев фосфат) и стандартизиране на концентрацията до 1 mg/ml. Буферът не трябва да съдържа първични амини, pH 7-9, оптимум pH 7. Напр. 25-50 μΐ антитяло се добавят към пре-еквилибрирана с PBS, pH 7 колона и последната се центрофугира на 3000 об/min за 2 min, докато е поставена в колекторна микро-епруветка. Събраното еквилибрирано антитяло се проверява за протеинова концентрация спектрофотометрично - 1 mg/ml протеин би трябвало да има приблизителна оптична плътност 1.4, при дължина на вълната 280 nm.

Claims (4)

1. Патентни претенции

   1. Метод за откриване на функционално активен онкофузионнен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата с използване на количествена полимеразно верижна реакция (qPCR), характеризиращ се с това, че предварително разтворени в реакционен PBS буфер антитялоолигонуклеиден конюгат, специфично детектиращ гена TMPRSS2 и антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ гена ERG, се накапват последователно в ямките на плака, съдържащи тестова проба, инкубират се в продължение на 2 h при стайна температура с последващо двуетапно омрежване на конюгатите в qPCR апарат и амплификация на продукта на омрежването чрез полимеразно верижна реакция в реално време и получените данни се подлагат на регресионен анализ за определяне стойностите за протеинова експресия, съответстващи на стойностите за наличие на функционално активен онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин (SEQ ID NO:1).
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че антитяло-олигонуклеотидният конюгат, специфично детектиращ гена TMPRSS2, представлява конюгат на пречистен поливалентен TMPRSS2-cπeциφичeн имуноглобулин G (IgG), разпознаващ епитопи с размер на 15-20 аминокиселинни остатъци, съответстващи на аминокиселинните остатъци при позиция 365 от молекулата на нативния TMPRSS2 ген, с лиофилизиран 40-60-мерен олигонуклеотид с молекулна маса от 12296 g/mol до 12690 g/mol, а антитяло-олигонуклеотидният конюгат, специфично детектиращ гена ERG, представлява конюгат на пречистен поливалентен ERG-специфичен IgG, локализиран в карбокси края на протеина от молекулата на нативния ERG ген, с лиофилизиран 40-60-мерен олигонуклеотид с молекулна маса от 12296 g/mol до 12690 g/mol.

   BG 67180 Bl
3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че в качеството на тестова проба се използват клетъчни линии, носещи генната фузия TMPRSS2-ERG или материал, получен от биологични течности като кръв, серум, урина, лимфна течност, цереброспинална течност, течност от кистозни формации или тъкани като цялостен лизат, получен от простатна биопсия, клетъчен лизат, получен от биопсичен материал от първичен тумор или метастатично огнище, циркулиращи метастатични клетки, изолирани от периферна кръв, единична клетка или малка група клетки, изолирани от тумори.
4. 4. Кит за откриване на функционално активен онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, характеризиращ се с това, че включва:

   - ямкова плака, съвместима с апарат за провеждане на количествена полимеразно верижна реакция (qPCR);

   - антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ TMPRSS2 гена, предварително разтворен в реакционен PBS буфер;

   - антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ ERG гена, предварително разтворен в реакционен PBS буфер;

   - тестова проба и

   - калибрационна проба.